DE112015003962T5 - 3-Hydroxypropionsäure erzeugende rekombinante Hefe und Verfahren zum Herstellen von 3-Hydroxypropionsäure unter Nutzung derselben - Google Patents

3-Hydroxypropionsäure erzeugende rekombinante Hefe und Verfahren zum Herstellen von 3-Hydroxypropionsäure unter Nutzung derselben Download PDF

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Abstract

Bereitgestellt werden eine rekombinante Hefe, die 3-Hydroxypropionsäure (3-HP) produziert, und ein Verfahren zur Produktion von 3-HP unter Verwendung derselben, insbesondere eine rekombinante Hefe, die 3-HP produziert, umfassend ein exogenes AADH-Gen; ein endogenes oder exogenes ACC-Gen; ein exogenes MCR-Gen und ein exogenes HPDH-Gen; und Produzieren von 3-HP gemäß dem Biosynthesestoffwechselweg [Pyruvat → Acetaldehyd → Acetyl-CoA → Malonyl-CoA → Malonatsemialdehyd → 3-HP], und ein Verfahren zur Produktion von 3-HP unter Verwendung derselben.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine 3-Hydroxypropionsäure (3-HP) erzeugende rekombinante Hefe und ein Verfahren zum Herstellen von 3-HP unter Nutzung derselben und betrifft spezieller eine 3-HP erzeugende rekombinante Hefe, umfassend: ein AADH kodierendes exogenes Gen; ein ACC kodierendes endo- oder exogenes Gen, ein MCR kodierendes exogenes Gen; und ein HPDH kodierendes exogenes Gen, sowie Erzeugen von 3-HP über den biosynthetischen Stoffwechselweg [Pyruvat → Acetaldehyd → Acetyl-CoA → Malonyl-CoA → Malonat-Semialdehyd → 3-HP] und ein Verfahren unter Verwendung derselben.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • 3-HP (3-Hydroxypropionsäure, C3) ist ein Isomer der Milchsäure (2-Hydroxypropionsäure) und verfügt an beiden Enden davon über eine Carbonsäure-Gruppe und eine Hydroxyl-Gruppe und ist dadurch ein nützliches Material, das in verschiedene chemische Substanzen umgewandelt werden kann, wie beispielsweise 1,3-Propandiol, Acrylsäure, Acrylamid, ein Polymer und dergleichen. Wegen der vorgenannten Gründe wurde 3-HP von dem U. S. Department of Energy 2004 sogar als eine der vielversprechenden chemischen Substanzen gewählt, die aus Biomasse erzeugt werden können. Insbesondere könnte Acrylsäure als eine vorrangig eingesetzte Form von 3-HP als besonders marktfähiges, in einem Beschichtungsmaterial, einer Klebmasse, einem Additiv, einer Windel oder dgl. angewendetes Material sein. Theoretisch kann 3-HP aus verschiedener Biomasse erzeugt werden, wie beispielsweise Glucose durch Fermentation bei einer Ausbeute von 100%, und es ist ein Fermentationsprozess unter Verwendung von Mikroorganismen geeignet, um den Bedarf für ein umweltfreundliches und erneuerbares Material zu decken.
  • Bisher gibt es noch keinen Fall einer kommerziellen Produktion von 3-HP unter Verwendung von Biomasse, allerdings sind Forschungsarbeiten zu verschiedenen Verfahren ausgeführt worden, wobei sich die Sicherung eines wirtschaftlichen, 3-HP produzierenden Stammes als das Haupthindernis erwiesen hat. Bakterien als repräsentative Mikroorganismen, die organische Säuren erzeugen und in der Industrie, wie beispielsweise Nahrungsmittelindustrie oder dgl. breite Anwendung finden, sind bekannt. Allerdings gibt es Nachteile beim Einsatz der Produktion organischer Säuren unter Verwendung industrieller Bakterien, wie beispielsweise E. coli, im großtechnischen Maßstab in der chemischen Industrie, wie beispielsweise der 3-HP-Produktion. Wenn die Menge der Produktion organischer Säure erhöht wird, nimmt die hydrierte Form der Säure zu und die Azidität wird erhöht (der pH-Wert nimmt ab), wodurch sich die Aktivität des größten Teils der E. coli verringert. In dem Fall der Herstellung organischer Säure bei hoher Konzentration erfordern die Bakterien eine Base, wie beispielsweise Natriumhydroxid (NaOH) und Ammoniumhydroxid (NH4OH), um einen neutralen pH-Wert aufrechtzuerhalten. Dieses bewirkt in Abhängigkeit von der eingespritzten Base eine Zunahme der Kosten des Fermentationsprozesses und macht einen Prozess der Extraktion und Abtrennung schwierig oder erhöht signifikant die Kosten.
  • In einem neueren Fall eines Einsatzes der Produktion organischer Säure in der chemischen Industrie wird eine organische Säure unter Verwendung von Hefe aus Glucose erzeugt. Im Vergleich zu Bakterien verfügt Hefe über eine hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber einer organischen Säure, so dass die Aktivität der Hefe selbst bei hoher Azidität (geringer pH-Wert) nicht signifikant verringert wird, was die Hefe zur Herstellung der organischen Säure zu einem besser geeigneten Wirt macht. Insbesondere hat Hefe konventionell als industrieller Biokatalysator für die Herstellung von Sprit, technischem Alkohol oder dgl. breite Anwendung gefunden und läßt sich in Massenkultur kultivieren und kann nicht mit Bakteriophagen kontaminiert werden, so dass die Einsetzbarkeit der Hefe in der chemischen Industrie gegenüber Bakterien weit überlegen ist. Bei der Herstellung einer organischen Säure hat Hefe Vorteile, allerdings gibt es auch bei der Verwendung der Hefe zur Herstellung einer organischen Säure wie 3-HP mehrere Nachteile. Erstens, ist es im Vergleich zu Bakterien schwieriger Hefe genetisch zu modifizieren, und um ein spezielles metabolisches Enzym zu exprimieren, müsste der subzelluläre Ort für die Exprimierung des Stoffwechselweges zusammen mit dem speziellen metabolischen Enzym identifiziert werden, was anders als bei Bakterien auf die Form der Zellen zurückzuführen ist, die in intrazelluläre strukturelle Körper geteilt werden, wie beispielsweise Mitochondrien, Peroxisomen oder dergleichen. Beispielsweise wird ein repräsentatives Stoffwechselzwischenprodukt, wie beispielsweise Acetyl-CoA in Hefen hauptsächlich in den Mitochondrien erzeugt. Wenn allerdings ein Zielprodukt in dem Cytosol erzeugt wird, ist ein Verfahren zum Herstellen von Acetyl-CoA in dem Cytosol ebenfalls erforderlich. Da es darüber hinaus im Bereich der Pilze eine große Zahl unterschiedlicher Hefen gibt und nicht alle Hefen der Anforderung hoher Produktivität, Widerstandsfähigkeit gegen organischen Säuren und Massenkultur gerecht werden, ist effektiv ein Wirt zu wählen, der zum Herstellen der organischen Säuren geeignet ist.
  • Es ist bekannt, dass einige Hefen wirkungsvoll Ethanol aus Glucose erzeugen, bei der es sich um eine Hexose handelt, und einige Hefearten erzeugen auch eine organische Säure. Zum Zeitpunkt der Modifikation beim Herstellen eines Zielprodukts unter Verwendung von Mikroorganismen kommt es darauf an, bei einer Stoffwechselreaktion ein Gesamtgleichgewicht von Oxidation und Reduktion aufrechtzuerhalten, wobei geeigneter Weise auch eine Stoffwechselreaktion des Fermentierens von Ethanol aus Glusose eine aufrechterhaltene Reaktion ist. Selbst im Fall der genetischen Modifizierung von Hefe zum Erzeugen einer organische Säure sollte das vorstehend beschriebene Gleichgewicht geeigneter Weise eingehalten werden, während in einem Fall des Herstellens von Milchsäure durch Modifikation von Hefe die ausgewogene Einführung von Milchsäure-Dehydrogenase (LDH) einer anderen Reduktionsreaktion zum Komplementieren einer Reduktionsreaktion zum Herstellen von Ethanol aus Acetaldehyd von Bedeutung ist.
  • Es ist bekannt, dass in einer kleinen Zahl von Mikroorganismen, wie beispielsweise Chloroflexus aurantiacus, eine kleine Menge 3-HP erzeugt wird und 3-HP teilweise aus einem Zersetzungsprozess von Dimethylsulfoniopropionat in Mikroorganismen gebildet wird, wie beispielsweise Alcaligenes faecalis, oder einem Zersetzungsprozess von Uracil in Hefe. Durch die Entdeckung des in der Natur vorhanden 3-HP, wie vorstehend beschrieben, ist Forschung nach 3-HP-Stoffwechselwegen und entsprechenden Enzymen ausgeführt worden und auf der Grundlage der Forschung neuerlich nach einer Technologie zum Herstellen von 3-HP oder einer PHA, die Polymer von 3-HP ist, ausgeführt worden, indem ein für die 3-HP-Biosynthese in E. coli erforderliches Gen eingeführt wurde. Um darüber hinaus die Produktivität und die Produktionsausbeute an 3-HP zu maximieren, die lediglich als ein Stoffwechselzwischenprodukt vorliegt oder lediglich in geringen Mengen in der Natur produziert wird, mussten Technologien zum Einsatz gelangen, wie beispielsweise eine Technologie des Stoffwechsel-Engineerings, eine Technologie der Systembiologie, eine Technologie der synthetischen Biologie oder dergleichen.
  • Im Rahmen der Entwicklung der Technologie des Stoffwechsel-Engineerings ist es möglich geworden, die Produktions-Stoffwechselwege verschiedener Materialien unter Verwendung von Mikroorganismen vorherzusagen, wobei sich ein Stoffwechselweg zur Herstellung von 3-HP aus Glucose ja nach den Stoffwechselzwischenprodukten grob unterteilen läßt in einen Acryloyl-CoA-Stoffwechselweg, einen β-Alanin-Stoffwechselweg, einen Malonyl-CoA-Stoffwechselweg und einen Glycerol-Stoffwechselweg.
  • Der Acryloyl-CoA-Stoffwechselweg bedeutet ein Stoffwechselweg der Umwandlung von Pyruvat oder Phosphoenolpyruvat (PEP), das aus der Glykolyse von Glucose erhalten wird, zu Acryloyl-CoA über Lactat oder β-Alanin, und dann Umwandeln des Acryloyl-CoA zu 3-HP durch eine Hydratationsreaktion und eine Reduktionsreaktion (Pyruvat oder PEP → Lactat oder β-Alanin → Acryloyl-CoA → 3-HP). Acryloyl-CoA ist ein Stoffwechselprodukt, das während des Zersetzungsprozesses von Propionsäure beobachtet wird, und da der Wert für die Gibbssche Freie Energie für die Bildung des Stoffwechselprodukts positiv ist, ist eine Hinreaktion eine ungünstige Reaktion. Darüber hinaus ist die Substratspezifität von Acryloyl-CoA-Thioesterasen gering, so dass der Acryloyl-CoA-Stoffwechselweg als Stoffwechselweg für die Massenherstellung von 3-HP nicht geeignet ist.
  • Der β-Alanin-Stoffwechselweg bedeutet ein Stoffwechselweg des Umwandelns von Pyruvat oder Oxaloacetat zu Aminosäure mit Hilfe einer Transaminierungsreaktion und abschließende Umwandlung in 3-HP über β-Alanin durch eine Transaminierungsreaktion (Pyruvat oder Oxaloacetat → Aminosäure → β-Alanin → 3-HP; US 2012/0135481A1 ). Da die Transaminierungsreaktion von β-Alanin zu 3-HP über Malonat-Semialdehyd abläuft, das für Mikroorganismen stark toxisch ist, wird eine 3-HP-Dehydrogenase benötigt, die über eine hohe Aktivität verfügt. Da die Transaminierungsreaktion darüber hinaus generell eine Radikalform einer Aminosäure-Molekularstruktur in einem stationären Zustand erzeugt, hat ein Enzym dieser Reaktion eine Struktur zur Milderung des Reaktionsvermögens des Radikals. Da dieses Radikal über ein starkes Reaktionsvermögen mit Sauerstoff verfügt, werden im Wesentlichen für eine glatte Transaminierungsreaktion anaerobe Bedingungen oder ein Coenzym zum Stabilisieren der Radikalmoleküle benötigt.
  • Der Malonyl-CoA-Stoffwechselweg ist ein Stoffwechselweg der Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch Carboxylierung und anschließende Umwandlung von Malonyl-CoA in 3-HP durch eine Reduktionsreaktion (Acetyl-CoA → Malonyl-CoA → 3-HP), wobei der Glycerol-Weg ein Stoffwechselweg der Umwandlung von Glucose in Glycerol ist, Umwandlung von Glycerol zu 3-Hydroxypropionaldehyd durch eine Reaktion der Dehydratisierung, und anschließend Umwandlung von 3-Hydroxypropionaldehyd zu 3-HP (Glucose → Glycerol → 3-Hydroxypropionaldehyd → 3-HP). Da der Malonyl-CoA-Stoffwechselweg und der Glycerol-Stoffwechselweg über ein Zwischenprodukt ablaufen, das im Allgemeinen durch Mikroorganismen wie E. coli oder dgl. erzeugt wird, sind überwiegend diese Stoffwechselwege als die Wege für die 3-HP-Produktion untersucht worden ( US 2013/0071893 A1 ). Da Malonyl-CoA in 3-HP durch Malonat-Reduktase und 3-HP-Dehydrogenase umgewandelt werden kann, und Glycerol zu 3-HP durch Glycerol-Dehydratase und Aldehyd-Dehydrogenase umgewandelt werden kann, war ein Verfahren zum Umwandeln von Glucose oder Glycerol in 3-HP unter Verwendung von modifizierten E. coli gut bekannt. Eine Dehydratationsreaktion von Glycerol, bei der es sich um eine Reaktion handelt, die ähnlich der Transaminierungsreaktion von Radikalen begleitet wird, erfordert im Wesentlichen Coenzym B12 zur Ausführung der Reaktion in Gegenwart von Sauerstoff.
  • Hinsichtlich der industriellen Fermentation sind der β-Alanin-Stoffwechselweg oder der Glycerol-Stoffwechselweg als Stoffwechselweg für die Erzeugung von 3-HP unter Verwendung von Hefe nicht geeignet, da es schwierig ist, ein Coenzym, wie beispielsweise Coenzym B12, als ein Material für ein Kulturmedium auf Grund seiner Kosten zu verwenden, und Bioorganismen wie Hefe das entsprechende Material nicht in Zellen biosynthetisieren oder absorbieren können. Neuerlich sind Untersuchungen zum Modifizieren der Schlüsselenzyme zur Überwindung dieses Problems veröffentlicht worden [ US 7,655,451 B2 ].
  • Malonyl-CoA wird aus Acetyl-CoA in dem Cytosol synthetisiert und kann dadurch zu 3-HP reduziert werden. In dem Fall von Bakterien wie E. coli wird in dem Cytosol aus Pyruvat Acetyl-CoA erzeugt und kann dadurch als ein Substrat des TCA-Zyklus oder anderer Stoffwechselreaktion verwendet werden. Allerdings wird, wie vorstehend beschrieben wurde, in Hefe mit unabhängigen subszellulären Kompartimenten im Allgemeinen Acetyl-CoA in den Mitochondrien synthetisiert und als ein Substrat des TCA-Zyklus verwendet, wobei Acetyl-CoA in dem Cytosol über Acetat erzeugende Reaktion erzeugt wird, die eine Nebenreaktion einer Reaktion der Ethanol-Erzeugung oder einer Reaktion des Zitronensäurekreislaufs ist. Alle Reaktionen der Erzeugung von Acetyl-CoA aus Acetat oder Citronensäure sind Reaktionen, die ATP verbrauchen, und da Hefe außerdem Energie verbraucht, um Acetyl-CoA in Cytosol gegenüber Bakterien zu erhalten, kann hinsichtlich der Energetik Hefe von Nachteil sein.
  • In Hefe sind Umgebungen, wie beispielsweise Reduktionszustand des Cytosols, Faltung nach der Proteinsynthese, Codon-Nutzung und dgl., im Vergleich zu denen in Bakterien verschieden, so dass zum Zeitpunkt des Exprimierens eines von Bakterien abgeleiteten exogenen Enzyms eine Aktivität davon nicht gezeigt werden kann oder die Aktivität signifikant herabgesetzt sein kann. Da darüber hinaus die Aktivität infolge Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff oder anderen Metallionen signifikant geändert sein kann, können selbst in dem Fall exogener Enzyme, die die gleichen Funktionen haben, Ergebnisse der Expression davon in Hefe entsprechend der Herkünften der Enzyme verschieden sein. In dem Fall von Xylose-Isomerase (XI), die ein wichtiges Enzym des Xylose-Stoffwechsels ist, war zum Zeitpunkt des Exprimierens von XI, deriviert von Bakterien in Hefe, eine Aktivität davon größtenteils signifikant niedrig, jedoch ist gezeigt worden, dass Hefe erfolgreich modifiziert wurde, um so Xylose-Stoffwechsel bei relativ hoher Aktivität durch Einführen von XI, die von anaerobem Pilz deriviert wurde, auszuführen. So sollte im Fall der Einführung eines von Bakterien oder Archaeen derivierten Stoffwechselwegs, wie beispielsweise der Malonyl-CoA-Stoffwechselweg in Hefe, ein über hohe Aktivität verfügendes Gen durch Gene gesichert werden, die die gleichen Funktionen mit unterschiedlicher Herkunft ausführen.
  • Im Zusammenhang mit einem Verfahren zum genetischen Modifizieren von Saccharomyces cerevisiae unter verschiedenen Hefestämmen zur Erzeugung von 3-HP gibt es zahlreich Veröffentlichungen und Patente, doch gibt es im Fall von Saccharomyces cerevisiae, da 3-HP über den [Pyruvinsäure → Acetaldehyd → Essigsäure → Acetyl-CoA → Malonyl-CoA → Malonat-Semialdehyd → 3-HP]-Stoffwechselweg erzeugt wird, Probleme insofern, dass dieser Stoffwechselweg zur Erzeugung von 3-HP kompliziert ist und die Produktivität von 3-HP relativ gering ist ( US 2010/0248233A1 ; Y. Chen et al., Metabolic Engineering, 22: 104–109, 2014).
  • Als Ergebnis des Versuchs zur Lösung der vorgenannten Probleme haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung, um die Nachteile von Hefe zu überwinden, wo ATP in einem Prozess zur Erlangung von Acetyl-CoA in Cytosol verbraucht wird, einen kürzeren Stoffwechselweg von [Pyruvat → Acetaldehyd – Acetyl-CoA → Malonyl-CoA → Malonat-Semialdehyd → 3-HP] gefunden, der Acetaldehyd direkt in Acetyl-CoA umwandelt, ohne ein Acetat-Zwischenprodukt zu durchlaufen, und haben bestätigt, dass in dem Fall der Verwendung einer diesen Stoffwechselweg umfassenden rekombinanten Hefe anders als im Fall der Verwendung von E. coli die Verwendung von Materialien zur pH-Werteinstellung nicht nur verringert und dadurch die Erzeugung von Salzen herabgesetzt wird, sondern 3-HP auch aus Biomasse mit einer hohen Konzentration und einer hohen Ausbeute selbst bei niedrigem pH-Wert erzeugt werden kann, womit die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Technische Aufgabe
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer einen aktiven biosynthetischen 3-HP-Stoffwechselweg von [Pyruvat → Acetaldehyd → Acetyl-CoA → Malonyl-CoA → Malonat-Semialdehyd → 3-HP] umfassende rekombinanten Hefe, der Acetaldehyd direkt und nicht über Acetat zu Acetyl-CoA umwandelt.
  • Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Herstellen von 3-HP unter Verwendung der rekombinanten Hefe.
  • Lösung der Aufgabe
  • Um die vorgenannten Ziele zu erreichen, gewährt die vorliegende Erfindung eine rekombinante Hefe, umfassend einen aktiven Stoffwechselweg zur Biosynthese von 3-HP von [Pyruvat → Acetaldehyd → Acetyl-CoA → Malonyl-CoA → Malonat-Semialdehyd → 3-HP], wobei die Hefe umfasst: ein exogenes Gen, das für AADH kodiert; ein endo- oder exogenes Gen, das für ACC kodiert; ein exogenes Gen, das für MCR kodiert, und ein exogenes Gen, das für HPDH kodiert.
  • In der vorliegenden Erfindung ist die Hefe säurebeständig und ausgewählt beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus den Genera Saccharomyces, Kazachstania und Candida. Hefe-Spezies von besonderem Interesse schliessen ein: Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua, Kazachstania bulderi und Candida humilis, wobei die Spezies auf diese allein nicht beschränkt sind.
  • Darüber hinaus gewährt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von 3-HP, umfassend: (a) Kultivieren der rekombinanten Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem Medium, das mindestens eine Kohlenstoffquelle einschließt, wodurch 3-HP erzeugt wird; und (b) Isolieren von 3-HP aus der Kultur.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt einen Stoffwechselweg zum Herstellen von 3-HP aus Glucose aus der rekombinanten Hefe der vorliegenden Erfindung (modifizierter Malonyl-CoA-Stoffwechselweg) und wichtiger Enzyme.
  • 2 zeigt ein relatives Ranking der ACC1-Aktvität von Acetyl-CoA-Carboxylase-Enzymen.
  • 3 zeigt Ergebnisse, die die relative Aktivität (links) und Expressionsstärken (SDS-PAGE) (rechts) der Archaeen-MCR-Varianten bestätigen.
  • 4 zeigt Hefe-Expressionsplasmide pSK-84 und pSK-85 für exprimierende Enzyme in Verbindung mit dem 3-HP-Stoffwechselweg.
  • 5 zeigt Ergebnisse des Testens der Kultivierungsbedingungen, die auf die Produktionsmengen von 3-HP einwirken könnten.
  • 6 zeigt 3-HP-Produktion mit einen besser etablierten 3-HP-Produktionsstamm unter Verwendung von Fed-batch(Tablet-spiking)-Bedingungen der Kultivierung.
  • Erfinderische Tätigkeit
  • Sofern nicht anders festgelegt, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleichen Bedeutungen, wie sie dem Fachmann auf dem Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, selbstverständlich sind. Im Allgemeinen ist die hierin verwendete Nomenklatur gut bekannt und wird üblicherweise auf dem Gebiet eingesetzt.
  • Im Allgemeinen wird ATP in Hefe in dem Verfahren zum Herstellen von Acetyl-CoA durch Umwandlung in AMP verbraucht, da Acetyl-CoA auf dem Stoffwechselweg von [Acetaldehyd → Acetat → Acetyl-CoA] hergestellt wird, und Acetat in Cytosol von Hefe erzeugt wird (1; Y. Chen et al., Metabolic Engineering, 22: 104–109, 2014).
  • In der vorliegenden Erfindung wird jedoch ein Stoffwechselweg konzipiert und angewendet, bei dem die Nachteile von ATP verbrauchender Hefe durch direktes Herstellen von Acetyl-CoA in Cytosol (1) aus Acetaldehyd und nicht über Acetat in dem Verfahren zum Erzeugen von Acetyl-CoA in Cytosol (1) überwunden und verbessert wurden. Als Ergebnis wurde in dem Fall der Verwendung rekombinanter Hefe der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass 3-HP in einer hohen Konzentration und einer hohen Ausbeute aus Glucose selbst bei einem niedrigen pH-Wert erzeugt wird.
  • Daher richtet sich die vorliegende Erfindung in einem Aspekt auf eine rekombinante Hefe, die einen aktiven biosynthetischen 3-HP-Stoffwechselweg von [Pyruvat → Acetaldehyd → Acetyl-CoA → Malonyl-CoA → Malonat-Semialdehyd → 3-HP] umfasst, wobei die Hefe umfasst: ein exogenes Gen, das für AADH kodiert; ein endo- oder exogenes Gen, das für ACC kodiert; ein exogenes Gen, das für MCR kodiert und ein exogenes Gen, das für HPDH kodiert.
  • Der biosynthetische 3-HP-Stoffwechselweg von [Pyruvat → Acetaldehyd → Acetyl-CoA → Malonyl-CoA → Malonat-Semialdehyd → 3-HP] ist ein Weg zum Erzeugen von 3-HP aus einer Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise Glucose usw.: (i) ”Pyruvat → Acetaldehyd” bedeutet einen Stoffwechselweg zum Erzeugen von Acetaldehyd aus Pyruvat unter Verwendung von Pyruvat-Decarboxylase (PDC) ohne Erzeugung eines Zwischenprodukts; (ii) ”Acetaldehyd → Acetyl-CoA” bedeutet einen Stoffwechselweg zum Erzeugen von Acetyl-CoA aus Acetaldehyd unter Verwendung von acetylierender Acetaldehyd-Dehydrogenase (AADH) ohne Erzeugung eines Zwischenprodukts, wie beispielsweise Acetat; (iii) ”Acetyl-CoA → Malonyl-CoA” bedeutet einen Stoffwechselweg zum Erzeugen von Malonyl-CoA aus Acetyl-CoA unter Verwendung von Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) ohne Erzeugung eines Zwischenprodukts; (iv) ”Malonyl-CoA → 3-HP” oder ”Malonyl-CoA → Malonat-Semialdehyd → 3-HP” bedeutet einen Stoffwechselweg zum Erzeugen von 3-HP aus Malonyl-CoA unter Verwendung von bifunktionaler Malonyl-CoA-Reduktase (MCR) ohne Erzeugung eines Zwischenprodukts oder einen Stoffwechselweg zum Erzeugen von 3-HP aus Malonat-Semialdehyd durch Biosynthese von Malonat-Semialdehyd unter Verwendung von monofunktionaler Malonyl-CoA-Reduktase (1).
  • In der vorliegenden Erfindung ist das PDC-Gen keinem Engineering unterzogen, wobei jedoch ein Engineering des PDC-Gens zu Erhöhung der 3-HP-Produktionsrate, beispielsweise durch Amplifizieren des in der Hefe vorhandenen PDC-Gens vorgenommen werden kann, indem auf dem Gebiet der wohl bekannte Stand der Technik angewendet wird.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Stoffwechselwegenzyme kodierende Gene, die über eine spezifische Funktion verfügen, extrahiert durch Bioinformatik-Genom Mining von Stoffwechselenzym-Kandidaten.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ein für AADH kodierendes exogenes Gen. In einer Ausführungsform ist das für AADH kodierende Gen eine für AADH kodierende Aminosäuresequenz mit mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer AADH-Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die nachfolgend in den Tabellen 1 bis 3 dargestellt sind, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, solange sie über eine Funktion der Biosynthese von Acetyl-CoA aus Acetaldehyd verfügen. [Tabelle 1] AADH (Typ adhE)
    Gen GenBank Accession-Nr. (Aminosäuresequenzen) GI-Nr. Organismus Abkürzung
    adhE NP_415757.1 16129202 Escherichia coli K-12 substr. MG1655 ADHEec
    adhE AY282576.1 33578054 Piromyces sp. E2 ADHEpm
    adhE NP_370672.1 15923138 Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 ADHEsa
    P343_14875 EST10864.1 558501608 Sporolactobacillus laevolacticus DSM 442 ADHEsl
    UCRPA7_2908 EOO01596.1 500258690 Togninia minima UCRPA7 ADHEtm
    WP_020582522 522071313 Endozoicomonas elysicola ADHEee
    RW1_006_000 90 GAF43117.1 589262551 Rhodococcus wratislaviensis NBRC 100605 ADHErw
    [Tabelle 2] AADH (Typ eutE)
    Gen GenBank Accession-Nr. (Aminosäuresequenzen) GI-Nr. Organismus Abkürzung
    eutE YP_001459232. 1 157161914 Escherichia coli HS EUTEec
    YP_003003316. 1 251788595 Dickeya zeae Ech1591 EUTEdz
    NP_470466.1 16800198 Listeria innocua Clip11262 LIN1129li
    C790_00285 EMP53767.1 468911480 Morganella morganii SC01 AADHmm
    C666_02610 ENO90114.1 479302014 Thauera linaloolentis DSM 12138 AADHtl
    WP_018205006. 1 516997301 Atribacteria bacterium SCGC AAA252-M02 AADHab
    Maqu_1235 ABM18325.1 120324010 Marinobacter aquaeolei VT8 AADHmal
    CLS_23700 CBK777783.1 295091676 Clostridium cf. saccharolyticum K10 AADHcs
    Plabr_4078 ADY61655.1 324970877 Planctomyces brasiliensis DSM 5305 AADHbp
    GCWU000342_00 651 EEP29295.1 229793181 Shuttleworthia satelles DSM 14600 AADHss
    Tola_1697 ACQ93307.1 237500714 Tolumonas auensis DSM9187 AADHta
    HMPREF9024_01 049 EFA26759.1 270280925 Pediococcus acidilactici 7_4 AADHpa
    BN552_01640 CDB76812.1 524431109 Blautia sp. CAG:237 AADHbs
    HMPREF0179_00 640 EFV45545.1 316924378 Bilophila wadsworthia 3_1_6 AADHbw
    Mahau 0819 AEE96017.1 332699076 Mahella australiensis 50-1 BON AADHma2
    ALO_06783 EG064744.1 337276312 Acetonema longum DSM 6540 AADHal
    HMPREF9200_06 41 EGS34769.1 341591638 Veillonella sp. oral taxon 780 str. F0422 AADHvso
    VEJY3 08440 AFX22176.1 369841032 Vibrio sp. EJY3 AADHvs
    OpiT1DRAFT_04 559 EIQ00023.1 391221602 Opitutaceae bacterium TAV1 AADHob
    HSACCH_00271 CCU77919.1 460789193 Halanaerobium saccharolyticum DSM 6643 AADHhs
    Hoch_5813 ACY18289.1 262082320 Haliangium ochraceuni DSM 14365 AADHho
    [Tabelle 3] AADH
    Gen GenBank Accession-Nr. (Aminosäuresequenzen) GI-Nr. Organismus Abkürzung
    sucD EEN82978.1 229317069 Porphyromonas endodontalis ATCC 35406 AADHpe
    AZOBR_p48004 5 CCD03730.1 356882712 Azospirillum brasilense Sp245 AADHabr
    HMPREF1987_0 1259 ERJ82808.1 543978929 Peptostreptococcaceae bacterium 113 str. W5053 AADHpba
    Terro 0974 AFL87295.1 390411791 Terriglobus roseus DSM 18391 AADHtr
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ein Gen, das ACC kodiert. In einer Ausführungsform ist das Gen, das ACC kodiert, eine Nukleinsäure, die ACC kodiert, mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer ACC-Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in nachstehender Tabelle 4 dargestellt sind, aber nicht darauf beschränkt ist, sofern sie die Funktion der Biosynthese von Malonyl-CoA aus Acetyl-CoA hat. [Tabelle 4] ACC (eukaryotischer Multidomänentyp)
    Gen GenBank Accession-Nr. (Aminosäuresequenzen) GI-Nr. Organismus Abkürzung
    ACC1 CAA96294.1 1302498 Saccharomyces cerevisiae S288c ACC1sc
    YALI0C11407g XP_501721.1 50548503 Yarrowia lipolytica CLIB122 ACC1yl
    HMPREF1544_10 598 EPB82652.1 511001160 Mucor circinelloidesf. circinelloides 1006PhL ACC1mc
    ACC1ke Kazachstania exigua ACC1ke
    ACC1ch Candida humilis ACC1ch
    CGB_F3610C XP_003194770. 1 321260100 Cryptococcus gattii WM276 ACC1cg
    AGABIIDRAFT_ 70405 EKM81867.1 409081508 Agaricus bisporus var. burnettii JB137-58 ACC1ab
    BATDEDRAFT18 673 EGF84402.1 328774365 Batrachochytrium dendrobatidis JAM81 ACC1bd
    RHTO_02004 EMS21133.1 472583500 Rhodosporidium toruloides NP11 ACC1rt
    PITG_18706 EEY68805.1 262110753 Phytophthora infestans F30-4 ACC1pi
    TCM_034957 XP_007018852. 1 590598290 Theobroma cacao ACC1tc
    Ot01g03240 CAL50235.1 116000555 Ostreococcus tauri ACC1ot
    NGATSA_3002800 AFJ69228.1 387219039 Nannochloropsis gaditana CCMP526 ACC1ng
    accA EA-L63219.1 60465120 Dictyostelium discoideum AX4 ACC1dd
    LOC101893358 XP_005182000. 1 557764587 Musca domestica ACC1md
    ACACA ABX09993.1 159895418 Sus scrofa ACC1ss
    Uniprot: H2YM65 Ciona savignyi ACC1es
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ein Gen, das MCR kodiert. In einer Ausführungsform kann eine MCR dahingehend bifunktional sein, dass sie eine Funktion der Umwandlung von Malonyl-CoA zu Malonatsemialdehyd und eine Funktion der Umwandlung von Malonatsemialdehyd zu 3-HP hat; oder dahingehend monofunktional, dass sie eine Funktion der Umwandlung von Malonyl-CoA zu Malonatsemialdehyd hat.
  • In der vorliegenden Erfindung ist das Gen, das die bifunktionale MCR kodiert, eine Nukleinsäure, die MCR kodiert, mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer MCR-Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in nachstehender Tabelle 5 dargestellt sind, aber nicht darauf beschränkt ist, sofern sie gleichzeitig die Funktion der Umwandlung von Malonyl-CoA zu Malonatsemialdehyd und die Funktion der Umwandlung von Malonatsemialdehyd zu 3-HP hat. [Tabelle 5] MCR (bifunktionaler Typ)
    Gen GenBank Accession-Nr. (Aminosäuresequenzen) GI-Nr: Organismus Abkürzung
    mcr AAS20429.1 42561982 Chloroflexus aurantiacus MCRca
    Cagg_1256 ACL24164.1 219542426 Chloroflexus aggregans DSM 9485 MCRcag
    OSCT_0547 EF081531.1 308227877 Oscillochloris trichoides DG-6 MCRot
    Rcas_2929 ABU58991.1 156234208 Roseiflexus castenholzii DSM 13941 MCRrc
    OMB55_00007 690 EHQ57048.1 374302864 gamma proteobacterium HIMB55 MCRgp
    Cabther_B0159 AEP13163.1 347588634 Chloracidobacterium thermophilum B MCRct
    WP_022680613. 1 550932202 Sandarakinorhabdus limnophila MCRsl
    WP_023839102. 1 564013708 Blastomonas sp. CACIA14H2 MCRbs
  • In einer anderen Ausführungsform kann das MCR-Gen monofunktional mit der Funktion der Umwandlung von Malonyl-CoA zu Malonatsemialdehyd sein, ein Gen, das ein Enzym kodiert, das Malonatsemialdehyd zu 3-HP umwandelt, kann weiter eingeschlossen sein.
  • In der vorliegenden Erfindung ist das Gen, das monofunktionale MCR kodiert, eine Nukleinsäure, die MCR kodiert, mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer MCR-Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in nachstehender Tabelle 6 dargestellt sind, aber nicht darauf beschränkt ist, sofern sie die Funktion der Umwandlung von Malonyl-CoA zu Malonatsemialdehyd hat. [Tabelle 6] MCR
    Gen GenBank Accession-Nr. (Aminosäuresequenzen) GI-Nr. Organismus Abkürzung
    Msed_0709 ABP94884.1 145701742 Metallosphaera sedula DSM 5348 MCRms
    mcr/scr BAB67276.1 15623288 Sulfolobus tokodaii DSM 16993 MCRst
    WP_020198954. 1 519043079 Sulfolobales archaeon Acd1 MCRsa1
    SacRon12I_1178 0 AGE74568.1 449039143 Sulfolobus acidocaldarius Ron12/I MCRsa2
    SacRon12I_1070 5 AGE74357.1 449038932 Sulfolobus acidocaldarius Ron12/I MCRsa3
    BAJ50751.1 343485097 Candidatus Caldiarchaeum subterraneum MCRcc
    MetMK1_000284 80 EHP68415.1 373523495 Metallosphaera yellowstonensis MK1 MCRmy
    TREAZ_1307 AEF80380.1 333734431 Treponema azotonutricium ZAS-9 MCRta
  • In der vorliegenden Erfindung ist das Gen, das ein Enzym kodiert, das Malonatsemialdehyd zu 3-HP umwandeln kann, eine Nukleinsäure, die ein Enzym kodiert, mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer HPDH-, HIBADH-, HBDH- oder BDH-Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in den nachstehenden Tabellen 7–10 dargestellt sind, aber nicht darauf beschränkt ist, sofern das Gen, das das Protein kodiert, die Funktion der Biosynthese von 3-HP aus Malonatsemialdehyd hat.
  • Die in nachstehender Tabelle 7 dargestellten HPDH-Aminosäuresequenzen, in nachstehender Tabelle 8 dargestellten HIBADH-Aminosäuresequenzen, in nachstehender Tabelle 9 dargestellten HBDH-Aminosäuresequenzen und in nachstehender Tabelle 10 dargestellten BDH-Aminosäuresequenzen sind Aminosäuresequenzen eines Proteins, das die Funktion der Biosynthese von 3-HP aus Malonatsemialdehyd hat. [Tabelle 7] HPDH
    Gen GenBank Accession-Nr. (Aminosäuresequenzen) GI-Nr. Organismus Abkürzung
    EC3431_0375 EFV00080.1 315619553 Escherichia coli 3431 HPDHec
    YMR226C DAA10125.1 285814230 Saccharomyces cerevisiae S288c HPDHsc
    Msed 1993 ABP96133.1 145702991 Metallosphaera sedula DSM 5348 HPDHms
    STK 15070 BAK54608.1 342306519 Sulfolobus tokodaii str. 7 HPDHst
    BWG 0862 ACR64730.1 238862732 Escherichia coli BW2952 HPDHecb
    ATEG_09041 XP_001217663. 1 115436862 Aspergillus terreus NIH2624 HPDHat
    YP_902607.1 118581357 Pelobacter propionicus DSM2379 HPDHpp
    Snov_0928 YP_003692871. 1 298290932 Starkeya novella DSM506 HPDHsn
    YP_004145243. 1 319785768 Pseudoxanthomonas suwonensis 11-1 HPDHps
    WP_002641751. 1 488717875 Simonsiella mueller HPDHsm
    WP_006802623. 1 493855747 Helicobacter winghamensis HPDHhw
    WP_007116408. 1 494180330 Enhydrobacter aerosaccus HPDHea
    WP_018365922. 1 517177104 Streptococcus didelphis HPDHsd
    WP_019460509. 1 518290301 Roseomonas sp. B5 HPDHrs
    YDF1 EAZ63492.1 126213385 Pichia stipitis CBS 6054 HPDHpst
    KAFR0B0336 0 CCF56633.1 372462351 Kazachstania africana CBS 2517 HPDHka
    ydfG EGC72291.1 325160162 Haemophilus parainfluenzae ATCC 33392 HPDHhp
    K788_004913 ETY79751.1 575860535 Burkholderia caribensis MBA4 HPDHbc
    AMED_69 ADJ48621.1 299798246 Amycolatopsis mediterranei U32 HPDHam
    CFU_3402 AEK63226.1 340553851 Collimonas fungivorans Ter331 HPDHcf
    Rahaq2_2300 AEX52155.1 371588425 Rahnella aquatilis ATCC 33071 HPDHra
    LS215_1598 ACP35603.1 227456916 Sulfolobus islandicus L.S.2.15 HPDHsi
    WP_003467297. 1 489562770 Xanthomonas translucens HPDHxt
    WP_007747336. 1 495021561 Cronobacter dublinensis HPDHcd
    WP_021506918. 1 545151592 Pantoea dispersa HPDHpd
    EHT00469.1 376387763 Klebsiella oxytoca 10-5245 HPDHko
    ESM32057.1 555088912 Enterobacter cloacae BWH 31 HPDHec1
    [Tabelle 8] HIBADH
    Gen GenBank Accession-Nr. (Aminosäuresequenzen) GI-Nr. Organismus Abkürzung
    mmsB ADR61938.1 313500572 Pseudomonas putida BIRD-1 HIBADHpp
    PA3569 AAG06957.1 9949723 Pseudomonas aeruginosa PAO1 HIBADHpa
    BC_4042 AAP10961.1 29897686 Bacillus cereus ATCC 14579 HIBADHbc
    QWA_01835 EJC65559.1 393165510 Alcaligenes faecalis NCIB 8687 HIBADHaf
    11420577.1 327223309 Lytechinus variegatus HIBADHlv
    GAXL0100717 2.1 596424618 Chyphotes mellipes HBADHcm
    POPTR_0001 s46990g XP_002300566. 1 224061611 Populus trichocarpa HIBADHpt
    WP_007234036. 1 494440757 marine gantma proteobacterium HTCC2080 HIBADHmgp
    WP_009244364. 1 496538096 Clostridiales sp. HIBADHcs
    WP_017931623. 1 516543998 Robiginitomaculum antarcticum HIBADHra
    WP_018914915. 1 517744707 Thiomonas sp. FB-6 HIBADHts
    WP_022530055. 1 548582704 Lactobacillus shenzhenensis HIBADHls
    ABAZ39_230 55 EZQ03930.1 612167293 Azospirillum brasilense HIBADHab
    EMI09340.1 460132162 Anoxybacillus sp. DT3-1 HIBADHas
    T458 21320 EST53365.1 558617142 Brevibacillus panacihumi W25 HIBADHbp
    xcc-b100 3039 CAP52402.1 167734194 Xanthomonas campestris pv. campestris HIBADHxc
    Bcenmc03_34 79 ACA92632.1 169818050 Burkholderia cenocepacia MC0-3 HIBADHbcm
    Hoch 3369 ACY15871.1 262079902 Haliangium ochraceum DSM 14365 HIBADHho
    mmsB ADP96674.1 311693801 Marinobacter adhaerens HP15 HIBADHma
    ivdF AAN54737.1 24347484 Shewanella oneidensis MR-1 HIBADHso
    [Tabelle 9] HBDH
    Gen GenBank Accession-Nr. (Aminosäuresequenzen) GI-Nr. Organismus Abkürzung
    gbd AAC41425.1 695279 Cupriavidus necator HBDHcn
    4hbD EDK35022.1 146348486 Clostridium kluyveri DSM555 HBDHck
    GOS_1589287 EDB80735.1 142959799 marine metagenome sp. HBDHmm
    HMPREF008 0_00276 EHM43401.1 364565684 Anaeroglobus geminatus F0357 HBDHag
    BN605_01179 CDD07748.1 524585315 Dorea sp. CAG: 317 HBDHds
    BN791_01127 CDE92329.1 524795667 Fusobacterium sp. CAG:815 HBDHfs
    Odosp_2059 ADY33063.1 324312510 Odoribacter splanchnicus DSM 220712 HBDHos
    Bpro_2526 ABE44443.1 91697614 Polaromonas sp. 75666 HBDHps
    Csal_1756 ABF59108.1 91796969 Chromohalobacter salexigens DSM 3043 HBDHcs
    BRPE64_DC DS02300 BAN27166.1 506947049 Burkholderia sp. RPE64 HBDHbs
    [Tabelle 10] BDH
    Gen GenBank Accession-Nr. (Aminosäuresequenzen) GI-Nr. Organismus Abkürzung
    bdhA GAA1755SSSS7.1 346057674 Pseudomonas aeruginosa NCMG1179 BDHpa
    Bresu2563 YP_003819493. 1 302383670 Brevundimonas subvibrioides ATCC 15264 BDHbs
    YP_004110707. 1 316935725 Rhodopseudomonas palustris DX-1 BDHrp
    WP_008960707. 1 496247322 Bradyrhizobium sp. STM 3809 BDHbss
    WP_009158463. 1 496449618 Thalassobium sp. R2A62 BDHts
    WP_010548788. 1 498234632 gamma proteobacterium HIMB30 BDHgp
    WP_018183273. 1 516955964 Kaistia granuli BDHkg
    h1_A1334 CAJ92474.1 113526129 Ralstonia eutropha H16 BDHre
    bdhA EOY63580.1 509564889 Klebsiella pneumoniae KP-7 BDHkp
    AZOBR_p1 40023 CCD00057.1 356879155 Azospirillum brasilense Sp245 BDHab
    bdhA ABF07432.1 93353343 Cupriavidus metallidurans CH34 BDHcm
  • In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die rekombinante Hefe, die einen aktiven Stoffwechselweg zur Biosynthese von 3-HP umfasst, die in Tabelle 11 aufgeführten Gene aufweisen, wie ein exogenes Gen, das AADH kodiert, mit einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 74 bis SEQ ID NO: 98, ein endogenes oder exogenes Gen, das ACC kodiert, mit einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 99 bis SEQ ID NO: 106, ein exogenes Gen, das MCR kodiert, mit einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 107 bis SEQ ID NO: 116, und ein exogenes Gen, das HPDH kodiert, mit einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 117 bis SEQ ID NO: 144. [Tabelle 11]
    Typ Abkürzung des Gens SEQ ID NR.
    AADHs AADHab SEQ ID NO:74
    AADHal SEQ ID NO:75
    AADHbs SEQ ID NO:76
    AADHbw SEQ ID NO:77
    AADHcs SEQ ID NO:78
    AADHho SEQ ID NO:79
    AADHhs SEQ ID NO:80
    AADHma1 SEQ ID NO:81
    AADHma2 SEQ ID NO:82
    AADHmm SEQ ID NO:83
    AADHpa SEQ ID NO:84
    AADHpb SEQ ID NO:85
    AADHpe SEQ ID NO:86
    AADHrw SEQ ID NO:87
    AADHsl SEQ ID NO:88
    AADHss SEQ ID NO:89
    AADHta SEQ ID NO:90
    AADHtl SEQ ID NO:91
    AADHtm SEQ ID NO:92
    AADHvs SEQ ID NO:93
    ADHEec SEQ ID NO:94
    AHEpm SEQ ID NO:95
    EUTEdz SEQ ID NO:96
    EUTEec SEQ ID NO:97
    LIN1129li SEQ ID NO:98
    ACC1s ACC1sc_S659A SEQ ID NO:99
    ACC1sc_S659A/S1157A SEQ ID NO:100
    ACC1sc_S1157A SEQ ID NO:101
    ACC1ke SEQ ID NO:102
    ACC1mc SEQ ID NO:103
    ACC1sc SEQ ID NO:104
    ACCyl SEQ ID NO:105
    ACC1ch SEQ ID NO:106
    bifunktionale HPDH-MCRs HPDH-MCRbs SEQ ID NO:107
    HPDH-MCRca SEQ ID NO:108
    HPDH-MCRcag SEQ ID NO:109
    HPDH-MCRct SEQ ID NO:110
    HPDH-MCRgb SEQ ID NO:111
    HPDH-MCRot SEQ ID NO:112
    HPDH-MCRrc SEQ ID NO:113
    HPDH-MCRsl SEQ ID NO:114
    HPDH-MCRca_variant_3 SEQ ID NO:115
    HPDH-MCRca_variant_6 SEQ ID NO:116
    HPDHs BDHcm SEQ ID NO:117
    BDHkp SEQ ID NO:118
    HBDHos SEQ ID NO:119
    HBDHps SEQ ID NO:120
    HIBADHas SEQ ID NO:121
    HIBADHbc SEQ ID NO:122
    HIBADHma SEQ ID NO:123
    HIBADHpa SEQ ID NO:124
    HIBADHxc SEQ ID NO:125
    HPDHam SEQ ID NO:126
    HPDHbs SEQ ID NO:127
    HPDHca SEQ ID NO:128
    HPDHcag SEQ ID NO:129
    HPDHct SEQ ID NO:130
    HPDHec SEQ ID NO:131
    HPDHed SEQ ID NO:132
    HPDHgb SEQ ID NO:133
    HPDHhw SEQ ID NO:134
    HPDHka SEQ ID NO:135
    HPDHms SEQ ID NO:136
    HPDHot SEQ ID NO:137
    HPDHps SEQ ID NO:138
    HPDHra SEQ ID NO:139
    HPDHrc SEQ ID NO:140
    HPDHsi SEQ ID NO:141
    HPDHsl SEQ ID NO:142
    HPDHsm SEQ ID NO:143
    HPDHst SEQ ID NO:144
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Hefe säurebeständig sein, und die säurebeständige Hefe kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus beispielsweise den Gattungen Saccharomyces, Kazachstania und Candida. Hefespezies von besonderem Interesse umfassen Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua, Kazachstania bulderi und Candida humilis, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die rekombinante Hefe säurebeständig sein, und um die säurebeständige rekombinante Hefe herzustellen, wird vorzugsweise ein Hefewirt verwendet, der Säureresistenz gegen eine organische Säure (insbesondere 3-HP und/oder eine organische Säure, die als Nebenprodukt bei der Herstellung von 3-HP gebildet wird) aufweist.
  • Die säurebeständige Hefe kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua, Kazachstania bulderi und Candida humilis, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Der in der Patentschrift verwendete Begriff ”säurebeständige Hefe” bezieht sich auf Hefe, die Säureresistenz gegen organische Säuren wie 3-HP oder dergleichen aufweist, und die Säureresistenz kann durch Bestätigung des Wachstums in einem Medium, das verschiedene Konzentrationen an organischer Säure enthält, bewertet werden. In diesem Fall kann ”säurebeständige Hefe” Hefe sein, die eine hohe Wachstumsrate und Biomasseverbrauchsrate bei Züchtung in einem Medium mit hohen Konzentrationen an organischer Säure, im Vergleich zu gewöhnlicher Hefe, aufweist.
  • Säurebeständige Hefe, gemäß der vorliegenden Erfindung, kann Hefe sein, die mindestens 10% der Glucoseverbrauchsrate (oder dergleichen) oder mindestens 10% der spezifischen Wachstumsrate in dem Medium, das über 1 M oder mehr organische Säure (insbesondere 3-HP) enthält, unter einem pH-Wert, der kleiner als der pKa-Wert der organischen Säure (insbesondere 3-HP) ist, im Vergleich zu Hefe, die in dem Medium gewachsen ist, das keine organische Säure enthält, aufrechterhalten kann. Säurebeständige Hefe, gemäß der vorliegenden Erfindung, kann Hefe sein, die mindestens 10% der Glucoseverbrauchsrate (oder dergleichen) oder mindestens 10% der spezifischen Wachstumsrate unter pH 2–4, im Vergleich zu pH 7, aufrechterhalten kann.
  • Der erfindungsgemäße gentechnisch veränderte Mikroorganismus kann durch Einführen eines Gens in ein Chromosom eines Mikroorganismus oder Einbringen eines modifizierten Vektors in einen Mikroorganismus hergestellt werden.
  • Ein Wirt, wo die Effizienz des Einbringens von DNA hoch ist und die Effizienz der Expression eingebrachter DNA hoch ist, wird im Allgemeinen als der veränderte Mikroorganismus verwendet, und in einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird Hefe verwendet, aber nicht beschränkt darauf, kann jede Art von Mikroorganismus verwendet werden, sofern die anvisierte DNA ausreichend exprimiert wird.
  • Der veränderte Mikroorganismus kann durch ein Transformationsverfahren hergestellt werden. ”Transformation” bedeutet das Einbringen von DNA in einen Wirt; dadurch kann DNA, als Faktor eines Chromosoms oder durch Einfügen in ein Chromosom, vervielfältigt werden, was ein Phänomen ist, das eine genetische Veränderung künstlich bewirkt. Bei üblichen Transformationsverfahren gibt es Elektroporation, Essigsäure-Lithium-PEG-Verfahren und dergleichen.
  • Außerdem kann, in der vorliegenden Erfindung, ein allgemein bekanntes gentechnisches Verfahren als Verfahren zum Einbringen eines Gens in ein Chromosom eines Wirtsmikroorganismus verwendet werden, und beispielsweise, gibt es ein Verfahren, das Retrovirus-Vektor, Adenovirus-Vektor, Adeno-assoziiertes Virus als Vektor, Herpes-simplex-Virus-Vektor, Pockenvirus-Vektor, Lentivirus-Vektor, nichtviralen Vektor usw. nutzt. ”Vektor” bedeutet ein DNA-Konstrukt mit einer DNA-Sequenz, die mit einer geeigneten Kontrollsequenz funktionsfähig zu verknüpfen ist, das DNA in einen Wirt exprimieren kann, ist. Ein Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder nur eine latente Genom-Einfügung sein. Wenn ein Vektor in einen geeigneten Wirt transformiert wird, kann er unabhängig von einem Wirtsgenom vervielfältigt werden oder funktionieren, oder in einigen Fällen, kann er in ein Genom selbst integriert werden. Ein Plasmid ist der Typ, der am meisten als Vektor verwendet wird.
  • Ein typischer Plasmid-Vektor, der für die Aufgabe verwendet werden kann, hat eine Struktur, umfassend (a) einen Replikationsstartpunkt, der ermöglicht, dass eine Replikation effektiv durchgeführt wird, damit Plasmid-Vektoren pro Wirtszelle enthalten sind, (b) ein antibiotikaresistentes Gen oder ein auxotrophes Markergen, das ermöglicht, dass eine mit einem Plasmid-Vektor transformierte Wirtszelle ausgewählt wird, und (c) eine Restriktionsstelle eines Restriktionsenzyms, die mit einem Fremd-DNA-Fragment eingeführt werden kann. Selbst wenn keine geeignete Restriktionsstelle eines Restriktionsenzyms vorhanden ist, können ein Vektor und Fremd-DNA leicht ligiert werden, wenn der Linker oder der synthetische Oligonukleotid-Adapter gemäß einem allgemeinen Verfahren verwendet wird.
  • Eine Nukleinsäure ist ”funktionsfähig verknüpft”, wenn sie mit einer funktionalen Beziehung zu anderen Nukleinsäuresequenzen angeordnet ist. Es können eine Gen- und Kontrollsequenz(en) sein, die in einem Prozess verknüpft sind, der die Genexpression ermöglicht, wenn ein geeignetes Molekül (zum Beispiel ein transkriptionsaktivierendes Protein) mit der/den Kontrollsequenz(en) verknüpft ist. Beispielsweise ist die DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader mit der DNA für ein Polypeptid funktionsfähig verknüpft, wenn ein an der Sekretion eines Polypeptids beteiligtes Präprotein exprimiert wird; ist ein Promotor oder ein Verstärker mit einer Kodierungssequenz funktionsfähig verknüpft, wenn die Transkription einer Sequenz beeinflusst wird; ist eine Ribosomenbindungsdomäne mit einer Kodierungssequenz funktionsfähig verknüpft, wenn die Transkription einer Sequenz beeinflusst wird; oder ist eine Ribosomenbindungsdomäne mit einer Kodierungssequenz funktionsfähig verknüpft, wenn sie so angeordnet ist, dass sie leicht translatiert werden kann.
  • Allgemein bezieht sich ”funktionsfähig verknüpft” auf einen Kontakt einer verknüpften DNA-Sequenz, oder darauf, dass ein Kontakt zu dem Sekretionsleader hergestellt und dieser in dem Leitrahmen dargestellt wird. Jedoch ist der Verstärker zum Herstellen des Kontakts nicht erforderlich. Die Verknüpfung der Verstärkersequenz wird durch Ligierung an einer geeigneten Restriktionsenzymstelle vollzogen. Wenn die Domäne nicht dargestellt ist, wird ein synthetischer Oligonukleotid-Adapter oder Oligonukleotid-Linker gemäß einem allgemeinen Verfahren verwendet.
  • Es versteht sich selbstverständlich, dass all die Vektoren nicht in gleichem Maße wirken, um die DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Ebenso wirken all die Wirtszellen bei dem gleichen Expressionssystem nicht in gleichem Maße. Der Fachmann wird jedoch einen Vektor, eine Expressionskontrollsequenz und eine Wirtszelle entsprechend auswählen, ohne vom Rahmen der vorliegenden Erfindung abzuweichen und ohne übermäßiges Experimentieren. Beispielsweise muss bei der Auswahl eines Vektors eine Wirtszelle in Betracht gezogen werden. Das ist so, weil der Vektor darin repliziert werden soll. Auch die Replikationszahl und das Vermögen, die Anzahl der Replikationen eines Vektors und die Expression von anderen Proteinen, die durch den Vektor kodiert werden, zum Beispiel Antibiotika-Marker, zu steuern, sollten berücksichtigt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von 3-HP gerichtet, umfassend: (a) Kultivieren der rekombinanten Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem Medium, das mindestens eine Kohlenstoffquelle umfasst, wodurch 3-HP produziert wird; und (b) Isolieren von 3-HP aus der Kultur.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Kohlenstoffquelle eine oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Xylose, Arabinose, Saccharose, Fructose, Galactose, Cellulose, Glucoseoligomeren und Glycerin, sein, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • In der vorliegenden Erfindung wird das Kultivieren vorzugsweise unter einer Bedingung, dass Mikroorganismen wie E. coli nicht mehr aktiv sind (z. B. Metabolitbildung usw.), durchgeführt. In einer Ausführungsform wird das Kultivieren bei einem pH-Wert von 1,0 bis 6,5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 1,0 bis 6,0, stärker bevorzugt bei einem pH-Wert von 2,6 bis 4,0, durchgeführt, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Art der Erfindung
  • Nachstehend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben. Jedoch werden die folgenden Beispiele als Beispiel, um Beschreibung und Umfang des technischen Wesens der vorliegenden Erfindung einfach zu erklären, bereitgestellt. Dementsprechend wird der Umfang der. vorliegenden Erfindung nicht dadurch beschränkt oder davon geändert. Außerdem können verschiedene Modifizierungen und Veränderungen durch den Fachmann, den die vorliegende Erfindung betrifft, ausgehend von dieser Beschreibung vorgenommen werden.
  • Beispiel 1: Auswahl von Wirtshefestämmen anhand der Toleranz gegenüber 3-HP
  • Ein wesentliches Merkmal eines 3-HP-Produktionsorganismus ist die gute Toleranz gegenüber hohen Konzentrationen an 3-HP, was die Produktakkumulation während der Fermentation bei minimalem Verlust der Leistungsfähigkeit des Stamms ermöglicht. Eine umfangreiche, vielfältige Reihe von 718 Wildtyp-Hefestämmen wurde gescreent, um jene Stämme zu identifizieren, die hohe Konzentrationen an 3-HP bei niedrigem pH-Wert tolerieren können und die unter diesen Bedingungen wachsen und Glucose verstoffwechseln können (Tabelle 12).
  • Eine Reihe von Wachstumsassays auf Basis von Agarplatten und Mikrotiterplatten mit flüssigem Medium wurde zunächst genutzt, um die gesamte Reihe von Stämmen auf Säuretoleranz zu screenen. Danach wurde eine Teilmenge der Stämme auf ihre Fähigkeit zum Tolerieren von hohen Mengen an 3-HP bei niedrigem pH-Wert in Kultivierungen im Schüttelkolben bewertet. Isoliert ist keines dieser Screening-Verfahren ein perfekter Indikator für die 3-HP-Toleranz in einem industriellen Umfeld, doch eine Kombination von vielen Verfahren bietet einen umfassenden und stabilen Weg zur Ermittlung aussichtsreicher 3-HP produzierender Hefestämme.
  • Zunächst wurde das Wachstum der 718 Hefestämme an festem YPD-Agar-Medium bewertet, das variierende Mengen an 3-HP enthielt: 0 g/L 3-HP (pH 6,62), 50 g/L 3-HP (pH 3,44), 75 g/L 3-HP (pH 3,28), 100 g/L 3-HP (pH 3,17) und 125 g/L 3-HP (pH 3,08). Die Stämme wurden dann anhand ihrer Fähigkeit, die variierenden Mengen an 3-HP zu tolerieren, in diesem Screening-Verfahren bepunktet.
  • Das Wachstum der 718 Hefestämme wurde anschließend in Abwesenheit (SCD-Medium, 0 g/L 3-HP, pH 6,0) oder Gegenwart (SCD-Medium, 70 g/L 3-HP, pH 3,5) von 3-HP in Mikrotiterplatten-Flüssigkulturen unter Verwendung von Bioscreen-C-Geräten, die automatisch inkubieren, schütteln und die Trübung der Kulturen messen können, bewertet. Vorhandene Software zur Modellierung von Kurven des mikrobiellen Wachstums wurde dann eingerichtet, um die Verzögerungsphase, die maximale Wachstumsrate und die Endzelldichte für jeden Stamm bei allen Versuchsbedingungen zu ermitteln. Für dieses Screening-Verfahren wurde jeder Stamm anhand seiner maximalen Wachstumsrate in Abwesenheit von 3-HP, seiner maximalen Wachstumsrate in Gegenwart von 3-HP und der relativen Differenz zwischen diesen beiden Werten der maximalen Wachstumsrate bepunktet.
  • Unter Verwendung eines Liquid-Handling-Roboters wurden die Wachstumsund Glucoseverbrauchsrate der 718 Hefestämme in flüssigem YPD-Medium mit 85 g/L 3-HP (pH 3,5) in Mikrotiterplatten bewertet. Ein automatisierter Ablauf wurde genutzt, um Wachstumsplatten zu inokulieren, Proben für die OD-Messung zu festgelegten Zeitpunkten zu verdünnen und zu zentrifugieren und Überstände für die HPLC-Analyse zu sammeln, die angewendet wurde, um die Restglucosemengen zu festgelegten Zeitpunkten zu messen. Im Gegensatz zu den Bioscreen-C-Wachstumsassays ermöglichte der Roboter-Mikrotiterplatten-Wachstumsassay, dass eine stärkere Belüftung und höhere maximale Zelldichten erreicht wurden, und ermöglichte auch, Glucoseverbrauchsraten statt nur die Wachstumsrate wie die beiden vorangegangenen Assays zu bewerten. Für diesen Screening-Assay wurde jeder Stamm anhand seiner maximalen Zelldichte, die in Gegenwart von 3-HP erhalten wurde, und seiner Fähigkeit, Glucose in Gegenwart von 3-HP bei niedrigem pH-Wert zu verbrauchen, bepunktet.
  • Die einzelnen Punktzahlen aus den verschiedenen Assays zur Bewertung der 3-HP-Toleranz wurden gemittelt, um das Endergebnis der 3-HP-Toleranz für jeden der Stämme zu erhalten (Tabelle 12). Diese Screenings zeigten, dass die Hefespezies Candida apicola, Candida humilis, Issatchenkia orientalis, Kazachstania bulderi, Kazachstania exigua, Pichia membranifaciens, Saccharomyces cerevisiae und Yarrowia lipolytica eine gute allgemeine Toleranz gegenüber 3-HP bei niedrigem pH-Wert unter variierenden Bedingungen aufwiesen.
  • Diese acht 3-HP-toleranten Hefespezies wurden anschließend weiter untersucht auf ihre Toleranz gegenüber 3-HP bei niedrigem pH-Wert in Kultivierungen im Schüttelkolben. Für diese Kultivierungen (definiertes SCD-Medium, hohe Anfangsbiomasse, geringe Belüftung) wurde die Fähigkeit des Stamms, zu wachsen, Glucose zu verbrauchen und Ethanol zu produzieren, in Gegenwart unterschiedlicher Mengen an 3-HP bei variierenden pH-Werten bewertet: 100 g/L 3-HP (pH 4,0), 100 g/L 3-HP (pH 3,5), 100 g/L 3-HP (pH 3,0) und 80 g/L 3-HP (pH 2,6). Diese Kultivierungen im Schüttelkolben zeigten, dass bestimmte C. humilis-, K. bulderi-, K exigua- und S. cerevisiae-Hefestämme eine sehr stabile Toleranz gegenüber hohen Mengen an 3-HP bei niedrigem pH-Wert aufweisen, da sie von den verschiedenen Hefestämmen die höchsten Glucoseverbrauchsraten, Biomassseproduktionsraten und Ethanolproduktionsraten unter diesen harschen Bedingungen hatten. Demgegenüber waren C. apicola-, I. orientalis-, P. membranifaciens- und Y. lipolytica-Hefestämme nicht imstande, unter diesen sehr einschränkenden Wachstumsbedingungen zu agieren.
  • Diese detaillierten Folgeanalysen unter Verwendung verschiedener Kultivierungen im Schüttelkolben bestätigten, dass bestimmte C. humilis-, K. bulderi-, K. exigua- und S. cerevisiae-Hefestämme ein großes Potenzial als 3-HP-Produktionswirte aufweisen, da sie eine hohe natürliche Toleranz gegenüber 3-HP unter industriell relevanten Bedingungen zeigen. [Tabelle 12] Toleranz des Hefestamms gegenüber 3-HP
    Hefestamm Hefespezies Mittlere Punktzahl
    VSK-1 Saccharomyces pastorianus 1.54
    VSK-2 Saccharomyces cerevisiae 1.38
    VSK-3 Saccharomyces cerevisiae 1.03
    VSK-4 Saccharomyces cerevisiae 0.83
    VSK-5 Saccharomyces cerevisiae 1.71
    VSK-6 Saccharomyces pastorianus 1.57
    VSK-7 Saccharomyces pastorianus 3.79
    VSK-8 Saccharomyces pastorianus 0.63
    VSK-9 Saccharomyces pastorianus 1.58
    VSK-10 Saccharomyces pastorianus 0.08
    VSK-11 Saccharomyces pastorianus 1.67
    VSK-12 Saccharomyces pastorianus 1.65
    VSK-13 Saccharomyces pastorianus 1.24
    VSK-14 Saccharomyces pastorianus 1.54
    VSK-15 Saccharomyces pastorianus 1.04
    VSK-16 Saccharomyces pastorianus 1.46
    VSK-17 Saccharomyces pastorianus 1.17
    VSK-18 Saccharomyces pastorianus 1.17
    VSK-19 Saccharomyces pastorianus 1.28
    VSK-20 Saccharomyces pastorianus 1.53
    VSK-21 Saccharomyces pastorianus 0.67
    VSK-22 Saccharomyces pastorianus 0.58
    VSK-23 Saccharomyces cerevisiae 1.67
    VSK-24 Saccharomyces cerevisiae 2.13
    VSK-25 Saccharomyces pastorianus 1.97
    VSK-26 Saccharomyces pastorianus 3.89
    VSK-27 Saccharomyces pastorianus 1.44
    VSK-28 Saccharomyces pastorianus 0.61
    VSK-29 Saccharomyces pastorianus 1.44
    VSK-30 Saccharomyces pastorianus 1.64
    VSK-31 Saccharomyces pastorianus 1.25
    VSK-32 Saccharomyces pastorianus 1.49
    VSK-33 Saccharomyces pastorianus 1.78
    VSK-34 Saccharomyces pastorianus 1.36
    VSK-35 Saccharomyces pastorianus 1.36
    VSK-36 Saccharomyces pastorianus 1.39
    VSK-37 Saccharomyces pastorianus 1.47
    VSK-38 Saccharomyces cerevisiae 3.82
    VSK-39 Saccharomyces pastorianus 1.22
    VSK-40 Saccharomyces pastorianus 1.31
    VSK-41 Saccharomyces pastorianus 3.13
    VSK-42 Saccharomyces pastorianus 1.44
    VSK-43 Saccharomyces pastorianus 1.44
    VSK-44 Saccharomyces pastorianus 1.36
    VSK-45 Saccharomyces pastorianus 1.28
    VSK-46 Saccharomyces pastorianus 1.57
    VSK-47 Saccharomyces pastorianus 1.32
    VSK-48 Saccharomyces pastorianus 0.44
    VSK-49 Saccharomyces pastorianus 1.18
    VSK-50 Saccharomyces cerevisiae 1.61
    VSK-51 Saccharomyces pastorianus 1.86
    VSK-52 Saccharomyces pastorianus 0.94
    VSK-53 Saccharomyces pastorianus 1.11
    VSK-54 Saccharomyces pastorianus 1.53
    VSK-55 Saccharomyces pastorianus 1.36
    VSK-56 Saccharomyces pastorianus 0.63
    VSK-57 Saccharomyces pastorianus 0.81
    VSK-58 Saccharomyces pastorianus 0.25
    VSK-59 Saccharomyces pastorianus 1.44
    VSK-60 Saccharomyces pastorianus 1.31
    VSK-61 Saccharomyces pastorianus 1.40
    VSK-62 Saccharomyces pastorianus 2.43
    VSK-63 Saccharomyces pastorianus 1.44
    VSK-64 Saccharomyces cerevisiae 2.42
    VSK-65 Saccharomyces cerevisiae 2.49
    VSK-66 Saccharomyces pastorianus 3.42
    VSK-67 Saccharomyces cerevisiae 2.78
    VSK-68 Saccharomyces pastorianus 0.86
    VSK-69 Saccharomyces pastorianus 0.65
    VSK-70 Saccharomyces pastorianus 2.57
    VSK-71 Saccharomyces pastorianus 1.58
    VSK-72 Saccharomyces pastorianus 1.19
    VSK-73 Saccharomyces pastorianus 1.33
    VSK-74 Saccharomyces cerevisiae 2.71
    VSK-75 Saccharomyces pastorianus 1.17
    VSK-76 Saccharomyces pastorianus 0.83
    VSK-77 Saccharomyces pastorianus 0.79
    VSK-78 Saccharomyces cerevisiae 1.46
    VSK-79 Saccharomyces cerevisiae 1.13
    VSK-80 Saccharomyces cerevisiae 1.25
    VSK-81 Saccharomyces cerevisiae 1.97
    VSK-82 Saccharomyces cerevisiae 1.65
    VSK-83 Saccharomyces cerevisiae 2.72
    VSK-84 Saccharomyces cerevisiae 1.74
    VSK-85 Saccharomyces cerevisiae 2.47
    VSK-86 Saccharomyces cerevisiae 3.00
    VSK-87 Saccharomyces cerevisiae 3.40
    VSK-88 Saccharomyces cerevisiae 2.13
    VSK-89 Saccharomyces pastorianus 1.25
    VSK-90 Saccharomyces pastorianus 1.13
    VSK-91 Saccharomyces pastorianus 2.00
    VSK-92 Saccharomyces pastorianus 3.01
    VSK-93 Saccharomyces pastorianus 2.38
    VSK-94 Saccharomyces cerevisiae 3.11
    VSK-95 Saccharomyces cerevisiae 3.10
    VSK-96 Saccharomyces cerevisiae 3.10
    VSK-97 Saccharomyces cerevisiae 3.26
    VSK-98 Saccharomyces cerevisiae 3.51
    VSK-99 Saccharomyces cerevisiae 3.63
    VSK-100 Saccharomyces cerevisiae 2.64
    VSK-101 Saccharomyces cerevisiae 2.69
    VSK-102 Saccharomyces cerevisiae 3.06
    VSK-103 Saccharomyces cerevisiae 3.01
    VSK-104 Saccharomyces pastorianus 1.44
    VSK-105 Saccharomyces cerevisiae 3.06
    VSK-106 Saccharomyces pastorianus 1.72
    VSK-107 Saccharomyces pastorianus 1.39
    VSK-108 Saccharomyces pastorianus 1.44
    VSK-109 Saccharomyces pastorianus 1.97
    VSK-110 Saccharomyces pastorianus 1.74
    VSK-111 Saccharomyces pastorianus 2.72
    VSK-112 Saccharomyces cerevisiae 3.10
    VSK-113 Saccharomyces cerevisiae 3.39
    VSK-114 Saccharomyces cerevisiae 1.42
    VSK-115 Saccharomyces pastorianus 1.44
    VSK-116 Saccharomyces cerevisiae 3.51
    VSK-117 Saccharomyces cerevisiae 3.75
    VSK-118 Saccharomyces bayanus 3.42
    VSK-119 Saccharomyces cerevisiae 3.15
    VSK-120 Saccharomyces cerevisiae 2.32
    VSK-121 Saccharomyces cerevisiae 3.51
    VSK-122 Saccharomyces cerevisiae 3.11
    VSK-123 Saccharomyces cerevisiae 3.49
    VSK-124 Saccharomyces cerevisiae 2.96
    VSK-125 Saccharomyces cerevisiae 3.51
    VSK-126 Saccharomyces cerevisiae 0.97
    VSK-127 Saccharomyces cerevisiae 2.75
    VSK-128 Saccharomyces cerevisiae 3.68
    VSK-129 Saccharomyces kudriavzevii 2.61
    VSK-130 Saccharomyces cerevisiae 3.01
    VSK-131 Saccharomyces cerevisiae 3.35
    VSK-132 Saccharomyces cerevisiae 2.90
    VSK-133 Saccharomyces cerevisiae 3.07
    VSK-134 Saccharomyces cerevisiae 3.49
    VSK-135 Saccharomyces cerevisiae 0.75
    VSK-136 Saccharomyces cerevisiae 2.36
    VSK-137 Saccharomyces cerevisiae 2.83
    VSK-138 Saccharomyces bayanus 1.61
    VSK-139 Saccharomyces cerevisiae 3.07
    VSK-140 Saccharomyces cerevisiae 3.35
    VSK-141 Saccharomyces cerevisiae 2.75
    VSK-142 Saccharomyces cerevisiae 3.04
    VSK-143 Saccharomyces bayanus 1.43
    VSK-144 Saccharomyces sp. 3.11
    VSK-145 Saccharomyces sp. 3.28
    VSK-146 Saccharomyces sp. 1.89
    VSK-147 Saccharomyces cerevisiae 3.25
    VSK-148 Saccharomyces cerevisiae 3.01
    VSK-149 Saccharomyces bayanus 3.38
    VSK-150 Saccharomyces cerevisiae 3.22
    VSK-151 Saccharomyces cerevisiae 2.75
    VSK-152 Saccharomyces cerevisiae 3.13
    VSK-153 Saccharomyces cerevisiae 0.08
    VSK-154 Saccharomyces cerevisiae 2.46
    VSK-155 Saccharomyces cerevisiae 3.38
    VSK-156 Saccharomyces cerevisiae 3.06
    VSK-157 Saccharomyces cerevisiae 2.00
    VSK-158 Saccharomyces pastorianus 2.75
    VSK-159 Saccharomyces cerevisiae 1.10
    VSK-160 Saccharomyces cerevisiae 1.83
    VSK-161 Saccharomyces bayanus 3.15
    VSK-162 Saccharomyces cerevisiae 1.79
    VSK-163 Saccharomyces cerevisiae 2.47
    VSK-164 Saccharomyces cerevisiae 2.43
    VSK-165 Saccharomyces bayanus 1.67
    VSK-166 Saccharomyces cerevisiae 2.90
    VSK-167 Saccharomyces cerevisiae 2.86
    VSK-168 Saccharomyces cerevisiae 2.17
    VSK-169 Saccharomyces cerevisiae 2.76
    VSK-170 Saccharomyces cerevisiae 3.46
    VSK-171 Saccharomyces cerevisiae 3.65
    VSK-172 Saccharomyces cerevisiae 3.89
    VSK-173 Saccharomyces cerevisiae 3.11
    VSK-174 Saccharomyces cerevisiae 3.61
    VSK-175 Saccharomyces cerevisiae 2.67
    VSK-176 Saccharomyces cerevisiae 2.67
    VSK-177 Saccharomyces cerevisiae 1.88
    VSK-178 Saccharomyces cerevisiae 3.56
    VSK-179 Saccharomyces cerevisiae 3.82
    VSK-180 Saccharomyces cerevisiae 2.54
    VSK-181 Saccharomyces cerevisiae 3.64
    VSK-182 Saccharomyces cerevisiae 3.07
    VSK-183 Saccharomyces cerevisiae 3.32
    VSK-184 Saccharomyces cerevisiae 3.89
    VSK-185 Saccharomyces cerevisiae 1.96
    VSK-186 Saccharomyces cerevisiae 3.51
    VSK-187 Saccharomyces cerevisiae 3.39
    VSK-188 Saccharomyces cerevisiae 3.07
    VSK-189 Saccharomyces cerevisiae 3.71
    VSK-190 Saccharomyces cerevisiae 3.13
    VSK-191 Saccharomyces pastorianus 2.04
    VSK-192 Saccharomyces cerevisiae 3.14
    VSK-193 Saccharomyces cerevisiae 3.99
    VSK-194 Saccharomyces cerevisiae 3.53
    VSK-195 Saccharomyces cerevisiae 3.90
    VSK-196 Saccharomyces cerevisiae 3.46
    VSK-197 Saccharomyces cerevisiae 2.99
    VSK-198 Saccharomyces cerevisiae 4.11
    VSK-199 Saccharomyces cerevisiae 3.93
    VSK-200 Saccharomyces cerevisiae 3.40
    VSK-201 Saccharomyces cerevisiae 1.83
    VSK-202 Saccharomyces cerevisiae 2.96
    VSK-203 Saccharomyces cerevisiae 2.64
    VSK-204 Saccharomyces cerevisiae 2.28
    VSK-205 Saccharomyces cerevisiae 3.42
    VSK-206 Saccharomyces cerevisiae 3.17
    VSK-207 Saccharomyces cerevisiae 3.13
    VSK-208 Saccharomyces cerevisiae 3.69
    VSK-209 Saccharomyces cerevisiae 3.64
    VSK-210 Issatchenkia orientalis 3.07
    VSK-211 Issatchenkia orientalis 2.40
    VSK-212 Issatchenkia orientalis 2.44
    VSK-213 Issatchenkia orientalis 2.60
    VSK-214 Issatchenkia orientalis 2.85
    VSK-215 Issatchenkia orientalis 2.35
    VSK-216 Issatchenkia orientalis 3.04
    VSK-217 Zygosaccharomyces kombuchaensis 0.67
    VSK-218 Candida glabrata 3.67
    VSK-219 Candida glabrata 3.38
    VSK-220 Kazachstania exigua 3.89
    VSK-221 Kazachstania exigua 3.89
    VSK-222 Issatchenkia orientalis 2.01
    VSK-223 Issatchenkia orientalis 3.13
    VSK-224 Issatchenkia orientalis 2.60
    VSK-225 Kazachstania exigua 3.26
    VSK-226 Pichia membranifaciens 3.11
    VSK-227 Pichia membranifaciens 3.18
    VSK-228 Pichia membranifaciens 2.76
    VSK-229 Pichia membranifaciens 3.26
    VSK-230 Pichia membranifaciens 3.35
    VSK-231 Pichia membranifaciens 3.13
    VSK-232 Pichia membranifaciens 3.06
    VSK-233 Pichia membranifaciens 3.18
    VSK-234 Pichia membranifaciens 2.56
    VSK-235 Kazachstania exigua 4.13
    VSK-236 Saccharomycodes ludwigii 2.94
    VSK-237 Zygosaccharomyces kombuchaensis 3.18
    VSK-238 Zygosaccharomyces kombuchaensis 2.96
    VSK-239 Candida glabrata 3.49
    VSK-240 Candida glabrata 1.61
    VSK-241 Issatchenkia orientalis 2.79
    VSK-242 Kazachstania bulderi 3.38
    VSK-243 Kazachstania bulderi 3.60
    VSK-244 Candida magnoliae 3.08
    VSK-245 Issatchenkia orientalis 1.63
    VSK-246 Kazachstania bulderi 3.44
    VSK-247 Issatchenkia orientalis 0.00
    VSK-248 Issatchenkia orientalis 3.08
    VSK-249 Issatchenkia orientalis 3.07
    VSK-250 Kazachstania exigua 3.00
    VSK-251 Candida glabrata 2.49
    VSK-252 Issatchenkia orientalis 2.35
    VSK-253 Kazachstania exigua 2.33
    VSK-254 Saccharomycodes ludwigii 2.43
    VSK-255 Issatchenkia orientalis 2.68
    VSK-256 Kazachstania exigua 3.56
    VSK-257 Kazachstania exigua 4.00
    VSK-258 Issatchenkia orientalis 2.24
    VSK-259 Issatchenkia orientalis 2.79
    VSK-260 Issatchenkia orientalis 2.53
    VSK-261 Pichia burtonii 0.42
    VSK-262 Candida boidinii 1.86
    VSK-263 Pichia kluyveri 1.56
    VSK-264 Torulaspora delbrueckii 3.19
    VSK-265 Kazachstania servazzii 2.40
    VSK-266 Zygosaccharomyces rouxii 1.15
    VSK-267 Pichia fermentans 2.00
    VSK-268 Yarrowia lipolytica 2.86
    VSK-269 Candida boidinii 2.46
    VSK-270 Candida intermedia 0.65
    VSK-271 Candida parapsilosis 1.58
    VSK-272 Yarrowia lipolytica 2.10
    VSK-273 Candida parapsilosis 2.24
    VSK-274 Debaryomyces hansenii 0.25
    VSK-275 Pichia guilliermondii 2.32
    VSK-276 Kazachstania servazzii 0.72
    VSK-277 Rhodotorula glutinis 0.72
    VSK-278 Cryptococcus albidus 0.74
    VSK-279 Rhodosporidium toruloides 0.67
    VSK-280 Debaryomyces occidentalis 1.17
    VSK-281 Rhodotorula mucilaginosa 1.54
    VSK-282 Candida auringiensis 1.58
    VSK-283 Candida succiphila 2.08
    VSK-284 Ambrosiozyma monospora 0.71
    VSK-285 Candida arabinofermentans 0.56
    VSK-286 Kluyveromyces marxianus 2.06
    VSK-287 Lachancea thermotolerans 2.28
    VSK-288 Cryptococcus albidus 0.25
    VSK-289 Debaryomyces occidentalis 1.76
    VSK-290 Rhodotorula mucilaginosa 2.85
    VSK-291 Rhodotorula glutinis 0.00
    VSK-292 Zygosaccharomyces lentus 0.33
    VSK-293 Rhodosporidium teruloides 0.38
    VSK-294 Cryptococcus albidus 0.00
    VSK-295 Torulaspora globosa 2.07
    VSK-296 Candida stellata 1.36
    VSK-297 Cryptococcus laurentii 0.53
    VSK-298 Williopsis saturnus 0.76
    VSK-299 Cystofilobasidium bisporidii 1.94
    VSK-300 Cryptococcus curvatus 1.78
    VSK-301 Sporidiobolus salmonicolor 2.17
    VSK-302 Pichia jadinii 0.86
    VSK-303 Geotrichum klebahnii 0.67
    VSK-304 Cryptococcus laurentii 0.19
    VSK-305 Debaryomyces hansenii 0.82
    VSK-306 Yarrowia lipolytica 1.36
    VSK-307 Candida rugosa 1.97
    VSK-308 Candida pararugosa 1.68
    VSK-309 Debaryomyces occidentalis 0.68
    VSK-310 Arxula adeninivorans 1.38
    VSK-311 Pichia stipitis 2.17
    VSK-312 Cryptococcus albidus 2.19
    VSK-313 Candida haemulonii 2.18
    VSK-314 Debaryomyces hansenii 0.38
    VSK-315 Pichia angusta 0.82
    VSK-316 Rhodotorula minuta 0.40
    VSK-317 Pichia mandshurica 1.03
    VSK-318 Zygosaccharomyces bailii 0.94
    VSK-319 Cryptococcus albidosimilis 0.44
    VSK-320 Cryptococcus wieringae 0.61
    VSK-321 Filobasidium globisporum 0.00
    VSK-322 Filobasidium globisporum 0.03
    VSK-323 Bulleromyces albus 0.39
    VSK-324 Candida anglica 0.56
    VSK-325 Candida anglica 0.65
    VSK-326 Candida fermentati 2.28
    VSK-327 Candida natalensis 0.76
    VSK-328 Candida pararugosa 1.08
    VSK-329 Candida picinguabensis 0.71
    VSK-330 Candida silvae 1.07
    VSK-331 Candida solani 0.63
    VSK-332 Candida cylindracea 1.22
    VSK-333 Cryptococcus curvatus 0.47
    VSK-334 Cryptococcus macerans 0.58
    VSK-335 Cryptococcus macerans 0.33
    VSK-336 Cryptococcus magnus 1.57
    VSK-337 Cryptococcus magnus 0.57
    VSK-338 Cryptococcus victoriae 0.74
    VSK-339 Cryptococcus victoriae 0.79
    VSK-340 Cryptococcus wieringae 1.19
    VSK-341 Cryptococcus mycelialis 0.33
    VSK-342 Dioszegia hungarica 2.01
    VSK-343 Hanseniaspora sp. 2.32
    VSK-344 Hanseniaspora uvarum 2.89
    VSK-345 Pichia fabianii 0.85
    VSK-346 Rhodotorula pinicola 0.36
    VSK-347 Rhodotorula pinicola 0.39
    VSK-348 Sporobolomyces ruberrimus 0.50
    VSK-349 Sporobolomyces roseus 0.36
    VSK-350 Williopsis californica 0.60
    VSK-351 Pichia pastoris 0.64
    VSK-352 Pichia pastoris 1.01
    VSK-353 Pichia pastoris 0.96
    VSK-354 Pichia mandshurica 3.00
    VSK-355 Pichia heedii 1.26
    VSK-356 Pichia punctispora 3.32
    VSK-357 Kazachstania unispora 1.19
    VSK-358 Schizosaccharomyces pombe 3.49
    VSK-359 Torulaspora delbrueckii 0.36
    VSK-360 Yarrowia lipolytica 2.82
    VSK-361 Yarrowia lipolytica 2.14
    VSK-362 Zygosaccharomyces bailii 2.08
    VSK-363 Zygosaccharomyces bailii 2.39
    VSK-364 Zygosaccharomyces bisporus 0.58
    VSK-365 Candida fluviatilis 0.76
    VSK-366 Saccharomycopsis capsularis 0.68
    VSK-367 Zygosaccharomyces rouxii 2.51
    VSK-368 Candida fluviatilis 0.68
    VSK-369 Candida humilis 0.36
    VSK-370 Candida catenulata 0.47
    VSK-371 Debaryomyces hansenii 0.38
    VSK-372 Pichia guilliermondii 1.90
    VSK-373 Candida intermedia 0.74
    VSK-374 Candida lactis-condensi 0.78
    VSK-375 Pichia fermentans 1.22
    VSK-376 Candida pignaliae 0.60
    VSK-377 Candida pseudolambica 0.82
    VSK-378 Candida rugosa 2.69
    VSK-379 Candida sorboxylosa 2.33
    VSK-380 Kregervanrija fluxuum 0.28
    VSK-381 Citeromyces matritensis 0.60
    VSK-382 Debaryomyces polymorphus 1.11
    VSK-383 Debaryomyces sp. 1.46
    VSK-384 Dekkera anomala 0.75
    VSK-385 Dekkera bruxellensis 0.67
    VSK-386 Dekkera bruxellensis 0.44
    VSK-387 Pichia burtonii 0.64
    VSK-388 Pichia burtonii 0.64
    VSK-389 Kluyveromyces yarrowii 0.53
    VSK-390 Kodamaea ohmeri 2.15
    VSK-391 Metschnikowia pulcherrima 0.83
    VSK-392 Eromothecium coryli 0.71
    VSK-393 Pichia anomala 1.22
    VSK-394 Kluyveromyces marxianus 2.07
    VSK-395 Saturnispora mendoncae 0.61
    VSK-396 Pichia minuta 0.53
    VSK-397 Pichia nakasei 0.50
    VSK-398 Pichia silvicola 0.50
    VSK-399 Pichia stipitis 0.60
    VSK-400 Pichia tannicola 2.29
    VSK-401 Pichia toletana 0.00
    VSK-402 Schizosaccharomyces japonicus 0.17
    VSK-403 Pichia haplophila 0.46
    VSK-404 Zygosaccharomyces bailii 0.83
    VSK-405 Zygosaccharomyces bisporus 1.32
    VSK-406 Bulleromyces albus 0.00
    VSK-407 Pseudozyma antarctica 0.00
    VSK-408 Pichia stipitis 0.25
    VSK-409 Cryptococcus wieringae 0.08
    VSK-410 Sporobolomyces ruberrimus 3.10
    VSK-411 Cryptococcus diffluens 0.29
    VSK-412 Cryptococcus curvatus 0.33
    VSK-413 Lipomyces tetrasporus 0.46
    VSK-414 Candida shehatae 0.42
    VSK-415 Lipomyces lipofer 0.00
    VSK-416 Lipomyces starkeyi 0.00
    VSK-417 Candida apis 1.21
    VSK-418 Candida sorbophila 1.08
    VSK-419 Candida oleophila 0.75
    VSK-420 Sporidiobolus salmonicolor 0.50
    VSK-421 Candida apicola 1.79
    VSK-422 Zygosaccharomyces lentus 0.29
    VSK-423 Candida saitoana 0.33
    VSK-424 Pichia guilliermondii 1.86
    VSK-425 Kluyveromyces lactis 0.88
    VSK-426 Pichia jadinii 1.65
    VSK-427 Metschnikowia pulcherrima 1.50
    VSK-428 Rhodosporidium toruloides 0.29
    VSK-429 Schizosaccharomyces japonicus 1.29
    VSK-430 Lachancea thermotolerans 0.75
    VSK-431 Candida saitoana 0.71
    VSK-432 Dekkera anomala 0.42
    VSK-433 Kluyveromyces marxianus 1.69
    VSK-434 Kluyveromyces marxianus 1.17
    VSK-435 Candida maltosa 2.19
    VSK-436 Pichia fabianii 1.33
    VSK-437 Candida viswanathii 0.29
    VSK-438 Candida catenulata 0.42
    VSK-439 Schizosaccharomyces pombe 1.93
    VSK-440 Kluyveromyces lactis 0.29
    VSK-441 Kazachstania unispora 3.28
    VSK-442 Kazachstania unispora 3.24
    VSK-443 Pachysolen tannophilus 0.75
    VSK-444 Pachysolen tannophilus 0.92
    VSK-445 Pichia subpelliculosa 1.76
    VSK-446 Trigonopsis variabilis 1.44
    VSK-447 Candida versatilis 1.99
    VSK-448 Pichia farinosa 0.54
    VSK-449 Pichia farinosa 2.04
    VSK-450 Kodamaea ohmeri 2.25
    VSK-451 Pichia triangularis 2.08
    VSK-452 Candida diddensiae 2.17
    VSK-453 Pichia quercuum 1.96
    VSK-454 Sporidiobolus johnsonii 0.65
    VSK-455 Debaryomyces coudertii 0.67
    VSK-456 Candida apicola 2.33
    VSK-457 Candida humilis 425
    VSK-458 Rhodotorula mucilaginosa 0.29
    VSK-459 Dekkera anomala 0.33
    VSK-460 Zygosaccharomyces bailii 1.18
    VSK-461 Rhodotorula glutinis 0.33
    VSK-462 Sporobolomyces roseus 0.25
    VSK-463 Pichia anomala 2.21
    VSK-464 Candida zeylanoides 2.03
    VSK-465 Zygosaccharomyces rouxii 2.29
    VSK-466 Pichia anomala 2.17
    VSK-467 Zygosaccharomyces bisporus 0.42
    VSK-468 Lachancea fermentati 1.51
    VSK-469 Zygosaccharomyces rouxii 0.46
    VSK-470 Torulaspora microellipsoides 0.67
    VSK-471 Zygotorulaspora florentinus 1.61
    VSK-472 Zygosaccharomyces mellis 0.33
    VSK-473 Lachancea cidri 2.26
    VSK-474 Zygotorulaspora mrakii 2.18
    VSK-475 Candida sake 0.42
    VSK-476 Candida silvae 1.21
    VSK-477 Sporopachydermia lactativora 0.46
    VSK-478 Sporopachydermia lactativora 0.46
    VSK-479 Clavispora lusitaniae 0.88
    VSK-480 Cryptococcus laurentii 0.46
    VSK-481 Clavispora lusitaniae 0.63
    VSK-482 Naumovia dairenensis 0.63
    VSK-483 Candida membranifaciens 0.46
    VSK-484 Candida tenuis 0.46
    VSK-485 Candida membranifaciens 0.46
    VSK-486 Cystofilobasidium infirmo-miniatum 0.50
    VSK-487 Candida oleophila 1.08
    VSK-488 Rhodotorula minuta 0.42
    VSK-489 Pichia farinosa 2.29
    VSK-490 Candida solani 0.61
    VSK-491 Candida sake 0.63
    VSK-492 Hanseniaspora uvarum 2.21
    VSK-493 Pichia angusta 1.79
    VSK-494 Candida entomophila 0.50
    VSK-495 Candida methanosorbosa 0.46
    VSK-496 Candida diddensiae 0.42
    VSK-497 Candida sonorensis 1.50
    VSK-498 Saccharomyces cerevisiae 0.88
    VSK-499 Zygosaccharomyces kombuchaensis 1.10
    VSK-500 Candida mesenterica 0.54
    VSK-501 Pichia punctispora 0.54
    VSK-502 Pichia sp. 1.63
    VSK-503 Pichia sp. 2.97
    VSK-504 Saccharomyces paradoxus 2.07
    VSK-505 Pichia fermentans 1.03
    VSK-506 Kregervanrija fluxuum 2.58
    VSK-507 Zygosaccharomyces mellis 1.46
    VSK-508 Lachancea fermentati 2.25
    VSK-509 Cryptococcus liquefaciens 0.17
    VSK-510 Filobasidium capsuligenum 0.36
    VSK-511 Wickerhamomyces anomalus 1.81
    VSK-512 Dipodascus ingens 2.00
    VSK-513 Candida santamariae 0.42
    VSK-514 Filobasidium capsuligenum 1.06
    VSK-515 Dipodascus ingens 2.50
    VSK-516 Filobasidium capsuligenum 0.58
    VSK-517 Candida anatomiae 0.64
    VSK-518 Lindnera fabianii 1.15
    VSK-519 Pichia mexicana 0.46
    VSK-520 Sporopachydermia cereana 2.10
    VSK-521 Sporopachydermia cereana 0.33
    VSK-522 Candida sonorensis 1.54
    VSK-523 Pichia cactophila 1.47
    VSK-524 Pichia cactophila 1.25
    VSK-525 Saccharomyces pastorianus 2.63
    VSK-526 Saccharomyces cerevisiae 1.72
    VSK-527 Saccharomyces cerevisiae 2.50
    VSK-528 Saccharomyces cerevisiae 2.25
    VSK-529 Saccharomyces cerevisiae 2.75
    VSK-530 Saccharomyces cerevisiae 2.71
    VSK-531 Saccharomyces cerevisiae 1.54
    VSK-532 Saccharomyces cerevisiae 2.79
    VSK-533 Saccharomyces cerevisiae 3.07
    VSK-534 Saccharomyces cerevisiae 2.38
    VSK-535 Saccharomyces cerevisiae 2.22
    VSK-536 Saccharomyces cerevisiae 2.47
    VSK-537 Saccharomyces cerevisiae 3.08
    VSK-538 Saccharomyces cerevisiae 2.35
    VSK-539 Saccharomyces cerevisiae 2.82
    VSK-540 Saccharomyces cerevisiae 2.83
    VSK-541 Saccharomyces cerevisiae 2.88
    VSK-542 Saccharomyces cerevisiae 2.50
    VSK-543 Saccharomyces cerevisiae 2.44
    VSK-544 Saccharomyces cerevisiae 2.63
    VSK-545 Saccharomyces cerevisiae 3.04
    VSK-546 Saccharomyces cerevisiae 2.83
    VSK-547 Saccharomyces cerevisiae 2.44
    VSK-548 Saccharomyces cerevisiae 2.44
    VSK-549 Saccharomyces cerevisiae 2.79
    VSK-550 Saccharomyces cerevisiae 2.93
    VSK-551 Saccharomyces cerevisiae 3.15
    VSK-552 Saccharomyces cerevisiae 2.83
    VSK-553 Saccharomyces cerevisiae 2.85
    VSK-554 Saccharomyces cerevisiae 3.19
    VSK-555 Saccharomyces cerevisiae 2.96
    VSK-556 Saccharomyces cerevisiae 2.92
    VSK-557 Saccharomyces cerevisiae 2.56
    VSK-558 Saccharomyces cerevisiae 2.21
    VSK-559 Saccharomyces cerevisiae 2.24
    VSK-560 Saccharomyces cerevisiae 2.96
    VSK-561 Saccharomyces cerevisiae 3.33
    VSK-562 Saccharomyces cerevisiae 2.97
    VSK-563 Saccharomyces cerevisiae 3.22
    VSK-564 Saccharomyces cerevisiae 3.32
    VSK-565 Saccharomyces cerevisiae 3.35
    VSK-566 Saccharomyces cerevisiae 3.36
    VSK-567 Saccharomyces cerevisiae 3.18
    VSK-568 Saccharomyces cerevisiae 3.29
    VSK-569 Saccharomyces cerevisiae 3.22
    VSK-570 Saccharomyces cerevisiae 2.81
    VSK-571 Saccharomyces cerevisiae 3.75
    VSK-572 Saccharomyces cerevisiae 3.07
    VSK-573 Saccharomyces cerevisiae 3.36
    VSK-574 Saccharomyces cerevisiae 3.22
    VSK-575 Saccharomyces cerevisiae 3.07
    VSK-576 Saccharomyces cerevisiae 2.93
    VSK-577 Saccharomyces cerevisiae 3.60
    VSK-578 Saccharomyces cerevisiae 3.60
    VSK-579 Saccharomyces cerevisiae 3.00
    VSK-580 Saccharomyces cerevisiae 2.99
    VSK-581 Saccharomyces cerevisiae 3.50
    VSK-582 Saccharomyces cerevisiae 3.58
    VSK-583 Saccharomyces cerevisiae 3.11
    VSK-584 Saccharomyces cerevisiae 3.75
    VSK-585 Saccharomyces cerevisiae 3.43
    VSK-586 Saccharomyces cerevisiae 2.93
    VSK-587 Saccharomyces cerevisiae 3.08
    VSK-588 Saccharomyces cerevisiae 3.60
    VSK-589 Saccharomyces cerevisiae 3.79
    VSK-590 Saccharomyces cerevisiae 2.96
    VSK-591 Saccharomyces cerevisiae 3.18
    VSK-592 Saccharomyces cerevisiae 3.47
    VSK-593 Saccharomyces cerevisiae 3.07
    VSK-594 Saccharomyces cerevisiae 3.33
    VSK-595 Saccharomyces cerevisiae 3.79
    VSK-596 Saccharomyces cerevisiae 3.51
    VSK-597 Saccharomyces cerevisiae 3.32
    VSK-598 Saccharomyces cerevisiae 3.53
    VSK-599 Saccharomyces cerevisiae 2.46
    VSK-600 Saccharomyces cerevisiae 3.49
    VSK-601 Saccharomyces cerevisiae 3.36
    VSK-602 Saccharomyces cerevisiae 3.51
    VSK-603 Saccharomyces cerevisiae 3.64
    VSK-604 Saccharomyces cerevisiae 3.50
    VSK-605 Saccharomyces cerevisiae 1.50
    VSK-606 Saccharomyces cerevisiae 3.92
    VSK-607 Saccharomyces cerevisiae 3.28
    VSK-608 Saccharomyces cerevisiae 3.32
    VSK-609 Saccharomyces cerevisiae 3.38
    VSK-610 Saccharomyces cerevisiae 3.39
    VSK-611 Saccharomyces cerevisiae 3.56
    VSK-612 Saccharomyces cerevisiae 3.24
    VSK-613 Saccharomyces cerevisiae 3.21
    VSK-614 Saccharomyces cerevisiae 3.32
    VSK-615 Saccharomyces cerevisiae 3.40
    VSK-616 Saccharomyces cerevisiae 3.24
    VSK-617 Kluyveromyces marxianus 1.46
    VSK-618 Kluyveromyces marxianus 2.89
    VSK-619 Kluyveromyces marxianus 1.13
    VSK-620 Kluyveromyces marxianus 1.33
    VSK-621 Kluyveromyces marxianus 1.46
    VSK-622 Kluyveromyces marxianus 1.46
    VSK-623 Kluyveromyces marxianus 0.92
    VSK-624 Kluyveromyces marxianus 0.96
    VSK-625 Kluyveromyces marxianus 1.39
    VSK-626 Kluyveromyces marxianus 0.92
    VSK-627 Kluyveromyces marxianus 1.71
    VSK-628 Kluyveromyces marxianus 2.17
    VSK-629 Kluyveromyces marxianus 2.40
    VSK-630 Kluyveromyces marxianus 1.36
    VSK-631 Kluyveromyces marxianus 1.40
    VSK-632 Kluyveromyces marxianus 1.61
    VSK-633 Kluyveromyces marxianus 0.75
    VSK-634 Kluyveromyces marxianus 0.83
    VSK-635 Pichia fermentans 1.33
    VSK-636 Pichia fermentans 1.92
    VSK-637 Pichia fermentans 1.81
    VSK-638 Pichia fermentans 2.24
    VSK-639 Pichia fermentans 0.96
    VSK-640 Pichia fermentans 1.72
    VSK-641 Pichia fermentans 0.33
    VSK-642 Debaryomyces hansenii 0.46
    VSK-643 Debaryomyces hansenii 0.54
    VSK-644 Debaryomyces hansenii 0.08
    VSK-645 Debaryomyces hansenii 2.83
    VSK-646 Debaryomyces hansenii 1.46
    VSK-647 Debaryomyces hansenii 1.74
    VSK-648 Debaryomyces hansenii 0.33
    VSK-649 Debaryomyces hansenii 0.50
    VSK-650 Debaryomyces hansenii 0.38
    VSK-651 Debaryomyces hansenii 0.71
    VSK-652 Debaryomyces hansenii 0.83
    VSK-653 Debaryomyces hansenii 1.04
    VSK-654 Debaryomyces hansenii 0.33
    VSK-655 Debaryomyces hansenii 0.42
    VSK-656 Saccharomyces pastorianus 1.25
    VSK-657 Saccharomyces pastorianus 1.04
    VSK-658 Saccharomyces pastorianus 2.51
    VSK-659 Saccharomyces pastorianus 2.54
    VSK-660 Trichosporon pullulans 2.60
    VSK-661 Candida sake 0.63
    VSK-662 Candida sake 1.17
    VSK-663 Cryptococcus tephrensis 0.63
    VSK-664 Cryptococcus tephrensis 0.50
    VSK-665 Trichosporon brassicae 0.38
    VSK-666 Candida sp. 2.46
    VSK-667 Yarrowia lipolytica 2.74
    VSK-668 Candida zeylanoides 2.08
    VSK-669 Torulopsis sp. 1.07
    VSK-670 Meyerozyma guilliermondii 2.17
    VSK-671 Wickerhamomyces anomalus 1.38
    VSK-672 Yarrowia lipolytica 2.94
    VSK-673 Candida boidinii 1.17
    VSK-674 Pichia membranifaciens 1.63
    VSK-675 Pichia membranifaciens 2.88
    VSK-676 Candida sp. 2.36
    VSK-677 Magnusiomyces ingens 0.75
    VSK-678 Trichosporon dulcitum 0.83
    VSK-679 Scheffersomyces stipitis 0.71
    VSK-680 Yarrowia lipolytica 2.99
    VSK-681 Hanseniaspora uvarum 1.83
    VSK-682 Hanseniaspora sp. 2.63
    VSK-683 Priceomyces carsonii 0.67
    VSK-684 Trichomonascus ciferrii 1.29
    VSK-685 Trichosporon veenhuisii 0.42
    VSK-686 Sugiyamaella smithiae 0.38
    VSK-687 Trichosporon aquatile 0.71
    VSK-688 Schwanniomyces polymorphus 2.82
    VSK-689 Priceomyces haplophilus 1.92
    VSK-690 Debaryomyces robertsiae 2.38
    VSK-691 Candida rhagii 0.71
    VSK-692 Metschnikowia reukaufii 0.88
    VSK-693 Metschnikowia agaves 0.88
    VSK-694 Komagataella pastoris 0.33
    VSK-695 Lodderomyces elongisporus 1.04
    VSK-696 Saccharomyces eubayanus 1.63
    VSK-697 Candida parapsilosis 2.04
    VSK-698 Torulaspora delbrueckii 3.14
    VSK-699 Torulaspora delbrueckii 1.29
    VSK-700 Hanseniaspora uvarum 2.00
    VSK-701 Hanseniaspora osmophila 2.54
    VSK-702 Zygosaccharomyces rouxii 0.92
    VSK-703 Cryptococcus flavescens 1.13
    VSK-704 Torulaspora delbrueckii 2.36
    VSK-705 Wickerhamomyces anomalus 2.22
    VSK-706 Rhodosporidium toruloides 0.75
    VSK-707 Candida sp. 0.71
    VSK-708 Pichia jadinii 1.13
    VSK-709 Pichia jadinii 1.17
    VSK-710 Candida humilis 3.60
    VSK-711 Pichia membranifaciens 3.04
    VSK-712 Rhodosporidium toruloides 1.79
    VSK-713 Candida zeylanoides 2.64
    VSK-714 Candida diddensiae 0.46
    VSK-715 Pichia membranifaciens 1.67
    VSK-716 Saccharomyces cerevisiae 1.92
    VSK-717 Candida mesenterica 2.13
    VSK-718 Saccharomyces cerevisiae 2.79
  • Beispiel 2: Bioinformatisches Genome Mining bei Enzymkandidaten des Stoffwechsels
  • Homologiebasierte Datenbanksuchen wurden durchgeführt, um Enzymkandidaten für eine spezielle Funktionalität zu identifizieren. Die Datenbanken wurden jeweils mit einer Reihe von Abfragesequenzen durchsucht. Zusätzlich wurden die Mitglieder der relevanten Proteinfamilie aus UniProt/SwissProt, basierend auf den InterPro-Domäneneinträgen, abgerufen. Die homologiebasierten Suchen wurden gegen UniProt-Proteindatenbanken (SwissProt und TrEMBL) und GenBank-Proteindatenbanken (nr, pat und env_nr) mittels blastp, und gegen GenBank-Nukleotid-Datenbanken (tsa_nt, env_nt und pat) mittels tblastn durchgeführt.
  • Sequenzen mit einem E-Wert kleiner als 1e-30 wurden extrahiert; in einigen Fällen wurde jedoch eine zusätzliche Analyse an Sequenzen mit einem E-Wert kleiner als 1e-80 durchgeführt. Nukleotid-Treffer wurden mit Gene Wise mittels der Abfragesequenz als Leitsequenz in der Translation in Proteinsequenzen translatiert. Die Aufgabe der Translation von langen ACC-Sequenzen war zu schwierig für Gene Wise, so wurde stattdessen die Proteinsequenz (mit der Abfragesequenz übereinstimmender Teil) aus der Datenausgabe von blast-xml extrahiert. Um nicht benötigte Sequenzen zu entfernen, wurden die abgerufenen Sequenzen, mittels BLASTCLUST oder CD-HIT, zu Cluster mit Sequenzen, die zu über 80% identisch zueinander sind, geclustert. Von jedem Cluster wurde nur eine repräsentative Sequenz behalten. Der nicht benötigte Satz von Sequenzen wurde abgeglichen, entweder mit der PFAM-Domäne der Proteinfamilie oder mittels MAFFT. Ein weltweiter Abgleich mittels MAFFT wurde in Fällen erstellt, in denen die Proteinfamilie nicht mit einer PFAM-Domäne in Zusammenhang stand oder wenn die Sequenz des Proteins auf mehrere PFAM-Domänen aufgeteilt war. Ein phylogenetischer Baum wurde anhand des multiplen Sequenzabgleichs mittels PHYLIP oder FASTTREE erzeugt. Der Baum wurde mit EC-Nummern, Name des Organismus, Blast-E-Werten kommentiert und unter Verwendung der Geneious-Software visualisiert.
  • 2-1: Acetylierende Acetaldehyd-Dehydrogenase
  • Die Reduzierung von Acetaldehyd zu Acetyl-CoA kann durch eine acetylierende Acetaldehyd-Dehydrogenase (AADH, E. C. 1.2.1.10) erreicht werden. AADHs können in drei Gruppen von funktionalen Homologen unterteilt werden (Wei et al., Nat. Commun. 4: 2580, 2013), darunter 1) bifunktionale Proteine mit AADH- und Alkohol-Dehydrogenase-Aktivitäten (E. coli-Gene vom adhE-Typ, GenBank-Nr.: NP_415757 Abfragesequenz), 2) Proteine, die am Ethanolamin- Katabolismus beteiligt sind (E. coli-Gene vom eutE-Typ, GenBank-Nr.: AAG57564, Abfragesequenz) und 3) bifunktionale Proteine, die Teil eines Aldolase-Dehydrogenase-Komplexes sind, der am 4-Hydroxy-2-Ketovalerat-Katabolismus beteiligt ist (E. coli-Gene vom mphF-Typ, GenBank-Nr.: NP_414885). Von besonderem Interesse sind die Enzyme der Gruppe 1 (adhE-Typ) und der Gruppe 2 (eutE-Typ).
  • Die N-terminale Domäne des AdhE-Proteins ist hochgradig homolog zu Aldehyd:NAD+ Oxidoreduktasen, wogegen die C-terminale Region homolog zu einer Familie von Fe2+-abhängigen Ethanol:NAD+ Oxidoreduktasen ist (Membrillo-Hernandez et al., J. Biol. Chem. 275: 33869–33875, 2000). Acetylierende Acetaldehyd-Dehydrogenase-Aktivität kann auch in die Zelle durch Trunkieren des bifunktionalen AdhE-Proteins eingeführt werden, um nur die N-terminale Aldehyd-Reduktase-Domäne durch Entfernen der Alkohol-Dehydrogenase-Domäne zu besitzen. Weitere Gene mit dieser bifunktionalen AADH-Aktivität wurden auf Grundlage bioinformatischer Analysen und Sequenzhomologie geschlussfolgert. Die verschiedenen Gene werden in Tabelle 1 zusammengefasst.
  • Viele Enterobakterien können Ethanolamin als- Kohlenstoff- und Stickstoffquelle nutzen (Stojiljkovic et al., J. Bacteriol. 177: 1357–1366, 1995). Dieser katabole Komplementweg schließt einen Schritt ein, in dem Acetaldehyd durch acetylierende Acetaldehyd-Dehydrogenase, EutE, in Acetyl-CoA umgewandelt wird. Neuartige Gene mit dieser AADH-Aktivität wurden auf Grundlage bioinformatischer Analysen und Sequenzhomologie geschlussfolgert. Die verschiedenen Gene werden in Tabelle 2 zusammengefasst.
  • Darüber hinaus gibt es auf Grundlage bioinformatischer Analysen und Sequenzhomologie zu den Genen vom adhE- und eutE-Typ eine Gruppe von Genen, die als Aldehyd-Dehydrogenasen vermerkt werden, von denen geschlussfolgert werden kann, eine AADH-Aktivität zu haben. Die verschiedenen Gene werden in Tabelle 3 zusammengefasst.
  • 2-2: Eukaryotische Acetyl-CoA-Carboxylase
  • Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC, EC 6.4.1.2) ist eine multifunktionale Biotinabhängige Carboxylase, die ein zentrales Enzym der Fettsäure-Biosynthese ist. Sie verwendet die Kofaktoren ATP und Biotin, um die Umwandlung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA zu katalysieren. Die Reaktion verläuft in zwei Schritten. Erstens katalysiert die Biotin-Carboxylase die ATP-abhängige Carboxylierung von Biotin mit Bicarbonat. Zweitens überträgt die Carboxyl-Transferase die Carboxyl-Gruppe vom Biotin zum Acetyl-CoA, um Malonyl-CoA zu bilden. Eukaryotische Enzyme sind große Multidomänen-Enzyme, wogegen entsprechende prokaryotische Enzyme aus mehreren Untereinheiten bestehen, die durch unterschiedliche Gene codiert werden.
  • Die Aktivität von ACC wird auf der transkriptionellen Ebene und auch auf der post-transkriptionellen Ebene (z. B. durch Phosphorylierung und Aggregation) geregelt, um die Acetyl-CoA-Homöostase zu erhalten. ACC-Manipulation in verschiedenen Hefearten führte zu erhöhter ACC-Aktivität und erhöhter Produktion von Malonyl-CoA-abgeleiteten Produkten. Gene, die für Enzyme mit ACC-Aktivität codieren, wurden in Saccharomyces cerevisiae (GenBank-Nr.: CAA96294.1, Abfragesequenz), Yarrowia lipolytica (GenBank-Nr.: XP_501721.1, Abfragesequenz) und Mucor circinelloides (GenBank-Nr.: EPB82652.1 Abfragesequenz) nachgewiesen oder postuliert. Acetyl-CoA-Carboxylase-Kandidatengene wurden in den neu sequenzierten Genomen von Kazachstania exigua (SEQ ID NR: 1) und Candida humilis (SEQ ID NR: 2) identifiziert und in unser Hefe-Expressionsplasmid geklont. Weitere Gene mit ACC-Aktivität wurden auf Grundlage bioinformatischer Analysen und Sequenzhomologie geschlussfolgert. Die verschiedenen eukaryotischen Multidomänen-ACC-Gene werden in Tabelle 4 zusammengefasst.
  • 2-3: Bifunktionale Malonyl-CoA-Reduktase
  • Die Reduzierung von Malonyl-CoA zu 3-HP (über ein Malonat-Semialdehyd-Zwischenprodukt) kann durch eine große bifunktionale Malonyl-CoA-Reduktase erreicht werden, die beide Funktionalitäten der C-terminalen Aldehyd-Dehydrogenase-Domäne und N-terminalen Alkohol-Dehydrogenase-Domäne besitzt. Ein hochgradig Substrat-spezifisches und NADPH-abhängiges Enzym mit dieser Aktivität wurde in dem phototrophischen, grünen Nichtschwefel-Bakterium Chloroflexus aurantiacus (GenBank-Nr.: AAS20429.1; Abfragesequenz) beschrieben, das an einem autotrophen CO2-Fixierungsweg beteiligt ist, der als 3-Hydroxypropionat-Zyklus bezeichnet wird (Hugler et al., J. Bacteriol. 184: 2404–2410, 2002). Weitere Gene mit dieser bifunktionalen Malonyl-CoA-Reduktase-Aktivität wurden auf Grundlage bioinformatischer Analysen und Sequenzhomologie geschlussfolgert. Die verschiedenen Gene werden in Tabelle 5 zusammengefasst.
  • 2-4: Malonyl-CoA-Reduktase
  • Im Gegensatz zu den vorhergehend erörterten bifunktionalen Malonyl-CoA-Reduktasen kann Malonyl-CoA auch durch zwei separate Enzyme zu 3-HP katalysiert werden. Durch diese Route wird Malonyl-CoA zunächst durch Malonyl-CoA-Reduktase zu Malonat-Semialdehyd (MCR; EC 1.2.1.75) oder einer CoA-acylierenden Malonat-Semialdehyd-Dehydrogenase reduziert und anschließend durch eine 3-Hydroxypropionat-Dehydrogenase zu 3-HP reduziert (3-HPDH; EC 1.1.1.59 oder EC 1.1.1.298). MCR ist ein NADPH-abhängiges Enzym, das von einigen thermoacidophilen Archaeen verwendet wird, um Kohlenstoff autotroph in organisches Material über einen 3-Hydroxypropionat/4-Hydroxybutyrat-Zyklus zu fixieren (Berg et al., Science, 318: 1782–1786, 2007). Gene, die für Enzyme mit dieser MCR-Aktivität codieren, werden in Metallosphaera sedula (GenBank-Nr.: ABP94884.1, Abfragesequenz) und Sulfolobus tokodaii (GenBank-Nr.: BAB67276.1 Abfragesequenz) beschrieben. Obwohl diese MCRs eine ähnliche Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität mit den bifunktionalen Malonyl-CoA-Reduktase-Enzymen von Chloroflexus aurantiacus gemeinsam haben, weisen sie keine signifikante Sequenzähnlichkeit auf, was darauf hindeutet, dass sich die autotrophen Komplementwege bei Chloroflexus und Sulfolobaceae konvergent entwickelt haben und dass verschiedene Gene rekrutiert wurden, um ähnliche metabolische Prozesse in diesen taxonomischen Gruppen auszuführen (Alber et al., J. Bacteriol. 188: 8551–8559, 2006). Insbesondere die Archaeen-MCRs zeigen eine hohe Sequenzähnlichkeit zu Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenasen. Weitere Gene mit dieser MCR-Aktivität wurden auf Grundlage bioinformatischer Analysen und Sequenzhomologie geschlussfolgert. Die verschiedenen Gene werden in Tabelle 6 zusammengefasst.
  • 2-5: 3-Hydroxypropionat-Dehydrogenase
  • Malonat-Semialdehyd kann durch eine reversible 3-Hydroxypropionat-Dehydrogenase zu 3-HP (HPDH; EC 1.1.1.59, NADH-abhängig) oder eine Malonat-Semialdehyd-Reduktase (EC 1.1.1.298, NADPH-abhängig) reduziert werden. Diese Enzyme sind natürlicherweise am beta-Alanin-Metabolismus, Propanoat-Metabolismus oder an der Uracil-Degradation in Bakterien und Pflanzen beteiligt. Darüber hinaus sind diese Enzyme für einige thermoacidophile Archaeen zur Fixierung von Kohlenstoff über den 3-Hydroxypropionat/4-Hydroxybutyrat-Zyklus erforderlich (Kockelkorn and Fuchs, J. Bacteriol. 191: 6352–6362, 2009). Gene, die für Enzyme mit 3-Hydroxypropionat-Dehydrogenase- oder Malonat-Semialdehyd-Reduktase-Aktivität codieren, wurden in Escherichia coli (GenBank-Nr.: EFV00080.1, Abfragesequenz), Saccharomyces cerevisiae (GenBank-Nr.: DAA10125.1, Abfragesequenz), Metallosphaera sedula (GenBank-Nr.: ABP96133.1, Abfragesequenz), Sulfolobus tokodaii (GenBank-Nr.: BAK54608.1, Abfragesequenz) und Escherichia coli (GenBank-Nr.: ACR64730.1 Abfragesequenz) nachgewiesen oder postuliert. Weitere Gene mit 3-Hydroxypropionat-Dehydrogenase- oder Malonat-Semialdehyd-Reduktase-Aktivität wurden auf Grundlage bioinformatischer Analysen und Sequenzhomologie geschlussfolgert. Die verschiedenen Gene werden in Tabelle 7 zusammengefasst.
  • 2-6: 3-Hydroxvisobutyrat-Dehydrogenase
  • 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (HIBADH; EC 1.1.1.31) ist ein zentrales Enzym, das am Metabolismus von Valin und den anderen verzweigtkettigen Aminosäuren beteiligt ist. HIBADH katalysiert die NADH- oder NADPH-abhängige reversible Umwandlung von 3-Hydroxyisobutyrat zu Methylmalonat-Semialdehyd. Als Ergebnis seiner breiten Substratspezifität wurde für HIBADH jedoch auch gezeigt, dass es über 3-Hydroxypropionat-Dehydrogenase-Aktivität (d. h. EC 1.1.1.59) durch Umwandlung von Malonat-Semialdehyd zu 3-HP (Yao et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 160: 694–703, 2010) verfügt. Enzyme mit HIBADH-Aktivität wurden in Pseudomonas putida (GenBank-Nr.: ADR61938.1, Abfragesequenz), Pseudomonas aeruginosa (GenBank-Nr.: AAG06957.1, Abfragesequenz), Bacillus cereus (GenBank-Nr.: AAP10961.1, Abfragesequenz) und Alcaligenes faecalis (GenBank-Nr.: EJC65559.1 Abfragesequenz) identifiziert. Weitere Gene mit dieser HIBADH-Aktivität wurden auf Grundlage bioinformatischer Analysen und Sequenzhomologie geschlussfolgert. Die verschiedenen Gene werden in Tabelle 8 zusammengefasst.
  • 2-7: 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase
  • 4-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (HBDH; EC 1.1.1.61) ist ein Enzym, das natürlicherweise am Butanoat-Metabolismus beteiligt ist. HBDH katalysiert die reversible NAD+-abhängige Umwandlung von 4-Hydroxybutanoat zu Sukzinat-Semialdehyd. HBDH kann jedoch auch Malonat-Semialdehyd zu 3-HP umwandeln, da die enzymatische Reaktion ähnlich ist. Enzyme mit HBDH-Aktivität wurden in Cupriavidus necator (GenBank-Nr.: AAC41425.1, Abfragesequenz) und Clostridium kluyveri (GenBank-Nr.: EDK35022.1 Abfragesequenz) identifiziert. Weitere Gene mit dieser HBDH-Aktivität wurden auf Grundlage bioinformatischer Analysen und Sequenzhomologie geschlussfolgert. Die verschiedenen Gene werden in Tabelle 9 zusammengefasst.
  • 2-8: 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase
  • 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (BDH; EC 1.1.1.30) ist ein Enzym, das natürlicherweise am Butanoat-Metabolismus beteiligt ist. BDH katalysiert die reversible NAD+-abhängige Umwandlung von 3-Hydroxybutyrat zu Acetoacetat, aber es kann auch andere 3-Hydroxymonocarboxylsäuren oxidieren. Zum Beispiel kann BDH Malonat-Semialdehyd zu 3-HP umwandeln, da die enzymatische Reaktion ähnlich ist. Ein Enzym mit BDH-Aktivität wurde in Pseudomonas aeruginosa (GenBank-Nr.: GAA17557.1 Abfragesequenz) identifiziert. Weitere Gene mit dieser BDH-Aktivität wurden auf Grundlage bioinformatischer Analysen und Sequenzhomologie geschlussfolgert. Die verschiedenen Gene werden in Tabelle 10 zusammengefasst.
  • Beispiel 3: Messung von Enzymaktivitäten
  • ACC spektrophotometrische Enzymassays
  • Spektrophotometrische ACC-Assays sind gekoppelte Assays, in denen ein Produkt, das durch ACC-Reaktion produziert wurde, weiter in einer Reaktion verbraucht wird, die den Kofaktor NAD(P)H erfordert, dessen Oxidation mit einem Spektralphotometer überwacht werden kann.
  • Kröger et al. (2011, Anal. Biochem. 411: 100–105) haben einen gekoppelten Assay beschrieben, bei dem durch ACC1 produziertes Malonyl-CoA weiter durch gereinigte Malonyl-CoA-Reduktase (MCR) in einer Reaktion, die NADPH als Kofaktor erfordert, zu Malonat-Semialdehyd umgewandelt wird. ACC-Aktivität wurde durch Verfolgen der NADPH-Oxidation gemessen.
  • Diacovich et al. (2002, J. Biol. Chem. 277: 31228–31236) kombinierte die Umwandlung von ADP, einem Hydrolyseprodukt von ATP, das als Kofaktor in der ACC-Reaktion verwendet wird, mit einer ADP-erfordernden Pyruvat-Kinase-Reaktion, die des Weiteren an die Bildung von Pyruvat unter Verwendung von Lactatdehydrogenase gekoppelt wurde. Das letztere Enzym erfordert NADH als Kofaktor, dessen Oxidation verfolgt wurde.
  • ACC radioaktive Enzymassays
  • Der am häufigsten verwendete In-vitro-ACC-Assay basiert auf der Verwendung von radioaktivem C14-Carbonat. Die Inkorporation radioaktiven Carbonats in einer Säure und einem nicht-flüchtigen Stoff (d. h. Malonyl-CoA) wird verfolgt. Das 14C-markierte Natriumbicarbonat, das nicht zu Malonyl-CoA umgewandelt wurde, wird durch eine Säure und Wärmebehandlung entfernt, die das verbleibende NaH14CO3 und die möglichen Nebenprodukte der Reaktion in 14C-markiertes CO2 umwandelt.
  • Dieser durch Diacovich et al. (2002, J. Biol. Chem. 277: 31228–31236) beschriebene Assay wurde mit geringfügigen Änderungen verwendet, um ACC-Aktivität in Hefe-Lysaten zu erkennen (Shi et al. 2014, mBIO 5:3 e01130-14). Die Zell-Lysate wurden aus Hefezellen zubereitet, die während der späten exponentiellen oder stationären Phase gewonnen wurden. Die Zellen wurden gewaschen und anschließend in Lysepuffer resuspendiert, der 100 mM Kaliumphosphat pH 7.5, 2 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol und 1 × EDTA-freien Complete-Proteasehemmer (Roche) enthielt. Die Zellen wurden durch Glasperlen zerschlagen und der Überstand wurde nach der Zentrifugierung bei 4°C gesammelt.
  • Das ACC-Enzymassay-Reaktionsgemisch wies 100 mM Kaliumphosphat (pH 8,0), 300 μg BSA, 3 mM ATP, 5 mM MgCl2, 10 mM NaH14CO3 [spezifische Aktivität 200 μCi mmol–1 (7400 kBq mmol)] und 0,5 mM Acetyl-CoA auf. Gesamtvolumen der Reaktion war 100 μl, das 20 μl Zellextrakt aufwies.
  • Die Reaktion wurde bei 30°C für 15 min inkubiert und durch Zugeben von 50 μl 5 M HCl gestoppt. Der Inhalt der Röhrchen wurde bei 95°C zur Trockne verdampft und der Rückstand wurde in 100 μl Wasser resuspendiert und mit 3 ml des Szintillationscocktails (Ultima Gold AB, PerkinElmer) gemischt. Der 14C-Gehalt der Proben wurde unter Verwendung eines Flüssigkeits-Szintillationszählers (PerkinElmer Tri-Carb 2810TR) bestimmt.
  • AADH-Enzymassay
  • AADH-Aktivität wurde, wie von Kozak et al. (2014, Metab. Eng. 21: 46–59) beschrieben, durch die Überwachung der Reduktion von NAD+ bei 340 nm bei 30°C gemessen. Die Hefezellen für die Zell-Lysate wurden gesammelt, mit Wasser gewaschen und dann in Lysepuffer resuspendiert, der 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) und 1X EDTA-freien Proteasehemmer-Cocktail (Roche) enthielt. Die Zellen wurden mit Glasperlen in einem Precellys 24 Homogenisierer bei 5500 U/min für 3 × 40 Sekunden lysiert und zwischen den Runden auf Eis gehalten. Lysate wurden bei 16000 g für 20 min bei 4°C zentrifugiert und Überstände wurden gesammelt. Die gesamte Proteinkonzentration wurde unter Verwendung der Bradford-Methode bestimmt.
  • Das Enzym-Assay-Reaktionsgemisch enthielt 0,1 mM Coenzym A, 50 mM CHES-Puffer (pH 9,5), 0,8 mM NAD+, 0,2 mM DTT und 10 μl Zellenextrakt in einem gesamten Reaktionsvolumen von 200 μl. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 10 mM frisch zubereiteter Acetaldehyd-Lösung gestartet und die Reduktion von NAD± wurde mit einem Thermo Konelab 20XT-Analysator verfolgt.
  • MCR-Enzymassay aus Hefezell-Lysaten
  • Die MCR-Enzymaktivität wurde gemäß der von Chen et al. beschriebenen Methode (2014, Metab. Eng. 22: 104–109) mit geringfügigen Änderungen gemessen. Die Methode basiert auf der Überwachung der Oxidation von NAD(P)H bei 340 nm.
  • Zellen wurden gesammelt und mit kaltem Waschpuffer mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM NaN3 gewaschen und dann in 1 ml Abbaupuffer resuspendiert, der 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM KCl 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 und 1X EDTA-freien Proteasehemmer-Cocktail (Roche) enthielt. Die Zellen wurden mit Glasperlen in einem Precellys 24 Homogenisierer bei 5500 U/min für 3 × 40 Sekunden lysiert und zwischen den Runden auf Eis gehalten. Lysate wurden bei 16000 g für 20 min bei 4°C zentrifugiert und Überständen wurden gesammelt. Die gesamte Proteinkonzentration wurde unter Verwendung der Bradford-Methode bestimmt.
  • Das MCR-Assay-Gemisch enthielt 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 5 mM MgCl2, 0,3 mM NADPH oder NADH. Nach Zugben von 20 μl Zell-Lysat in ein gesamtes Reaktionsvolumen von 200 μl wurde die Reaktion für fünf Minuten bei 30°C prä-inkubiert, nach denen die Reaktion durch Zugabe von 0,15 mM Malonyl-CoA gestartet wurde. Der Assay wurde bei 340 nm mit einem Thermo Konelab 20XT-Analysator überwacht.
  • Herstellung von Hefe-Expressionsvektoren
  • Eine Reihe von Hefe-Expressionsplasmiden wurden hergestellt, um die Kandidatengene auf ihre Expressions- und Aktivitätsfähigkeiten in Hefe zu bewerten. Erstens wurde ein neuer, pBlueScript-basierter Polylinker (MCS) so konzipiert, dass alle möglichen Restriktionsenzym-(RE)-Stellenkombinationen verwendet werden könnten. Dieser veränderte MCS wurde dann in die pRS-basierte Reihe von zentromerischen und Multikopie-Hefeplasmiden eingesetzt. Darauf folgend wurden unter Verwendung eines Satzes von 10 einzigartigen RE-Stellen neun unterschiedliche Sätze von Promoter und Terminatoren in diese pRS-basierte Hefe-Expressionsvektoren geklont. Somit könnte dieses Plasmidsystem genutzt werden, um bis zu 9 Gene gleichzeitig konstituiv entweder mit einer niedrigen oder hohen Kopieanzahl in einem geeigneten Hefestamm zu exprimieren, um eine Vielzahl von Komplementweg-Enzymkombinationen für die Produktion von 3-HP zu bewerten.
  • Klonen der ACC-Gene
  • ACC1-Gene, die in den industriellen S. cerevisiae VSK-128-Stamm mit und ohne SNFI-Deletion umgewandelt wurden, werden in Tabelle 13 dargestellt. ACC-Gene wurden von einem Multikopie-Plasmid exprimiert, wo sie unter Kontrolle des PDC1-Promoters standen. Mutierte ACC1sc-Gene, die in einer Veröffentlichung von Shi et al. (2014) beschrieben wurden, wurden mit einem QuikChange II Site Mutagenese Kit (Agilent Technologies) konstruiert. Tabelle 13. Acetyl-CoA-Carboxylase-Gene, umgewandelt zu S. cerevisiae VSK-128.
    ACC1sc S. cerevisiae-Wildtyp ACC1
    ACC1scS659A S. cerevisiae S659A-Mutante ACC1
    ACC1scS1157A S. cerevisiae S1157A-Mutante ACC1
    ACC1scS659A/S1157A S. cerevisiae S659A/S1157A-Mutante ACC1
    ACC1ch C. humilis-Wildtyp ACC
    ACC1ke K. exigua-Wildtyp ACC
    ACC1mc M Circinelloides-Wildtyp ACC
    ACC1yl Y. lipolytica-Wildtyp ACC
  • ACC-Enzymassays
  • In der Literatur wurden spektralphotometrische Assays verwendet, um ACC-Enzymaktivität mit gereinigten oder teilweise gereinigten ACC-Enzymen zu erkennen. Spektrophotometrische Assays wurden mit Hefezell-Lysaten getestet, in denen ACC überexprimiert wurde, aber keine Absorptionsänderung im Vergleich zu den Kontrollen erkannt wurde.
  • Der radioaktive ACC-Enzymassay ist sehr empfindlich, auch wenn pmol/mg/min-Aktivitäten erkannt werden können. Das Verfahren wurde zum ersten Mal mit gereinigtem menschlichen ACC-Enzym getestet, das kommerziell erhältlich ist. Als klare Aktivität festgestellt wurde, wurde das Verfahren weiter optimiert, um ACC-Aktivität aus Hefezell-Lysaten zu erkennen. Die in der Tabelle 13 aufgeführten Stämme wurden auf ihre ACC1-Aktivität und auf der Grundlage der Ergebnisse getestet; eine Liste, die die relative Rangfolge der ACC1s beschreibt ( ), wurde erstellt. Der aussichtsreichste Kandidat ACCyl wurde weiter untersucht und die Ergebnisse des S. cerevisiae S-128-Wildtyp-Stamms und desselben Stamms, in dem ACC1 überexprimiert wurde, werden in Tabelle 14 dargestellt. Tabelle 14. Die Überexpression des ACCyl-Gens führte zu einem 2,9-fachen Anstieg in der ACC1-Enzymaktivität im Vergleich zu der endogenen ACC1-Aktivität des Wildtyp-S. cerevisiae VSK-128-Stamms.
    Mittlere ACC1-Aktivität (pmol min–1 mg Gesamtprotein–1) Std. Abw. Anzahl der Replikate
    S. cerevisiae VSK-128 Wildtyp 25,55 0,74 2
    S. cerevisiae VSK-128 (ACC1yl) 73,79 17,23 4
  • AADH In-vitro-Enzymaktivitätsassays
  • Fünf AADH-Gene wurden ursprünglich ausgewählt (d. h. ADHEpm, ADHEec, EUTec, EUTdz und LIN1129li) und wurden in den CEN.PK-Laborstamm umgewandelt. Diese AADHs wurden von einem Multikopie-Plasmid exprimiert, wo sie unter Kontrolle des TEF1-Promoters standen. Alle fünf AADH-Gene zeigten AADH-Aktivität, aber die drei AADH-Gene vom eutE-Typ (d. h. EUTec, EUTdz und LIN1129li) ergaben eine viel höhere AADH-Aktivität in Hefe im Vergleich zu den AADHs vom adhE-Typ (d. h. ADHEpm und ADHEec).
  • Zwanzig weitere neuartige AADH-Gene wurden aus den Genomanalysen ausgewählt, um auf Expression und Enzymaktivität in Hefe bewertet zu werden. Diese zwanzig neuartigen AADH-Gene wurden auf In-vitro-Enzymaktivität getestet und bei vier von ihnen (d. h. AADHmm, AADHab, AADHbw und AADHvs) wurde gezeigt, dass sie AADH-Aktivität haben.
  • AADH In-vivo-Wachstumsassays
  • Alle Kopien der ACS2-Gene wurden bei dem industriellen S. cerevisiae VSK-128-Stamm entfernt, um einen Stamm mit einem defekten PDH-Bypass herzustellen, der unfähig war, auf Glucose-basiertem Medium zu wachsen. Expressionsvektoren, die 25 verschiedene AADH-Varianten tragen, wurden daraufhin in diesem ACS2-Deletionsstamm umgewandelt, um ihre Fähigkeit zur Wiederherstellung des Wachstums dieses Stamms auf Glukose zu bewerten.
  • Zwölf verschiedene AADH-Varianten (d. h. EUTEec, EUTEdz, LIN1129li, AADHmm, AADHtl, AADHab, AADHta, AADHbs, AADHbw, AADHvs, AADHhs und ADHEec) waren fähig, das Wachstumsdefizit des ACS2-Deletionsstamms auf Grundlage ihrer Fähigkeit wiederherzustellen, auf Glucose-basierten Agarplatten zu wachsen. Es gab eine gute Korrelation zwischen den In-vitro-AADH-Enzymaktivitätsassays und den In-vivo-Wachstumswiederherstellungsanalysen.
  • Die Wachstumsrate der ersten neun AADH-Variantenstämme, von denen festgestellt wurde, dass sie fähig waren, das Wachstum des ACS2-Deletionsstamms wiederherzustellen, wurden daraufhin in Kultivierungen im Schüttelkolben bewertet und mit dem Wildtyp-Stamm verglichen, der den intakten PDH-Bypass enthält. Alle neun dieser AADH-Varianten waren fähig, > 50% der aeroben Wachstumsrate des S. cerevisiae VSK-128-Stamms zu erhalten, wenn sie auf Glukose wuchsen, und sechs dieser AADH-Varianten waren fähig, ≥ 80% der aeroben Wachstumsrate des S. cerevisiae VSK-128-Stamms zu erhalten.
  • MCR-Enzymassays in Hefen
  • Die acht Volllängen-Chloroflexus-MCR-Homologe wurden in ihre zwei funktionalen Domänen trunkiert und die MCR-spezifischen Domänen wurden auf Enzymaktivität in Hefe zusammen mit den sechs Archaeen-MCRs getestet. Diese MCRs wurden von einem Multikopie-Plasmid exprimiert, wo sie unter Kontrolle des TEF1-Promotors standen und wurden in den CEN.PK-Laborstamm umgewandelt.
  • MCRca (Chloroflexus aurantiacus) und sein Homolog MCRrc (Roseiflexus castenholzii) waren die einzigen zwei Chloroflexus-MCR-Homologe, die bei Verwendung von NADPH als Kofaktor eine MCR-Enzymaktivitäten ergaben, die höher als bei dem Wildtyp-Stamm war. Kein Enzymaktivität wurde bei diesen acht Chloroflexus MCR-Homologen bei Verwendung von NADH als Kofaktor beobachtet.
  • Drei der Archaeen-MCRs [Sulfolobales archaeon, Sulfolobus acidocaldarius (×2)] ergaben MCR-Enzymaktivitäten, die bei Verwendung von NADPH als Kofaktor höher als beim Wildtyp-Stamm waren und alle sechs der Archaeen-MCRs ergaben MCR-Enzymaktivitäten, die bei Verwendung von NADH als Kofaktor höher als beim Wildtyp-Stamm waren.
  • Heterologe Expression und Charakterisierung von Archaeen-MCRs
  • Auf pBAT T7 Promoter basierende Expressionskonstrukte wurden für vier unterschiedliche MCRs von Archaeen hergestellt, Metallosphaera sedula (MCRms), Sulfolobus tokodai (MCRst), Candidatus caldiarchaeum (MCRcc) und Sulfolobales archaeon (MCRsa1). Diese Konstrukte enthalten kein Reinigungs-Tag und waren für E. coli codonoptimiert und wurden unter den zuvor in diesem Bericht beschriebenen Bedingungen exprimiert (Tabelle 15). Tabelle 15. Übersicht über Konstrukte von Archaeen-MCRs zur Expression in E. coli. (ca – Chloroflexus aurantiacus, ms – Metallosphaera sedula, st – Sulfolobus tokodaii, cc – Candidatus caldiarchaeum, sa1 – Sulfolobales archaeon, sa2 – Sulfolobales acidocaldarius)
    Figure DE112015003962T5_0002
  • Ihre Aktivität wurde unter Verwendung der folgenden Assay-Bedingungen analysiert: 0,4 mM NAD(P)H; 0,15 mM Malonyl-CoA; Tris-HCl pH 7; 2 mM MgCl2. Assays mit 20-fach verdünnten Lysaten wurden im Mikrotiterplatten(MTP)-Format bei RT durchgeführt. Die Oxidation von NADPH oder NADH an A365 wurde im Zeitverlauf verfolgt. MCRsa1 und MCRst zeigten von den vier getesteten Archaeen-Genen die höchste MCR-Aktivität. Die MCR-Aktivitäten waren jedoch kleiner als diejenigen, die für das getaggte MCRca gemessen wurden. An NADPH oder NADH konnte bei der Candidatus caldiarchaeum MCR (MCRcc) (in dem E. coli Zelllysat) keine Aktivität gemessen werden.
  • Beim Analysieren dieser Konstrukte unter Verwendung von SDS-PAGE Gelen zeigte MCRsa1 die höchsten Expressionsniveaus in dem E. coli Lysat, während MCRcc nicht in löslicher Form exprimiert werden konnte; siehe das Gel (sa1 > ca > st > ms > cc) (3). Die Konstrukte MCRsa1 und MCRst scheinen eine doppelte Cofaktorpräferenz aufzuweisen und zeigten etwa 40–50% relative NADH-Aktivität im Vergleich zu derjenigen, die an NADPH gemessen wurde. MCRst ist möglicherweise hinsichtlich der spezifischen Aktivität das aktivste Enzym der vier getesteten Archaeen-MCRs, da es ein relativ hohes Aktivitätsniveau bei einem relativ niedrigen Expressionsniveau zeigte.
  • Beispiel 4: Produktion von 3-HP durch Kultivieren einer rekombinanten Hefe Kultivierung von S. cerevisiae im Schüttelkolben
  • Eine kleine Zellschleife wurde aus Stämmen entnommen, die frisch auf Platten gezüchtet worden waren, die auf selektivem Agar basierten, und wurden zum Inokulieren von 20 mL selektivem SC-basiertem Medium (20 g/L Glucose) in einem 250 mL-Kolben verwendet und 2 Tage gezüchtet (30°C, 250 UpM), bis die gesamte Glucose und das gesamte Ethanol verbraucht waren. Die am Ende vorhandene Zelldichte wurde gemessen, und die Kulturen wurden 5 min mit 4000 UpM zentrifugiert. Die Überstände wurden dann mittels HPLC oder GC/MS analysiert, um die Akkumulation von 3-HP und anderen Hauptmetaboliten in den Kulturüberständen zu bestimmen. Es wurden jedoch je nach speziellem Stamm und Ziel (z. B. Ausgangsmenge an Glucose, Menge der Belüftung, Typ des Mediums und Zusatz von zusätzlichen Substanzen zu dem Medium, usw.) auch andere Kultivierungsbedingungen getestet.
  • Beispiel 5: Kultivierung von S. cerevisiae im Bioreaktor
  • Kulturen wurden in Multifors-Bioreaktoren (maximales Arbeitsvolumen 500 mL, 2 4-schaufelige Rusthon-Turbinenlaufräder, Infors HT, Schweiz) durchgeführt, die 250–500 mL Medium enthielten. Die Kulturen wurden auf 30°C, 300 oder 900–950 UpM mit anfangs 1,2, 2,4 oder 3,6 Volumina Gas (Volumenkultur)–1 min–1 (VVM) gehalten. Der pH-Wert der Kultur wurde durch Zugabe von steriler 2 M NaOH oder 2 M H3PO4 auf pH 5,5 ± 0,2 konstant gehalten. Clerol FBA 3107 Antischaum (Cognis France, Ponthierry Paris, Frankreich; 0,03% V/V) wurde zugegeben, um die Schaumproduktion zu kontrollieren. Die Gaskonzentration (CO2, O2, N2 und Ar) wurde kontinuierlich in einem Prima Pro Process Massenspektrometer (Thermo Scientific, UK) analysiert, das mit 3% CO2 in Ar, 5% CO2 mit 0,99% Ar und 15% O2 in N2, 20% O2 plus 20% Ar in N2 sowie 0,04% Ethanol in N2 kalibriert worden war.
  • Die Stämme wurden über Nacht in geschüttelten Kolben in SCD-basiertem selektivem Medium vorgezüchtet und zum Inokulieren der Bioreaktoren verwendet. Die Chargenphase der Kulturen (20 g/L Anfangsglucose) wurde 14 bis 20 h weitermachen gelassen, und die Glucosezufuhr wurde erst gestartet, nachdem die Glucose verbraucht worden war, aber entweder nach oder bevor Ethanol verbraucht worden war (je nach Zielsetzung der Kultivierung). Die Glucosezufuhrrate wurde auf 0,38 – 0,65 g L–1 h–1 gehalten (je nach Zielsetzung der Kultivierung). Überstandproben wurden dann mittels HPLC analysiert, um die Akkumulation von 3-HP und anderen Hauptmetaboliten in den Kulturen zu bestimmen.
  • Beispiel 6: 3-HP-Analyse aus Zellkulturüberständen mittels HPLC
  • Die Kulturüberstandproben wurden mit dem Waters Alliance e2695 HPLC-System (Waters, Milford, USA) analysiert, wobei das Injektionsvolumen 10 μl betrug. Als stationäre Phase wurde in der HPLC eine Aminex HPX-87H Organic Acid Column (Säule für organische Säure) (300 mm × 7,8 mm) (Bio-Rad, USA) verwendet, die an eine Fast Acid Analysis Column (schnelle Säureanalysesäule) (100 mm × 7,8 mm) (Bio-Rad, USA) gekoppelt war. Die Säulen wurden auf +55°C gehalten, und als Eluierungsmittel wurde 5,0 mM H2SO4 (Merck KgaA, Deutschland) mit der Flussrate von 0,3 oder 0,5 ml min–1 verwendet. Zur Detektierung von 3-Hydroxypropionsäure, Glucose, Acetat, Succinat, Pyruvat, Glycerin und Ethanol wurden ein Waters 2489 Dualwellenlängen-UV(210 nm)-Detektor (Waters, Milford, USA) und ein 2414 Differentialrefraktometer (Waters, Milford, USA) verwendet.
  • Beispiel 7: 3-HP -Analyse aus Zellkulturüberständen mittels GC/MS
  • Die Testproben und Standardkurve wurden auf folgende Weise vorbereitet: Überstand (0,5 ml) wurde mit 50 μl of HCl (6 N) angesäuert und mit 3-HPA (TCI) Standard (in Ethylacetat) versetzt. 5 μl der Milchsäurelösung als interner Standard (Sigma Aldrich (ISOTEC) Natrium-L-lactat-3,3,3-d3 98 Atom%; 5,5 g/l) und ungefähr 0,2 g NaCl wurden zugefügt. Da markierte 3-HP nicht im Handel erhältlich ist, wurde dieses Milchsäureprodukt mit stabilem Isotop als interner Standard verwendet, da es die erhältliche Verbindung war, die 3-HP strukturell/chemisch am ähnlichsten war, die nicht in der Probenmatrix vorhanden ist. Die Mischung wurde in einem Vortex-Mischer ungefähr 3 Minuten geschüttelt. Die Probe wurde dann zwei Mal mit 0,5 ml Ethylacetat extrahiert, indem sie ungefähr 3 Minuten in einem Vortex-Mischer gemischt wurde. Die Phasen wurden getrennt, indem 5 Minuten lang mit 10000 UpM zentrifugiert wurde. Die oberen Phasen wurden in einem GC-Vial aufgefangen und eingedampft. Die getrockneten Rückstände wurden mit MSTFA (50 μl), das 1% TMCS enthielt, durch Inkubieren für 1 Stunde bei 60°C derivatisiert. Die Standards für die Kalibrierkurve wurden in der gleichen Weise wie die Proben extrahiert, um Fehler zu minimieren.
  • Die Proben wurden mit einem Agilent 6890 Gaschromatographen (GC) kombiniert mit einem Agilent 5973 masseselektiven Detektor (MSD) vermessen. Die Injektor-(Injektionvolumen 1 μl Teilungsverhältnis 20:1) und MSD-Schnittstellentemperaturen waren 280°C, und das Ofentemperaturprogramm war 50°C bis 280°C mit einer Rate von 20°C/min. Die Analysen wurden an einer Agilent HP-5MS Kapillarsäule (30 m, ID 200 μm, Filmdicke 0,25 μm; Agilent 19091S-433) durchgeführt. Die Identifikationen der Verbindungen basierten auf einer Spektralsuche aus der NIST-Bibliothek. 3-HP wurde durch Überwachen von m/z 147 und m/z 219 detektiert, und 3-HP-Dimer wurde durch Überwachen von m/z 177 detektiert. Es wurden Fünfpunkt-Kalibrierkurven (c = 1 – 400 mg/l) unter Verwendung der 3-HP-Reaktionen konstruiert, und zur Normalisierung wurde ein interner Standard genutzt. Die Quantifizierung erwies sich in diesem Konzentrationsbereich als linear. Zusammen mit den Proben wurden Blindproben analysiert.
  • Beispiel 8: Beurteilung von S. cerevisiae Plasmidexpressionsstämmen
  • Die 3-HP-Plasmidexpressionsstämme exprimierten gleichzeitig ein, zwei oder drei Enzyme des 3-HP-Stoffwechselwegs (d. h. AADH, ACC1, MCR und HPDH) aus zwei unterschiedlichen Expressionsplasmiden (d. h. pSK-084 und/oder pSK-085) (4). Diese Stämme wurden verwendet, um die Auswirkungen der unterschiedlichen Enzyme des 3-HP-Stoffwechselwegs (und Kombinationen dieser Enzyme) auf die Produktion von 3-HP in dem VSK-128 säuretoleranten S. cerevisiae Stanzen zu beurteilen. Die Stämme wurden in 20 mL selektivem SC-basierendem Medium (20 g/L Glucose) in 250 mL Kolben kultiviert und 2 Tage (30°C, 250 UpM) gezüchtet, bis die gesamte Glucose und das gesamte Ethanol verbraucht worden waren.
  • Beispiel 9: Zusammenfassung der in vivo-Aktivitätsanalysen der Enzyme des Stoffwechselwegs
  • Fünfundzwanzig AADHs, 8 ACC1s, 10 bifunktionale HPDH-MCRs, 6 Archaeen-MCRs und 28 HPDHs in Tabelle 16 wurden auf ihre Fähigkeit zur Produktion von 3-HP in verschiedenen S. cerevisiae Stämmen analysiert, die nach Bedarf auch zusätzliche Enzyme des 3-HP-Stoffwechselwegs exprimierten. Es wurde gezeigt, dass viele neue Enzyme des 3-HP-Stoffwechselwegs (erhalten aus Genome Mining-Analysen) in Hefe aktiv waren und viele von ihnen hervorragende Eigenschaften besaßen (d. h. höhere Aktivitäten, bessere Cofaktorpräferenz), verglichen mit zuvor veröffentlichten Enzymen des 3-HP-Stoffwechselwegs. [Tabelle 16]
    Typ Genabkürzung SEQ ID NRn.
    Gene, die für AADHs kodieren AADHab SEQ ID NO:3
    AADHal SEQ ID NO:4
    AADHbs SEQ ID NO:5
    AADHbw SEQ ID NO:6
    AADHcs SEQ ID NO:7
    AADHho SEQ ID NO:8
    AADHhs SEQ ID NO:9
    AADHma1 SEQ ID NO:10
    AADHma2 SEQ ID NO:11
    AADHmm SEQ ID NO:12
    AADHpa SEQ ID NO:13
    AADHpb SEQ ID NO:14
    AADHpe SEQ ID NO:15
    AADHrw SEQ ID NO:16
    AADHsl SEQ ID NO:17
    AADHss SEQ ID NO:18
    AADHta SEQ ID NO:19
    AADHtl SEQ ID NO:20
    AADHtm SEQ ID NO:21
    AADHvs SEQ ID NO:22
    ADHEec SEQ ID NO:23
    AHEpm SEQ ID NO:24
    EUTEdz SEQ ID NO:25
    EUTEec SEQ ID NO:26
    LIN1129li SEQ ID NO:27
    ACC1sc_S659A SEQ ID NO:28
    ACC1sc_S659A/S1157A SEQ ID NO:29
    ACC1sc_S1157A SEQ ID NO:30
    Gene, die für ACC1s kodieren ACC1ke SEQ ID NO:31
    ACC1mc SEQ ID NO:32
    ACC1sc SEQ ID NO:33
    ACCyl SEQ ID NO:34
    ACC1ch SEQ ID NO:35
    Gene, die für bifunktionale HPDH-MCRs kodieren HPDH-MCRbs SEQ ID NO:36
    HPDH-MCRca SEQ ID NO:37
    HPDH-MCRcag SEQ ID NO:3 8
    HPDH-MCRct SEQ ID NO:39
    HPDH-MCRgb SEQ ID NO:40
    HPDH-MCRot SEQ ID NO:41
    HPDH-MCRrc SEQ ID NO:42
    HPDH-MCRsl SEQ ID NO:43
    HPDH-MCRca_variant_3 SEQ ID NO:44
    HPDH-MCRca_variant_6 SEQ ID NO:45
    BDHcm SEQ ID NO:46
    BDHkp SEQ ID NO:47
    HBDHos SEQ ID NO:48
    HBDHps SEQ ID NO:49
    HIBADHas SEQ ID NO:50
    HIBADHbc SEQ ID NO:51
    HIBADHma SEQ ID NO:52
    Gene, die für HPDHs kodieren HIBADHpa SEQ ID NO:53
    HIBADHxc SEQ ID NO:54
    HPDHam SEQ ID NO:55
    HPDHbs SEQ ID NO:56
    HPDHca SEQ ID NO:57
    HPDHcag SEQ ID NO:58
    HPDHct SEQ ID NO:59
    HPDHec SEQ ID NO:60
    HPDHed SEQ ID NO:61
    HPDHgb SEQ ID NO:62
    HPDHhw SEQ ID NO:63
    HPDHka SEQ ID NO:64
    HPDHms SEQ ID NO:65
    HPDHot SEQ ID NO:66
    HPDHps SEQ ID NO:67
    HPDHra SEQ ID NO:68
    HPDHrc SEQ ID NO:69
    HPDHsi SEQ ID NO:70
    HPDHsl SEQ ID NO:71
    HPDHsm SEQ ID NO:72
    HPDHst SEQ ID NO:73
  • Beispiel 10: Schüttelkolben-Kulturversuche mit S. cerevisiae zur Produktion von 3-HP
  • Kultivierungsbedingungen
  • An einigen frühen Teststämmen wurden verschiedene unterschiedliche Kultivierungsbedingungen beurteilt, um zu sehen, wie die verschiedenen Kulturbedingungen die Fähigkeit des Stamms beeinflussten, 3-HP zu produzieren. Der Stamm S. cerevisiae VSK-128 (Δura3, Δhis3) exprimierte zwei Plasmide, wobei eines der Plasmide entweder das HIBADHpa oder das HPDHec Gen enthielt, und das zweite Plasmid enthielt das MCRsa2 Gen. Beide Stämme verhielten sich während der Kultivierungen ähnlich und hatten sehr ähnliche Metabolitenprofile.
  • Es wurden sechs unterschiedliche Kultivierungsbedingungen in Schüttelkolben getestet:
    • 1. Aerob, Chargenprozess, hohe Anfangsglucose (120 g/L). An Tag 3 wurden weitere 100 g/L Glucose zugefügt.
    • 2. Anaerob, Chargenprozess, hohe Anfangsglucose (100 g/L). Die Kolben wurden versiegelt, und das Schütteln war mit 100 UpM langsamer.
    • 3. Aerob, Chargenprozess, wiederholtes Versetzen mit Glucose Anfangsglucose war 20 g/L, danach wurden an jedem Folgetag 40 g/L zugegeben.
    • 4. Aerob, simulierter gefütterter Chargenprozess, viele Anfangsglucosetabletten.
    • Anfangs wurden 5 Tabletten zugegeben, weitere 5 Tabletten wurden an Tag 3 zugegeben. Täglich wurden verschiedene Mengen an Enzym A Lösung (50–150 μl pro Tag) zugegeben.
    • 5. Aerob, simulierter gefütterter Chargenprozess, wiederholtes Versetzen mit Glucosetabletten. 1 Tablette wurde anfangs zugegeben, 2 Tabletten wurden an den Tagen 1 und 2 zugegeben, 3 Tabletten wurden an den Tagen 3 und 4 zugegeben. Täglich wurden verschiedene Mengen an Enzym A Lösung (50–150 μl pro Tag) zugegeben.
    • 6. Aerob, Chargenprozess, wiederholtes Versetzen mit Galactose. Anfangsgalactose war 20 g/L, danach wurden an jedem Folgetag 40 g/L zugegeben.
  • Es wird bei den simulierten gefütterten Chargenkultivierungen angenommen, dass jede Tablette 0,5 g Glucose freisetzt (was 20 g/L Glucose in unseren Kulturvolumina von 25 ml entspricht). Die Tabletten bestehen im Wesentlichen aus Glucose (d. h. Stärke) und einer Enzym A Lösung (d. h. Amylase), wodurch während der Kultivierungen im Schüttelkolben die kontrollierte langsame Freisetzung von Glucose in das Medium möglich ist. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass Glucose-limitierte gefütterte Chargenbedingungen den Wandel zu Wachstum hin und anschließend zur 3-HP-Produktion begünstigen können.
  • Zellwachstum
  • Alle der regulären Glucose-basierten Kultivierungen wuchsen in ähnlicher Weise, und die mit Galactose gefütterte Kultivierung wuchs langsamer. Die Bedingungen der gefütterten Charge begünstigten andererseits mehr Zellwachstum, verglichen mit den anderen Kultivierungsbedingungen. Die Bedingungen der gefütterten Charge (Versetzen mit Tabletten) begünstigten insbesondere ein starkes Wachstum früh in der Kultivierung.
  • 3-HP-Produktion
  • Der überwiegende Teil des Wachstums war bei diesen Kultivierungen allgemein bis zum Ende von Tag 2 aufgetreten, und der wesentliche Hauptteil von 3-HP war auch bis Tag 2 produziert worden, was anzeigt, dass Wachstum und 3-HP-Produktion miteinander verknüpft sind. Die Kultivierungsbedingungen der gefütterten Charge (Versetzen mit Tabletten) produzierte die meiste 3-HP (~0,85 g/L), und die mit Galactose gefütterten Kultivierungen produzierten die geringste Menge an 3-HP (~0,12 g/L), und die anderen Kultivierungsbedingungen produzierten alle etwa 0,3 bis 0,4 g/L 3-HP. Diese Ergebnisse zeigen, dass Kultivierungsbedingungen eine große Wirkung auf die 3-HP-Produktionsniveaus (5) haben können.
  • Glucoseverbrauch
  • Glucose wurde in allen der Kultivierungsversuche bis zu den Tagen 2–3 rasch verbraucht, danach sanken die Glucoseverbrauchsraten signifikant (während der Tage 4–5) zusammen mit Wachstum und 3-HP-Produktion. Bei den Kultivierungen der gefütterten Charge schien Glucose so rasch konsumiert zu werden, wie sie aus den Tabletten freigesetzt wurde, was nahelegt, dass diese Kultivierungen unter Glucoselimitierten Bedingungen durchgeführt wurden.
  • Akkumulation von Glycerin, Acetat und Ethanol
  • Die Akkumulation von Glycerin war für die mit Glucose gefütterten Kultivierungen recht hoch und für die mit Galactose gefütterten Kultivierungen viel niedriger. Die Acetatakkumulation war unter den unterschiedlichen Kultivierungsbedingungen recht ähnlich, die Bedingungen mit gefütterter Charge (viele Tabletten) produzierten jedoch mehr Acetat.
  • In den meisten dieser Kultivierungen im Schüttelkolben sammeln sich große Mengen an Ethanol an, insbesondere in den Glucose-Chargenkultivierungen und den Kultivierungen mit Versetzen mit Glucose. Die gefütterten Chargenkultivierungen zielten darauf, Glucose-limitierte Bedingungen zu repräsentieren, um. Überflussmetabolismus zu reduzieren, und dieser Ansatz scheint erfolgreich gewesen zu sein, da die Ethanolakkumulation in den gefütterten Chargenkultivierungen signifikant niedriger war.
  • Kultivierung eines etabliereren 3-HP-Produktionsstamms
  • Ein zusätzlicher 3-HP-Produktionsstamm [(EutEec, HPDH-MCRca, ACC1sc_S1157A) und (HIBADHpa, MCRsa2)] wurde gemäß den vielversprechendsten Kultivierungsbedingungen mit gefütterter Charge (Versetzen mit Tabletten) kultiviert, um seine Leistung zu prüfen.
  • Das meiste des Wachstums hatte wiederum bis zum Tag 3 stattgefunden, und die meiste 3-HP-Produktion hatte bis zum Tag 3 stattgefunden. Unter diesen Kultivierungsbedingungen übertraf die 3-HP-Produktion bei diesem Stamm 1,2 g/L, (6).
  • Obwohl konkrete Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung detailliert beschrieben sind, wird es für Fachleute offensichtlich sein, dass die konkrete Beschreibung sich lediglich auf erwünschte beispielhafte Ausführungsformen bezieht und nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränkend angesehen werden sollte. Der wesentliche Umfang der vorliegenden Erfindung ist daher durch die angefügten Ansprüche und deren Äquivalent definiert.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die Verwendung der rekombinanten Hefe und des Verfahrens zur Herstellung von 3-HP der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Produktion von 3-HP in einer hohen Konzentration und einer hohen Ausbeute bei einem niedrigen pH-Wert aus einem brauchbaren Zucker, wie Glucose, wodurch zur wirtschaftlichen Produktion von 3-HP aus Biomasse und deren angewandten Produkten wesentlich beigetragen wird.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (13)

  1. Rekombinante Hefe, umfassend einen aktiven Stoffwechselweg zur Biosynthese von 3-HP gemäß [Pyruvat → Acetaldehyd → Acetyl-CoA → Malonyl-CoA → Malonatsemialdehyd → 3-HP], wobei die Hefe umfasst: ein exogenes Gen, das für AADH kodiert; ein endo- oder exogenes Gen, das für ACC kodiert; ein exogenes Gen, das für MCR kodiert und ein exogenes Gen, das für HPDH kodiert.
  2. Rekombinante Hefe nach Anspruch 1, wobei das Gen, das für AADH kodiert, eine Nukleinsäure ist, die für AADH kodiert, mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 80% Sequenzidentität zu einer AADH-Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in den Tabellen 1–3 dargestellt sind.
  3. Rekombinante Hefe nach Anspruch 1, wobei das Gen, das für ACC kodiert, eine Nukleinsäure ist, die für ACC kodiert, mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 80% Sequenzidentität zu einer ACC-Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in Tabelle 4 dargestellt sind.
  4. Rekombinante Hefe nach Anspruch 1, wobei die MCR dahingehend bifunktional ist, dass die MCR gleichzeitig eine Funktion zum Umwandeln von Malonyl-CoA in Malonatsemialdehyd und eine Funktion zur Umwandlung von Malonatsemialdehyd in 3-HP hat.
  5. Rekombinante Hefe nach Anspruch 4, wobei das Gen, das für die bifunktionale MCR kodiert, eine Nukleinsäure ist, die für MCR kodiert, mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 80% Sequenzidentität zu einer MCR-Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in Tabelle 5 dargestellt sind.
  6. Rekombinante Hefe nach Anspruch 1, wobei die MCR dahingehend monofunktional ist, dass sie eine Funktion zum Umwandeln von Malonyl-CoA in Malonatsemialdehyd hat; und ferner ein Gen umfasst, welches für ein Enzym kodiert, das Malonatsemialdehyd in 3-HP umwandeln kann.
  7. Rekombinante Hefe nach Anspruch 6, wobei das Gen, das für die MCR kodiert, eine Nukleinsäure ist, die für MCR kodiert, mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 80% Sequenzidentität zu einer MCR-Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in Tabelle 6 dargestellt sind.
  8. Rekombinante Hefe nach Anspruch 6, wobei das Gen, das für ein Enzym kodiert, das Malonatsemialdehyd in 3-HP umwandeln kann, eine Nukleinsäure ist, die für ein Enzym kodiert, mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 80% Sequenzidentität zu einer HPDH-, HIBADH-, HBDH- oder BDH-Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in den Tabellen 7–10 dargestellt sind.
  9. Rekombinante Hefe nach Anspruch 1, wobei die Hefe säurebeständig ist.
  10. Rekombinante Hefe nach Anspruch 9, wobei die Hefe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua, Kazachstania bulderi und Candida humilis.
  11. Verfahren zum Herstellen von 3-HP, umfassend: (a) Kultivieren der rekombinanten Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem Medium, das mindestens eine Kohlenstoffquelle einschließt, wodurch 3-HP produziert wird; und (b) Isolieren von 3-HP aus der Kultur.
  12. Verfahren zum Herstellen von 3-HP nach Anspruch 11, wobei die Kohlenstoffquelle eine oder mehrere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Xylose, Arabinose, Saccharose, Fructose, Galactose, Cellulose, Glucoseoligomeren und Glycerin ist.
  13. Verfahren zum Herstellen von 3-HP nach Anspruch 11, wobei das Kultivieren bei einem pH-Wert im Bereich von 2,6 bis 4,0 durchgeführt wird.
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