JP2023156360A - キシリトールを生産するメチニコビア種 - Google Patents
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-
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Abstract
【課題】培養したときにキシロースからキシリトールを生産するメチニコビア種、キシリトールを生産する方法、及び生物由来キシリトールを有する組成物を提供する。【解決手段】単離されたメチニコビア種であって:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;及び(b)該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を含む、前記単離されたメチニコビア種を提供する。【選択図】図１
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、その内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、2016年12月21日に
出願された米国仮出願第62/437,606号の優先権の恩典を主張する。
本出願は、その内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、2016年12月21日に
出願された米国仮出願第62/437,606号の優先権の恩典を主張する。
(分野)
本発明は、分子生物学及び微生物学の分野に関する。本明細書に提供されるのは、培養
したときにキシロースからキシリトールを生産するメチニコビア種、並びにこれらのメチ
ニコビア種を作製及び使用する方法である。
本発明は、分子生物学及び微生物学の分野に関する。本明細書に提供されるのは、培養
したときにキシロースからキシリトールを生産するメチニコビア種、並びにこれらのメチ
ニコビア種を作製及び使用する方法である。
(配列表の参照)
本出願は、ASCII形式でEFS-Web経由で提出され、かつ引用により本明細書中に完全に組
み込まれる配列表を含有する。2017年12月19日に作成された該ASCIIコピーは、14305-001
-228_Sequence_Listing.txtという名称であり、サイズが170,340バイトである。
本出願は、ASCII形式でEFS-Web経由で提出され、かつ引用により本明細書中に完全に組
み込まれる配列表を含有する。2017年12月19日に作成された該ASCIIコピーは、14305-001
-228_Sequence_Listing.txtという名称であり、サイズが170,340バイトである。
(背景)
キシロースは、生物由来化学物質を生産するための再生可能原料であるリグノセルロー
ス系バイオマス中に存在する豊富な糖である。しかしながら、リグノセルロース系バイオ
マスの使用及び生物由来化学物質の生産は、微生物中でのもともと低いキシロース取込み
によって制限される。それゆえ、キシロースを用いて、キシリトールなどの生物由来化合
物を生産することができる微生物は、満たされていないニーズである。
キシロースは、生物由来化学物質を生産するための再生可能原料であるリグノセルロー
ス系バイオマス中に存在する豊富な糖である。しかしながら、リグノセルロース系バイオ
マスの使用及び生物由来化学物質の生産は、微生物中でのもともと低いキシロース取込み
によって制限される。それゆえ、キシロースを用いて、キシリトールなどの生物由来化合
物を生産することができる微生物は、満たされていないニーズである。
キシリトールは、糖の低カロリー、低炭水化物代用品として広く使用される五炭糖アル
コールである(Druckerらの文献、Arch of Oral Biol. 24:965-970(1979))。キシリトール
は、スクロースとほぼ同じ甘さであるが、33％低いカロリーを有する。キシリトールは、
糖尿病の人々及び高血糖症の個人のインスリンレベルに影響を及ぼさないと報告されてい
る。キシリトールの消費は、口腔衛生に有益であり、虫歯の発生率を低下させるとも報告
されている。例えば、チューインガム中のキシリトールは、ストレプトコックス・ミュー
タンスの成長を阻害すること(Haresakuらの文献、Caries Res. 41:198-203(2007))、及び
急性中耳炎の発生率を低下させること(Azarpazhoohらの文献、Cochrane Database of Sys
tematic Reviews 11:CD007095(2011))が報告されている。さらに、キシリトールは、健康
な歯のエナメル質の脱灰を阻害すること及び損傷した歯のエナメル質を再石灰化すること
が報告されている(Steinbergらの文献、Clinical Preventive Dentistry 14:31-34(1992)
; Maguireらの文献、British Dental J. 194:429-436(2003); Grillaudらの文献、Arch o
f Pediatrics and Adolescent Medicine 12:1180-1186(2005))。
コールである(Druckerらの文献、Arch of Oral Biol. 24:965-970(1979))。キシリトール
は、スクロースとほぼ同じ甘さであるが、33％低いカロリーを有する。キシリトールは、
糖尿病の人々及び高血糖症の個人のインスリンレベルに影響を及ぼさないと報告されてい
る。キシリトールの消費は、口腔衛生に有益であり、虫歯の発生率を低下させるとも報告
されている。例えば、チューインガム中のキシリトールは、ストレプトコックス・ミュー
タンスの成長を阻害すること(Haresakuらの文献、Caries Res. 41:198-203(2007))、及び
急性中耳炎の発生率を低下させること(Azarpazhoohらの文献、Cochrane Database of Sys
tematic Reviews 11:CD007095(2011))が報告されている。さらに、キシリトールは、健康
な歯のエナメル質の脱灰を阻害すること及び損傷した歯のエナメル質を再石灰化すること
が報告されている(Steinbergらの文献、Clinical Preventive Dentistry 14:31-34(1992)
; Maguireらの文献、British Dental J. 194:429-436(2003); Grillaudらの文献、Arch o
f Pediatrics and Adolescent Medicine 12:1180-1186(2005))。
商業的に、キシリトールは、キシロースの化学的還元によって生産することができるが
、これは、加水分解物からのキシロース又はキシリトールの分離及び精製に付随する困難
を示すことがある。キシリトールの生産用の微生物系が記載されている(Sirisansaneeyak
ulらの文献、J. Ferment. Bioeng. 80:565-570(1995); Onishiらの文献、Agric. Biol. C
hem. 30:1139-1144(1966); Barbosaらの文献、J. Ind. Microbiol. 3:241-251(1988); Go
ngらの文献、Biotechnol. Lett. 3:125-130(1981); Vandeskaらの文献、World J. Microb
iol. Biotechnol. 11:213-218(1995); Dahiyaらの文献、Cabdirect.org 292-303(1990);
Gongらの文献、Biotechnol. Bioeng. 25:85-102(1983))。例えば、カンジダ属由来の酵
母は、キシリトール生産に有用であると記載されている。しかしながら、カンジダ属種は
日和見病原体であり得るので、食品生産物に関連するプロセスにおけるこれらの生物の使
用は望ましくない。
、これは、加水分解物からのキシロース又はキシリトールの分離及び精製に付随する困難
を示すことがある。キシリトールの生産用の微生物系が記載されている(Sirisansaneeyak
ulらの文献、J. Ferment. Bioeng. 80:565-570(1995); Onishiらの文献、Agric. Biol. C
hem. 30:1139-1144(1966); Barbosaらの文献、J. Ind. Microbiol. 3:241-251(1988); Go
ngらの文献、Biotechnol. Lett. 3:125-130(1981); Vandeskaらの文献、World J. Microb
iol. Biotechnol. 11:213-218(1995); Dahiyaらの文献、Cabdirect.org 292-303(1990);
Gongらの文献、Biotechnol. Bioeng. 25:85-102(1983))。例えば、カンジダ属由来の酵
母は、キシリトール生産に有用であると記載されている。しかしながら、カンジダ属種は
日和見病原体であり得るので、食品生産物に関連するプロセスにおけるこれらの生物の使
用は望ましくない。
本明細書に提供されるメチニコビア種、方法、及び組成物は、これらのニーズを満たし
、他の関連する利点を提供する。
、他の関連する利点を提供する。
(発明の概要)
本明細書に提供されるのは、キシリトール経路を有する単離されたメチニコビア種であ
る。そのようなメチニコビア種は、キシロースを有する培地中で培養したとき、キシロー
スからキシリトールを生産することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に
記載されるキシリトール経路は、キシロースをキシリトールに変換するキシロースレダク
ターゼを含む。さらに、いくつかの実施態様において、単離されたメチニコビア種は、通
常であればキシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼに対す
る遺伝子修飾を含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される
のは、キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸、又はその代わ
りにもしくはそれに加えて、単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰
発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸を有する単離されたメチニコビア種である。
いくつかの実施態様において、また本明細書に提供されるのは、単離されたメチニコビア
種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単
離されたメチニコビア種である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるの
は:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は単離された
メチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性
核酸;及び(b)単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか
又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種である。
本明細書に提供されるのは、キシリトール経路を有する単離されたメチニコビア種であ
る。そのようなメチニコビア種は、キシロースを有する培地中で培養したとき、キシロー
スからキシリトールを生産することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に
記載されるキシリトール経路は、キシロースをキシリトールに変換するキシロースレダク
ターゼを含む。さらに、いくつかの実施態様において、単離されたメチニコビア種は、通
常であればキシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼに対す
る遺伝子修飾を含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される
のは、キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸、又はその代わ
りにもしくはそれに加えて、単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰
発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸を有する単離されたメチニコビア種である。
いくつかの実施態様において、また本明細書に提供されるのは、単離されたメチニコビア
種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単
離されたメチニコビア種である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるの
は:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は単離された
メチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性
核酸;及び(b)単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか
又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種である。
また本明細書に提供されるのは、特定の速度でキシロースからキシリトールを生産する
ことができる単離されたメチニコビア種である。例えば、いくつかの実施態様において、
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.50g/L/
h、少なくとも0.60g/L/h、少なくとも0.70g/L/h、少なくとも0.80g/L/h、少なくとも0.90
g/L/h、少なくとも1.00g/L/h、少なくとも1.50g/L/h、少なくとも2.00g/L/h、少なくとも
2.50g/L/h、少なくとも3.00g/L/h、少なくとも3.50g/L/h、少なくとも4.00g/L/h、少なく
とも5.00g/L/h、少なくとも6.00g/L/h、少なくとも7.00g/L/h、少なくとも8.00g/L/h、少
なくとも9.00g/L/h、又は少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産す
る。
ことができる単離されたメチニコビア種である。例えば、いくつかの実施態様において、
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.50g/L/
h、少なくとも0.60g/L/h、少なくとも0.70g/L/h、少なくとも0.80g/L/h、少なくとも0.90
g/L/h、少なくとも1.00g/L/h、少なくとも1.50g/L/h、少なくとも2.00g/L/h、少なくとも
2.50g/L/h、少なくとも3.00g/L/h、少なくとも3.50g/L/h、少なくとも4.00g/L/h、少なく
とも5.00g/L/h、少なくとも6.00g/L/h、少なくとも7.00g/L/h、少なくとも8.00g/L/h、少
なくとも9.00g/L/h、又は少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産す
る。
またさらに本明細書に提供されるのは、特定の濃度でキシロースからキシリトールを生
産することができる単離されたメチニコビア種である。例えば、いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも75
g/L、少なくとも80g/L、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なく
とも100g/L、少なくとも110g/L、少なくとも120g/L、少なくとも130g/L、少なくとも140g
/L、少なくとも150g/L、少なくとも160g/L、少なくとも170g/L、少なくとも180g/L、少な
くとも190g/L、少なくとも200g/L、少なくとも250g/L、又は少なくとも300g/Lのキシリト
ールをキシロースから生産する。
産することができる単離されたメチニコビア種である。例えば、いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも75
g/L、少なくとも80g/L、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なく
とも100g/L、少なくとも110g/L、少なくとも120g/L、少なくとも130g/L、少なくとも140g
/L、少なくとも150g/L、少なくとも160g/L、少なくとも170g/L、少なくとも180g/L、少な
くとも190g/L、少なくとも200g/L、少なくとも250g/L、又は少なくとも300g/Lのキシリト
ールをキシロースから生産する。
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、メチニコビア・プルケリマ(Metsc
hnikowia pulcherrima)、メチニコビア・フルクティコラ(Metschnikowia fructicola)、
メチニコビア・クリソペルラエ(Metschnikowia chrysoperlae)、メチニコビア・レウカウ
フィイ(Metschnikowia reukaufii)、メチニコビア・アンダウエンシス(Metschnikowia an
dauensis)、メチニコビア・シャンキシエンシス(Metschnikowia shanxiensis)、メチニコ
ビア・シネンシス(Metschnikowia sinensis)、メチニコビア・ジジフィコラ(Metschnikow
ia zizyphicola)、メチニコビア・ビクスピダータ(Metschnikowia bicuspidata)、メチニ
コビア・ルナータ(Metschnikowia lunata)、メチニコビア・ゾベルリイ(Metschnikowia z
obellii)、メチニコビア・アウストラリス(Metschnikowia australis)、メチニコビア・
アガウェアエ(Metschnikowia agaveae)、メチニコビア・グルエッシイ(Metschnikowia gr
uessii)、メチニコビア・ハワイエンシス(Metschnikowia hawaiiensis)、メチニコビア・
クリッシイ(Metschnikowia krissii)、メチニコビア属種株NS-O-85、及びメチニコビア属
種株NS-O-89から選択されるメチニコビア種であることができる。特定の実施態様におい
て、該単離されたメチニコビア種は、ブダペスト条約の条項の下で、2016年11月8日に、
国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(International Depositary Authority of Canad
a)に寄託された、アクセッション番号081116-01に指定されたメチニコビア種である。
hnikowia pulcherrima)、メチニコビア・フルクティコラ(Metschnikowia fructicola)、
メチニコビア・クリソペルラエ(Metschnikowia chrysoperlae)、メチニコビア・レウカウ
フィイ(Metschnikowia reukaufii)、メチニコビア・アンダウエンシス(Metschnikowia an
dauensis)、メチニコビア・シャンキシエンシス(Metschnikowia shanxiensis)、メチニコ
ビア・シネンシス(Metschnikowia sinensis)、メチニコビア・ジジフィコラ(Metschnikow
ia zizyphicola)、メチニコビア・ビクスピダータ(Metschnikowia bicuspidata)、メチニ
コビア・ルナータ(Metschnikowia lunata)、メチニコビア・ゾベルリイ(Metschnikowia z
obellii)、メチニコビア・アウストラリス(Metschnikowia australis)、メチニコビア・
アガウェアエ(Metschnikowia agaveae)、メチニコビア・グルエッシイ(Metschnikowia gr
uessii)、メチニコビア・ハワイエンシス(Metschnikowia hawaiiensis)、メチニコビア・
クリッシイ(Metschnikowia krissii)、メチニコビア属種株NS-O-85、及びメチニコビア属
種株NS-O-89から選択されるメチニコビア種であることができる。特定の実施態様におい
て、該単離されたメチニコビア種は、ブダペスト条約の条項の下で、2016年11月8日に、
国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(International Depositary Authority of Canad
a)に寄託された、アクセッション番号081116-01に指定されたメチニコビア種である。
いくつかの実施態様において、該単離されたメチニコビア種に導入されるキシロースレ
ダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸は、異種核酸である。
ダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸は、異種核酸である。
いくつかの実施態様において、該キシロースレダクターゼは、配列番号11～18から選択
されるアミノ酸配列を有する。特定の実施態様において、該キシロースレダクターゼは、
配列番号11のアミノ酸配列又は配列番号11と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ
酸配列を有する。
されるアミノ酸配列を有する。特定の実施態様において、該キシロースレダクターゼは、
配列番号11のアミノ酸配列又は配列番号11と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ
酸配列を有する。
いくつかの態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、遺伝子
修飾を含み、ここで、該遺伝子修飾は、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒ
ドロゲナーゼ又はその部分をコードする少なくとも1つのアレルの欠失を含む。特定の実
施態様において、該遺伝子修飾は、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロ
ゲナーゼ又はその部分をコードする両方のアレルの欠失を含む。
修飾を含み、ここで、該遺伝子修飾は、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒ
ドロゲナーゼ又はその部分をコードする少なくとも1つのアレルの欠失を含む。特定の実
施態様において、該遺伝子修飾は、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロ
ゲナーゼ又はその部分をコードする両方のアレルの欠失を含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、キシロ
ーストランスポーターをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は単離されたメチニコ
ビア種のキシローストランスポーターの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸
をさらに含む。該キシローストランスポーターは、いくつかの実施態様において、配列番
号27～40から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施態様において、該キシロース
トランスポーターは、配列番号27～36のいずれか1つのアミノ酸配列又は配列番号27～36
のいずれか1つと少なくとも30％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
ーストランスポーターをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は単離されたメチニコ
ビア種のキシローストランスポーターの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸
をさらに含む。該キシローストランスポーターは、いくつかの実施態様において、配列番
号27～40から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施態様において、該キシロース
トランスポーターは、配列番号27～36のいずれか1つのアミノ酸配列又は配列番号27～36
のいずれか1つと少なくとも30％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、キシリトールを生産する方法で
ある。いくつかの実施態様において、本方法は、本明細書に提供される単離されたメチニ
コビア種を、キシロースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに十分な
期間培養することを含む。本方法は、該単離されたメチニコビア種を、キシロース及びC3
炭素源、C4炭素源、C5炭素源、C6炭素源、又はこれらの組合せを含む培地中で培養するこ
とを含むことができる。いくつかの実施態様において、該条件は、該単離されたメチニコ
ビア種を、キシロース並びにセロビオース、ガラクトース、グルコース、エタノール、ア
セテート、アラビノース、アラビトール、ソルビトール、及びグリセロール、又はこれら
の組合せから選択される共基質を含む培地中で培養することを含む。特定の実施態様にお
いて、該共基質はグルコースである。また別の特定の実施態様において、該培地は、キシ
ロースとセロビオースの組合せ、又はキシロースとガラクトースの組合せ、又はキシロー
スとグリセロールの組合せを含む。培養条件は、好気的培養条件を含むこともできる。培
養は、回分培養、流加培養、又は連続培養を含むことができる。いくつかの実施態様にお
いて、本方法は、例えば、抽出、連続液液抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透、電
気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸収クロ
マトグラフィー、又は限外濾過を用いて、キシリトールを培養物中の他の成分から分離す
ることを含む。
ある。いくつかの実施態様において、本方法は、本明細書に提供される単離されたメチニ
コビア種を、キシロースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに十分な
期間培養することを含む。本方法は、該単離されたメチニコビア種を、キシロース及びC3
炭素源、C4炭素源、C5炭素源、C6炭素源、又はこれらの組合せを含む培地中で培養するこ
とを含むことができる。いくつかの実施態様において、該条件は、該単離されたメチニコ
ビア種を、キシロース並びにセロビオース、ガラクトース、グルコース、エタノール、ア
セテート、アラビノース、アラビトール、ソルビトール、及びグリセロール、又はこれら
の組合せから選択される共基質を含む培地中で培養することを含む。特定の実施態様にお
いて、該共基質はグルコースである。また別の特定の実施態様において、該培地は、キシ
ロースとセロビオースの組合せ、又はキシロースとガラクトースの組合せ、又はキシロー
スとグリセロールの組合せを含む。培養条件は、好気的培養条件を含むこともできる。培
養は、回分培養、流加培養、又は連続培養を含むことができる。いくつかの実施態様にお
いて、本方法は、例えば、抽出、連続液液抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透、電
気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸収クロ
マトグラフィー、又は限外濾過を用いて、キシリトールを培養物中の他の成分から分離す
ることを含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される方法によ
って生産される生物由来キシリトールである。
って生産される生物由来キシリトールである。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される単離され
たメチニコビア種を有する組成物である。それに加えて又はその代わりに、また本明細書
に提供されるのは、本明細書に提供される生物由来キシリトールを有する組成物である。
該組成物は、いくつかの実施態様において、キシロースを含む培養培地である。特定の実
施態様において、該組成物は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種が除去さ
れている培養培地である。
たメチニコビア種を有する組成物である。それに加えて又はその代わりに、また本明細書
に提供されるのは、本明細書に提供される生物由来キシリトールを有する組成物である。
該組成物は、いくつかの実施態様において、キシロースを含む培養培地である。特定の実
施態様において、該組成物は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種が除去さ
れている培養培地である。
いくつかの実施態様において、該組成物は、グリセロール、アラビトール、C7糖アルコ
ール、又はこれらの組合せを、本明細書に記載される方法からの不純物として含む。特定
の実施態様において、C7糖アルコールは、ボレミトール又はその異性体である。いくつか
の実施態様において、グリセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量は、本明細
書に提供される単離されたメチニコビア種以外の微生物によって生産されるそれぞれのグ
リセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量よりも少なくとも10％、20％、30％
、又は40％多い。
ール、又はこれらの組合せを、本明細書に記載される方法からの不純物として含む。特定
の実施態様において、C7糖アルコールは、ボレミトール又はその異性体である。いくつか
の実施態様において、グリセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量は、本明細
書に提供される単離されたメチニコビア種以外の微生物によって生産されるそれぞれのグ
リセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量よりも少なくとも10％、20％、30％
、又は40％多い。
(図面の簡単な説明)
図1は、野生型H0メチニコビア属種及び出芽酵母(Saccharomyces. cerevisiae) M2株についてのキシロースからのキシリトールの生産を示している。YP＋4％キシロースは、4％キシロースを有する酵母抽出物ペプトン培地を示している。YP＋10％キシロースは、10％キシロースを有する酵母抽出物ペプトン培地を示している。
(詳細な説明)
本明細書に提供される組成物及び方法は、メチニコビア属内の新規の酵母種の発見、単
離、及び特徴解析に一部基づいている。本明細書において「H0」又は「H0メチニコビア属
種」と呼ばれる、この新規のメチニコビア種の分離及び特徴解析により、キシロースをキ
シリトールの生産に利用する能力をメチニコビア種に提供する、新規の遺伝子及びタンパ
ク質、特に、新規のキシロースレダクターゼ及び新規のキシローストランスポーターが明
らかになった。これらの新規の遺伝子及びタンパク質の使用には、例えば、メチニコビア
種におけるキシリトール経路酵素及びタンパク質、例えば、キシロースレダクターゼ又は
キシロース輸送の過剰発現をもたらす外因性核酸の導入、並びにメチニコビア種のキシリ
トールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾の導入が含まれる。本
明細書に記載されるH0メチニコビア属種を含む、メチニコビア種へのそのような修飾の導
入は、キシリトール生産の顕著な増加をもたらすことができる。したがって、本明細書に
記載されるメチニコビア種は、キシロースをキシリトールの生産のための炭素源として有
する培地中でメチニコビア種を培養することにより、キシリトールを生産する方法におい
て使用することができる。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換え
メチニコビア種を用いて、キシリトールを生産する方法によって生産されるキシリトール
を有する組成物である。またさらに本明細書に提供されるのは、H0メチニコビア属種の新
規タンパク質に関する単離されたポリペプチド及びH0メチニコビア属種の新規遺伝子に関
する単離された核酸、並びにそのような核酸を含む宿主細胞である。
本明細書に提供される組成物及び方法は、メチニコビア属内の新規の酵母種の発見、単
離、及び特徴解析に一部基づいている。本明細書において「H0」又は「H0メチニコビア属
種」と呼ばれる、この新規のメチニコビア種の分離及び特徴解析により、キシロースをキ
シリトールの生産に利用する能力をメチニコビア種に提供する、新規の遺伝子及びタンパ
ク質、特に、新規のキシロースレダクターゼ及び新規のキシローストランスポーターが明
らかになった。これらの新規の遺伝子及びタンパク質の使用には、例えば、メチニコビア
種におけるキシリトール経路酵素及びタンパク質、例えば、キシロースレダクターゼ又は
キシロース輸送の過剰発現をもたらす外因性核酸の導入、並びにメチニコビア種のキシリ
トールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾の導入が含まれる。本
明細書に記載されるH0メチニコビア属種を含む、メチニコビア種へのそのような修飾の導
入は、キシリトール生産の顕著な増加をもたらすことができる。したがって、本明細書に
記載されるメチニコビア種は、キシロースをキシリトールの生産のための炭素源として有
する培地中でメチニコビア種を培養することにより、キシリトールを生産する方法におい
て使用することができる。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換え
メチニコビア種を用いて、キシリトールを生産する方法によって生産されるキシリトール
を有する組成物である。またさらに本明細書に提供されるのは、H0メチニコビア属種の新
規タンパク質に関する単離されたポリペプチド及びH0メチニコビア属種の新規遺伝子に関
する単離された核酸、並びにそのような核酸を含む宿主細胞である。
本明細書で使用される場合、培養又は成長条件に関して使用されるときの「好気的」と
いう用語は、遊離酸素(O2)が培養又は成長条件下で利用可能であることを意味することが
意図される。これには、液体培地中の溶存酸素が50％飽和を上回る場合が含まれる。
いう用語は、遊離酸素(O2)が培養又は成長条件下で利用可能であることを意味することが
意図される。これには、液体培地中の溶存酸素が50％飽和を上回る場合が含まれる。
本明細書で使用される場合、培養又は成長条件に関して使用されるときの「嫌気的」と
いう用語は、培養又は成長条件が遊離酸素(O2)を欠くことを意味することが意図される。
いう用語は、培養又は成長条件が遊離酸素(O2)を欠くことを意味することが意図される。
本明細書で使用される場合、「減弱させる」という用語又はその文法的同等物は、酵素
又はタンパク質の活性又は量を低下させるか、低減させるか、又は減少させることを意味
することが意図される。酵素又はタンパク質の活性又は量の減弱は、該減弱によって、該
活性又は量が、所与の経路が機能するのに必要とされる臨界レベルを下回るようになる場
合、完全な破壊を模倣することができる。しかしながら、ある経路の完全な破壊を模倣す
る酵素又はタンパク質の活性又は量の減弱は、依然として、別の経路が機能し続けるのに
十分であることができる。例えば、内在性酵素又はタンパク質の減弱は、特定の化合物(
例えば、キシリトール)の生産のための同じ酵素又はタンパク質の完全な破壊を模倣する
のに十分であることができるが、酵素又はタンパク質の残存する活性又は量は、依然とし
て、他の経路又は反応、例えば、宿主メチニコビア種が生存し、生殖し、又は成長するの
に極めて重要である経路を維持するのに十分であり得る。酵素又はタンパク質の減弱は、
酵素又はタンパク質の活性又は量を、キシリトールの収率を増加させるのに十分である量
で低下させるか、低減させるか、又は減少させることでもあり得るが、酵素又はタンパク
質の完全な破壊を必ずしも模倣するものではない。
又はタンパク質の活性又は量を低下させるか、低減させるか、又は減少させることを意味
することが意図される。酵素又はタンパク質の活性又は量の減弱は、該減弱によって、該
活性又は量が、所与の経路が機能するのに必要とされる臨界レベルを下回るようになる場
合、完全な破壊を模倣することができる。しかしながら、ある経路の完全な破壊を模倣す
る酵素又はタンパク質の活性又は量の減弱は、依然として、別の経路が機能し続けるのに
十分であることができる。例えば、内在性酵素又はタンパク質の減弱は、特定の化合物(
例えば、キシリトール)の生産のための同じ酵素又はタンパク質の完全な破壊を模倣する
のに十分であることができるが、酵素又はタンパク質の残存する活性又は量は、依然とし
て、他の経路又は反応、例えば、宿主メチニコビア種が生存し、生殖し、又は成長するの
に極めて重要である経路を維持するのに十分であり得る。酵素又はタンパク質の減弱は、
酵素又はタンパク質の活性又は量を、キシリトールの収率を増加させるのに十分である量
で低下させるか、低減させるか、又は減少させることでもあり得るが、酵素又はタンパク
質の完全な破壊を必ずしも模倣するものではない。
本明細書で使用される場合、「生物ベース」という用語は、全体として又は部分的に、
生物由来化合物から構成されている生成物を意味する。生物ベース又は生物由来の生成物
は、石油由来生成物と対照的であり、ここで、そのような生成物は、石油もしくは石油化
学原料に由来するか、又は石油もしくは石油化学原料から合成される。
生物由来化合物から構成されている生成物を意味する。生物ベース又は生物由来の生成物
は、石油由来生成物と対照的であり、ここで、そのような生成物は、石油もしくは石油化
学原料に由来するか、又は石油もしくは石油化学原料から合成される。
本明細書で使用される場合、「生物由来」という用語は、生物に由来するか又は生物に
よって合成されることを意味し、生物によって生産されることができるので、再生可能資
源とみなすことができる。そのような生物、特に、本明細書に開示されるメチニコビア種
は、糖(例えば、キシロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース(例えば、海洋植
物バイオマス由来のガラクトース)、スクロース、及びアラビノース)、農業、植物、細菌
、又は動物の源から得られる炭水化物、並びにグリセロール(例えば、バイオディーゼル
製造からの廃グリセロール副生成物)などの、原料又はバイオマスを利用することができ
る。
よって合成されることを意味し、生物によって生産されることができるので、再生可能資
源とみなすことができる。そのような生物、特に、本明細書に開示されるメチニコビア種
は、糖(例えば、キシロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース(例えば、海洋植
物バイオマス由来のガラクトース)、スクロース、及びアラビノース)、農業、植物、細菌
、又は動物の源から得られる炭水化物、並びにグリセロール(例えば、バイオディーゼル
製造からの廃グリセロール副生成物)などの、原料又はバイオマスを利用することができ
る。
本明細書で使用される場合、「炭素源」という用語は、限定されないが、本明細書に記
載される生物由来化合物を含む、その有機分子の合成用の生物によって使用される任意の
炭素含有分子を指す。これには、様々な量の炭素原子を有する分子が含まれる。具体的な
例としては、C3炭素源、C4炭素源、C5炭素源、及びC6炭素源が挙げられる。「C3炭素源」
は、3個の炭素原子を含有する炭素源、例えば、グリセロールを指す。「C4炭素源」は、4
個の炭素原子を含有する炭素源、例えば、エリトロース又はトレオースを指す。「C5炭素
源」は、5個の炭素原子を含有する炭素源、例えば、キシロース、アラビノース、アラビ
トール、リボース、又はリキソースを指す。「C6炭素源」は、6個の炭素原子を含有する
炭素源、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトース、グロ
ース、又はイドースを指す。
載される生物由来化合物を含む、その有機分子の合成用の生物によって使用される任意の
炭素含有分子を指す。これには、様々な量の炭素原子を有する分子が含まれる。具体的な
例としては、C3炭素源、C4炭素源、C5炭素源、及びC6炭素源が挙げられる。「C3炭素源」
は、3個の炭素原子を含有する炭素源、例えば、グリセロールを指す。「C4炭素源」は、4
個の炭素原子を含有する炭素源、例えば、エリトロース又はトレオースを指す。「C5炭素
源」は、5個の炭素原子を含有する炭素源、例えば、キシロース、アラビノース、アラビ
トール、リボース、又はリキソースを指す。「C6炭素源」は、6個の炭素原子を含有する
炭素源、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトース、グロ
ース、又はイドースを指す。
「外因性」という用語は、それが本明細書で使用されるとき、言及された分子又は言及
された活性が本明細書に記載されるメチニコビア種に導入されることを意味することが意
図される。該分子は、例えば、宿主染色体への組込みなどによる、宿主メチニコビア種の
遺伝物質へのコード核酸の導入によって、又はプラスミドなどの非染色体遺伝物質として
導入することができる。その代わりに又はそれに加えて、導入される分子は、例えば、コ
ード核酸の発現を調節する(例えば、増大させる、減少させる、もしくは構成的にする)非
コード核酸、例えば、プロモーターもしくはエンハンサーであることができるか、又はこ
れらを含むことができる。それゆえ、この用語は、それがコード核酸の発現に関連して使
用されるとき、宿主メチニコビア種への発現可能な形態のコード核酸の導入及び/又は宿
主メチニコビア種のコード核酸の発現を増大させる(例えば、過剰発現する)核酸の導入を
指す。生合成活性に関連して使用されるとき、この用語は、宿主メチニコビア種に導入さ
れる活性を指す。供給源は、例えば、メチニコビア種への導入後に言及された活性を発現
する相同又は異種コード核酸であることができる。それゆえ、「内在性」という用語は、
宿主メチニコビア種に存在する言及された分子又は活性を指す。同様に、コード核酸の発
現に関連して使用される場合のこの用語は、微生物に含まれるコード核酸の発現を指す。
「異種」という用語が、言及されたメチニコビア種以外の源に由来する分子又は活性を指
すのに対し、「相同」は、宿主メチニコビア種に由来する分子又は活性を指す。したがっ
て、本明細書に開示されるコード核酸の外因性発現は、異種又は相同コード核酸のいずれ
か又は両方を利用することができる。
された活性が本明細書に記載されるメチニコビア種に導入されることを意味することが意
図される。該分子は、例えば、宿主染色体への組込みなどによる、宿主メチニコビア種の
遺伝物質へのコード核酸の導入によって、又はプラスミドなどの非染色体遺伝物質として
導入することができる。その代わりに又はそれに加えて、導入される分子は、例えば、コ
ード核酸の発現を調節する(例えば、増大させる、減少させる、もしくは構成的にする)非
コード核酸、例えば、プロモーターもしくはエンハンサーであることができるか、又はこ
れらを含むことができる。それゆえ、この用語は、それがコード核酸の発現に関連して使
用されるとき、宿主メチニコビア種への発現可能な形態のコード核酸の導入及び/又は宿
主メチニコビア種のコード核酸の発現を増大させる(例えば、過剰発現する)核酸の導入を
指す。生合成活性に関連して使用されるとき、この用語は、宿主メチニコビア種に導入さ
れる活性を指す。供給源は、例えば、メチニコビア種への導入後に言及された活性を発現
する相同又は異種コード核酸であることができる。それゆえ、「内在性」という用語は、
宿主メチニコビア種に存在する言及された分子又は活性を指す。同様に、コード核酸の発
現に関連して使用される場合のこの用語は、微生物に含まれるコード核酸の発現を指す。
「異種」という用語が、言及されたメチニコビア種以外の源に由来する分子又は活性を指
すのに対し、「相同」は、宿主メチニコビア種に由来する分子又は活性を指す。したがっ
て、本明細書に開示されるコード核酸の外因性発現は、異種又は相同コード核酸のいずれ
か又は両方を利用することができる。
複数の外因性核酸がメチニコビア種に含まれるとき、該複数の外因性核酸は、上で論じ
られたような、言及されたコード核酸又は生合成活性を指すことが理解される。微生物は
1コピー又は多コピーの同じ外因性核酸を有することができることも理解される。本明細
書に開示されるように、そのような複数の外因性核酸は、別の核酸分子上で、ポリシスト
ロン性核酸分子上で、又はこれらの組合せで、宿主メチニコビア種に導入され、それでも
、複数の外因性核酸とみなされることがさらに理解される。例えば、本明細書に開示され
るように、微生物を、所望の経路酵素又はタンパク質をコードする2以上の外因性核酸を
発現するように改変することができる。所望の活性をコードする2つの外因性核酸が宿主
メチニコビア種に導入される場合、この2つの外因性核酸は、例えば、単一のプラスミド
上で単一の核酸として導入されることができ、別々のプラスミド上で導入されることがで
き、単一の部位又は複数の部位で宿主染色体に組み込まれることができ、それでも、2つ
の外因性核酸とみなされることが理解される。同様に、3以上の外因性核酸は、任意の所
望の組合せで、例えば、単一のプラスミド上で、別々のプラスミド上で、宿主生物に導入
されることができ、単一の部位又は複数の部位で宿主染色体に組み込まれることができ、
それでも、2以上の外因性核酸、例えば、3つの外因性核酸とみなされることが理解される
。したがって、言及される外因性核酸又は生合成活性の数は、宿主生物に導入される別々
の核酸の数ではなく、コード核酸の数又は生合成活性の数を指す。
られたような、言及されたコード核酸又は生合成活性を指すことが理解される。微生物は
1コピー又は多コピーの同じ外因性核酸を有することができることも理解される。本明細
書に開示されるように、そのような複数の外因性核酸は、別の核酸分子上で、ポリシスト
ロン性核酸分子上で、又はこれらの組合せで、宿主メチニコビア種に導入され、それでも
、複数の外因性核酸とみなされることがさらに理解される。例えば、本明細書に開示され
るように、微生物を、所望の経路酵素又はタンパク質をコードする2以上の外因性核酸を
発現するように改変することができる。所望の活性をコードする2つの外因性核酸が宿主
メチニコビア種に導入される場合、この2つの外因性核酸は、例えば、単一のプラスミド
上で単一の核酸として導入されることができ、別々のプラスミド上で導入されることがで
き、単一の部位又は複数の部位で宿主染色体に組み込まれることができ、それでも、2つ
の外因性核酸とみなされることが理解される。同様に、3以上の外因性核酸は、任意の所
望の組合せで、例えば、単一のプラスミド上で、別々のプラスミド上で、宿主生物に導入
されることができ、単一の部位又は複数の部位で宿主染色体に組み込まれることができ、
それでも、2以上の外因性核酸、例えば、3つの外因性核酸とみなされることが理解される
。したがって、言及される外因性核酸又は生合成活性の数は、宿主生物に導入される別々
の核酸の数ではなく、コード核酸の数又は生合成活性の数を指す。
本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾」、「遺伝子破壊」という用語、又はその文
法的同等物は、コード遺伝子産物を機能的に不活性状態にするか、又は活性はあるが、減
弱した状態にする遺伝子改変を意味することが意図される。遺伝子改変は、例えば、全遺
伝子の欠失、転写もしくは翻訳に必要とされる調節配列の欠失、切断された遺伝子産物を
もたらす遺伝子の一部の欠失、又は当技術分野で周知のコード遺伝子産物を不活化するか
又は減弱させる様々な突然変異戦略のいずれかによるものであることができる。遺伝子破
壊の1つの特に有用な方法は、完全な遺伝子欠失であるが、それは、該方法が本明細書に
提供されるメチニコビア種における遺伝的復帰の発生を低下又は消失させるからである。
遺伝子破壊には、ヌル突然変異も含まれ、これは、遺伝子又はRNAに転写されない及び/も
しくは機能的遺伝子産物に翻訳されない遺伝子を生じる遺伝子を含有する領域内の突然変
異を指す。そのようなヌル突然変異は、例えば、不活化点突然変異、遺伝子の一部の欠失
、全遺伝子欠失、又は染色体セグメントの欠失を含む、多くのタイプの突然変異から生じ
ることができる。
法的同等物は、コード遺伝子産物を機能的に不活性状態にするか、又は活性はあるが、減
弱した状態にする遺伝子改変を意味することが意図される。遺伝子改変は、例えば、全遺
伝子の欠失、転写もしくは翻訳に必要とされる調節配列の欠失、切断された遺伝子産物を
もたらす遺伝子の一部の欠失、又は当技術分野で周知のコード遺伝子産物を不活化するか
又は減弱させる様々な突然変異戦略のいずれかによるものであることができる。遺伝子破
壊の1つの特に有用な方法は、完全な遺伝子欠失であるが、それは、該方法が本明細書に
提供されるメチニコビア種における遺伝的復帰の発生を低下又は消失させるからである。
遺伝子破壊には、ヌル突然変異も含まれ、これは、遺伝子又はRNAに転写されない及び/も
しくは機能的遺伝子産物に翻訳されない遺伝子を生じる遺伝子を含有する領域内の突然変
異を指す。そのようなヌル突然変異は、例えば、不活化点突然変異、遺伝子の一部の欠失
、全遺伝子欠失、又は染色体セグメントの欠失を含む、多くのタイプの突然変異から生じ
ることができる。
本明細書で使用される場合、「不活化する」という用語又はその文法的同等物は、酵素
又はタンパク質の活性を停止することを意味することが意図される。そのような不活化は
、酵素又はタンパク質をコードする全核酸配列の欠失によって達成することができる。不
活化は、核酸配列によってコードされる得られる酵素又はタンパク質が全長酵素又はタン
パク質の活性を有さないような酵素又はタンパク質をコードする核酸配列の一部の欠失に
よって達成することもできる。さらに、酵素又はタンパク質の不活化は、欠失との組合せ
を含む、酵素又はタンパク質をコードする核酸配列への置換又は挿入によって達成するこ
とができる。挿入は、異種核酸、例えば、本明細書に記載されるものを含むことができる
。
又はタンパク質の活性を停止することを意味することが意図される。そのような不活化は
、酵素又はタンパク質をコードする全核酸配列の欠失によって達成することができる。不
活化は、核酸配列によってコードされる得られる酵素又はタンパク質が全長酵素又はタン
パク質の活性を有さないような酵素又はタンパク質をコードする核酸配列の一部の欠失に
よって達成することもできる。さらに、酵素又はタンパク質の不活化は、欠失との組合せ
を含む、酵素又はタンパク質をコードする核酸配列への置換又は挿入によって達成するこ
とができる。挿入は、異種核酸、例えば、本明細書に記載されるものを含むことができる
。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、本明細書に記載されるメチ
ニコビア種に関連して使用されるとき、言及された微生物が天然に見出されるときの少な
くとも1つの成分を実質的に含まない生物を意味することが意図される。この用語は、そ
れがその天然の環境において見出されるときのいくつかの又は全ての成分から取り出され
ているメチニコビア種を含む。この用語は、該微生物が非天然の環境において見出される
ときのいくつかの又は全ての成分から取り出されている微生物も含む。それゆえ、単離さ
れたメチニコビア種は、それが天然に見出されるときの又はそれが非天然の環境において
成長している、保存されている、もしくは生存しているときの他の物質から部分的に又は
完全に分離されている。単離されたメチニコビア種の具体的な例としては、部分的に純粋
な微生物、実質的に純粋な微生物、及び非天然の培地中で培養された微生物が挙げられる
。
ニコビア種に関連して使用されるとき、言及された微生物が天然に見出されるときの少な
くとも1つの成分を実質的に含まない生物を意味することが意図される。この用語は、そ
れがその天然の環境において見出されるときのいくつかの又は全ての成分から取り出され
ているメチニコビア種を含む。この用語は、該微生物が非天然の環境において見出される
ときのいくつかの又は全ての成分から取り出されている微生物も含む。それゆえ、単離さ
れたメチニコビア種は、それが天然に見出されるときの又はそれが非天然の環境において
成長している、保存されている、もしくは生存しているときの他の物質から部分的に又は
完全に分離されている。単離されたメチニコビア種の具体的な例としては、部分的に純粋
な微生物、実質的に純粋な微生物、及び非天然の培地中で培養された微生物が挙げられる
。
本明細書で使用される場合、「培地」、「培養培地」、「成長培地」という用語、又は
これらの文法的同等物は、本明細書に記載されるメチニコビア種などの任意の微生物を含
む、細胞の成長を支持する栄養素を含有する液体又は固体(例えば、ゼラチン状)物質を指
す。成長を支持する栄養素としては:限定されないが、キシロース、セロビオース、ガラ
クトース、グルコース、エタノール、アセテート、アラビノース、アラビトール、ソルビ
トール、及びグリセロールなどの、炭素を供給する物質;マグネシウム、窒素、リン、及
び硫黄を含む、必須元素を提供する塩;ペプトン又はトリプトンなどの、アミノ酸の供給
源;並びに酵母抽出物などの、ビタミン内容物の供給源が挙げられる。本方法において及
び本明細書に記載されるメチニコビア種の特徴解析において有用な培地の具体的な例とし
ては、限定されないが、キシロース、グルコース、セロビオース、ガラクトース、もしく
はグリセロール、又はこれらの組合せなどの炭素源を有する酵母抽出物ペプトン(YEP)培
地及び酵母窒素塩基(YNB)培地が挙げられる。YEP及びYNB培地の製剤は、当技術分野で周
知である。例えば、4％キシロースを有するYEP培地は、限定されないが、酵母抽出物1.0g
、ペプトン2.0g、キシロース4.0g、及び水100mlを含む。別の例として、2％グルコース及
び2％キシロースを有するYNB培地は、限定されないが、ビオチン2μg、パントテン酸カル
シウム400μg、葉酸2μg、イノシトール2000μg、ナイアシン400μg、p-アミノ安息香酸2
00μg、塩酸ピリドキシン400μg、リボフラビン200μg、塩酸チアミン400μg、ホウ酸500
μg、硫酸銅40μg、ヨウ化カリウム100μg、塩化第二鉄200μg、硫酸マンガン400μg、モ
リブデン酸ナトリウム200μg、硫酸亜鉛400μg、第一リン酸カリウム1g、硫酸マグネシウ
ム500mg、塩化ナトリウム100mg、塩化カルシウム100mg、グルコース20g、キシロース20g
、及び水1Lを含む。培地中の炭素源の量は、当業者によって容易に決定されることができ
る。炭素を供給する複数の基質が培地中に存在するとき、これらは「共基質」と呼ばれる
。培地は、成長に必要とされる栄養素以外の物質、例えば、選択培地中に一般に見られる
、選択された細胞が成長することだけを可能にする物質(例えば、抗生物質もしくは抗真
菌薬)又は示差もしくは指標培地中に一般に見られる、同じ培地中で成長したときにある
微生物の分化を別のものよりも優先して可能にする物質も含むことができる。そのような
物質は、当業者に周知である。
これらの文法的同等物は、本明細書に記載されるメチニコビア種などの任意の微生物を含
む、細胞の成長を支持する栄養素を含有する液体又は固体(例えば、ゼラチン状)物質を指
す。成長を支持する栄養素としては:限定されないが、キシロース、セロビオース、ガラ
クトース、グルコース、エタノール、アセテート、アラビノース、アラビトール、ソルビ
トール、及びグリセロールなどの、炭素を供給する物質;マグネシウム、窒素、リン、及
び硫黄を含む、必須元素を提供する塩;ペプトン又はトリプトンなどの、アミノ酸の供給
源;並びに酵母抽出物などの、ビタミン内容物の供給源が挙げられる。本方法において及
び本明細書に記載されるメチニコビア種の特徴解析において有用な培地の具体的な例とし
ては、限定されないが、キシロース、グルコース、セロビオース、ガラクトース、もしく
はグリセロール、又はこれらの組合せなどの炭素源を有する酵母抽出物ペプトン(YEP)培
地及び酵母窒素塩基(YNB)培地が挙げられる。YEP及びYNB培地の製剤は、当技術分野で周
知である。例えば、4％キシロースを有するYEP培地は、限定されないが、酵母抽出物1.0g
、ペプトン2.0g、キシロース4.0g、及び水100mlを含む。別の例として、2％グルコース及
び2％キシロースを有するYNB培地は、限定されないが、ビオチン2μg、パントテン酸カル
シウム400μg、葉酸2μg、イノシトール2000μg、ナイアシン400μg、p-アミノ安息香酸2
00μg、塩酸ピリドキシン400μg、リボフラビン200μg、塩酸チアミン400μg、ホウ酸500
μg、硫酸銅40μg、ヨウ化カリウム100μg、塩化第二鉄200μg、硫酸マンガン400μg、モ
リブデン酸ナトリウム200μg、硫酸亜鉛400μg、第一リン酸カリウム1g、硫酸マグネシウ
ム500mg、塩化ナトリウム100mg、塩化カルシウム100mg、グルコース20g、キシロース20g
、及び水1Lを含む。培地中の炭素源の量は、当業者によって容易に決定されることができ
る。炭素を供給する複数の基質が培地中に存在するとき、これらは「共基質」と呼ばれる
。培地は、成長に必要とされる栄養素以外の物質、例えば、選択培地中に一般に見られる
、選択された細胞が成長することだけを可能にする物質(例えば、抗生物質もしくは抗真
菌薬)又は示差もしくは指標培地中に一般に見られる、同じ培地中で成長したときにある
微生物の分化を別のものよりも優先して可能にする物質も含むことができる。そのような
物質は、当業者に周知である。
本明細書で使用される場合、「メチニコビア種」という用語は、メチニコビア属に含ま
れる酵母の任意の種を指す。例示的なメチニコビア種としては、メチニコビア・プルケリ
マ、メチニコビア・フルクティコラ、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・レ
ウカウフィイ、メチニコビア・アンダウエンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、
メチニコビア・シネンシス、メチニコビア・ジジフィコラ、メチニコビア・ビクスピダー
タ、メチニコビア・ルナータ、メチニコビア・ゾベルリイ、メチニコビア・アウストラリ
ス、メチニコビア・アガウェアエ、メチニコビア・グルエッシイ、メチニコビア・ハワイ
エンシス、メチニコビア・クリッシイ、メチニコビア属種の株NS-O-85、メチニコビア属
種の株NS-O-89、及び本明細書に記載される独特のメチニコビア種であるメチニコビア属
種H0、別名、「H0メチニコビア属種」が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書
に記載されるメチニコビア種、すなわち、「H0メチニコビア属種」は、新たに発見された
種であり、これは、アクセッション番号081116-01に指定されており、かつブダペスト条
約の条項の下で、2016年11月8日に、R3E 3R2カナダマニトバ州ウィニペグアーリントン通
り1015番地(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)の住所にあ
る国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(「IDAC」)に寄託された。H0メチニコビア属種
の提案された学名は、メチニコビア・ウィニフィコラ(Metschnikowia vinificola)である
(ウィニフィ:ウィニフェラ(ワイン用ブドウの種)に由来する;コラ:住人を意味するラテン
語の「インコラ」に由来する)。したがって、ウィニフィコラ(ウィニフェラの住人)とい
う種名は、ワイン用ブドウからの基準株の単離を指す。
れる酵母の任意の種を指す。例示的なメチニコビア種としては、メチニコビア・プルケリ
マ、メチニコビア・フルクティコラ、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・レ
ウカウフィイ、メチニコビア・アンダウエンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、
メチニコビア・シネンシス、メチニコビア・ジジフィコラ、メチニコビア・ビクスピダー
タ、メチニコビア・ルナータ、メチニコビア・ゾベルリイ、メチニコビア・アウストラリ
ス、メチニコビア・アガウェアエ、メチニコビア・グルエッシイ、メチニコビア・ハワイ
エンシス、メチニコビア・クリッシイ、メチニコビア属種の株NS-O-85、メチニコビア属
種の株NS-O-89、及び本明細書に記載される独特のメチニコビア種であるメチニコビア属
種H0、別名、「H0メチニコビア属種」が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書
に記載されるメチニコビア種、すなわち、「H0メチニコビア属種」は、新たに発見された
種であり、これは、アクセッション番号081116-01に指定されており、かつブダペスト条
約の条項の下で、2016年11月8日に、R3E 3R2カナダマニトバ州ウィニペグアーリントン通
り1015番地(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)の住所にあ
る国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(「IDAC」)に寄託された。H0メチニコビア属種
の提案された学名は、メチニコビア・ウィニフィコラ(Metschnikowia vinificola)である
(ウィニフィ:ウィニフェラ(ワイン用ブドウの種)に由来する;コラ:住人を意味するラテン
語の「インコラ」に由来する)。したがって、ウィニフィコラ(ウィニフェラの住人)とい
う種名は、ワイン用ブドウからの基準株の単離を指す。
さらに、本明細書で言及されるメチニコビア種は、「非天然」又は「組換え」メチニコ
ビア種を含むことができる。そのような生物は、言及された種の野生型株を含む、天然の
メチニコビア種に通常は見られない少なくとも1つの遺伝子改変を有するメチニコビア種
を意味することが意図される。遺伝子改変には、例えば、代謝的ポリペプチドをコードす
る発現可能な核酸を導入する修飾、他の核酸付加、核酸欠失、及び/又は微生物の遺伝物
質の他の遺伝子破壊が含まれる。そのような修飾には、例えば、言及された種の異種ポリ
ペプチド、相同ポリペプチド、又は異種ポリペプチドと相同ポリペプチドの両方のコード
領域及びその機能的断片が含まれる。さらなる修飾には、例えば、修飾が遺伝子又はオペ
ロンの発現を変化させる非コード調節性領域が含まれる。例示的な代謝的ポリペプチドに
は、本明細書に記載される代謝経路(例えば、キシリトール経路)内の酵素又はタンパク質
が含まれる。
ビア種を含むことができる。そのような生物は、言及された種の野生型株を含む、天然の
メチニコビア種に通常は見られない少なくとも1つの遺伝子改変を有するメチニコビア種
を意味することが意図される。遺伝子改変には、例えば、代謝的ポリペプチドをコードす
る発現可能な核酸を導入する修飾、他の核酸付加、核酸欠失、及び/又は微生物の遺伝物
質の他の遺伝子破壊が含まれる。そのような修飾には、例えば、言及された種の異種ポリ
ペプチド、相同ポリペプチド、又は異種ポリペプチドと相同ポリペプチドの両方のコード
領域及びその機能的断片が含まれる。さらなる修飾には、例えば、修飾が遺伝子又はオペ
ロンの発現を変化させる非コード調節性領域が含まれる。例示的な代謝的ポリペプチドに
は、本明細書に記載される代謝経路(例えば、キシリトール経路)内の酵素又はタンパク質
が含まれる。
代謝的修飾は、その天然の状態から変化させる生化学的反応を指す。それゆえ、本明細
書に記載されるメチニコビア種は、代謝的ポリペプチド又はその機能的断片をコードする
1以上の核酸配列に対する遺伝子修飾を有することができ、これにより、異化又は同化反
応並びに基礎代謝を含む、代謝的ポリペプチドが触媒する生化学的反応が変化する。例示
的な代謝的修飾が本明細書に開示されている。
書に記載されるメチニコビア種は、代謝的ポリペプチド又はその機能的断片をコードする
1以上の核酸配列に対する遺伝子修飾を有することができ、これにより、異化又は同化反
応並びに基礎代謝を含む、代謝的ポリペプチドが触媒する生化学的反応が変化する。例示
的な代謝的修飾が本明細書に開示されている。
本明細書で使用される場合、「過剰発現」という用語又はその文法的同等物は、宿主メ
チニコビア種にとって普通であるよりも大きい量での、又は野生型発現の時間もしくは場
所とは異なる宿主メチニコビア種内の時間もしくは場所での遺伝子産物(例えば、リボ核
酸(RNA)、タンパク質、又は酵素)の発現を意味することが意図される。
チニコビア種にとって普通であるよりも大きい量での、又は野生型発現の時間もしくは場
所とは異なる宿主メチニコビア種内の時間もしくは場所での遺伝子産物(例えば、リボ核
酸(RNA)、タンパク質、又は酵素)の発現を意味することが意図される。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」又は「配列相同性」という用語は、核酸配
列又はアミノ酸配列に関連して使用される場合、2以上の核酸分子間又は2以上のポリペプ
チド間の類似性を指す。同一性は、比較目的で整列させることができる各々の配列におけ
る位置を比較することにより決定することができる。比較される配列の位置が同じ塩基又
はアミノ酸によって占められている場合、これらの分子は、その位置で同一である。配列
間の同一性の程度は、該配列によって共有される一致する又は相同な位置の数の関数であ
る。そのパーセント配列同一性を決定するための2つの配列のアラインメントは、例えば
、Ausubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Bio
logy)、John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)に記載されているものなどの当技術
分野で公知のソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。好ましくは、デフォル
トパラメータがアラインメントに使用される。使用することができる当技術分野で周知の
1つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータに設定されているBLASTである
。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメータ:遺伝コード＝標準;フィルター＝な
し;鎖＝両方;カットオフ＝60;期待＝10;マトリクス＝BLOSUM62;記載＝50配列;選別方法＝
高得点;データベース＝非冗長、GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS翻訳＋SwissPro
tein＋SPupdate＋PIRを用いるBLASTN及びBLASTPである。これらのプログラムの詳細は、
国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)において
見出すことができる。
列又はアミノ酸配列に関連して使用される場合、2以上の核酸分子間又は2以上のポリペプ
チド間の類似性を指す。同一性は、比較目的で整列させることができる各々の配列におけ
る位置を比較することにより決定することができる。比較される配列の位置が同じ塩基又
はアミノ酸によって占められている場合、これらの分子は、その位置で同一である。配列
間の同一性の程度は、該配列によって共有される一致する又は相同な位置の数の関数であ
る。そのパーセント配列同一性を決定するための2つの配列のアラインメントは、例えば
、Ausubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Bio
logy)、John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)に記載されているものなどの当技術
分野で公知のソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。好ましくは、デフォル
トパラメータがアラインメントに使用される。使用することができる当技術分野で周知の
1つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータに設定されているBLASTである
。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメータ:遺伝コード＝標準;フィルター＝な
し;鎖＝両方;カットオフ＝60;期待＝10;マトリクス＝BLOSUM62;記載＝50配列;選別方法＝
高得点;データベース＝非冗長、GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS翻訳＋SwissPro
tein＋SPupdate＋PIRを用いるBLASTN及びBLASTPである。これらのプログラムの詳細は、
国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)において
見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「実質的に嫌気的」という用語は、培養又は成長条件に関
連して使用される場合、液体培地中の溶存酸素の量が約10％飽和未満であることを意味す
ることが意図される。この用語は、液体又は固体培地を含む約1％未満の酸素の雰囲気で
維持される密閉チャンバーを含むことも意図される。
連して使用される場合、液体培地中の溶存酸素の量が約10％飽和未満であることを意味す
ることが意図される。この用語は、液体又は固体培地を含む約1％未満の酸素の雰囲気で
維持される密閉チャンバーを含むことも意図される。
本明細書で使用される場合、「糖アルコール」という用語は、糖のアルデヒド又はケト
ンの還元によって生産されるアルコールを指す。したがって、「C7糖アルコール」は、7
個の炭素原子を有する糖のアルデヒド又はケトンの還元によって生産されるアルコール、
例えば、ボレミトール又はその異性体を指す。
ンの還元によって生産されるアルコールを指す。したがって、「C7糖アルコール」は、7
個の炭素原子を有する糖のアルデヒド又はケトンの還元によって生産されるアルコール、
例えば、ボレミトール又はその異性体を指す。
本明細書で使用される場合、「キシリトール」という用語は、C5H12O5という化学式、1
52.15g/molというモル質量、及び(2R,3r,4S)-ペンタン-1,2,3,4,5-ペントール[(2S,4R)-
ペンタン-1,2,3,4,5-ペントール]という1つのIUPAC名を有するペントース糖アルコールを
指す。キシリトールは、糖尿病の人及び高血糖症の個人のインスリンレベルに影響を及ぼ
さない、糖の低カロリー、低炭水化物代用品として一般に使用されている。
52.15g/molというモル質量、及び(2R,3r,4S)-ペンタン-1,2,3,4,5-ペントール[(2S,4R)-
ペンタン-1,2,3,4,5-ペントール]という1つのIUPAC名を有するペントース糖アルコールを
指す。キシリトールは、糖尿病の人及び高血糖症の個人のインスリンレベルに影響を及ぼ
さない、糖の低カロリー、低炭水化物代用品として一般に使用されている。
本明細書で使用される場合、「キシリトールデヒドロゲナーゼ」という用語は、キシル
ロースを生産するためのキシリトールの酸化を触媒する酵素を指す。そのようなキシリト
ールの酸化は、共因子NADを使用する酵素を含む。例示的なキシリトールデヒドロゲナー
ゼとしては、E.C.1.1.1.9又はE.C.1.1.1.B19に分類される酵素が挙げられる。「メチニコ
ビアキシリトールデヒドロゲナーゼ」という用語又はその文法的等価物は、メチニコビア
種由来のキシリトールデヒドロゲナーゼを指す。表1は、例示的なキシリトールデヒドロ
ゲナーゼのアミノ酸配列と核酸配列の両方を提供している。
(表1)
ロースを生産するためのキシリトールの酸化を触媒する酵素を指す。そのようなキシリト
ールの酸化は、共因子NADを使用する酵素を含む。例示的なキシリトールデヒドロゲナー
ゼとしては、E.C.1.1.1.9又はE.C.1.1.1.B19に分類される酵素が挙げられる。「メチニコ
ビアキシリトールデヒドロゲナーゼ」という用語又はその文法的等価物は、メチニコビア
種由来のキシリトールデヒドロゲナーゼを指す。表1は、例示的なキシリトールデヒドロ
ゲナーゼのアミノ酸配列と核酸配列の両方を提供している。
(表1)
本明細書で使用される場合、「キシロース」という用語は、C5H10O5という化学式、150
.13g/molというモル質量、及び(3R,4S,5R)-オキサン-2,3,4,5-テトロールという1つのIUP
AC名を有するホルミル官能基を有する五炭素単糖を指す。キシロースは、当技術分野にお
いて、D-キシロース、D-キシロピラノース、キシロシド、d-(+)-キシロース、キシロピラ
ノース、木糖、キシロメド、及びD-キシロペントースとしても知られている。
.13g/molというモル質量、及び(3R,4S,5R)-オキサン-2,3,4,5-テトロールという1つのIUP
AC名を有するホルミル官能基を有する五炭素単糖を指す。キシロースは、当技術分野にお
いて、D-キシロース、D-キシロピラノース、キシロシド、d-(+)-キシロース、キシロピラ
ノース、木糖、キシロメド、及びD-キシロペントースとしても知られている。
本明細書で使用される場合、「キシロースレダクターゼ」という用語は、キシリトール
を生産するためのキシロースの還元を触媒する酵素を指す。そのようなキシロースの還元
は、NADH又はNADPHを共因子として用いる酵素を含む。例示的なキシロースレダクターゼ
としては、E.C.1.1.1.307に分類される酵素が挙げられる。「メチニコビアのキシロース
レダクターゼ」という用語又はその文法的等価物は、メチニコビア種由来のキシロースレ
ダクターゼを指す。表2は、例示的なキシロースレダクターゼのアミノ酸配列と核酸配列
の両方を提供している。
(表2)
を生産するためのキシロースの還元を触媒する酵素を指す。そのようなキシロースの還元
は、NADH又はNADPHを共因子として用いる酵素を含む。例示的なキシロースレダクターゼ
としては、E.C.1.1.1.307に分類される酵素が挙げられる。「メチニコビアのキシロース
レダクターゼ」という用語又はその文法的等価物は、メチニコビア種由来のキシロースレ
ダクターゼを指す。表2は、例示的なキシロースレダクターゼのアミノ酸配列と核酸配列
の両方を提供している。
(表2)
本明細書で使用される場合、「キシローストランスポーター」という用語は、キシロー
スの細胞膜通過を容易にする膜タンパク質を指す。「メチニコビアのキシローストランス
ポーター」という用語又はその文法的等価物は、メチニコビア種由来のキシローストラン
スポーターを指す。表3は、例示的な キシローストランスポーターのアミノ酸配列と核酸
配列の両方を提供している。
(表3)
スの細胞膜通過を容易にする膜タンパク質を指す。「メチニコビアのキシローストランス
ポーター」という用語又はその文法的等価物は、メチニコビア種由来のキシローストラン
スポーターを指す。表3は、例示的な キシローストランスポーターのアミノ酸配列と核酸
配列の両方を提供している。
(表3)
本明細書に提供されるのは、キシリトール経路を有する新規の単離されたメチニコビア
種である。そのようなメチニコビア種は、キシロースを有する培地中で培養したとき、キ
シロースからキシリトールを生産することができる。いくつかの実施態様において、本明
細書に記載されるキシリトール経路は、キシロースをキシリトールに変換するキシロース
レダクターゼを含む。さらに、いくつかの実施態様において、該単離されたメチニコビア
種は、通常であればキシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナー
ゼに対する遺伝子修飾を含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提
供されるのは、キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸を有す
る単離されたメチニコビア種、又はその代わりにもしくはそれに加えて、単離されたメチ
ニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸
を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの実施態様において、また本明細書
に提供されるのは、単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱さ
せるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの
実施態様において、本明細書に提供されるのは:(a)キシロースレダクターゼをコードする
少なくとも1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼ
の過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;及び(b)単離されたメチニコビア種の
キシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離さ
れたメチニコビア種である。
種である。そのようなメチニコビア種は、キシロースを有する培地中で培養したとき、キ
シロースからキシリトールを生産することができる。いくつかの実施態様において、本明
細書に記載されるキシリトール経路は、キシロースをキシリトールに変換するキシロース
レダクターゼを含む。さらに、いくつかの実施態様において、該単離されたメチニコビア
種は、通常であればキシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナー
ゼに対する遺伝子修飾を含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提
供されるのは、キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸を有す
る単離されたメチニコビア種、又はその代わりにもしくはそれに加えて、単離されたメチ
ニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸
を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの実施態様において、また本明細書
に提供されるのは、単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱さ
せるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの
実施態様において、本明細書に提供されるのは:(a)キシロースレダクターゼをコードする
少なくとも1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼ
の過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;及び(b)単離されたメチニコビア種の
キシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離さ
れたメチニコビア種である。
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、特定の速度でキシロースからキシ
リトールを生産することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に提
供される単離されたメチニコビアは、培養したとき、少なくとも0.50g/L/h、少なくとも0
.60g/L/h、少なくとも0.70g/L/h、少なくとも0.80g/L/h、少なくとも0.90g/L/h、少なく
とも1.00g/L/h、少なくとも1.50g/L/h、少なくとも2.00g/L/h、少なくとも2.50g/L/h、少
なくとも3.00g/L/h、少なくとも3.50g/L/h、少なくとも4.00g/L/h、少なくとも5.00g/L/h
、少なくとも6.00g/L/h、少なくとも7.00g/L/h、少なくとも8.00g/L/h、少なくとも9.00g
/L/h、又は少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。したがって
、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培
養したとき、少なくとも0.50g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつか
の実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき
、少なくとも0.60g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくと
も0.70g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.80g/L/
hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に
提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.90g/L/hのキシリ
トールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される
単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも1.00g/L/hのキシリトールをキ
シロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離された
メチニコビア種は、培養したとき、少なくとも1.50g/L/hのキシリトールをキシロースか
ら生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビ
ア種は、培養したとき、少なくとも2.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培
養したとき、少なくとも2.50g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつか
の実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき
、少なくとも3.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくと
も3.50g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも4.00g/L/
hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に
提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも5.00g/L/hのキシリ
トールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される
単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも6.00g/L/hのキシリトールをキ
シロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離された
メチニコビア種は、培養したとき、少なくとも7.00g/L/hのキシリトールをキシロースか
ら生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビ
ア種は、培養したとき、少なくとも8.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培
養したとき、少なくとも9.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつか
の実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき
、少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。
リトールを生産することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に提
供される単離されたメチニコビアは、培養したとき、少なくとも0.50g/L/h、少なくとも0
.60g/L/h、少なくとも0.70g/L/h、少なくとも0.80g/L/h、少なくとも0.90g/L/h、少なく
とも1.00g/L/h、少なくとも1.50g/L/h、少なくとも2.00g/L/h、少なくとも2.50g/L/h、少
なくとも3.00g/L/h、少なくとも3.50g/L/h、少なくとも4.00g/L/h、少なくとも5.00g/L/h
、少なくとも6.00g/L/h、少なくとも7.00g/L/h、少なくとも8.00g/L/h、少なくとも9.00g
/L/h、又は少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。したがって
、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培
養したとき、少なくとも0.50g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつか
の実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき
、少なくとも0.60g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくと
も0.70g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.80g/L/
hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に
提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.90g/L/hのキシリ
トールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される
単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも1.00g/L/hのキシリトールをキ
シロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離された
メチニコビア種は、培養したとき、少なくとも1.50g/L/hのキシリトールをキシロースか
ら生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビ
ア種は、培養したとき、少なくとも2.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培
養したとき、少なくとも2.50g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつか
の実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき
、少なくとも3.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくと
も3.50g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも4.00g/L/
hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に
提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも5.00g/L/hのキシリ
トールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される
単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも6.00g/L/hのキシリトールをキ
シロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離された
メチニコビア種は、培養したとき、少なくとも7.00g/L/hのキシリトールをキシロースか
ら生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビ
ア種は、培養したとき、少なくとも8.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培
養したとき、少なくとも9.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつか
の実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき
、少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、特定の濃度でキシロースからキシ
リトールを生産することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に提
供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも75g/L、少なくとも80g
/L、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なくとも100g/L、少なく
とも110g/L、少なくとも120g/L、少なくとも130g/L、少なくとも140g/L、少なくとも150g
/L、少なくとも160g/L、少なくとも170g/L、少なくとも180g/L、少なくとも190g/L、少な
くとも200g/L、少なくとも250g/L、又は少なくとも300g/Lのキシリトールをキシロースか
ら生産する。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離され
たメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも75g/Lのキシリトールをキシロースから
生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア
種は、培養したとき、少なくとも80g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いく
つかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養した
とき、少なくとも90g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくと
も95g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明
細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも100g/Lのキシ
リトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供され
る単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも110g/Lのキシリトールをキシ
ロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメ
チニコビア種は、培養したとき、少なくとも120g/Lのキシリトールをキシロースから生産
する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は
、培養したとき、少なくとも130g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつか
の実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき
、少なくとも140g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも15
0g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書
に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも160g/Lのキシリト
ールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単
離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも170g/Lのキシリトールをキシロー
スから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニ
コビア種は、培養したとき、少なくとも180g/Lのキシリトールをキシロースから生産する
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培
養したとき、少なくとも190g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実
施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少
なくとも200g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において
、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも250g/L
のキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提
供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも300g/Lのキシリトール
をキシロースから生産する。
リトールを生産することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に提
供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも75g/L、少なくとも80g
/L、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なくとも100g/L、少なく
とも110g/L、少なくとも120g/L、少なくとも130g/L、少なくとも140g/L、少なくとも150g
/L、少なくとも160g/L、少なくとも170g/L、少なくとも180g/L、少なくとも190g/L、少な
くとも200g/L、少なくとも250g/L、又は少なくとも300g/Lのキシリトールをキシロースか
ら生産する。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離され
たメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも75g/Lのキシリトールをキシロースから
生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア
種は、培養したとき、少なくとも80g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いく
つかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養した
とき、少なくとも90g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくと
も95g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明
細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも100g/Lのキシ
リトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供され
る単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも110g/Lのキシリトールをキシ
ロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメ
チニコビア種は、培養したとき、少なくとも120g/Lのキシリトールをキシロースから生産
する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は
、培養したとき、少なくとも130g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつか
の実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき
、少なくとも140g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも15
0g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書
に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも160g/Lのキシリト
ールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単
離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも170g/Lのキシリトールをキシロー
スから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニ
コビア種は、培養したとき、少なくとも180g/Lのキシリトールをキシロースから生産する
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培
養したとき、少なくとも190g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実
施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少
なくとも200g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において
、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも250g/L
のキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提
供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも300g/Lのキシリトール
をキシロースから生産する。
本明細書に記載されるキシリトール経路は、当技術分野で公知の任意のメチニコビア種
に導入することができる。本明細書に記載されるキシリトール経路を有することができる
例示的で非限定的なメチニコビア種としては、メチニコビア・プルケリマ、メチニコビア
・フルクティコラ、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・ロイカウフィイ、メ
チニコビア・アンダウエンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、メチニコビア・シ
ネンシス、メチニコビア・ジジフィコラ、メチニコビア・ビクスピダータ、メチニコビア
・ルナータ、メチニコビア・ゾベルリイ、メチニコビア・アウストラリス、メチニコビア
・アガウェアエ、メチニコビア・グルエスシイ、メチニコビア・ハワイエンシス、メチニ
コビア・クリスシイ、メチニコビア属種株NS-O-85、及びメチニコビア属種株NS-O-89が挙
げられる。特定の実施態様において、本明細書に記載されるキシリトール経路は、ブダペ
スト条約の条項の下で、2016年11月8日に、国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(Inte
rnational Depositary Authority of Canada)に寄託された、アクセッション番号081116-
01に指定されたメチニコビア種に導入することができる。
に導入することができる。本明細書に記載されるキシリトール経路を有することができる
例示的で非限定的なメチニコビア種としては、メチニコビア・プルケリマ、メチニコビア
・フルクティコラ、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・ロイカウフィイ、メ
チニコビア・アンダウエンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、メチニコビア・シ
ネンシス、メチニコビア・ジジフィコラ、メチニコビア・ビクスピダータ、メチニコビア
・ルナータ、メチニコビア・ゾベルリイ、メチニコビア・アウストラリス、メチニコビア
・アガウェアエ、メチニコビア・グルエスシイ、メチニコビア・ハワイエンシス、メチニ
コビア・クリスシイ、メチニコビア属種株NS-O-85、及びメチニコビア属種株NS-O-89が挙
げられる。特定の実施態様において、本明細書に記載されるキシリトール経路は、ブダペ
スト条約の条項の下で、2016年11月8日に、国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(Inte
rnational Depositary Authority of Canada)に寄託された、アクセッション番号081116-
01に指定されたメチニコビア種に導入することができる。
当業者に理解されることができるように、本明細書に提供されるメチニコビア種は当業
者に公知の任意のメチニコビア種であることができるので、本明細書に記載されるキシロ
ースレダクターゼをコードする外因性核酸は、いくつかの実施態様において、該外因性核
酸が導入される宿主メチニコビア種と比較したとき、異種核酸である。言い換えると、い
くつかの実施態様において、キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因
性核酸は、異種核酸である。
者に公知の任意のメチニコビア種であることができるので、本明細書に記載されるキシロ
ースレダクターゼをコードする外因性核酸は、いくつかの実施態様において、該外因性核
酸が導入される宿主メチニコビア種と比較したとき、異種核酸である。言い換えると、い
くつかの実施態様において、キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因
性核酸は、異種核酸である。
いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼをコードする外因性核酸、又は
該外因性核酸の導入によって過剰発現されるキシロースレダクターゼは、本明細書に記載
される例示的なキシロースレダクターゼのうちの1つである。例えば、いくつかの実施態
様において、キシロースレダクターゼは、配列番号11～18のいずれか1つから選択される
アミノ酸配列を有する。したがって、いくつかの実施態様において、キシロースレダクタ
ーゼは、配列番号11のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロース
レダクターゼは、配列番号12のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キ
シロースレダクターゼは、配列番号13のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様にお
いて、キシロースレダクターゼは、配列番号14のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施
態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号15のアミノ酸配列を有する。いくつ
かの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号16のアミノ酸配列を有する
。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号17のアミノ酸配列
を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号18のアミ
ノ酸配列を有する。
該外因性核酸の導入によって過剰発現されるキシロースレダクターゼは、本明細書に記載
される例示的なキシロースレダクターゼのうちの1つである。例えば、いくつかの実施態
様において、キシロースレダクターゼは、配列番号11～18のいずれか1つから選択される
アミノ酸配列を有する。したがって、いくつかの実施態様において、キシロースレダクタ
ーゼは、配列番号11のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロース
レダクターゼは、配列番号12のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キ
シロースレダクターゼは、配列番号13のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様にお
いて、キシロースレダクターゼは、配列番号14のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施
態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号15のアミノ酸配列を有する。いくつ
かの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号16のアミノ酸配列を有する
。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号17のアミノ酸配列
を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号18のアミ
ノ酸配列を有する。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される単離されたメチニコビア種に導入
されるキシロースレダクターゼは、本明細書に記載されるキシロースレダクターゼの変異
体である。そのような変異体は、依然として、該キシロースレダクターゼの機能的活性を
保持する。例えば、いくつかの実施態様において、該キシロースレダクターゼは、配列番
号11～18のいずれか1つのアミノ酸配列を有し、ここで、該アミノ酸配列は、1、2、3、4
、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又
は25個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。本明細書に提供されるキシロースレダク
ターゼの変異体は、例えば、参照ポリペプチド配列と比較したとき、欠失、融合、又は切
断も含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるキシロース
レダクターゼは、配列番号11～18のいずれか1つと少なくとも95.0％、少なくとも95.1％
、少なくとも95.2％、少なくとも95.3％、少なくとも95.4％、少なくとも95.5％、少なく
とも95.6％、少なくとも95.7％、少なくとも95.8％、少なくとも95.9％、少なくとも96.0
％、少なくとも96.1％、少なくとも96.2％、少なくとも96.3％、少なくとも96.4％、少な
くとも96.5％、少なくとも96.6％、少なくとも96.7％、少なくとも96.8％、少なくとも96
.9％、少なくとも97.0％、少なくとも97.1％、少なくとも97.2％、少なくとも97.3％、少
なくとも97.4％、少なくとも97.5％、少なくとも97.6％、少なくとも97.7％、少なくとも
97.8％、少なくとも97.9％、少なくとも98.0％、少なくとも98.1％、少なくとも98.2％、
少なくとも98.3％、少なくとも98.4％、少なくとも98.5％、少なくとも98.6％、少なくと
も98.7％、少なくとも98.8％、少なくとも98.9％、少なくとも99.0％、少なくとも99.1％
、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なく
とも99.6％、少なくとも99.7％、又は少なくとも99.8％同一であるアミノ酸配列を有する
。具体的な実施態様において、該キシロースレダクターゼは、配列番号11のアミノ酸配列
又は配列番号11と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
されるキシロースレダクターゼは、本明細書に記載されるキシロースレダクターゼの変異
体である。そのような変異体は、依然として、該キシロースレダクターゼの機能的活性を
保持する。例えば、いくつかの実施態様において、該キシロースレダクターゼは、配列番
号11～18のいずれか1つのアミノ酸配列を有し、ここで、該アミノ酸配列は、1、2、3、4
、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又
は25個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。本明細書に提供されるキシロースレダク
ターゼの変異体は、例えば、参照ポリペプチド配列と比較したとき、欠失、融合、又は切
断も含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるキシロース
レダクターゼは、配列番号11～18のいずれか1つと少なくとも95.0％、少なくとも95.1％
、少なくとも95.2％、少なくとも95.3％、少なくとも95.4％、少なくとも95.5％、少なく
とも95.6％、少なくとも95.7％、少なくとも95.8％、少なくとも95.9％、少なくとも96.0
％、少なくとも96.1％、少なくとも96.2％、少なくとも96.3％、少なくとも96.4％、少な
くとも96.5％、少なくとも96.6％、少なくとも96.7％、少なくとも96.8％、少なくとも96
.9％、少なくとも97.0％、少なくとも97.1％、少なくとも97.2％、少なくとも97.3％、少
なくとも97.4％、少なくとも97.5％、少なくとも97.6％、少なくとも97.7％、少なくとも
97.8％、少なくとも97.9％、少なくとも98.0％、少なくとも98.1％、少なくとも98.2％、
少なくとも98.3％、少なくとも98.4％、少なくとも98.5％、少なくとも98.6％、少なくと
も98.7％、少なくとも98.8％、少なくとも98.9％、少なくとも99.0％、少なくとも99.1％
、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なく
とも99.6％、少なくとも99.7％、又は少なくとも99.8％同一であるアミノ酸配列を有する
。具体的な実施態様において、該キシロースレダクターゼは、配列番号11のアミノ酸配列
又は配列番号11と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される単離されたメチニコビア種であ
り、ここで、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させる
か又は不活化する遺伝子修飾には、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロ
ゲナーゼ又はその部分をコードする1つ又は両方のアレルの欠失が含まれる。したがって
、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、該
単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又はその部分をコードする少
なくとも1つのアレルの欠失を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に提供され
る単離されたメチニコビア種は、単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナ
ーゼ又はその部分をコードする両方のアレルの欠失を含む。
り、ここで、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させる
か又は不活化する遺伝子修飾には、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロ
ゲナーゼ又はその部分をコードする1つ又は両方のアレルの欠失が含まれる。したがって
、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、該
単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又はその部分をコードする少
なくとも1つのアレルの欠失を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に提供され
る単離されたメチニコビア種は、単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナ
ーゼ又はその部分をコードする両方のアレルの欠失を含む。
また本明細書に提供されるのは、キシローストランスポーターの過剰発現を含むキシリ
トール経路を有する単離されたメチニコビア種である。そのようなメチニコビア種は、キ
シロースを有する培地中で培養したとき、キシローストランスポーターを有さないメチニ
コビア種と比較して、キシロースからのキシリトールの生産を増大させることができる。
したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、キシローストラ
ンスポーターをコードする少なくとも1つの外因性核酸、又はその代わりにもしくはそれ
に加えて、単離されたメチニコビア種のキシローストランスポーターの過剰発現をもたら
す少なくとも1つの外因性核酸を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの実
施態様において、本明細書に提供されるのは:(a)キシロースレダクターゼをコードする少
なくとも1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの
過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;(b)単離されたメチニコビア種のキシリ
トールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾;及び(c)キシロースト
ランスポーターをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は単離されたメチニコビア種
のキシローストランスポーターの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸を有す
る単離されたメチニコビア種である。
トール経路を有する単離されたメチニコビア種である。そのようなメチニコビア種は、キ
シロースを有する培地中で培養したとき、キシローストランスポーターを有さないメチニ
コビア種と比較して、キシロースからのキシリトールの生産を増大させることができる。
したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、キシローストラ
ンスポーターをコードする少なくとも1つの外因性核酸、又はその代わりにもしくはそれ
に加えて、単離されたメチニコビア種のキシローストランスポーターの過剰発現をもたら
す少なくとも1つの外因性核酸を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの実
施態様において、本明細書に提供されるのは:(a)キシロースレダクターゼをコードする少
なくとも1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの
過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;(b)単離されたメチニコビア種のキシリ
トールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾;及び(c)キシロースト
ランスポーターをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は単離されたメチニコビア種
のキシローストランスポーターの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸を有す
る単離されたメチニコビア種である。
いくつかの実施態様において、キシローストランスポーターをコードする外因性核酸又
は該外因性核酸の導入によって過剰発現されるキシローストランスポーターは、本明細書
に記載される例示的なキシローストランスポーターのうちの1つである。例えば、いくつ
かの実施態様において、該キシローストランスポーターは、配列番号27～40のいずれか1
つから選択されるアミノ酸配列を有する。したがって、いくつかの実施態様において、キ
シロースレダクターゼは、配列番号27のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様にお
いて、キシロースレダクターゼは、配列番号28のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施
態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号29のアミノ酸配列を有する。いくつ
かの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号30のアミノ酸配列を有する
。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号31のアミノ酸配列
を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号32のアミ
ノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号
33のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、
配列番号34のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクタ
ーゼは、配列番号35のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロース
レダクターゼは、配列番号36のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キ
シロースレダクターゼは、配列番号37のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様にお
いて、キシロースレダクターゼは、配列番号38のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施
態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号39のアミノ酸配列を有する。いくつ
かの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号40のアミノ酸配列を有する
。
は該外因性核酸の導入によって過剰発現されるキシローストランスポーターは、本明細書
に記載される例示的なキシローストランスポーターのうちの1つである。例えば、いくつ
かの実施態様において、該キシローストランスポーターは、配列番号27～40のいずれか1
つから選択されるアミノ酸配列を有する。したがって、いくつかの実施態様において、キ
シロースレダクターゼは、配列番号27のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様にお
いて、キシロースレダクターゼは、配列番号28のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施
態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号29のアミノ酸配列を有する。いくつ
かの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号30のアミノ酸配列を有する
。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号31のアミノ酸配列
を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号32のアミ
ノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号
33のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、
配列番号34のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクタ
ーゼは、配列番号35のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロース
レダクターゼは、配列番号36のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キ
シロースレダクターゼは、配列番号37のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様にお
いて、キシロースレダクターゼは、配列番号38のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施
態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号39のアミノ酸配列を有する。いくつ
かの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号40のアミノ酸配列を有する
。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される単離されたメチニコビア種に導入
されるキシローストランスポーターは、本明細書に記載されるキシローストランスポータ
ーの変異体である。そのような変異体は、依然として、該キシローストランスポーターの
機能的活性を保持する。例えば、いくつかの実施態様において、該キシローストランスポ
ーターは、配列番号27～40のいずれか1つのアミノ酸配列を有し、ここで、該アミノ酸配
列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21
、22、23、24、又は25個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。本明細書に提供される
キシローストランスポーターの変異体は、例えば、参照ポリペプチド配列と比較したとき
、欠失、融合、又は切断も含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に
提供されるキシローストランスポーターは、配列番号27～40のいずれか1つと少なくとも3
0％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも5
5％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも7
2％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも7
7％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも8
2％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも8
7％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも9
2％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも9
7％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する。具
体的な実施態様において、該キシローストランスポーターは、配列番号27～36のいずれか
1つのアミノ酸配列又は配列番号27～36のいずれか1つと少なくとも30％、少なくとも35％
、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％
、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％
、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％
、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％
、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％
、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％
、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％
、少なくとも99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を有する。
されるキシローストランスポーターは、本明細書に記載されるキシローストランスポータ
ーの変異体である。そのような変異体は、依然として、該キシローストランスポーターの
機能的活性を保持する。例えば、いくつかの実施態様において、該キシローストランスポ
ーターは、配列番号27～40のいずれか1つのアミノ酸配列を有し、ここで、該アミノ酸配
列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21
、22、23、24、又は25個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。本明細書に提供される
キシローストランスポーターの変異体は、例えば、参照ポリペプチド配列と比較したとき
、欠失、融合、又は切断も含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に
提供されるキシローストランスポーターは、配列番号27～40のいずれか1つと少なくとも3
0％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも5
5％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも7
2％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも7
7％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも8
2％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも8
7％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも9
2％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも9
7％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する。具
体的な実施態様において、該キシローストランスポーターは、配列番号27～36のいずれか
1つのアミノ酸配列又は配列番号27～36のいずれか1つと少なくとも30％、少なくとも35％
、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％
、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％
、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％
、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％
、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％
、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％
、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％
、少なくとも99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を有する。
本明細書に提供されるキシロースレダクターゼ及びキシローストランスポーターは、そ
れぞれ、本明細書に示されるアミノ酸配列を有するH0メチニコビア属種に由来するものを
含む、メチニコビアキシロースレダクターゼ又はメチニコビアトランスポーター、及びそ
のそれぞれの機能(例えば、キシロースからキシリトールへの変換又はキシロース輸送)を
保持するその変異体であることができる。例えば、本明細書に提供されるのは、配列番号
11のアミノ酸配列を有するH0メチニコビア属種由来のXyl1、及びXyl1の酵素機能を保持す
るのその変異体である。Xyl1の酵素機能には、限定されないが、キシロースからキシリト
ールへの変換を触媒することが含まれ、これは、例えば、該変異体を本明細書に記載され
ているか又はそれ以外の形で当技術分野で公知のアッセイに供することにより決定するこ
とができる。別の例として、本明細書に提供されるのは、配列番号27のアミノ酸配列を有
するH0メチニコビア属種由来のXyt1、及びXyt1のトランスポーター機能を保持するその変
異体である。Xyt1のトランスポーター機能には、限定されないが、細胞壁及び/又は細胞
膜内外へのキシロースの輸送が含まれ、これは、例えば、該変異体を本明細書に記載され
ているか又はそれ以外の形で当技術分野で公知のトランスポーターアッセイに供すること
により決定することができる。
れぞれ、本明細書に示されるアミノ酸配列を有するH0メチニコビア属種に由来するものを
含む、メチニコビアキシロースレダクターゼ又はメチニコビアトランスポーター、及びそ
のそれぞれの機能(例えば、キシロースからキシリトールへの変換又はキシロース輸送)を
保持するその変異体であることができる。例えば、本明細書に提供されるのは、配列番号
11のアミノ酸配列を有するH0メチニコビア属種由来のXyl1、及びXyl1の酵素機能を保持す
るのその変異体である。Xyl1の酵素機能には、限定されないが、キシロースからキシリト
ールへの変換を触媒することが含まれ、これは、例えば、該変異体を本明細書に記載され
ているか又はそれ以外の形で当技術分野で公知のアッセイに供することにより決定するこ
とができる。別の例として、本明細書に提供されるのは、配列番号27のアミノ酸配列を有
するH0メチニコビア属種由来のXyt1、及びXyt1のトランスポーター機能を保持するその変
異体である。Xyt1のトランスポーター機能には、限定されないが、細胞壁及び/又は細胞
膜内外へのキシロースの輸送が含まれ、これは、例えば、該変異体を本明細書に記載され
ているか又はそれ以外の形で当技術分野で公知のトランスポーターアッセイに供すること
により決定することができる。
キシロースレダクターゼ機能は、例えば、キシロースレダクターゼをメチニコビア種で
発現させ、該メチニコビア種によるキシリトール生産の増加を測定することにより決定す
ることができる。同様に、キシローストランスポーター機能は、例えば、該トランスポー
ターをメチニコビア種で発現させ、該メチニコビア種によるキシロース取込みの増加を測
定することにより決定することができる。例示的なアッセイにおいて、キシロースレダク
ターゼ及び/又はキシローストランスポーターをコードする内在性核酸を過剰発現するメ
チニコビア種をキシロース含有培地中で培養し、培養培地中のキシロースの減少及び/又
は該培地中のキシリトールの増加を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定するこ
とができる。別の例示的なアッセイにおいて、キシロースレダクターゼ及び/又はキシロ
ーストランスポーターを発現する野生型及び組換えメチニコビア種のスターター培養物を
、グルコース及びキシロースの量(％; w/v)が制御されたYEP塩基培地中で成長させること
ができる。接種されていない培地を所与のサンプリング時間の間の参照として使用し;該
培地は、0時間の時点での100％の出発キシロース又はキシロースを示す。24時間の間隔で
、300～1000μLの容量の試料を培養物から無菌的に除去し、0.2μmシリンジフィルターに
通して濾過し、培地と酵母を物理的に分離することができる。培地をガラスバイアルに移
すことができ、キシロース及びキシリトール含有量をHPLCによって調べることができる。
キシロースレダクターゼ及び/又はキシローストランスポーターを発現する組換えメチニ
コビア種は、その野生型対応物よりも高速でキシロースを消費し、かつキシリトールを生
産することができ、野生型メチニコビア種と組換えメチニコビア種の違いは、変異体のキ
シロースレダクターゼ及び/又はキシローストランスポーター機能を示すことができる。
発現させ、該メチニコビア種によるキシリトール生産の増加を測定することにより決定す
ることができる。同様に、キシローストランスポーター機能は、例えば、該トランスポー
ターをメチニコビア種で発現させ、該メチニコビア種によるキシロース取込みの増加を測
定することにより決定することができる。例示的なアッセイにおいて、キシロースレダク
ターゼ及び/又はキシローストランスポーターをコードする内在性核酸を過剰発現するメ
チニコビア種をキシロース含有培地中で培養し、培養培地中のキシロースの減少及び/又
は該培地中のキシリトールの増加を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定するこ
とができる。別の例示的なアッセイにおいて、キシロースレダクターゼ及び/又はキシロ
ーストランスポーターを発現する野生型及び組換えメチニコビア種のスターター培養物を
、グルコース及びキシロースの量(％; w/v)が制御されたYEP塩基培地中で成長させること
ができる。接種されていない培地を所与のサンプリング時間の間の参照として使用し;該
培地は、0時間の時点での100％の出発キシロース又はキシロースを示す。24時間の間隔で
、300～1000μLの容量の試料を培養物から無菌的に除去し、0.2μmシリンジフィルターに
通して濾過し、培地と酵母を物理的に分離することができる。培地をガラスバイアルに移
すことができ、キシロース及びキシリトール含有量をHPLCによって調べることができる。
キシロースレダクターゼ及び/又はキシローストランスポーターを発現する組換えメチニ
コビア種は、その野生型対応物よりも高速でキシロースを消費し、かつキシリトールを生
産することができ、野生型メチニコビア種と組換えメチニコビア種の違いは、変異体のキ
シロースレダクターゼ及び/又はキシローストランスポーター機能を示すことができる。
本明細書に記載されるように、提供される組換えメチニコビア種は、キシロースからキ
シリトールを生産することができるキシリトール経路を含むように修飾することができる
。その修飾が該キシリトール経路の少なくとも1つの酵素をコードする異種外因性核酸配
列の導入を含む場合、該酵素のコード配列は、宿主のコドン利用に従って修飾することが
できる。標準的な遺伝コードは、例えば、Osawaらの文献、Microbiol Rev. 56(1):229-64
(1992)に概説されているように、当技術分野で周知である。限定されないが、出芽酵母、
カンジダ・アジマ(Candida azyma)、カンジダ・ジベルサ(Candida diversa)、カンジダ・
マグノリアエ(Candida magnoliae)、カンジダ・ルゴペリクローサ(Candida rugopellicul
osa)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、及びジゴアスクス・ヘレニク
ス(Zygoascus hellenicus)を含む、酵母種は、標準的なコードを使用する。ある種の酵母
種は別のコードを使用する。例えば、「Leu」に対する標準的なコードである「CUG」は、
「CUG」クレード種、例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・
シリンドラセア(Candida cylindracea)、カンジダ・メリビオシカ(Candida melibiosica)
、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ルゴセ(Candida rug
ose)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)、及びメチニコビア種では、「Ser」を
コードする。H0メチニコビア属種のDNAコドン表が、本明細書に提供されている。非「CUG
」クレード種由来の外来遺伝子におけるDNAコドンCTGは、メチニコビア種におけるタンパ
ク質の機能的発現のために、TTG、CTT、CTC、TTA、又はCTAに変更される必要がある。他
のコドン最適化は、メチニコビア種における外来遺伝子のタンパク質発現の増大をもたら
すことができる。コドン最適化の方法は、当技術分野で周知であり(例えば、Chungらの文
献、BMC Syst Biol. 6:134(2012); Chinらの文献、Bioinfomatics 30(15):2210-12(2014)
)、様々なツールが利用可能である(例えば、https://www.dna20.com/services/genegpsの
DNA2.0;及びhttp://genomes.urv.es/OPTIMIZERのOPTIMIZER)。
シリトールを生産することができるキシリトール経路を含むように修飾することができる
。その修飾が該キシリトール経路の少なくとも1つの酵素をコードする異種外因性核酸配
列の導入を含む場合、該酵素のコード配列は、宿主のコドン利用に従って修飾することが
できる。標準的な遺伝コードは、例えば、Osawaらの文献、Microbiol Rev. 56(1):229-64
(1992)に概説されているように、当技術分野で周知である。限定されないが、出芽酵母、
カンジダ・アジマ(Candida azyma)、カンジダ・ジベルサ(Candida diversa)、カンジダ・
マグノリアエ(Candida magnoliae)、カンジダ・ルゴペリクローサ(Candida rugopellicul
osa)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、及びジゴアスクス・ヘレニク
ス(Zygoascus hellenicus)を含む、酵母種は、標準的なコードを使用する。ある種の酵母
種は別のコードを使用する。例えば、「Leu」に対する標準的なコードである「CUG」は、
「CUG」クレード種、例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・
シリンドラセア(Candida cylindracea)、カンジダ・メリビオシカ(Candida melibiosica)
、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ルゴセ(Candida rug
ose)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)、及びメチニコビア種では、「Ser」を
コードする。H0メチニコビア属種のDNAコドン表が、本明細書に提供されている。非「CUG
」クレード種由来の外来遺伝子におけるDNAコドンCTGは、メチニコビア種におけるタンパ
ク質の機能的発現のために、TTG、CTT、CTC、TTA、又はCTAに変更される必要がある。他
のコドン最適化は、メチニコビア種における外来遺伝子のタンパク質発現の増大をもたら
すことができる。コドン最適化の方法は、当技術分野で周知であり(例えば、Chungらの文
献、BMC Syst Biol. 6:134(2012); Chinらの文献、Bioinfomatics 30(15):2210-12(2014)
)、様々なツールが利用可能である(例えば、https://www.dna20.com/services/genegpsの
DNA2.0;及びhttp://genomes.urv.es/OPTIMIZERのOPTIMIZER)。
いくつかの実施態様において、単離されたメチニコビア種は、本明細書に記載される1
コピー以上の外因性核酸を有することができる。いくつかの実施態様において、該メチニ
コビア種は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
又はそれより多くのコピーの外因性核酸を有する。本明細書に記載される複数の外因性核
酸の発現は、メチニコビア種へのキシロース取込み及び/又はキシロースからキシリトー
ルへの変換をさらに改善することができる。したがって、該メチニコビア種は、各々キシ
ローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする、少なくとも1つ
、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少
なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、又は少なくとも10の外因性核酸を有する
ことができる。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストラ
ンスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも2つの外因性核酸
を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランス
ポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも3つの外因性核酸を有
する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポー
ター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも4つの外因性核酸を有する
。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター
及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも5つの外因性核酸を有する。い
くつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び
/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも6つの外因性核酸を有する。いくつ
かの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又
はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも7つの外因性核酸を有する。いくつか
の実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーターをコードす
る少なくとも8つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア
種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする
少なくとも9つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種
は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少
なくとも10の外因性核酸を有する。
コピー以上の外因性核酸を有することができる。いくつかの実施態様において、該メチニ
コビア種は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
又はそれより多くのコピーの外因性核酸を有する。本明細書に記載される複数の外因性核
酸の発現は、メチニコビア種へのキシロース取込み及び/又はキシロースからキシリトー
ルへの変換をさらに改善することができる。したがって、該メチニコビア種は、各々キシ
ローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする、少なくとも1つ
、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少
なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、又は少なくとも10の外因性核酸を有する
ことができる。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストラ
ンスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも2つの外因性核酸
を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランス
ポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも3つの外因性核酸を有
する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポー
ター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも4つの外因性核酸を有する
。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター
及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも5つの外因性核酸を有する。い
くつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び
/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも6つの外因性核酸を有する。いくつ
かの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又
はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも7つの外因性核酸を有する。いくつか
の実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーターをコードす
る少なくとも8つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア
種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする
少なくとも9つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種
は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少
なくとも10の外因性核酸を有する。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、キ
シロースからキシリトールを生産するための1以上のキシリトール経路を有することがで
きる。該キシリトール経路は、内在性経路又は外因性経路であることができる。本明細書
に提供されるメチニコビア種は、キシリトールの生産のための1以上のキシリトール経路
に関与する酵素又はタンパク質のうちの1つ又は複数をコードする発現可能な核酸をさら
に有することができる。どの酵素又はタンパク質がメチニコビア種にとって内在性である
かに応じて、特定のキシリトール経路のいくつか又は全てのための核酸を発現させること
ができる。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、キシロースからキシリト
ールを生産し、かつキシリトールを天然に生産するためのキシリトール経路の全ての酵素
の内在性発現を有することができ、これは、キシリトール経路の酵素又はタンパク質(例
えば、キシローストランスポーター又はキシロースレダクターゼ)の発現をさらに修飾し
又は増大させることにより改善することができる。いくつかの実施態様において、該メチ
ニコビア種は、所望のキシリトール経路のための1以上の酵素又はタンパク質が欠損して
いる可能性があり、その場合、欠損している酵素又はタンパク質に代わる発現可能な核酸
が後続の外因性発現のためにメチニコビア種に導入される。或いは、該メチニコビア種が
いくつかの経路遺伝子の内在性発現を示すが、その他のものが欠損している場合、キシリ
トールの生合成を達成するために、欠損している酵素又はタンパク質の代わりにコード核
酸が必要とされる。したがって、組換えメチニコビア種は、所望のキシリトール経路を得
るための外因性酵素もしくはタンパク質活性をさらに含むことができるか、又は1以上の
内在性酵素もしくはタンパク質と一緒に、キシリトールを生産する1以上の外因性酵素も
しくはタンパク質活性を導入することにより、所望のキシリトール経路を得ることができ
る。
シロースからキシリトールを生産するための1以上のキシリトール経路を有することがで
きる。該キシリトール経路は、内在性経路又は外因性経路であることができる。本明細書
に提供されるメチニコビア種は、キシリトールの生産のための1以上のキシリトール経路
に関与する酵素又はタンパク質のうちの1つ又は複数をコードする発現可能な核酸をさら
に有することができる。どの酵素又はタンパク質がメチニコビア種にとって内在性である
かに応じて、特定のキシリトール経路のいくつか又は全てのための核酸を発現させること
ができる。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、キシロースからキシリト
ールを生産し、かつキシリトールを天然に生産するためのキシリトール経路の全ての酵素
の内在性発現を有することができ、これは、キシリトール経路の酵素又はタンパク質(例
えば、キシローストランスポーター又はキシロースレダクターゼ)の発現をさらに修飾し
又は増大させることにより改善することができる。いくつかの実施態様において、該メチ
ニコビア種は、所望のキシリトール経路のための1以上の酵素又はタンパク質が欠損して
いる可能性があり、その場合、欠損している酵素又はタンパク質に代わる発現可能な核酸
が後続の外因性発現のためにメチニコビア種に導入される。或いは、該メチニコビア種が
いくつかの経路遺伝子の内在性発現を示すが、その他のものが欠損している場合、キシリ
トールの生合成を達成するために、欠損している酵素又はタンパク質の代わりにコード核
酸が必要とされる。したがって、組換えメチニコビア種は、所望のキシリトール経路を得
るための外因性酵素もしくはタンパク質活性をさらに含むことができるか、又は1以上の
内在性酵素もしくはタンパク質と一緒に、キシリトールを生産する1以上の外因性酵素も
しくはタンパク質活性を導入することにより、所望のキシリトール経路を得ることができ
る。
本明細書に提供されるメチニコビア種は、安定な遺伝子改変を含有することができ、こ
れは、該改変を失うことなく、5世代よりも長い間培養することができる微生物を指す。
通常、安定な遺伝子改変には、10世代よりも長く持続する修飾が含まれ、特に安定な修飾
は、約25世代よりも長く持続し、より具体的には、遺伝子修飾は、無限を含めて、50世代
よりも長いものである。
れは、該改変を失うことなく、5世代よりも長い間培養することができる微生物を指す。
通常、安定な遺伝子改変には、10世代よりも長く持続する修飾が含まれ、特に安定な修飾
は、約25世代よりも長く持続し、より具体的には、遺伝子修飾は、無限を含めて、50世代
よりも長いものである。
酵素又はタンパク質を減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾の場合、特に有用で安定
な遺伝子改変は遺伝子欠失である。安定な遺伝子改変を導入するための遺伝子欠失の使用
は、遺伝子改変前の表現型の復帰の可能性を低下させるために特に有用である。例えば、
安定な成長と連動したキシリトールの生産は、例えば、キシリトールデヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子の欠失によって達成することができる。安定な成長と連動したキシリト
ールの生産の安定性は、各々の破壊された活性について起こる複数の代償性復帰の可能性
を顕著に低下させる複数の欠失(例えば、所与の遺伝子の両方のアレルの欠失)によってさ
らに強化することができる。
な遺伝子改変は遺伝子欠失である。安定な遺伝子改変を導入するための遺伝子欠失の使用
は、遺伝子改変前の表現型の復帰の可能性を低下させるために特に有用である。例えば、
安定な成長と連動したキシリトールの生産は、例えば、キシリトールデヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子の欠失によって達成することができる。安定な成長と連動したキシリト
ールの生産の安定性は、各々の破壊された活性について起こる複数の代償性復帰の可能性
を顕著に低下させる複数の欠失(例えば、所与の遺伝子の両方のアレルの欠失)によってさ
らに強化することができる。
当業者は、本明細書に例示される代謝的修飾を含む遺伝子改変が、好適な宿主生物、例
えば、本明細書に提供されるメチニコビア種及びその対応する代謝反応又は所望の遺伝物
質、例えば、所望の代謝経路の遺伝子のための好適な供給源生物を参照して説明されてい
ることを理解するであろう。しかしながら、多種多様な生物の完全なゲノムシークエンシ
ング及びゲノミクスの領域における高度な技術を考慮して、当業者は、本明細書に提供さ
れる教示及び指針を本質的に全ての他の生物に容易に適用することができるであろう。例
えば、本明細書に例示される代謝的改変は、言及された種以外の種由来の同じ又は類似の
コード化核酸を組み込むことにより、他の種に容易に適用することができる。そのような
遺伝子改変には、例えば、種ホモログ一般、特に、オーソログ、パラログの遺伝子改変、
又は非オーソロガス遺伝子置換が含まれる。
えば、本明細書に提供されるメチニコビア種及びその対応する代謝反応又は所望の遺伝物
質、例えば、所望の代謝経路の遺伝子のための好適な供給源生物を参照して説明されてい
ることを理解するであろう。しかしながら、多種多様な生物の完全なゲノムシークエンシ
ング及びゲノミクスの領域における高度な技術を考慮して、当業者は、本明細書に提供さ
れる教示及び指針を本質的に全ての他の生物に容易に適用することができるであろう。例
えば、本明細書に例示される代謝的改変は、言及された種以外の種由来の同じ又は類似の
コード化核酸を組み込むことにより、他の種に容易に適用することができる。そのような
遺伝子改変には、例えば、種ホモログ一般、特に、オーソログ、パラログの遺伝子改変、
又は非オーソロガス遺伝子置換が含まれる。
オーソログは、垂直血統によって関連付けられ、異なる生物において実質的に同じ又は
同一の機能に関与している遺伝子(単数又は複数)である。例えば、マウスエポキシドヒド
ロラーゼとヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能につい
てオーソログとみなすことができる。遺伝子は、例えば、それらが相同であるか、又は共
通の祖先からの進化によって関連することを示すのに十分な量の配列類似性を共有する場
合に垂直血統によって関連付けられる。遺伝子はまた、3次元構造を共有するが、一次配
列類似性が確認できない程度に共通の祖先から進化していることを示すのに十分な量の配
列類似性を必ずしも共有しない場合、オーソログとみなすことができる。オーソロガスで
ある遺伝子は、約25％～100％のアミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質を
コードすることができる。25％未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする
遺伝子は、それらの3次元構造も類似性を示す場合に、垂直血統によって生じたとみなす
こともできる。組織プラスミノーゲン活性化因子及びエラスターゼを含む、セリンプロテ
アーゼファミリーの酵素のメンバーは、共通の祖先からの垂直血統によって生じたとみな
される。
同一の機能に関与している遺伝子(単数又は複数)である。例えば、マウスエポキシドヒド
ロラーゼとヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能につい
てオーソログとみなすことができる。遺伝子は、例えば、それらが相同であるか、又は共
通の祖先からの進化によって関連することを示すのに十分な量の配列類似性を共有する場
合に垂直血統によって関連付けられる。遺伝子はまた、3次元構造を共有するが、一次配
列類似性が確認できない程度に共通の祖先から進化していることを示すのに十分な量の配
列類似性を必ずしも共有しない場合、オーソログとみなすことができる。オーソロガスで
ある遺伝子は、約25％～100％のアミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質を
コードすることができる。25％未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする
遺伝子は、それらの3次元構造も類似性を示す場合に、垂直血統によって生じたとみなす
こともできる。組織プラスミノーゲン活性化因子及びエラスターゼを含む、セリンプロテ
アーゼファミリーの酵素のメンバーは、共通の祖先からの垂直血統によって生じたとみな
される。
オーソログには、例えば、進化を通じて、構造又は全体的な活性が分岐した遺伝子又は
そのコードされた遺伝子産物が含まれる。例えば、1つの種が2つの機能を示す遺伝子産物
をコードする場合及びそのような機能が第二の種において異なる遺伝子に分離している場
合、これら3つの遺伝子及びその対応する産物は、オーソログとみなされる。生化学的化
合物の生産のために、当業者は、導入又は破壊されるべき代謝活性を保有するオーソロガ
ス遺伝子が本明細書に提供されるメチニコビア種の構築のために選択されることになるこ
とを理解しているであろう。分離可能な活性を示すオーソログの例は、異なる活性が2以
上の種間で又は単一の種内で異なる遺伝子産物に分離している場合である。具体的な例は
、エラスターゼタンパク質分解及びプラスミノーゲンタンパク質分解という2種類のセリ
ンプロテアーゼ活性がプラスミノーゲン活性化因子及びエラスターゼとして異なる分子に
分離していることである。第二の例は、マイコプラズマ5'-3'エキソヌクレアーゼ及びド
ロソフィラ(Drosophila)DNAポリメラーゼIII活性の分離である。第一の種由来のDNAポリ
メラーゼを第二の種由来のエキソヌクレアーゼもしくはポリメラーゼのどちらか又はその
両方に対するオーソログとみなすことができ、そしてその逆も同様である。
そのコードされた遺伝子産物が含まれる。例えば、1つの種が2つの機能を示す遺伝子産物
をコードする場合及びそのような機能が第二の種において異なる遺伝子に分離している場
合、これら3つの遺伝子及びその対応する産物は、オーソログとみなされる。生化学的化
合物の生産のために、当業者は、導入又は破壊されるべき代謝活性を保有するオーソロガ
ス遺伝子が本明細書に提供されるメチニコビア種の構築のために選択されることになるこ
とを理解しているであろう。分離可能な活性を示すオーソログの例は、異なる活性が2以
上の種間で又は単一の種内で異なる遺伝子産物に分離している場合である。具体的な例は
、エラスターゼタンパク質分解及びプラスミノーゲンタンパク質分解という2種類のセリ
ンプロテアーゼ活性がプラスミノーゲン活性化因子及びエラスターゼとして異なる分子に
分離していることである。第二の例は、マイコプラズマ5'-3'エキソヌクレアーゼ及びド
ロソフィラ(Drosophila)DNAポリメラーゼIII活性の分離である。第一の種由来のDNAポリ
メラーゼを第二の種由来のエキソヌクレアーゼもしくはポリメラーゼのどちらか又はその
両方に対するオーソログとみなすことができ、そしてその逆も同様である。
対照的に、パラログは、例えば、重複とその後の進化的分岐によって関連付けられるホ
モログであり、類似又は共通しているが、同一ではない機能を有する。パラログは、例え
ば、同じ種もしくは異なる種に由来するか又はこれらから派生することができる。例えば
、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ(エポキシドヒドロラーゼI)と可溶性エポキシド
ヒドロラーゼ(エポキシドヒドロラーゼII)は、異なる反応を触媒し、かつ同じ種において
異なる機能を有する、共通の祖先から共進化した2つの異なる酵素を表すので、パラログ
とみなすことができる。パラログは、互いに顕著な配列類似性を有する同じ種由来のタン
パク質であり、それが相同であるか、又は共通の祖先からの共進化によって関連付けられ
ることを示唆している。パラロガスなタンパク質ファミリーの群としては、HipAホモログ
、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチーダーゼ、及びその他のものが挙げられる。
モログであり、類似又は共通しているが、同一ではない機能を有する。パラログは、例え
ば、同じ種もしくは異なる種に由来するか又はこれらから派生することができる。例えば
、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ(エポキシドヒドロラーゼI)と可溶性エポキシド
ヒドロラーゼ(エポキシドヒドロラーゼII)は、異なる反応を触媒し、かつ同じ種において
異なる機能を有する、共通の祖先から共進化した2つの異なる酵素を表すので、パラログ
とみなすことができる。パラログは、互いに顕著な配列類似性を有する同じ種由来のタン
パク質であり、それが相同であるか、又は共通の祖先からの共進化によって関連付けられ
ることを示唆している。パラロガスなタンパク質ファミリーの群としては、HipAホモログ
、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチーダーゼ、及びその他のものが挙げられる。
非オーソロガス遺伝子置換は、異なる種における言及された遺伝子機能と置き換わるこ
とができる1つの種由来の非オーソロガス遺伝子である。置換は、例えば、異なる種にお
ける言及された機能と比較して起源の種において実質的に同じ又は同様の機能を果たすこ
とができることを含む。通常、非オーソロガス遺伝子置換は、言及された機能をコードす
る既知の遺伝子と構造的に関連があるものとして同定可能であるが、構造的にあまり関連
はないが、機能的に類似している遺伝子及びその対応する遺伝子産物もやはり、それが使
用される場合の用語の意味に含まれる。機能的類似性は、例えば、置換しようとする機能
をコードする遺伝子と比較して非オーソロガス遺伝子産物の活性部位又は結合領域におけ
る少なくともある程度の構造的類似性を必要とする。それゆえ、非オーソロガス遺伝子に
は、例えば、パラログ又は無関係な遺伝子が含まれる。
とができる1つの種由来の非オーソロガス遺伝子である。置換は、例えば、異なる種にお
ける言及された機能と比較して起源の種において実質的に同じ又は同様の機能を果たすこ
とができることを含む。通常、非オーソロガス遺伝子置換は、言及された機能をコードす
る既知の遺伝子と構造的に関連があるものとして同定可能であるが、構造的にあまり関連
はないが、機能的に類似している遺伝子及びその対応する遺伝子産物もやはり、それが使
用される場合の用語の意味に含まれる。機能的類似性は、例えば、置換しようとする機能
をコードする遺伝子と比較して非オーソロガス遺伝子産物の活性部位又は結合領域におけ
る少なくともある程度の構造的類似性を必要とする。それゆえ、非オーソロガス遺伝子に
は、例えば、パラログ又は無関係な遺伝子が含まれる。
それゆえ、生合成能力を有する本明細書に提供されるメチニコビア種を同定及び構築す
る際に、当業者は、本明細書に提供される教示及び指針を特定の種に適用して、代謝的修
飾の同定がオーソログの同定及び包含又は不活化を含むことができるということを理解す
るであろう。パラログ及び/又は非オーソロガス遺伝子置換が同様の又は実質的に同様の
代謝反応を触媒する酵素をコードする言及された微生物に存在する限りにおいて、当業者
は、これらの進化的に関連のある遺伝子を利用することもできる。遺伝子破壊についても
同様に、進化的に関連する遺伝子を宿主微生物おいて破壊するか又は欠失させて、破壊の
標的とされる酵素活性の機能的冗長性を低下又は消失させることができる。
る際に、当業者は、本明細書に提供される教示及び指針を特定の種に適用して、代謝的修
飾の同定がオーソログの同定及び包含又は不活化を含むことができるということを理解す
るであろう。パラログ及び/又は非オーソロガス遺伝子置換が同様の又は実質的に同様の
代謝反応を触媒する酵素をコードする言及された微生物に存在する限りにおいて、当業者
は、これらの進化的に関連のある遺伝子を利用することもできる。遺伝子破壊についても
同様に、進化的に関連する遺伝子を宿主微生物おいて破壊するか又は欠失させて、破壊の
標的とされる酵素活性の機能的冗長性を低下又は消失させることができる。
オーソログ、パラログ、及び非オーソロガス遺伝子置換は、当業者に周知の方法によっ
て決定することができる。例えば、2つのポリペプチドについての核酸又はアミノ酸配列
の調査により、比較された配列間の配列同一性及び類似性が明らかになるであろう。その
ような類似性に基づいて、当業者は、これらのタンパク質が共通の祖先からの進化によっ
て関連付けられることを示すほど類似性が十分に高いかどうかを決定することができる。
当業者に周知のアルゴリズム、例えば、Align、BLAST、Clustal W、及びその他のものは
、未加工の配列の類似性又は同一性を比較及び決定し、また、加重又はスコアを割り当て
ることができる配列中のギャップの存在又は重要性を決定する。そのようなアルゴリズム
も当技術分野で公知であり、ヌクレオチド配列の類似性又は同一性を決定するために同様
に適用される。関連性を決定するための十分な類似性のパラメータは、統計的類似性、又
はランダムなポリペプチドにおける類似の一致を発見する見込み、及び決定された一致の
有意性を計算するための周知の方法に基づいて計算される。2以上の配列のコンピュータ
比較は、望ましい場合、当業者によって視覚的に最適化されることもできる。関連する遺
伝子産物又はタンパク質は、高い類似性、例えば、25％～100％の配列同一性を有すると
考えることができる。関連のないタンパク質は、十分なサイズのデータベースをスキャン
しても、偶然に起こると考えられるもの(約5％)と本質的に同じである同一性を有するこ
とがある。5％～24％の配列は、比較された配列が関連しているという結論を下すのに十
分な相同性を表す場合もあるし、表さない場合もある。データセットのサイズを考慮して
、そのような一致の有意性を決定するためのさらなる統計解析を実施して、これらの配列
の関連性を決定することができる。
て決定することができる。例えば、2つのポリペプチドについての核酸又はアミノ酸配列
の調査により、比較された配列間の配列同一性及び類似性が明らかになるであろう。その
ような類似性に基づいて、当業者は、これらのタンパク質が共通の祖先からの進化によっ
て関連付けられることを示すほど類似性が十分に高いかどうかを決定することができる。
当業者に周知のアルゴリズム、例えば、Align、BLAST、Clustal W、及びその他のものは
、未加工の配列の類似性又は同一性を比較及び決定し、また、加重又はスコアを割り当て
ることができる配列中のギャップの存在又は重要性を決定する。そのようなアルゴリズム
も当技術分野で公知であり、ヌクレオチド配列の類似性又は同一性を決定するために同様
に適用される。関連性を決定するための十分な類似性のパラメータは、統計的類似性、又
はランダムなポリペプチドにおける類似の一致を発見する見込み、及び決定された一致の
有意性を計算するための周知の方法に基づいて計算される。2以上の配列のコンピュータ
比較は、望ましい場合、当業者によって視覚的に最適化されることもできる。関連する遺
伝子産物又はタンパク質は、高い類似性、例えば、25％～100％の配列同一性を有すると
考えることができる。関連のないタンパク質は、十分なサイズのデータベースをスキャン
しても、偶然に起こると考えられるもの(約5％)と本質的に同じである同一性を有するこ
とがある。5％～24％の配列は、比較された配列が関連しているという結論を下すのに十
分な相同性を表す場合もあるし、表さない場合もある。データセットのサイズを考慮して
、そのような一致の有意性を決定するためのさらなる統計解析を実施して、これらの配列
の関連性を決定することができる。
例えば、BLASTアルゴリズムを用いて2以上の配列の関連性を決定するための例示的なパ
ラメータは、以下に記載されているようなものであることができる。簡潔に述べると、ア
ミノ酸配列アラインメントは、BLASTPバージョン2.0.8(Jan-05-1999)及び以下のパラメー
タ:マトリクス: 0 BLOSUM62;ギャップ開始: 11;ギャップ伸長: 1; x_dropoff: 50;期待:
10.0;文字サイズ: 3;フィルター:オンを用いて実施することができる。核酸配列アライン
メントは、BLASTNバージョン2.0.6(Sept-16-1998)及び以下のパラメータ:マッチ: 1;ミス
マッチ: -2;ギャップ開始: 5;ギャップ伸長: 2; x_dropoff: 50;期待: 10.0;文字サイズ:
11;フィルター:オフを用いて実施することができる。当業者は、例えば、比較のストリ
ンジェンシーを増加又は減少させて、2以上の配列の関連性を決定するために、どの修正
を上記のパラメータに対して行うことができるかを知っているであろう。
ラメータは、以下に記載されているようなものであることができる。簡潔に述べると、ア
ミノ酸配列アラインメントは、BLASTPバージョン2.0.8(Jan-05-1999)及び以下のパラメー
タ:マトリクス: 0 BLOSUM62;ギャップ開始: 11;ギャップ伸長: 1; x_dropoff: 50;期待:
10.0;文字サイズ: 3;フィルター:オンを用いて実施することができる。核酸配列アライン
メントは、BLASTNバージョン2.0.6(Sept-16-1998)及び以下のパラメータ:マッチ: 1;ミス
マッチ: -2;ギャップ開始: 5;ギャップ伸長: 2; x_dropoff: 50;期待: 10.0;文字サイズ:
11;フィルター:オフを用いて実施することができる。当業者は、例えば、比較のストリ
ンジェンシーを増加又は減少させて、2以上の配列の関連性を決定するために、どの修正
を上記のパラメータに対して行うことができるかを知っているであろう。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される単離されたメチニコビア種を用いて
キシリトールを生産する方法である。そのような方法は、キシリトールを生産するための
キシリトール経路を有する単離されたメチニコビア種を、キシロースからキシリトールを
生産するための条件下で、かつそれに十分な期間培養することを含むことができる。した
がって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、キシリトールを生産
する方法であって:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸
又は単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくと
も1つの外因性核酸;及び(b)単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ
を減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種を、キシロ
ースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに十分な期間培養することを
含む、方法である。
キシリトールを生産する方法である。そのような方法は、キシリトールを生産するための
キシリトール経路を有する単離されたメチニコビア種を、キシロースからキシリトールを
生産するための条件下で、かつそれに十分な期間培養することを含むことができる。した
がって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、キシリトールを生産
する方法であって:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸
又は単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくと
も1つの外因性核酸;及び(b)単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ
を減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種を、キシロ
ースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに十分な期間培養することを
含む、方法である。
本明細書に提供される方法は、特定の速度及び/又は濃度でのキシリトールの生産を含
む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくと
も0.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に提供される方法は、少なくとも0.60g/L/hの速度でキシロースからキシ
リトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少な
くとも0.70g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される方法は、少なくとも0.80g/L/hの速度でキシロースから
キシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、
少なくとも0.90g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施
態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも1.00g/L/hの速度でキシロース
からキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法
は、少なくとも1.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの
実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも2.00g/L/hの速度でキシロ
ースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される
方法は、少なくとも2.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつ
かの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも3.00g/L/hの速度でキ
シロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供さ
れる方法は、少なくとも3.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。い
くつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも4.00g/L/hの速度
でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提
供される方法は、少なくとも5.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも6.00g/L/hの
速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書
に提供される方法は、少なくとも7.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産
する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも8.00g/L/
hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明
細書に提供される方法は、少なくとも9.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを
生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも10.0
0g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。
む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくと
も0.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に提供される方法は、少なくとも0.60g/L/hの速度でキシロースからキシ
リトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少な
くとも0.70g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される方法は、少なくとも0.80g/L/hの速度でキシロースから
キシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、
少なくとも0.90g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施
態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも1.00g/L/hの速度でキシロース
からキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法
は、少なくとも1.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの
実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも2.00g/L/hの速度でキシロ
ースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される
方法は、少なくとも2.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつ
かの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも3.00g/L/hの速度でキ
シロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供さ
れる方法は、少なくとも3.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。い
くつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも4.00g/L/hの速度
でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提
供される方法は、少なくとも5.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも6.00g/L/hの
速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書
に提供される方法は、少なくとも7.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産
する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも8.00g/L/
hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明
細書に提供される方法は、少なくとも9.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを
生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも10.0
0g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも75g/Lの濃度
でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提
供される方法は、少なくとも80g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。い
くつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも85g/Lの濃度でキ
シロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供さ
れる方法は、少なくとも90g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつ
かの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも95g/Lの濃度でキシロ
ースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される
方法は、少なくとも100g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの
実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも110g/Lの濃度でキシロース
からキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法
は、少なくとも120g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施
態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも130g/Lの濃度でキシロースから
キシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、
少なくとも140g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される方法は、少なくとも150g/Lの濃度でキシロースからキシ
リトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少な
くとも160g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に提供される方法は、少なくとも170g/Lの濃度でキシロースからキシリト
ールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくと
も180g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において
、本明細書に提供される方法は、少なくとも190g/Lの濃度でキシロースからキシリトール
を生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも20
0g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本
明細書に提供される方法は、少なくとも250g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生
産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも300g/L
の濃度でキシロースからキシリトールを生産する。
でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提
供される方法は、少なくとも80g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。い
くつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも85g/Lの濃度でキ
シロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供さ
れる方法は、少なくとも90g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつ
かの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも95g/Lの濃度でキシロ
ースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される
方法は、少なくとも100g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの
実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも110g/Lの濃度でキシロース
からキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法
は、少なくとも120g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施
態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも130g/Lの濃度でキシロースから
キシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、
少なくとも140g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される方法は、少なくとも150g/Lの濃度でキシロースからキシ
リトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少な
くとも160g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に提供される方法は、少なくとも170g/Lの濃度でキシロースからキシリト
ールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくと
も180g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において
、本明細書に提供される方法は、少なくとも190g/Lの濃度でキシロースからキシリトール
を生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも20
0g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本
明細書に提供される方法は、少なくとも250g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生
産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも300g/L
の濃度でキシロースからキシリトールを生産する。
本明細書に記載されるメチニコビア種のいずれかを、キシリトールを生産及び/又は分
泌するように培養することができる。例えば、本明細書に提供されるメチニコビア種は、
キシリトールの生合成的生産のために培養することができる。したがって、いくつかの実
施態様において、本明細書に提供されるのは、キシリトールを含有する培養培地である。
いくつかの態様において、該培養培地は、キシリトールを生産したメチニコビア種から分
離することもできる。培養培地から微生物を分離する方法は、当技術分野で周知である。
例示的な方法としては、濾過、綿状沈殿、沈殿、遠心分離、沈降などが挙げられる。
泌するように培養することができる。例えば、本明細書に提供されるメチニコビア種は、
キシリトールの生合成的生産のために培養することができる。したがって、いくつかの実
施態様において、本明細書に提供されるのは、キシリトールを含有する培養培地である。
いくつかの態様において、該培養培地は、キシリトールを生産したメチニコビア種から分
離することもできる。培養培地から微生物を分離する方法は、当技術分野で周知である。
例示的な方法としては、濾過、綿状沈殿、沈殿、遠心分離、沈降などが挙げられる。
キシリトールの生産のために、本明細書に提供されるメチニコビア種は、炭素源及び他
の必須栄養素を含む培地中で培養される。いくつかの実施態様において、本明細書に提供
されるメチニコビア種は、好気的培養培地中で培養される。好気的培養は、回分培養、流
加培養、又は連続培養であることができ、ここで、培地中の溶存酸素は50％飽和を上回る
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるメチニコビア種は、実質的に嫌気
的な培養培地中で培養される。本明細書に記載されるように、キシリトールの生合成を達
成するための1つの例示的な成長条件には、嫌気的培養又は発酵条件が含まれる。ある実
施態様において、本明細書に提供されるメチニコビア種は、嫌気的又は実質的に嫌気的な
条件下で維持し、培養し、又は発酵させることができる。簡潔に述べると、嫌気的条件は
、酸素がない環境を指す。実質的に嫌気的な条件には、例えば、培地中の溶存酸素濃度が
0～10％飽和であり続けるような培養、回分発酵、又は連続発酵が含まれる。実質的に嫌
気的な条件には、細胞を1％酸素未満の雰囲気で維持された密閉チャンバー内部の液体培
地中又は固形寒天上で成長又は休止させることも含まれる。酸素のパーセントは、例えば
、培養物に、N2/CO2混合物又は他の好適な非酸素ガス(単数又は複数)をスパージすること
により維持することができる。
の必須栄養素を含む培地中で培養される。いくつかの実施態様において、本明細書に提供
されるメチニコビア種は、好気的培養培地中で培養される。好気的培養は、回分培養、流
加培養、又は連続培養であることができ、ここで、培地中の溶存酸素は50％飽和を上回る
。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるメチニコビア種は、実質的に嫌気
的な培養培地中で培養される。本明細書に記載されるように、キシリトールの生合成を達
成するための1つの例示的な成長条件には、嫌気的培養又は発酵条件が含まれる。ある実
施態様において、本明細書に提供されるメチニコビア種は、嫌気的又は実質的に嫌気的な
条件下で維持し、培養し、又は発酵させることができる。簡潔に述べると、嫌気的条件は
、酸素がない環境を指す。実質的に嫌気的な条件には、例えば、培地中の溶存酸素濃度が
0～10％飽和であり続けるような培養、回分発酵、又は連続発酵が含まれる。実質的に嫌
気的な条件には、細胞を1％酸素未満の雰囲気で維持された密閉チャンバー内部の液体培
地中又は固形寒天上で成長又は休止させることも含まれる。酸素のパーセントは、例えば
、培養物に、N2/CO2混合物又は他の好適な非酸素ガス(単数又は複数)をスパージすること
により維持することができる。
全工程の費用を低下させるために、発酵槽中の嫌気的条件を維持することが望ましい場
合がある。そのような条件は、例えば、まず培地に窒素をスパージし、その後、フラスコ
をセプタム及びクリンプキャップで密閉することにより得ることができる。嫌気的には成
長が観察されない株については、セプタムに制限通気用の小さい穴を開けることにより、
微好気的又は実質的に嫌気的な条件を適用することができる。例示的な嫌気的条件は、以
前に記載されており、かつ当技術分野で周知である。例示的な好気的及び嫌気的条件は、
例えば、2007年8月10日に出願された米国公開第2009/0047719号に記載されている。発酵
は、本明細書に開示されているように、回分的に、流加的に、又は連続的に実施すること
ができる。発酵は、望ましい場合、2段階で実施することもできる。第一段階を好気的に
して、高成長、したがって、高生産性を可能にし、その後、高収率の嫌気的段階にするこ
とができる。
合がある。そのような条件は、例えば、まず培地に窒素をスパージし、その後、フラスコ
をセプタム及びクリンプキャップで密閉することにより得ることができる。嫌気的には成
長が観察されない株については、セプタムに制限通気用の小さい穴を開けることにより、
微好気的又は実質的に嫌気的な条件を適用することができる。例示的な嫌気的条件は、以
前に記載されており、かつ当技術分野で周知である。例示的な好気的及び嫌気的条件は、
例えば、2007年8月10日に出願された米国公開第2009/0047719号に記載されている。発酵
は、本明細書に開示されているように、回分的に、流加的に、又は連続的に実施すること
ができる。発酵は、望ましい場合、2段階で実施することもできる。第一段階を好気的に
して、高成長、したがって、高生産性を可能にし、その後、高収率の嫌気的段階にするこ
とができる。
望ましい場合、塩基、例えば、NaOHもしくは他の塩基、又は酸を必要に応じて添加して
、培養培地を所望のpHに維持することにより、培地のpHを、約5.5～6.5のpHなどの所望の
pHに維持する。成長速度は、分光光度計(600nm)を用いて光学密度を測定することにより
決定することができ、キシロース取込み速度は、炭素源枯渇を経時的にモニタリングする
ことにより決定することができる。
、培養培地を所望のpHに維持することにより、培地のpHを、約5.5～6.5のpHなどの所望の
pHに維持する。成長速度は、分光光度計(600nm)を用いて光学密度を測定することにより
決定することができ、キシロース取込み速度は、炭素源枯渇を経時的にモニタリングする
ことにより決定することができる。
本明細書に提供されるメチニコビア種のための培養培地は、唯一の炭素源として又は本
明細書に記載されるもしくは当技術分野で公知の1以上の共基質と組み合わせて、キシロ
ースを含むことができる。該培養培地は、他の栄養補助剤、例えば、酵母抽出物及び/又
はペプトンをさらに含むことができる。該培養培地は、例えば、炭素源をメチニコビア種
に供給することができる任意の他の炭水化物源をさらに含むことができる。そのような源
としては、例えば:他の糖、例えば、セロビオース、ガラクトース、グルコース、エタノ
ール、アセテート、アラビトール、ソルビトール、及びグリセロールが挙げられる。した
がって、該培養培地は、キシロース及び共基質のグルコースを含むことができる。該培養
培地は、キシロース及び共基質のセロビオースを含むことができる。該培養培地は、キシ
ロース及び共基質のガラクトースを含むことができる。該培養培地は、キシロース及び共
基質のグリセロールを含むことができる。該培養培地は、グルコースとキシロースとセロ
ビオースの組合せを含むことができる。該培養培地は、グルコースとキシロースとガラク
トースの組合せを含むことができる。該培養培地は、グルコースとキシロースとグリセロ
ールの組合せを含むことができる。該培養培地は、キシロースとセロビオースとガラクト
ースとグリセロールの組合せを含むことができる。
明細書に記載されるもしくは当技術分野で公知の1以上の共基質と組み合わせて、キシロ
ースを含むことができる。該培養培地は、他の栄養補助剤、例えば、酵母抽出物及び/又
はペプトンをさらに含むことができる。該培養培地は、例えば、炭素源をメチニコビア種
に供給することができる任意の他の炭水化物源をさらに含むことができる。そのような源
としては、例えば:他の糖、例えば、セロビオース、ガラクトース、グルコース、エタノ
ール、アセテート、アラビトール、ソルビトール、及びグリセロールが挙げられる。した
がって、該培養培地は、キシロース及び共基質のグルコースを含むことができる。該培養
培地は、キシロース及び共基質のセロビオースを含むことができる。該培養培地は、キシ
ロース及び共基質のガラクトースを含むことができる。該培養培地は、キシロース及び共
基質のグリセロールを含むことができる。該培養培地は、グルコースとキシロースとセロ
ビオースの組合せを含むことができる。該培養培地は、グルコースとキシロースとガラク
トースの組合せを含むことができる。該培養培地は、グルコースとキシロースとグリセロ
ールの組合せを含むことができる。該培養培地は、キシロースとセロビオースとガラクト
ースとグリセロールの組合せを含むことができる。
培養培地は、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13
％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、又はそれより多くの量の炭素源(w/v)
を有することができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、2％の炭素源を有す
ることができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、4％の炭素源を有すること
ができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、10％の炭素源を有することができ
る。いくつかの実施態様において、培養培地は、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8
％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、又は
それより多くの量のキシロース(w/v)を有することができる。培養培地は、1％のキシロー
スを有することができる。培養培地は、2％のキシロースを有することができる。培養培
地は、3％のキシロースを有することができる。培養培地は、4％のキシロースを有するこ
とができる。培養培地は、5％のキシロースを有することができる。培養培地は、6％のキ
シロースを有することができる。培養培地は、7％のキシロースを有することができる。
培養培地は、8％のキシロースを有することができる。培養培地は、9％のキシロースを有
することができる。培養培地は、10％のキシロースを有することができる。培養培地は、
11％のキシロースを有することができる。培養培地は、12％のキシロースを有することが
できる。培養培地は、13％のキシロースを有することができる。培養培地は、14％のキシ
ロースを有することができる。培養培地は、15％のキシロースを有することができる。培
養培地は、16％のキシロースを有することができる。培養培地は、17％のキシロースを有
することができる。培養培地は、18％のキシロースを有することができる。培養培地は、
19％のキシロースを有することができる。培養培地は、20％のキシロースを有することが
できる。
％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、又はそれより多くの量の炭素源(w/v)
を有することができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、2％の炭素源を有す
ることができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、4％の炭素源を有すること
ができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、10％の炭素源を有することができ
る。いくつかの実施態様において、培養培地は、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8
％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、又は
それより多くの量のキシロース(w/v)を有することができる。培養培地は、1％のキシロー
スを有することができる。培養培地は、2％のキシロースを有することができる。培養培
地は、3％のキシロースを有することができる。培養培地は、4％のキシロースを有するこ
とができる。培養培地は、5％のキシロースを有することができる。培養培地は、6％のキ
シロースを有することができる。培養培地は、7％のキシロースを有することができる。
培養培地は、8％のキシロースを有することができる。培養培地は、9％のキシロースを有
することができる。培養培地は、10％のキシロースを有することができる。培養培地は、
11％のキシロースを有することができる。培養培地は、12％のキシロースを有することが
できる。培養培地は、13％のキシロースを有することができる。培養培地は、14％のキシ
ロースを有することができる。培養培地は、15％のキシロースを有することができる。培
養培地は、16％のキシロースを有することができる。培養培地は、17％のキシロースを有
することができる。培養培地は、18％のキシロースを有することができる。培養培地は、
19％のキシロースを有することができる。培養培地は、20％のキシロースを有することが
できる。
いくつかの実施態様において、キシロースは、唯一の炭素源ではない。例えば、いくつ
かの実施態様において、培地は、キシロース及びC3炭素源、C4炭素源、C5炭素源、C6炭素
源、又はこれらの組合せを含む。したがって、いくつかの実施態様において、培地は、キ
シロース及びC3炭素源(例えば、グリセロール)を含む。いくつかの実施態様において、培
地は、キシロース及びC4炭素源(例えば、エリトロース又はトレオース)を含む。いくつか
の実施態様において、培地は、キシロース及びC5炭素源(例えば、アラビトール、リボー
ス、又はリキソース)を含む。いくつかの実施態様において、培地は、キシロース及びC6
炭素源(例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトース、グロ
ース、及びイドース)を含む。その代わりに又はそれに加えて、いくつかの実施態様にお
いて、培地は、キシロース並びにセロビオース、ガラクトース、グルコース、アラビトー
ル、ソルビトール、及びグリセロール、又はこれらの組合せを含む。具体的な実施態様に
おいて、培地は、キシロース及びグルコースを含む。培地中の2以上の炭素源の量は、独
立に、1％～20％(例えば、1％～20％キシロース及び1％～20％グルコース)、又はその代
わりに、2％～14％(例えば、2％～14％キシロース及び2％～14％グルコース)、又はその
代わりに、4％～10％(例えば、4％～10％キシロース及び4％～10％)の範囲であることが
できる。具体的な実施態様において、炭素源の各々の量は、2％(例えば、2％キシロース
及び2％グルコース)である。
かの実施態様において、培地は、キシロース及びC3炭素源、C4炭素源、C5炭素源、C6炭素
源、又はこれらの組合せを含む。したがって、いくつかの実施態様において、培地は、キ
シロース及びC3炭素源(例えば、グリセロール)を含む。いくつかの実施態様において、培
地は、キシロース及びC4炭素源(例えば、エリトロース又はトレオース)を含む。いくつか
の実施態様において、培地は、キシロース及びC5炭素源(例えば、アラビトール、リボー
ス、又はリキソース)を含む。いくつかの実施態様において、培地は、キシロース及びC6
炭素源(例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトース、グロ
ース、及びイドース)を含む。その代わりに又はそれに加えて、いくつかの実施態様にお
いて、培地は、キシロース並びにセロビオース、ガラクトース、グルコース、アラビトー
ル、ソルビトール、及びグリセロール、又はこれらの組合せを含む。具体的な実施態様に
おいて、培地は、キシロース及びグルコースを含む。培地中の2以上の炭素源の量は、独
立に、1％～20％(例えば、1％～20％キシロース及び1％～20％グルコース)、又はその代
わりに、2％～14％(例えば、2％～14％キシロース及び2％～14％グルコース)、又はその
代わりに、4％～10％(例えば、4％～10％キシロース及び4％～10％)の範囲であることが
できる。具体的な実施態様において、炭素源の各々の量は、2％(例えば、2％キシロース
及び2％グルコース)である。
培養培地は、五炭素糖(例えば、キシロース)を主要炭素源として含む、C5が豊富な培地
であることができる。培養培地は、C6糖(六炭素糖)も有することができる。いくつかの実
施態様において、培養培地は、C6糖を主要炭素源として有する。いくつかの実施態様にお
いて、C6糖はグルコースである。培養物は、C6糖とC5糖の両方を炭素源として有すること
ができ、かつ様々な比で存在するC6糖及びC5糖を有することができる。いくつかの実施態
様において、培養培地中のC6糖の量とC5糖の量の比(C6:C5比)は、約10:1～約1:20である
。例えば、培養培地中のC6:C5比は、約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1、1:1
、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:
16、1:17、1:18、1:19、又は1:20であることができる。いくつかの実施態様において、培
養培地中のC6:C5比は、約3:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6:C5
比は、約1:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6:C5比は、約1:5であ
る。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6:C5比は、約1:10である。C5糖はキシ
ロースであることができ、C6糖はグルコースであることができる。いくつかの実施態様に
おいて、培養培地中のグルコースの量とキシロースの量の比(グルコース:キシロース比)
は、約20:1～約1:10である。例えば、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約20:1
、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1
、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、又は1:10であること
ができる。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約3
:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約1
:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約1
:5である。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約1
:10である。
であることができる。培養培地は、C6糖(六炭素糖)も有することができる。いくつかの実
施態様において、培養培地は、C6糖を主要炭素源として有する。いくつかの実施態様にお
いて、C6糖はグルコースである。培養物は、C6糖とC5糖の両方を炭素源として有すること
ができ、かつ様々な比で存在するC6糖及びC5糖を有することができる。いくつかの実施態
様において、培養培地中のC6糖の量とC5糖の量の比(C6:C5比)は、約10:1～約1:20である
。例えば、培養培地中のC6:C5比は、約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1、1:1
、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:
16、1:17、1:18、1:19、又は1:20であることができる。いくつかの実施態様において、培
養培地中のC6:C5比は、約3:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6:C5
比は、約1:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6:C5比は、約1:5であ
る。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6:C5比は、約1:10である。C5糖はキシ
ロースであることができ、C6糖はグルコースであることができる。いくつかの実施態様に
おいて、培養培地中のグルコースの量とキシロースの量の比(グルコース:キシロース比)
は、約20:1～約1:10である。例えば、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約20:1
、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1
、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、又は1:10であること
ができる。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約3
:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約1
:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約1
:5である。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約1
:10である。
炭水化物の他の源としては、例えば、再生可能原料及びバイオマスが挙げられる。本明
細書に提供される方法における原料として用いることができる例示的なタイプのバイオマ
スとしては、セルロース系バイオマス及びヘミセルロース系バイオマスの原料又は原料部
分が挙げられる。そのようなバイオマス原料は、例えば、炭素源として有用な炭水化物基
質、例えば、キシロース、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フル
クトース、及びデンプンを含有する。本明細書に提供される教示及び指針を考慮すると、
当業者は、上で例示されたもの以外の再生可能原料及びバイオマスも、キシリトールの生
産用の本明細書に提供される微生物を培養するために使用することができることを理解す
るであろう。
細書に提供される方法における原料として用いることができる例示的なタイプのバイオマ
スとしては、セルロース系バイオマス及びヘミセルロース系バイオマスの原料又は原料部
分が挙げられる。そのようなバイオマス原料は、例えば、炭素源として有用な炭水化物基
質、例えば、キシロース、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フル
クトース、及びデンプンを含有する。本明細書に提供される教示及び指針を考慮すると、
当業者は、上で例示されたもの以外の再生可能原料及びバイオマスも、キシリトールの生
産用の本明細書に提供される微生物を培養するために使用することができることを理解す
るであろう。
したがって、本明細書に提供される教示及び指針を考慮すると、当業者は、炭素源とし
てのキシロース上で成長させたときにキシリトールを分泌するメチニコビア種を作製する
ことができることを理解するであろう。必要なのは、必要とされる酵素又はタンパク質活
性の1つ又は複数を操作して、例えば、キシリトールを生産するための生合成経路のいく
つか又は全ての包含を含めて、キシリトールの生合成を達成することだけである。さらに
、遺伝子修飾を操作して、キシリトールから別の化合物への変換をさらに触媒する酵素、
例えば、キシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化するメチニコビア種に
することができる。したがって、本明細書に提供されるのは、炭水化物、例えば、キシロ
ース、又は他の炭素源上で成長させたときにキシリトールを生産及び/又は分泌するメチ
ニコビア種である。
てのキシロース上で成長させたときにキシリトールを分泌するメチニコビア種を作製する
ことができることを理解するであろう。必要なのは、必要とされる酵素又はタンパク質活
性の1つ又は複数を操作して、例えば、キシリトールを生産するための生合成経路のいく
つか又は全ての包含を含めて、キシリトールの生合成を達成することだけである。さらに
、遺伝子修飾を操作して、キシリトールから別の化合物への変換をさらに触媒する酵素、
例えば、キシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化するメチニコビア種に
することができる。したがって、本明細書に提供されるのは、炭水化物、例えば、キシロ
ース、又は他の炭素源上で成長させたときにキシリトールを生産及び/又は分泌するメチ
ニコビア種である。
本明細書に提供されるメチニコビア種を、本明細書に例示される当技術分野で周知の方
法を用いて構築して、本明細書に記載されるキシリトール経路の酵素又はタンパク質をコ
ードする少なくとも1つの核酸をキシロースからキシリトールを生産するのに十分な量で
外因性に発現させることができる。本明細書に提供されるメチニコビア種は、キシリトー
ルを生産するのに十分な条件下で培養されることが理解される。本明細書に提供される教
示及び指針に従って、本明細書に提供されるメチニコビア種は、所望の化合物の生合成を
達成し、約0.1～200mM又はそれを上回る細胞内濃度を生じることができる。通常、所望の
化合物の細胞内濃度は、約3～150mM、特に、約5～125mM、より特には、約10mM、20mM、50
mM、80mM、又はそれを上回るものを含む、約8～100mMである。これらの例示的な範囲の各
々の間及びそれを上回る細胞内濃度も、本明細書に提供されるメチニコビア種から達成す
ることができる。
法を用いて構築して、本明細書に記載されるキシリトール経路の酵素又はタンパク質をコ
ードする少なくとも1つの核酸をキシロースからキシリトールを生産するのに十分な量で
外因性に発現させることができる。本明細書に提供されるメチニコビア種は、キシリトー
ルを生産するのに十分な条件下で培養されることが理解される。本明細書に提供される教
示及び指針に従って、本明細書に提供されるメチニコビア種は、所望の化合物の生合成を
達成し、約0.1～200mM又はそれを上回る細胞内濃度を生じることができる。通常、所望の
化合物の細胞内濃度は、約3～150mM、特に、約5～125mM、より特には、約10mM、20mM、50
mM、80mM、又はそれを上回るものを含む、約8～100mMである。これらの例示的な範囲の各
々の間及びそれを上回る細胞内濃度も、本明細書に提供されるメチニコビア種から達成す
ることができる。
いくつかの実施態様において、培養条件には、嫌気的又は実質的に嫌気的な成長又は維
持条件が含まれる。例示的な嫌気的条件は以前に記載されており、かつ当技術分野で周知
である。発酵プロセスの例示的な嫌気的条件は本明細書に記載されており、かつ例えば、
米国公開第2009/0047719号に記載されている。これらの条件のいずれかを、メチニコビア
種及び当技術分野で周知の他の嫌気的条件とともに利用することができる。そのような嫌
気的又は実質的に嫌気的な条件下において、生産者株は、5～10mM又はそれを上回る細胞
内濃度及び本明細書に例示される他の全ての濃度で所望の化合物を合成することができる
。上の説明は細胞内濃度に言及しているにもかかわらず、生産微生物は、所望の化合物を
細胞内で生産し、かつ/又は該化合物を培養培地中に分泌することができることが理解さ
れる。
持条件が含まれる。例示的な嫌気的条件は以前に記載されており、かつ当技術分野で周知
である。発酵プロセスの例示的な嫌気的条件は本明細書に記載されており、かつ例えば、
米国公開第2009/0047719号に記載されている。これらの条件のいずれかを、メチニコビア
種及び当技術分野で周知の他の嫌気的条件とともに利用することができる。そのような嫌
気的又は実質的に嫌気的な条件下において、生産者株は、5～10mM又はそれを上回る細胞
内濃度及び本明細書に例示される他の全ての濃度で所望の化合物を合成することができる
。上の説明は細胞内濃度に言及しているにもかかわらず、生産微生物は、所望の化合物を
細胞内で生産し、かつ/又は該化合物を培養培地中に分泌することができることが理解さ
れる。
本明細書に提供される方法は、当技術分野で周知の任意の培養プロセス、例えば、回分
培養、流加培養、又は連続培養を含むことができる。そのようなプロセスは、発酵を含む
ことができる。例示的な発酵プロセスは、限定されないが、流加発酵と回分分離;流加発
酵と連続分離;及び連続発酵と連続分離を含む。例示的な回分発酵プロトコルにおいて、
生産生物を、適当なガスがスパージされた好適なサイズのバイオリアクターで成長させる
。嫌気的条件下では、培養物に、不活性ガス又はガスの組合せ、例えば、窒素、N2/CO2混
合物、アルゴン、ヘリウムなどをスパージする。細胞が成長し、炭素源を利用するにつれ
て、炭素源及び/又は栄養素の消費とほぼ見合うようにする速度で、追加の炭素源及び/又
は他の栄養素をバイオリアクターに供給する。バイオリアクターの温度は、所望の温度、
通常、22～37℃の範囲で維持するが、生産生物の成長特性及び/又は発酵プロセスのため
の所望の条件に応じて、この温度をより高い又はより低い温度で維持することができる。
成長は、所望の期間続いて、発酵槽中での培養物の所望の特性、例えば、細胞密度、化合
物濃度などを達成する。回分発酵プロセスにおいて、発酵の期間は、所望の培養条件に応
じて、通常、数時間から数日間の範囲、例えば、8～24時間、又は1、2、3、4、もしくは5
日間、又は最大1週間である。pHは、所望により、制御しても制御しなくてもよく、その
場合、pHが制御されない培養物は、通常、連続運転の終わりまでに、pH 5～6まで増加又
は減少する。培養期間の終了時に、発酵槽の内容物を、細胞分離ユニット、例えば、遠心
分離器、濾過ユニットなどに通して、細胞及び細胞残渣を除去することができる。所望の
化合物を細胞内で発現させる場合、さらなる化合物を放出させるために、細胞を、所望に
より、発酵ブロスから細胞を分離する前又は後に、酵素的に又は化学的に溶解又は破壊す
ることができる。発酵ブロスを化合物分離ユニットに移すことができる。化合物の単離を
当技術分野で利用される標準的な分離手順によって行い、所望の化合物を希釈水溶液から
分離する。そのような方法としては、発酵プロセスの化合物の化学的特性に応じて、水不
混和性有機溶媒(例えば、トルエン又は限定されないが、ジエチルエーテル、酢酸エチル
、テトラヒドロフラン(THF)、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、ペンタン、ヘキ
サン、ヘプタン、石油エーテル、メチル3級ブチルエーテル(MTBE)、ジオキサン、ジメチ
ルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)などを含む、他の好適な溶媒)を用い
て、化合物の有機溶液を提供する液液抽出、適切な場合、標準的な蒸留法などが挙げられ
るが、これらに限定されない。
培養、流加培養、又は連続培養を含むことができる。そのようなプロセスは、発酵を含む
ことができる。例示的な発酵プロセスは、限定されないが、流加発酵と回分分離;流加発
酵と連続分離;及び連続発酵と連続分離を含む。例示的な回分発酵プロトコルにおいて、
生産生物を、適当なガスがスパージされた好適なサイズのバイオリアクターで成長させる
。嫌気的条件下では、培養物に、不活性ガス又はガスの組合せ、例えば、窒素、N2/CO2混
合物、アルゴン、ヘリウムなどをスパージする。細胞が成長し、炭素源を利用するにつれ
て、炭素源及び/又は栄養素の消費とほぼ見合うようにする速度で、追加の炭素源及び/又
は他の栄養素をバイオリアクターに供給する。バイオリアクターの温度は、所望の温度、
通常、22～37℃の範囲で維持するが、生産生物の成長特性及び/又は発酵プロセスのため
の所望の条件に応じて、この温度をより高い又はより低い温度で維持することができる。
成長は、所望の期間続いて、発酵槽中での培養物の所望の特性、例えば、細胞密度、化合
物濃度などを達成する。回分発酵プロセスにおいて、発酵の期間は、所望の培養条件に応
じて、通常、数時間から数日間の範囲、例えば、8～24時間、又は1、2、3、4、もしくは5
日間、又は最大1週間である。pHは、所望により、制御しても制御しなくてもよく、その
場合、pHが制御されない培養物は、通常、連続運転の終わりまでに、pH 5～6まで増加又
は減少する。培養期間の終了時に、発酵槽の内容物を、細胞分離ユニット、例えば、遠心
分離器、濾過ユニットなどに通して、細胞及び細胞残渣を除去することができる。所望の
化合物を細胞内で発現させる場合、さらなる化合物を放出させるために、細胞を、所望に
より、発酵ブロスから細胞を分離する前又は後に、酵素的に又は化学的に溶解又は破壊す
ることができる。発酵ブロスを化合物分離ユニットに移すことができる。化合物の単離を
当技術分野で利用される標準的な分離手順によって行い、所望の化合物を希釈水溶液から
分離する。そのような方法としては、発酵プロセスの化合物の化学的特性に応じて、水不
混和性有機溶媒(例えば、トルエン又は限定されないが、ジエチルエーテル、酢酸エチル
、テトラヒドロフラン(THF)、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、ペンタン、ヘキ
サン、ヘプタン、石油エーテル、メチル3級ブチルエーテル(MTBE)、ジオキサン、ジメチ
ルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)などを含む、他の好適な溶媒)を用い
て、化合物の有機溶液を提供する液液抽出、適切な場合、標準的な蒸留法などが挙げられ
るが、これらに限定されない。
例示的な完全連続発酵プロトコルにおいて、所望の細胞密度を達成するために、生産生
物を、通常は、まず回分モードで成長させる。炭素源及び/又は他の栄養素が使い尽くさ
れたとき、同じ組成のフィード培地を所望の速度で連続的に供給し、発酵液を同じ速度で
回収する。そのような条件下では、バイオリアクター中の化合物濃度及び細胞密度は、通
常、一定のままである。上で論じられているように、発酵槽の温度を所望の温度で維持す
る。連続発酵段階では、通常、最適化された生産のために好適なpH範囲を維持することが
望ましい。所望のpH範囲を維持するための好適な酸又は塩基の添加を含む、ルーチンの方
法を用いて、pHをモニタリング及び維持することができる。バイオリアクターを、長期間
、通常、必要に応じてかつ所望により、少なくとも1週間から数週間、及び最大1カ月、又
はそれより長い間、連続的に操作する。発酵液及び/又は培養物を、所望により、最大毎
日のサンプリングを含め、定期的にモニタリングして、化合物濃度及び/又は細胞密度の
不変性を保証する。連続モードでは、新しいフィード培地が供給されるときに、発酵槽の
内容物を常に除去する。細胞を含有する出口ストリーム、培地、及び生成物を、通常、連
続的な化合物分離手順に供し、所望により、細胞及び細胞残渣の除去を伴う又は伴わない
。当技術分野で利用される連続分離法を用いて、希釈水溶液から化合物を分離することが
でき、該連続分離法には、水不混和性有機溶媒(例えば、トルエン又は限定されないが、
ジエチルエーテル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン(THF)、塩化メチレン、クロロホル
ム、ベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、メチル3級ブチルエーテ
ル(MTBE)、ジオキサン、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)など
を含む、他の好適な溶媒)を用いる連続液液抽出、標準的な連続蒸留法など、又は当技術
分野で周知の他の方法が含まれるが、これらに限定されない。
物を、通常は、まず回分モードで成長させる。炭素源及び/又は他の栄養素が使い尽くさ
れたとき、同じ組成のフィード培地を所望の速度で連続的に供給し、発酵液を同じ速度で
回収する。そのような条件下では、バイオリアクター中の化合物濃度及び細胞密度は、通
常、一定のままである。上で論じられているように、発酵槽の温度を所望の温度で維持す
る。連続発酵段階では、通常、最適化された生産のために好適なpH範囲を維持することが
望ましい。所望のpH範囲を維持するための好適な酸又は塩基の添加を含む、ルーチンの方
法を用いて、pHをモニタリング及び維持することができる。バイオリアクターを、長期間
、通常、必要に応じてかつ所望により、少なくとも1週間から数週間、及び最大1カ月、又
はそれより長い間、連続的に操作する。発酵液及び/又は培養物を、所望により、最大毎
日のサンプリングを含め、定期的にモニタリングして、化合物濃度及び/又は細胞密度の
不変性を保証する。連続モードでは、新しいフィード培地が供給されるときに、発酵槽の
内容物を常に除去する。細胞を含有する出口ストリーム、培地、及び生成物を、通常、連
続的な化合物分離手順に供し、所望により、細胞及び細胞残渣の除去を伴う又は伴わない
。当技術分野で利用される連続分離法を用いて、希釈水溶液から化合物を分離することが
でき、該連続分離法には、水不混和性有機溶媒(例えば、トルエン又は限定されないが、
ジエチルエーテル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン(THF)、塩化メチレン、クロロホル
ム、ベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、メチル3級ブチルエーテ
ル(MTBE)、ジオキサン、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)など
を含む、他の好適な溶媒)を用いる連続液液抽出、標準的な連続蒸留法など、又は当技術
分野で周知の他の方法が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される培養及び発酵条件に加えて、所望の化合物の生合成を達成するた
めの成長条件は、培養条件への浸透圧保護剤の追加を含むことができる。ある実施態様に
おいて、本明細書に提供されるメチニコビア種を、浸透圧保護剤の存在下で、本明細書に
記載されている通りに維持し、培養し、又は発酵させることができる。簡潔に述べると、
浸透圧保護剤は、オスモライトとして作用し、かつ本明細書に記載される微生物が浸透圧
ストレスを切り抜けるのを助ける化合物を指す。浸透圧保護剤としては、ベタイン、アミ
ノ酸、及び糖トレハロースが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなものの非
限定的な例は、グリシンベタイン、プラリン(praline)ベタイン、ジメチルテチン、ジメ
チルスルホニオプロプリオネート(dimethylslfonioproprionate)、3-ジメチルスルホニオ
-2-メチルプロプリオネート、ピペコリン酸、ジメチルスルホニオアセテート、コリン、L
-カルニチン、及びエクトインである。一態様において、浸透圧保護剤は、グリシンベタ
インである。本明細書に記載される微生物を浸透圧ストレスから保護するのに好適な浸透
圧保護剤の量及び種類は、使用される微生物によって決まることが当業者に理解される。
培養条件下の浸透圧保護剤の量は、例えば、約0.1mM以下、約0.5mM以下、約1.0mM以下、
約1.5mM以下、約2.0mM以下、約2.5mM以下、約3.0mM以下、約5.0mM以下、約7.0mM以下、約
10mM以下、約50mM以下、約100mM以下、又は約500mM以下であることができる。
めの成長条件は、培養条件への浸透圧保護剤の追加を含むことができる。ある実施態様に
おいて、本明細書に提供されるメチニコビア種を、浸透圧保護剤の存在下で、本明細書に
記載されている通りに維持し、培養し、又は発酵させることができる。簡潔に述べると、
浸透圧保護剤は、オスモライトとして作用し、かつ本明細書に記載される微生物が浸透圧
ストレスを切り抜けるのを助ける化合物を指す。浸透圧保護剤としては、ベタイン、アミ
ノ酸、及び糖トレハロースが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなものの非
限定的な例は、グリシンベタイン、プラリン(praline)ベタイン、ジメチルテチン、ジメ
チルスルホニオプロプリオネート(dimethylslfonioproprionate)、3-ジメチルスルホニオ
-2-メチルプロプリオネート、ピペコリン酸、ジメチルスルホニオアセテート、コリン、L
-カルニチン、及びエクトインである。一態様において、浸透圧保護剤は、グリシンベタ
インである。本明細書に記載される微生物を浸透圧ストレスから保護するのに好適な浸透
圧保護剤の量及び種類は、使用される微生物によって決まることが当業者に理解される。
培養条件下の浸透圧保護剤の量は、例えば、約0.1mM以下、約0.5mM以下、約1.0mM以下、
約1.5mM以下、約2.0mM以下、約2.5mM以下、約3.0mM以下、約5.0mM以下、約7.0mM以下、約
10mM以下、約50mM以下、約100mM以下、又は約500mM以下であることができる。
培養条件は、例えば、液体培養法並びに発酵及び他の大規模培養法を含むことができる
。本明細書に記載されるように、生合成生成物の特に有用な収率を、好気的、嫌気的、又
は実質的に嫌気的な培養条件下で得ることができる。
。本明細書に記載されるように、生合成生成物の特に有用な収率を、好気的、嫌気的、又
は実質的に嫌気的な培養条件下で得ることができる。
本明細書に記載される培養条件を所望の化合物の製造のためにスケールアップし、連続
的に成長させることができる。例示的な成長法は、例えば、流加発酵と回分分離;流加発
酵と連続分離、又は連続発酵と連続分離を含む。これらのプロセスは全て、当技術分野で
周知である。発酵法は、商業量の所望の生成物の生合成的生産に特に有用である。一般に
、かつ非連続培養法の場合、連続的及び/又はほぼ連続的な生産は、本明細書に提供され
る微生物を、対数期における成長を持続及び/又はほぼ持続させるのに十分な栄養素及び
培地中で培養することを含む。そのような条件下の連続培養は、例えば、1日、2日、3日
、4日、5日、6日、もしくは7日間、又はそれより長い間の成長又は培養を含むことができ
る。さらに、連続培養は、1週間、2週間、3週間、4週間、もしくは5週間、又はそれより
長い週間、及び最大数カ月間というより長い期間を含むことができる。或いは、特定の用
途に好適である場合、本明細書に提供される生物を数時間培養することができる。連続的
及び/又はほぼ連続的な培養条件は、これらの例示的な期間の中間の全ての時間間隔も含
むことができることが理解されるべきである。本明細書に提供される微生物の培養時間は
、所望の目的のために十分な量の化合物を生産するのに十分な期間であることがさらに理
解される。
的に成長させることができる。例示的な成長法は、例えば、流加発酵と回分分離;流加発
酵と連続分離、又は連続発酵と連続分離を含む。これらのプロセスは全て、当技術分野で
周知である。発酵法は、商業量の所望の生成物の生合成的生産に特に有用である。一般に
、かつ非連続培養法の場合、連続的及び/又はほぼ連続的な生産は、本明細書に提供され
る微生物を、対数期における成長を持続及び/又はほぼ持続させるのに十分な栄養素及び
培地中で培養することを含む。そのような条件下の連続培養は、例えば、1日、2日、3日
、4日、5日、6日、もしくは7日間、又はそれより長い間の成長又は培養を含むことができ
る。さらに、連続培養は、1週間、2週間、3週間、4週間、もしくは5週間、又はそれより
長い週間、及び最大数カ月間というより長い期間を含むことができる。或いは、特定の用
途に好適である場合、本明細書に提供される生物を数時間培養することができる。連続的
及び/又はほぼ連続的な培養条件は、これらの例示的な期間の中間の全ての時間間隔も含
むことができることが理解されるべきである。本明細書に提供される微生物の培養時間は
、所望の目的のために十分な量の化合物を生産するのに十分な期間であることがさらに理
解される。
相当な量のキシリトールの連続生産を用いる本明細書に提供されるメチニコビア種を用
いる上記の発酵法に加えて、生物由来化合物を、例えば、化学合成法及び/もしくは酵素
法に同時に供して、キシリトールを他の化合物に変換することもでき、又は望ましい場合
、生物由来キシリトールを発酵培養物から分離して、順次、化学的変換及び/又は酵素的
変換に供して、キシリトールを他の化合物に変換することができる。
いる上記の発酵法に加えて、生物由来化合物を、例えば、化学合成法及び/もしくは酵素
法に同時に供して、キシリトールを他の化合物に変換することもでき、又は望ましい場合
、生物由来キシリトールを発酵培養物から分離して、順次、化学的変換及び/又は酵素的
変換に供して、キシリトールを他の化合物に変換することができる。
より優れた生産者を作製するために、代謝モデリングを利用して、成長条件を最適化す
ることができる。モデリングを用いて、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウ
トを設計することもできる(例えば、米国特許公開US 2002/0012939号、US 2003/0224363
号、US 2004/0029149号、US 2004/0072723号、US 2003/0059792号、US 2002/0168654号、
及びUS 2004/0009466号、並びに米国特許第7,127,379号を参照)。モデリング解析は、細
胞成長に対するより効率的な所望の生成物の生産への代謝の移行の効果の確実な予測を可
能にする。
ることができる。モデリングを用いて、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウ
トを設計することもできる(例えば、米国特許公開US 2002/0012939号、US 2003/0224363
号、US 2004/0029149号、US 2004/0072723号、US 2003/0059792号、US 2002/0168654号、
及びUS 2004/0009466号、並びに米国特許第7,127,379号を参照)。モデリング解析は、細
胞成長に対するより効率的な所望の生成物の生産への代謝の移行の効果の確実な予測を可
能にする。
いくつかの実施態様において、生物由来キシリトールを生産するための本明細書に提供
される方法は、当技術分野で周知の種々の方法を用いて、生物由来キシリトールを培養物
中の他の成分から分離することをさらに含む。そのような分離方法としては、例えば、抽
出法、並びに連続液液抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶
化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、限外濾過、活性炭吸着、pH調節、及び沈殿、又は上に列挙
された1以上の方法の組合せを含む方法が挙げられる。上記の方法は全て、当技術分野で
周知である。
される方法は、当技術分野で周知の種々の方法を用いて、生物由来キシリトールを培養物
中の他の成分から分離することをさらに含む。そのような分離方法としては、例えば、抽
出法、並びに連続液液抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶
化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、限外濾過、活性炭吸着、pH調節、及び沈殿、又は上に列挙
された1以上の方法の組合せを含む方法が挙げられる。上記の方法は全て、当技術分野で
周知である。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される生物由来キシリトールである。その
ような生物由来キシリトールは、いくつかの実施態様において本明細書に記載されるメチ
ニコビア種によって生産される。また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載され
るメチニコビア種によって生産される生物由来キシリトール、及び追加成分を有する組成
物である。該生物由来化合物以外の成分は、細胞性部分、例えば、培養培地の微量の細胞
性部分であることができるか、或いは本明細書に提供されるメチニコビア種の存在下で生
産される発酵ブロスもしくは培養培地又はその精製もしくは部分精製画分であることがで
きる。したがって、いくつかの実施態様において、該組成物は培養培地である。いくつか
の実施態様において、培養培地は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種が除
去された培養培地であることができる。該組成物は、例えば、本明細書に提供されるメチ
ニコビア種によって生産されるとき、低レベルの副生成物を有することができる。該組成
物は、例えば、生物由来キシリトール及び本明細書に提供されるメチニコビア種の細胞溶
解物又は培養上清を有することができる。追加成分は、副生成物又は不純物、例えば、グ
リセロール、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せであることができる。
副生成物は、グリセロールであることができる。副生成物は、アラビトールであることが
できる。副生成物は、C7糖アルコール(例えば、ボレミトール又はその異性体)であること
ができる。いくつかの実施態様において、副生成物又は不純物(例えば、グリセロールも
しくはアラビトール、又はその両方)は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア
種以外の微生物によって生産されるそれぞれの副生成物又は不純物の量よりも少なくとも
10％、20％、30％、又は40％多い。
ような生物由来キシリトールは、いくつかの実施態様において本明細書に記載されるメチ
ニコビア種によって生産される。また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載され
るメチニコビア種によって生産される生物由来キシリトール、及び追加成分を有する組成
物である。該生物由来化合物以外の成分は、細胞性部分、例えば、培養培地の微量の細胞
性部分であることができるか、或いは本明細書に提供されるメチニコビア種の存在下で生
産される発酵ブロスもしくは培養培地又はその精製もしくは部分精製画分であることがで
きる。したがって、いくつかの実施態様において、該組成物は培養培地である。いくつか
の実施態様において、培養培地は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種が除
去された培養培地であることができる。該組成物は、例えば、本明細書に提供されるメチ
ニコビア種によって生産されるとき、低レベルの副生成物を有することができる。該組成
物は、例えば、生物由来キシリトール及び本明細書に提供されるメチニコビア種の細胞溶
解物又は培養上清を有することができる。追加成分は、副生成物又は不純物、例えば、グ
リセロール、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せであることができる。
副生成物は、グリセロールであることができる。副生成物は、アラビトールであることが
できる。副生成物は、C7糖アルコール(例えば、ボレミトール又はその異性体)であること
ができる。いくつかの実施態様において、副生成物又は不純物(例えば、グリセロールも
しくはアラビトール、又はその両方)は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア
種以外の微生物によって生産されるそれぞれの副生成物又は不純物の量よりも少なくとも
10％、20％、30％、又は40％多い。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される組成物は、生物由来キシリトール
及び追加成分を有することができる。追加成分は、発酵ブロス又は培養培地であることが
できる。追加成分は、発酵ブロス又は培養培地の上清であることができる。追加成分は、
発酵ブロス又は培養培地の細胞性部分であることができる。追加成分は、本明細書に提供
されるメチニコビア種であることができる。追加成分は、本明細書に提供されるメチニコ
ビア種の細胞溶解物であることができる。追加成分は、副生成物、例えば、グリセロール
、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せであることができる。
及び追加成分を有することができる。追加成分は、発酵ブロス又は培養培地であることが
できる。追加成分は、発酵ブロス又は培養培地の上清であることができる。追加成分は、
発酵ブロス又は培養培地の細胞性部分であることができる。追加成分は、本明細書に提供
されるメチニコビア種であることができる。追加成分は、本明細書に提供されるメチニコ
ビア種の細胞溶解物であることができる。追加成分は、副生成物、例えば、グリセロール
、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せであることができる。
いくつかの実施態様において、炭素原料及び他の細胞取込み源、例えば、ホスフェート
、アンモニア、スルフェート、塩化物、及び他のハロゲンを選んで、本明細書に提供され
る微生物によって生産される生物由来キシリトール中に存在する原子の同位体分布を変化
させることができる。様々な炭素原料及び上に列挙された他の取込み源は、本明細書にお
いて、「取込み源」と総称される。取込み源は、本明細書に提供される微生物によって生
産される生物由来キシリトール中に、又は副生成物もしくは不純物中に存在する任意の原
子の同位体濃縮をもたらすことができる。同位体濃縮は、例えば、炭素、水素、酸素、窒
素、硫黄、リン、塩化物又は他のハロゲンを含む、任意の標的原子について達成すること
もできる。
、アンモニア、スルフェート、塩化物、及び他のハロゲンを選んで、本明細書に提供され
る微生物によって生産される生物由来キシリトール中に存在する原子の同位体分布を変化
させることができる。様々な炭素原料及び上に列挙された他の取込み源は、本明細書にお
いて、「取込み源」と総称される。取込み源は、本明細書に提供される微生物によって生
産される生物由来キシリトール中に、又は副生成物もしくは不純物中に存在する任意の原
子の同位体濃縮をもたらすことができる。同位体濃縮は、例えば、炭素、水素、酸素、窒
素、硫黄、リン、塩化物又は他のハロゲンを含む、任意の標的原子について達成すること
もできる。
いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、炭素-12、炭素-13、及び炭素-14
比を変化させることができる。いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、酸素
-16、酸素-17、及び酸素-18比を変化させることができる。いくつかの実施態様において
、取込み源を選択して、水素、重水素、及び三重水素比を変化させることができる。いく
つかの実施態様において、取込み源を選択して、窒素-14及び窒素-15比を変化させること
ができる。いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、硫黄-32、硫黄-33、硫黄
-34、及び硫黄-35比を変化させることができる。いくつかの実施態様において、取込み源
を選択して、リン-31、リン-32、及びリン-33比を変化させることができる。いくつかの
実施態様において、取込み源を選択して、塩素-35、塩素-36、及び塩素-37比を変化させ
ることができる。
比を変化させることができる。いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、酸素
-16、酸素-17、及び酸素-18比を変化させることができる。いくつかの実施態様において
、取込み源を選択して、水素、重水素、及び三重水素比を変化させることができる。いく
つかの実施態様において、取込み源を選択して、窒素-14及び窒素-15比を変化させること
ができる。いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、硫黄-32、硫黄-33、硫黄
-34、及び硫黄-35比を変化させることができる。いくつかの実施態様において、取込み源
を選択して、リン-31、リン-32、及びリン-33比を変化させることができる。いくつかの
実施態様において、取込み源を選択して、塩素-35、塩素-36、及び塩素-37比を変化させ
ることができる。
いくつかの実施態様において、1以上の取込み源を選択することにより、標的原子の同
位体比を所望の比まで変化させることができる。取込み源は、自然界に見られるような天
然源に、又は人工源に由来することができ、当業者は、天然源、人工源、又はこれらの組
合せを選択して、標的原子の所望の同位体比を達成することができる。人工取込み源の例
としては、例えば、少なくとも部分的に化学合成反応に由来する取込み源が挙げられる。
そのような同位体濃縮取込み源を市販で購入するかもしくは実験室で調製し、かつ/又は
任意に取込み源の天然源と混合して、所望の同位体比を達成することができる。いくつか
の実施態様において、取込み源の標的原子同位体比は、自然界に見られる取込み源の所望
の源を選択することにより達成することができる。例えば、本明細書で論じられているよ
うに、天然源は、生物に由来するかもしくは生物によって合成される生物ベースのもの、
又は石油系生成物もしくは大気などの源であることができる。いくつかのそのような実施
態様において、炭素の源を、例えば、化石燃料由来の炭素源(これは、炭素-14が相対的に
枯渇している可能性がある)、又はCO2などの環境もしくは大気の炭素源(これは、その石
油由来の対応物よりも多くの量の炭素-14を保有する可能性がある)から選択することがで
きる。
位体比を所望の比まで変化させることができる。取込み源は、自然界に見られるような天
然源に、又は人工源に由来することができ、当業者は、天然源、人工源、又はこれらの組
合せを選択して、標的原子の所望の同位体比を達成することができる。人工取込み源の例
としては、例えば、少なくとも部分的に化学合成反応に由来する取込み源が挙げられる。
そのような同位体濃縮取込み源を市販で購入するかもしくは実験室で調製し、かつ/又は
任意に取込み源の天然源と混合して、所望の同位体比を達成することができる。いくつか
の実施態様において、取込み源の標的原子同位体比は、自然界に見られる取込み源の所望
の源を選択することにより達成することができる。例えば、本明細書で論じられているよ
うに、天然源は、生物に由来するかもしくは生物によって合成される生物ベースのもの、
又は石油系生成物もしくは大気などの源であることができる。いくつかのそのような実施
態様において、炭素の源を、例えば、化石燃料由来の炭素源(これは、炭素-14が相対的に
枯渇している可能性がある)、又はCO2などの環境もしくは大気の炭素源(これは、その石
油由来の対応物よりも多くの量の炭素-14を保有する可能性がある)から選択することがで
きる。
不安定な炭素同位体である炭素-14又は放射性炭素は、地球の大気中の炭素原子の約101
2個に1個を構成し、かつ約5700年の半減期を有する。炭素のストックは、高層大気中で、
宇宙線及び通常の窒素(14N)が関与する核反応によって補充される。炭素-14は、ずっと以
前に崩壊したので、化石燃料は、炭素-14を含有しない。化石燃料の燃焼は、大気の炭素-
14の割合を低下させる(いわゆる、「スース効果」)。
2個に1個を構成し、かつ約5700年の半減期を有する。炭素のストックは、高層大気中で、
宇宙線及び通常の窒素(14N)が関与する核反応によって補充される。炭素-14は、ずっと以
前に崩壊したので、化石燃料は、炭素-14を含有しない。化石燃料の燃焼は、大気の炭素-
14の割合を低下させる(いわゆる、「スース効果」)。
化合物中の原子の同位体比を決定する方法は、当業者に周知である。同位体濃縮は、当
技術分野で公知の技法を用いる質量分析、例えば、加速質量分析(AMS)、安定同位体比質
量分析(SIRMS)、及び核磁気共鳴による位置特異的天然同位体分画(SNIF-NMR)によって容
易に評価される。そのような質量スペクトル法を、例えば、液体クロマトグラフィー(LC)
、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、及び/又はガスクロマトグラフィーなどの分離法
と統合することができる。
技術分野で公知の技法を用いる質量分析、例えば、加速質量分析(AMS)、安定同位体比質
量分析(SIRMS)、及び核磁気共鳴による位置特異的天然同位体分画(SNIF-NMR)によって容
易に評価される。そのような質量スペクトル法を、例えば、液体クロマトグラフィー(LC)
、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、及び/又はガスクロマトグラフィーなどの分離法
と統合することができる。
炭素の場合、ASTM D6866は、米国材料試験協会(American Society for Testing and Ma
terials)(ASTM)インターナショナルによる放射性炭素年代測定を用いて、固体、液体、及
び気体試料の生物ベースの含有量を決定する標準的な分析方法として米国で開発された。
標準は、生成物の生物ベースの含有量の決定への放射性炭素年代測定の使用に基づいてい
る。ASTM D6866は、2004年に最初に発表され、この標準の現在活用されているバージョン
は、ASTM D6866-11である(2011年4月1日に有効となった)。本明細書に記載されているも
のを含めて、放射性炭素年代測定法は、当業者に周知である。
terials)(ASTM)インターナショナルによる放射性炭素年代測定を用いて、固体、液体、及
び気体試料の生物ベースの含有量を決定する標準的な分析方法として米国で開発された。
標準は、生成物の生物ベースの含有量の決定への放射性炭素年代測定の使用に基づいてい
る。ASTM D6866は、2004年に最初に発表され、この標準の現在活用されているバージョン
は、ASTM D6866-11である(2011年4月1日に有効となった)。本明細書に記載されているも
のを含めて、放射性炭素年代測定法は、当業者に周知である。
化合物の生物ベースの含有量は、炭素-14(14C)と炭素-12(12C)の比によって推定される
。具体的には、現在の割合(Fm)は、式: Fm=(S-B)/(M-B)(式中、B、S、及びMは、それぞれ
、ブランク、試料、及び現在の参照物質の14C/12C比を表す)から計算される。現在の割合
は、「現在」からの試料の14C/12C比の偏差の測定値である。現在は、δ13CVPDB=-19/mil
に対して標準化された、米国規格基準局(National Bureau of Standards)(NBS)シュウ酸I
(すなわち、標準参照物質(SRM) 4990b)の(AD 1950年の)放射性炭素濃度の95％と定義され
る(Olssonの文献、標準物質としてのシュウ酸の使用(The use of Oxalic acid as a Stan
dard)、放射性炭素による偏差及び絶対年代(Radiocarbon Variations and Absolute Chro
nology)、ノーベル財団シンポジウム、第12回議事録(Nobel Symposium, 12th Proc.)、Jo
hn Wiley & Sons, New York(1970)に所収)。例えば、ASMにより測定された質量分析の結
果は、δ13CVPDB=-19/milに対して標準化されたNBSシュウ酸I(SRM 4990b)の比放射能の0.
95倍という国際的に合意された定義を用いて計算される。これは、1.176±0.010×10-12
の絶対的な(AD 1950年の)14C/12Cの比と同等である(Karlenらの文献、Arkiv Geofysik, 4
:465-471(1968))。標準的な計算には、ある同位体の別の同位体に関する示差取込み、例
えば、12C＞13C＞14Cという生物学的系における優先的な取込みが考慮に入れられており
、これらの補正は、δ13について補正されたFmとして反映されている。
。具体的には、現在の割合(Fm)は、式: Fm=(S-B)/(M-B)(式中、B、S、及びMは、それぞれ
、ブランク、試料、及び現在の参照物質の14C/12C比を表す)から計算される。現在の割合
は、「現在」からの試料の14C/12C比の偏差の測定値である。現在は、δ13CVPDB=-19/mil
に対して標準化された、米国規格基準局(National Bureau of Standards)(NBS)シュウ酸I
(すなわち、標準参照物質(SRM) 4990b)の(AD 1950年の)放射性炭素濃度の95％と定義され
る(Olssonの文献、標準物質としてのシュウ酸の使用(The use of Oxalic acid as a Stan
dard)、放射性炭素による偏差及び絶対年代(Radiocarbon Variations and Absolute Chro
nology)、ノーベル財団シンポジウム、第12回議事録(Nobel Symposium, 12th Proc.)、Jo
hn Wiley & Sons, New York(1970)に所収)。例えば、ASMにより測定された質量分析の結
果は、δ13CVPDB=-19/milに対して標準化されたNBSシュウ酸I(SRM 4990b)の比放射能の0.
95倍という国際的に合意された定義を用いて計算される。これは、1.176±0.010×10-12
の絶対的な(AD 1950年の)14C/12Cの比と同等である(Karlenらの文献、Arkiv Geofysik, 4
:465-471(1968))。標準的な計算には、ある同位体の別の同位体に関する示差取込み、例
えば、12C＞13C＞14Cという生物学的系における優先的な取込みが考慮に入れられており
、これらの補正は、δ13について補正されたFmとして反映されている。
シュウ酸標準物質(SRM 4990b又はHOx1)は、1955年のサトウダイコンの作物から作製さ
れた。1000ポンドが作製されたが、このシュウ酸標準物質はもはや市販されていない。シ
ュウ酸II標準物質(HOx2; N.I.S.T表記SRM 4990C)は、1977年のフランス甜菜(French beet
)の作物の糖蜜から作製された。1980年代初期に、12の研究室のグループが、2つの標準物
質の比を測定した。シュウ酸II対1の放射能の比は、1.2933±0.001(加重平均)である。HO
xIIの同位体比は、-17.8/milである。ASTM D6866-11は、現在の標準物質に、入手可能な
シュウ酸II標準物質SRM 4990C(Hox2)の使用を提案している(Mannの文献、Radiocarbon, 2
5(2):519-527(1983)中のもとのシュウ酸標準物質対現在入手可能なシュウ酸標準物質の考
察を参照)。Fm=0％は、材料中に炭素-14原子が完全に欠けていることを表し、したがって
、化石(例えば、石油系)炭素源を示す。1950年以降の核爆弾実験による大気中への炭素-1
4の注入について補正した後のFm=100％は、完全に現在の炭素源を示す。本明細書に記載
されるように、そのような「現在の」源には、生物ベースの源が含まれる。
れた。1000ポンドが作製されたが、このシュウ酸標準物質はもはや市販されていない。シ
ュウ酸II標準物質(HOx2; N.I.S.T表記SRM 4990C)は、1977年のフランス甜菜(French beet
)の作物の糖蜜から作製された。1980年代初期に、12の研究室のグループが、2つの標準物
質の比を測定した。シュウ酸II対1の放射能の比は、1.2933±0.001(加重平均)である。HO
xIIの同位体比は、-17.8/milである。ASTM D6866-11は、現在の標準物質に、入手可能な
シュウ酸II標準物質SRM 4990C(Hox2)の使用を提案している(Mannの文献、Radiocarbon, 2
5(2):519-527(1983)中のもとのシュウ酸標準物質対現在入手可能なシュウ酸標準物質の考
察を参照)。Fm=0％は、材料中に炭素-14原子が完全に欠けていることを表し、したがって
、化石(例えば、石油系)炭素源を示す。1950年以降の核爆弾実験による大気中への炭素-1
4の注入について補正した後のFm=100％は、完全に現在の炭素源を示す。本明細書に記載
されるように、そのような「現在の」源には、生物ベースの源が含まれる。
ASTM D6866に記載されているように、現在の炭素のパーセント(pMC)が100％よりも大き
くなることがある。これは、ASTM D6866-11に記載されているような大気中の炭素-14の相
当な濃縮をもたらした1950年代の核実験プログラムの効果が減少しているものの持続して
いるからである。全ての試料の炭素-14放射能が「爆弾前」の標準物質を基準とするので
、及びほとんど全ての新しい生物ベースの生成物が爆弾後の環境中に生成されるので、試
料の本当の生物ベースの含有量をより良好に反映するために、(同位体割合について補正
した後の)全てのpMC値に0.95(2010年時点)を乗じなければならない。103％よりも大きい
生物ベースの含有量は、分析誤差が生じているか、又は生物ベースの炭素の源が数年以上
古いものであるかのいずれかであることを示唆している。
くなることがある。これは、ASTM D6866-11に記載されているような大気中の炭素-14の相
当な濃縮をもたらした1950年代の核実験プログラムの効果が減少しているものの持続して
いるからである。全ての試料の炭素-14放射能が「爆弾前」の標準物質を基準とするので
、及びほとんど全ての新しい生物ベースの生成物が爆弾後の環境中に生成されるので、試
料の本当の生物ベースの含有量をより良好に反映するために、(同位体割合について補正
した後の)全てのpMC値に0.95(2010年時点)を乗じなければならない。103％よりも大きい
生物ベースの含有量は、分析誤差が生じているか、又は生物ベースの炭素の源が数年以上
古いものであるかのいずれかであることを示唆している。
ASTM D6866により、材料の全有機含有量と比べた生物ベースの含有量が定量され、存在
する無機炭素及び他の非炭素含有物質は考慮されない。例えば、50％がデンプン系材料で
あり、かつ50％が水である生成物であれば、ASTM D6866に基づいて、生物ベースの含有量
＝100％(100％生物ベースである50％有機含有量)を有するとみなされる。別の例では、50
％がデンプン系材料であり、25％が石油系であり、25％が水である生成物であれば、生物
ベースの含有量＝66.7％を有する(75％有機含有量であるが、生成物の50％しか生物ベー
スでない)。別の例では、50％が有機炭素であり、かつ石油系生成物である生成物であれ
ば、生物ベースの含有量＝0％を有するとみなされる(50％有機炭素であるが、化石源由来
である)。したがって、化合物又は材料の生物ベースの含有量を決定するための周知の方
法及び既知の標準物質に基づいて、当業者は、生物ベースの含有量を容易に決定すること
、及び/又は所望の生物ベースの含有量を有する本明細書に提供されるものを利用する下
流の生成物を調製することができる。
する無機炭素及び他の非炭素含有物質は考慮されない。例えば、50％がデンプン系材料で
あり、かつ50％が水である生成物であれば、ASTM D6866に基づいて、生物ベースの含有量
＝100％(100％生物ベースである50％有機含有量)を有するとみなされる。別の例では、50
％がデンプン系材料であり、25％が石油系であり、25％が水である生成物であれば、生物
ベースの含有量＝66.7％を有する(75％有機含有量であるが、生成物の50％しか生物ベー
スでない)。別の例では、50％が有機炭素であり、かつ石油系生成物である生成物であれ
ば、生物ベースの含有量＝0％を有するとみなされる(50％有機炭素であるが、化石源由来
である)。したがって、化合物又は材料の生物ベースの含有量を決定するための周知の方
法及び既知の標準物質に基づいて、当業者は、生物ベースの含有量を容易に決定すること
、及び/又は所望の生物ベースの含有量を有する本明細書に提供されるものを利用する下
流の生成物を調製することができる。
材料の生物ベースの含有量を定量するための炭素-14年代測定法の適用は、当技術分野
で公知である(Currieらの文献、Nuclear Instruments and Methods in Physics Research
B, 172:281-287(2000))。例えば、炭素-14年代測定を用いて、テレフタレート含有材料
中の生物ベースの含有量が定量されている(Colonnaらの文献、Green Chemistry, 13:2543
-2548(2011))。とりわけ、再生可能な1,3-プロパンジオール及び石油由来テレフタル酸か
ら誘導されたポリプロピレンテレフタレート(PPT)ポリマーからは、30％に近いFm値が得
られた(すなわち、ポリマー炭素の3/11が再生可能な1,3-プロパンジオールに由来し、8/1
1が化石の端成分であるテレフタル酸に由来するため)(Currieらの文献、上記、2000))。
対照的に、再生可能な1,4-ブタンジオールと再生可能なテレフタル酸の両方から誘導され
たポリブチレンテレフタレートポリマーからは、90％を超える生物ベースの含有量が得ら
れた(Colonnaらの文献、上記、2011)。
で公知である(Currieらの文献、Nuclear Instruments and Methods in Physics Research
B, 172:281-287(2000))。例えば、炭素-14年代測定を用いて、テレフタレート含有材料
中の生物ベースの含有量が定量されている(Colonnaらの文献、Green Chemistry, 13:2543
-2548(2011))。とりわけ、再生可能な1,3-プロパンジオール及び石油由来テレフタル酸か
ら誘導されたポリプロピレンテレフタレート(PPT)ポリマーからは、30％に近いFm値が得
られた(すなわち、ポリマー炭素の3/11が再生可能な1,3-プロパンジオールに由来し、8/1
1が化石の端成分であるテレフタル酸に由来するため)(Currieらの文献、上記、2000))。
対照的に、再生可能な1,4-ブタンジオールと再生可能なテレフタル酸の両方から誘導され
たポリブチレンテレフタレートポリマーからは、90％を超える生物ベースの含有量が得ら
れた(Colonnaらの文献、上記、2011)。
したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、環境の炭素と
も呼ばれる、大気中の炭素の取込み源を反映する炭素-12、炭素-13、及び炭素-14の比を
有する生物由来キシリトールである。例えば、いくつかの態様において、該生物由来キシ
リトールは、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少な
くとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少な
くとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少な
くとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は
100％と同程度のFm値を有することができる。いくつかのそのような実施態様において、
該取込み源はCO2である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、石
油系炭素取込み源を反映する炭素-12、炭素-13、及び炭素-14の比を有する生物由来キシ
リトールである。この態様において、本明細書に提供される生物由来キシリトールは、95
％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55
％未満、50％未満、45％未満、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15
％未満、10％未満、5％未満、2％未満、又は1％未満のFm値を有することができる。いく
つかの実施態様において、本明細書に提供される生物由来キシリトールは、大気中の炭素
の取込み源と石油系取込み源との組合せによって得られる炭素-12、炭素-13、及び炭素-1
4の比を有することができる。そのような取込み源の組合せの使用は、炭素-12、炭素-13
、及び炭素-14の比を変動させることができる1つの方法であり、それぞれの比は、取込み
源の割合を反映している。
も呼ばれる、大気中の炭素の取込み源を反映する炭素-12、炭素-13、及び炭素-14の比を
有する生物由来キシリトールである。例えば、いくつかの態様において、該生物由来キシ
リトールは、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少な
くとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少な
くとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少な
くとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は
100％と同程度のFm値を有することができる。いくつかのそのような実施態様において、
該取込み源はCO2である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、石
油系炭素取込み源を反映する炭素-12、炭素-13、及び炭素-14の比を有する生物由来キシ
リトールである。この態様において、本明細書に提供される生物由来キシリトールは、95
％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55
％未満、50％未満、45％未満、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15
％未満、10％未満、5％未満、2％未満、又は1％未満のFm値を有することができる。いく
つかの実施態様において、本明細書に提供される生物由来キシリトールは、大気中の炭素
の取込み源と石油系取込み源との組合せによって得られる炭素-12、炭素-13、及び炭素-1
4の比を有することができる。そのような取込み源の組合せの使用は、炭素-12、炭素-13
、及び炭素-14の比を変動させることができる1つの方法であり、それぞれの比は、取込み
源の割合を反映している。
さらに、本明細書に提供されるのは、生物由来キシリトールに由来する生成物でもあり
、ここで、該生物由来キシリトールは、環境中に生じるCO2とほぼ同じ値の炭素-12、炭素
-13、及び炭素-14同位体比を有する。例えば、いくつかの態様において、本明細書に提供
されるのは、環境中に生じるCO2とほぼ同じ値の炭素-12対炭素-13対炭素-14同位体比、又
は本明細書に開示される他の比のいずれかを有する本明細書に記載される生物由来キシリ
トールを有する生物ベースの生成物である。本明細書に開示されるように、生成物は、環
境中に生じるCO2とほぼ同じ値の炭素-12対炭素-13対炭素-14同位体比、又は本明細書に開
示される比のいずれかを有することができることが理解され、ここで、該生成物は、本明
細書に開示される生物由来キシリトールから生成され、ここで、該生物由来キシリトール
は、最終生成物を生成させるために化学修飾される。本明細書に記載されるように、所望
の生成物を生成させるために生物由来キシリトールを化学修飾する方法は、当業者に周知
である。
、ここで、該生物由来キシリトールは、環境中に生じるCO2とほぼ同じ値の炭素-12、炭素
-13、及び炭素-14同位体比を有する。例えば、いくつかの態様において、本明細書に提供
されるのは、環境中に生じるCO2とほぼ同じ値の炭素-12対炭素-13対炭素-14同位体比、又
は本明細書に開示される他の比のいずれかを有する本明細書に記載される生物由来キシリ
トールを有する生物ベースの生成物である。本明細書に開示されるように、生成物は、環
境中に生じるCO2とほぼ同じ値の炭素-12対炭素-13対炭素-14同位体比、又は本明細書に開
示される比のいずれかを有することができることが理解され、ここで、該生成物は、本明
細書に開示される生物由来キシリトールから生成され、ここで、該生物由来キシリトール
は、最終生成物を生成させるために化学修飾される。本明細書に記載されるように、所望
の生成物を生成させるために生物由来キシリトールを化学修飾する方法は、当業者に周知
である。
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるメチニコビア種によって生産さ
れるか又は本明細書に記載される方法を用いて生産される生物由来キシリトールを有する
生物ベースの生成物である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、
本明細書に記載される生物由来キシリトールを用いて生産される生物ベースの生成物であ
る。そのような製造は、生物由来化合物を化学反応させて(例えば、化学的変換、化学的
官能化、化学的カップリング、酸化、還元、重合、共重合など)、最終生成物にすること
を含むことができる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細
書に記載される生物由来キシリトールを有する生物ベースの生成物である。いくつかの実
施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される少なくとも2％、少
なくとも3％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少な
くとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも50％、少な
くとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少な
くとも98％、又は100％生物由来キシリトールを有する生物ベースの生成物である。
れるか又は本明細書に記載される方法を用いて生産される生物由来キシリトールを有する
生物ベースの生成物である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、
本明細書に記載される生物由来キシリトールを用いて生産される生物ベースの生成物であ
る。そのような製造は、生物由来化合物を化学反応させて(例えば、化学的変換、化学的
官能化、化学的カップリング、酸化、還元、重合、共重合など)、最終生成物にすること
を含むことができる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細
書に記載される生物由来キシリトールを有する生物ベースの生成物である。いくつかの実
施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される少なくとも2％、少
なくとも3％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少な
くとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも50％、少な
くとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少な
くとも98％、又は100％生物由来キシリトールを有する生物ベースの生成物である。
本明細書に提供されるのは、H0メチニコビア属種のキシロースレダクターゼ(Xyl1タン
パク質)に関する単離されたポリペプチド及びH0メチニコビア属種のXYL1遺伝子に関する
単離された核酸、並びにそのような核酸を含む宿主細胞である。メチニコビア種における
この核酸の存在は、本明細書に記載されるようなキシロースからキシリトールを生産する
ことができるメチニコビア種を生じさせることができる。したがって、本明細書に提供さ
れるのは、Xyl1タンパク質又はその変異体のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチ
ド; Xyl1タンパク質又はその変異体をコードする核酸配列を有する単離された核酸; XYL1
の遺伝子の核酸配列を有する単離された核酸;並びにそのような核酸配列を有する及び/又
はそのようなタンパク質を発現する宿主細胞である。
パク質)に関する単離されたポリペプチド及びH0メチニコビア属種のXYL1遺伝子に関する
単離された核酸、並びにそのような核酸を含む宿主細胞である。メチニコビア種における
この核酸の存在は、本明細書に記載されるようなキシロースからキシリトールを生産する
ことができるメチニコビア種を生じさせることができる。したがって、本明細書に提供さ
れるのは、Xyl1タンパク質又はその変異体のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチ
ド; Xyl1タンパク質又はその変異体をコードする核酸配列を有する単離された核酸; XYL1
の遺伝子の核酸配列を有する単離された核酸;並びにそのような核酸配列を有する及び/又
はそのようなタンパク質を発現する宿主細胞である。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号11のアミノ酸配列
を有する単離されたポリペプチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記
載されるH0メチニコビア属種のXyl1タンパク質に対する変異体となるアミノ酸配列を有す
るが、該ポリペプチドの機能的活性を依然として保持する単離されたポリペプチドである
。例えば、いくつかの実施態様において、単離されたポリペプチドは、配列番号11のアミ
ノ酸配列を有し、ここで、該アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のアミノ酸置換、欠失、
又は挿入を含む。本明細書に提供されるタンパク質の変異体は、参照ポリペプチド配列と
比較したとき、例えば、欠失、融合、又は切断も含む。したがって、いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される単離されたポリペプチドは、配列番号37、40、42、44、
46、51、52、55、及び56のいずれか1つと少なくとも95.0％、少なくとも95.1％、少なく
とも95.2％、少なくとも95.3％、少なくとも95.4％、少なくとも95.5％、少なくとも95.6
％、少なくとも95.7％、少なくとも95.8％、少なくとも95.9％、少なくとも96.0％、少な
くとも96.1％、少なくとも96.2％、少なくとも96.3％、少なくとも96.4％、少なくとも96
.5％、少なくとも96.6％、少なくとも96.7％、少なくとも96.8％、少なくとも96.9％、少
なくとも97.0％、少なくとも97.1％、少なくとも97.2％、少なくとも97.3％、少なくとも
97.4％、少なくとも97.5％、少なくとも97.6％、少なくとも97.7％、少なくとも97.8％、
少なくとも97.9％、少なくとも98.0％、少なくとも98.1％、少なくとも98.2％、少なくと
も98.3％、少なくとも98.4％、少なくとも98.5％、少なくとも98.6％、少なくとも98.7％
、少なくとも98.8％、少なくとも98.9％、少なくとも99.0％、少なくとも99.1％、少なく
とも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6
％、少なくとも99.7％、又は少なくとも99.8％同一であるアミノ酸配列を有する。
を有する単離されたポリペプチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記
載されるH0メチニコビア属種のXyl1タンパク質に対する変異体となるアミノ酸配列を有す
るが、該ポリペプチドの機能的活性を依然として保持する単離されたポリペプチドである
。例えば、いくつかの実施態様において、単離されたポリペプチドは、配列番号11のアミ
ノ酸配列を有し、ここで、該アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のアミノ酸置換、欠失、
又は挿入を含む。本明細書に提供されるタンパク質の変異体は、参照ポリペプチド配列と
比較したとき、例えば、欠失、融合、又は切断も含む。したがって、いくつかの実施態様
において、本明細書に提供される単離されたポリペプチドは、配列番号37、40、42、44、
46、51、52、55、及び56のいずれか1つと少なくとも95.0％、少なくとも95.1％、少なく
とも95.2％、少なくとも95.3％、少なくとも95.4％、少なくとも95.5％、少なくとも95.6
％、少なくとも95.7％、少なくとも95.8％、少なくとも95.9％、少なくとも96.0％、少な
くとも96.1％、少なくとも96.2％、少なくとも96.3％、少なくとも96.4％、少なくとも96
.5％、少なくとも96.6％、少なくとも96.7％、少なくとも96.8％、少なくとも96.9％、少
なくとも97.0％、少なくとも97.1％、少なくとも97.2％、少なくとも97.3％、少なくとも
97.4％、少なくとも97.5％、少なくとも97.6％、少なくとも97.7％、少なくとも97.8％、
少なくとも97.9％、少なくとも98.0％、少なくとも98.1％、少なくとも98.2％、少なくと
も98.3％、少なくとも98.4％、少なくとも98.5％、少なくとも98.6％、少なくとも98.7％
、少なくとも98.8％、少なくとも98.9％、少なくとも99.0％、少なくとも99.1％、少なく
とも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6
％、少なくとも99.7％、又は少なくとも99.8％同一であるアミノ酸配列を有する。
本明細書に記載されるXyl1タンパク質の変異体は、保存的アミノ酸置換を含有すること
もでき、つまり、1以上のアミノ酸をタンパク質の二次及び/又は三次構造を変化させない
アミノ酸に置き換えることができる。そのような置換としては、同様の物理化学的特性を
有する残基によるアミノ酸の置換、例えば、ある脂肪族残基(Ile、Val、Leu、もしくはAl
a)の別の残基への置換、又は塩基性残基LysとArgの間、酸性残基GluとAspの間、アミド残
基GlnとAsnの間、ヒドロキシル残基SerとTyrの間、又は芳香族残基PheとTyrの間の置換を
挙げることができる。表現型に影響しないアミノ酸交換は、Bowieらの文献、Science 247
:1306-10(1990)により完全に記載されている。さらに、本明細書に記載されるタンパク質
の変異体は、置換、欠失、又は付加が、結果として得られるポリペプチドの機能に影響を
及ぼさない限り、タンパク質の機能的領域の外側にアミノ酸配列に対するアミノ酸置換、
欠失、又は付加を有するものを含む。これらの置換及び欠失を作製するための技法は、当
技術分野で周知であり、例えば、部位特異的突然変異誘発を含む。
もでき、つまり、1以上のアミノ酸をタンパク質の二次及び/又は三次構造を変化させない
アミノ酸に置き換えることができる。そのような置換としては、同様の物理化学的特性を
有する残基によるアミノ酸の置換、例えば、ある脂肪族残基(Ile、Val、Leu、もしくはAl
a)の別の残基への置換、又は塩基性残基LysとArgの間、酸性残基GluとAspの間、アミド残
基GlnとAsnの間、ヒドロキシル残基SerとTyrの間、又は芳香族残基PheとTyrの間の置換を
挙げることができる。表現型に影響しないアミノ酸交換は、Bowieらの文献、Science 247
:1306-10(1990)により完全に記載されている。さらに、本明細書に記載されるタンパク質
の変異体は、置換、欠失、又は付加が、結果として得られるポリペプチドの機能に影響を
及ぼさない限り、タンパク質の機能的領域の外側にアミノ酸配列に対するアミノ酸置換、
欠失、又は付加を有するものを含む。これらの置換及び欠失を作製するための技法は、当
技術分野で周知であり、例えば、部位特異的突然変異誘発を含む。
本明細書に提供される単離されたポリペプチドは、その機能を保持する本明細書に記載
されるXyl1タンパク質の機能的断片も含む。いくつかの実施態様において、本明細書に提
供されるのは、本明細書に記載されるXyl1タンパク質の機能的断片である単離されたポリ
ペプチドである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に
記載されるXyl1タンパク質の機能的断片であるポリペプチドをコードする単離された核酸
である。いくつかの実施態様において、該単離されたポリペプチドは、該タンパク質の機
能を保持する、Xyl1タンパク質(配列番号11)の断片であることができる。
されるXyl1タンパク質の機能的断片も含む。いくつかの実施態様において、本明細書に提
供されるのは、本明細書に記載されるXyl1タンパク質の機能的断片である単離されたポリ
ペプチドである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に
記載されるXyl1タンパク質の機能的断片であるポリペプチドをコードする単離された核酸
である。いくつかの実施態様において、該単離されたポリペプチドは、該タンパク質の機
能を保持する、Xyl1タンパク質(配列番号11)の断片であることができる。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるXyl1タンパク質の変異体は、他の
化学的部分、例えば、グリコシル基、ポリエチレングリコール(PEG)基、脂質、ホスフェ
ート、アセチル基などとの共有結合的修飾又は凝集的コンジュゲーションを含む。いくつ
かの実施態様において、本明細書に記載されるXyl1タンパク質の変異体は、例えば、本明
細書に記載されるタンパク質及び別のポリペプチドから形成された融合タンパク質をさら
に含む。該融合タンパク質を構築するための付加されるポリペプチドには、本明細書に記
載されるタンパク質の精製もしくはオリゴマー化を容易にするもの、又は本明細書に記載
されるXyl1タンパク質の安定性及び/もしくは機能を増強するものが含まれる。
化学的部分、例えば、グリコシル基、ポリエチレングリコール(PEG)基、脂質、ホスフェ
ート、アセチル基などとの共有結合的修飾又は凝集的コンジュゲーションを含む。いくつ
かの実施態様において、本明細書に記載されるXyl1タンパク質の変異体は、例えば、本明
細書に記載されるタンパク質及び別のポリペプチドから形成された融合タンパク質をさら
に含む。該融合タンパク質を構築するための付加されるポリペプチドには、本明細書に記
載されるタンパク質の精製もしくはオリゴマー化を容易にするもの、又は本明細書に記載
されるXyl1タンパク質の安定性及び/もしくは機能を増強するものが含まれる。
本明細書に記載されるXyl1タンパク質を異種ポリペプチドに融合して、精製を容易にす
ることができる。多くの利用可能な異種ペプチド(ペプチドタグ)は、融合タンパク質の結
合パートナーへの選択的結合を可能にする。ペプチドタグの非限定的な例としては、6-Hi
s、チオレドキシン、ヘマグルチニン、GST、及びOmpAシグナル配列タグが挙げられる。異
種ペプチドタグを認識し、それに結合する結合パートナーは、金属イオン(例えば、金属
親和性カラム)、抗体、抗体断片、又は異種ペプチドに選択的にもしくは特異的に結合し
て、融合タンパク質の精製を可能にする任意のタンパク質もしくはペプチドを含む、任意
の分子又は化合物であることができる。
ることができる。多くの利用可能な異種ペプチド(ペプチドタグ)は、融合タンパク質の結
合パートナーへの選択的結合を可能にする。ペプチドタグの非限定的な例としては、6-Hi
s、チオレドキシン、ヘマグルチニン、GST、及びOmpAシグナル配列タグが挙げられる。異
種ペプチドタグを認識し、それに結合する結合パートナーは、金属イオン(例えば、金属
親和性カラム)、抗体、抗体断片、又は異種ペプチドに選択的にもしくは特異的に結合し
て、融合タンパク質の精製を可能にする任意のタンパク質もしくはペプチドを含む、任意
の分子又は化合物であることができる。
本明細書に記載されるXyl1タンパク質を修飾して、オリゴマーの形成を容易にすること
もできる。例えば、本明細書に記載されるタンパク質を、オリゴマー化を促進するペプチ
ド部分、例えば、ロイシンジッパー、及び特定の抗体断片ポリペプチド、例えば、Fcポリ
ペプチドと融合することができる。これらの融合タンパク質を調製する技法は公知であり
、例えば、WO 99/31241号及びCosmanらの文献、Immunity 14:123-133(2001)に記載されて
いる。Fcポリペプチドとの融合は、プロテインA又はプロテインGカラムでの親和性クロマ
トグラフィーによる精製を容易にするさらなる利点を提供する。ロイシン-ジッパー(LZ)
、例えば、4又は5個のロイシン残基が他のアミノ酸とともに散在することが多い反復ヘプ
タッドリピートとの融合は、Landschulzらの文献、Science 240:1759-64(1988)に記載さ
れている。
もできる。例えば、本明細書に記載されるタンパク質を、オリゴマー化を促進するペプチ
ド部分、例えば、ロイシンジッパー、及び特定の抗体断片ポリペプチド、例えば、Fcポリ
ペプチドと融合することができる。これらの融合タンパク質を調製する技法は公知であり
、例えば、WO 99/31241号及びCosmanらの文献、Immunity 14:123-133(2001)に記載されて
いる。Fcポリペプチドとの融合は、プロテインA又はプロテインGカラムでの親和性クロマ
トグラフィーによる精製を容易にするさらなる利点を提供する。ロイシン-ジッパー(LZ)
、例えば、4又は5個のロイシン残基が他のアミノ酸とともに散在することが多い反復ヘプ
タッドリピートとの融合は、Landschulzらの文献、Science 240:1759-64(1988)に記載さ
れている。
本明細書に記載されるXyl1タンパク質は、単離された形態で、又は実質的に精製された
形態で提供することができる。ポリペプチドは、例えば、硫酸アンモニウム又はエタノー
ル沈殿、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ
フィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む、既知の方法に
よって、組換え細胞培養物から回収又は精製することができる。いくつかの実施態様にお
いて、タンパク質クロマトグラフィーを精製に利用する。
形態で提供することができる。ポリペプチドは、例えば、硫酸アンモニウム又はエタノー
ル沈殿、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ
フィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む、既知の方法に
よって、組換え細胞培養物から回収又は精製することができる。いくつかの実施態様にお
いて、タンパク質クロマトグラフィーを精製に利用する。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるXyl1
タンパク質をコードする外因性核酸を有する組換え微生物である。いくつかの実施態様に
おいて、該組換え微生物は、本明細書に記載されるXyl1タンパク質をコードする外因性核
酸を有し、ここで、該タンパク質は、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、又は1～5個
のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。いくつかの実施態様において、該Xyl1タンパ
ク質は、配列番号11のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、該Xyl1タン
パク質は、配列番号11の1～10個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有し、かつ該タンパ
ク質の機能を保持する。いくつかの実施態様において、該Xyl1タンパク質は、配列番号11
の1～5個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有し、かつ該タンパク質の機能を保持する。
該組換え微生物は、限定されないが、本明細書に記載されるH0メチニコビア属種を含む、
メチニコビア種であることができる。
タンパク質をコードする外因性核酸を有する組換え微生物である。いくつかの実施態様に
おいて、該組換え微生物は、本明細書に記載されるXyl1タンパク質をコードする外因性核
酸を有し、ここで、該タンパク質は、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、又は1～5個
のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。いくつかの実施態様において、該Xyl1タンパ
ク質は、配列番号11のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、該Xyl1タン
パク質は、配列番号11の1～10個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有し、かつ該タンパ
ク質の機能を保持する。いくつかの実施態様において、該Xyl1タンパク質は、配列番号11
の1～5個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有し、かつ該タンパク質の機能を保持する。
該組換え微生物は、限定されないが、本明細書に記載されるH0メチニコビア属種を含む、
メチニコビア種であることができる。
本明細書に記載されるXyl1タンパク質は、好適な宿主によって組換え発現させることが
できる。該タンパク質の異種発現が望ましい場合、特定の遺伝子のコード配列を宿主のコ
ドン使用に従って修飾することができる。標準的な遺伝コードは、例えば、Osawaらの文
献、Microbiol Rev. 56(1):229-64(1992)に概説されているように、当技術分野で周知で
ある。限定されないが、出芽酵母、カンジダ・アジマ、カンジダ・ジベルサ、カンジダ・
マグノリアエ、カンジダ・ルゴペリクローサ、ヤロウィア・リポリティカ、及びジゴアス
クス・ヘレニクスを含む、酵母種は、標準的なコードを使用している。ある種の酵母種は
、別のコードを使用している。例えば、「Leu」の標準的なコドンである「CUG」は、カン
ジダ・アルビカンス、カンジダ・シリンドラセア、カンジダ・メリビオシカ、カンジダ・
パラプシローシス、カンジダ・ルゴセ、ピキア・スティピティス、及びメチニコビア種な
どの種では、「Ser」をコードする。H0メチニコビア属種をコドン表は、本明細書に提供
されている。
できる。該タンパク質の異種発現が望ましい場合、特定の遺伝子のコード配列を宿主のコ
ドン使用に従って修飾することができる。標準的な遺伝コードは、例えば、Osawaらの文
献、Microbiol Rev. 56(1):229-64(1992)に概説されているように、当技術分野で周知で
ある。限定されないが、出芽酵母、カンジダ・アジマ、カンジダ・ジベルサ、カンジダ・
マグノリアエ、カンジダ・ルゴペリクローサ、ヤロウィア・リポリティカ、及びジゴアス
クス・ヘレニクスを含む、酵母種は、標準的なコードを使用している。ある種の酵母種は
、別のコードを使用している。例えば、「Leu」の標準的なコドンである「CUG」は、カン
ジダ・アルビカンス、カンジダ・シリンドラセア、カンジダ・メリビオシカ、カンジダ・
パラプシローシス、カンジダ・ルゴセ、ピキア・スティピティス、及びメチニコビア種な
どの種では、「Ser」をコードする。H0メチニコビア属種をコドン表は、本明細書に提供
されている。
さらに、宿主は、同じ種類のタンパク質の複数の形態が同じ細胞内で発現されるように
同じカテゴリーのタンパク質の他の形態を同時に生産することができる。例えば、宿主は
、オリゴマーを形成して、同じ糖を輸送することができる異なるキシロースレダクターゼ
を同時に生産することができる。
同じカテゴリーのタンパク質の他の形態を同時に生産することができる。例えば、宿主は
、オリゴマーを形成して、同じ糖を輸送することができる異なるキシロースレダクターゼ
を同時に生産することができる。
本明細書に記載されるXyl1タンパク質の変異体は、当技術分野で公知の従来の方法によ
り、例えば、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発によって特定の位置に突
然変異を導入することにより作製することができる。部位特異的突然変異誘発は、タンパ
ク質工学への情報提供アプローチと考えられており、特定のアミノ酸変化を標的タンパク
質の高解像度結晶構造に頼ることができる(Van Den Burgらの文献、PNAS 95:2056-60(199
8))。種々のタンパク質工学対象物の部位特異的変化を同定するための計算方法も、当技
術分野で公知である(Hellingaの文献、Nature Structural Biology 5:525-27(1998))。
り、例えば、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発によって特定の位置に突
然変異を導入することにより作製することができる。部位特異的突然変異誘発は、タンパ
ク質工学への情報提供アプローチと考えられており、特定のアミノ酸変化を標的タンパク
質の高解像度結晶構造に頼ることができる(Van Den Burgらの文献、PNAS 95:2056-60(199
8))。種々のタンパク質工学対象物の部位特異的変化を同定するための計算方法も、当技
術分野で公知である(Hellingaの文献、Nature Structural Biology 5:525-27(1998))。
当技術分野で公知の他の技法としては、非情報提供突然変異誘発法(一般に、「有向進
化」と呼ばれる)が挙げられるが、これらに限定されない。有向進化は、ハイスループッ
トスクリーニングと併せて、タンパク質立体構造における統計的に意味のあるバリエーシ
ョンの試験を可能にする(Arnoldの文献、1998)。有向進化技術としては、Crameriらの文
献、Nature 391:288-91(1998)に記載されているものと同様の多様化法、部位飽和突然変
異誘発、互い違い伸長プロセス(StEP)(Zhaoらの文献、Nature Biotechnology 16:258-61(
1998))、及びDNA合成/再集合(米国特許第5,965,408号)を挙げることができる。
化」と呼ばれる)が挙げられるが、これらに限定されない。有向進化は、ハイスループッ
トスクリーニングと併せて、タンパク質立体構造における統計的に意味のあるバリエーシ
ョンの試験を可能にする(Arnoldの文献、1998)。有向進化技術としては、Crameriらの文
献、Nature 391:288-91(1998)に記載されているものと同様の多様化法、部位飽和突然変
異誘発、互い違い伸長プロセス(StEP)(Zhaoらの文献、Nature Biotechnology 16:258-61(
1998))、及びDNA合成/再集合(米国特許第5,965,408号)を挙げることができる。
本明細書に開示されるように、本明細書に記載されるXyl1タンパク質をコードする核酸
を宿主生物に導入することができる。場合により、タンパク質の活性を修飾して、所望の
生成物の生産を増大させることが望ましいこともある。例えば、タンパク質の活性を増大
させる既知の突然変異をコード核酸分子に導入することができる。さらに、最適化の方法
を適用して、タンパク質の活性を増大させ、かつ/又は阻害活性を減少させる、例えば、
負の調節因子の活性を減少させることができる。
を宿主生物に導入することができる。場合により、タンパク質の活性を修飾して、所望の
生成物の生産を増大させることが望ましいこともある。例えば、タンパク質の活性を増大
させる既知の突然変異をコード核酸分子に導入することができる。さらに、最適化の方法
を適用して、タンパク質の活性を増大させ、かつ/又は阻害活性を減少させる、例えば、
負の調節因子の活性を減少させることができる。
1つのそのような最適化の方法は、有向進化である。有向進化は、酵素の特性を改善及
び/又は改変するために特定の遺伝子を標的とする突然変異の導入を伴う強力なアプロー
チである。改善及び/又は改変された酵素は、多くの酵素変異体(例えば、＞104個)の自動
化スクリーニングを可能にする感度の高いハイスループットスクリーニングアッセイの開
発及び実行を通して同定することができる。典型的には、突然変異誘発とスクリーニング
の反復ラウンドを実施して、最適化された特性を有する酵素を得る。突然変異誘発のため
の遺伝子の領域を特定するの支援することができる計算アルゴリズムも開発されており、
これは、作製及びスクリーニングされる必要がある酵素変異体の数を顕著に低下させるこ
とができる。多様な変異体ライブラリーを作出するのに有効である数多くの有向進化の技
術が開発されており(総説については、Hibbertらの文献、Biomol.Eng 22:11-19(2005); H
uisman及びLalondeの文献、製薬及びバイオテクノロジー産業における生体触媒作用(Bioc
atalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries)、717～742ページ(200
7)、Patel(編)、CRC Press所収; Otten and Quaxの文献、Biomol.Eng 22:1-9(2005).;並
びにSenらの文献、Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007)を参照)、これらの方法
は、多くの酵素クラスにわたる広範囲の特性の改善に首尾よく適用されている。有向進化
の技術によって改善及び/又は改変されている酵素特性としては、例えば:非天然の基質の
変換のための選択性/特異性;激しい高温処理のための温度安定性;より低い又はより高いp
H条件下におけるバイオプロセシングのためのpH安定性;高い生成物力価を達成することが
できるような基質又は生成物の公差;非天然の基質を含めるための基質結合性の拡大を含
む、結合(Km);生成物、基質、又は主要な中間体による阻害を除去するための阻害(Ki);所
望のフラックスを達成するように酵素反応速度を増大させる活性(kcat);タンパク質収率
及び全経路フラックスを増大させる発現レベル;好気的な条件下における空気感受性酵素
の作動のための酸素安定性;並びに酸素の非存在下における好気的酵素の作動のための嫌
気的活性が挙げられる。
び/又は改変するために特定の遺伝子を標的とする突然変異の導入を伴う強力なアプロー
チである。改善及び/又は改変された酵素は、多くの酵素変異体(例えば、＞104個)の自動
化スクリーニングを可能にする感度の高いハイスループットスクリーニングアッセイの開
発及び実行を通して同定することができる。典型的には、突然変異誘発とスクリーニング
の反復ラウンドを実施して、最適化された特性を有する酵素を得る。突然変異誘発のため
の遺伝子の領域を特定するの支援することができる計算アルゴリズムも開発されており、
これは、作製及びスクリーニングされる必要がある酵素変異体の数を顕著に低下させるこ
とができる。多様な変異体ライブラリーを作出するのに有効である数多くの有向進化の技
術が開発されており(総説については、Hibbertらの文献、Biomol.Eng 22:11-19(2005); H
uisman及びLalondeの文献、製薬及びバイオテクノロジー産業における生体触媒作用(Bioc
atalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries)、717～742ページ(200
7)、Patel(編)、CRC Press所収; Otten and Quaxの文献、Biomol.Eng 22:1-9(2005).;並
びにSenらの文献、Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007)を参照)、これらの方法
は、多くの酵素クラスにわたる広範囲の特性の改善に首尾よく適用されている。有向進化
の技術によって改善及び/又は改変されている酵素特性としては、例えば:非天然の基質の
変換のための選択性/特異性;激しい高温処理のための温度安定性;より低い又はより高いp
H条件下におけるバイオプロセシングのためのpH安定性;高い生成物力価を達成することが
できるような基質又は生成物の公差;非天然の基質を含めるための基質結合性の拡大を含
む、結合(Km);生成物、基質、又は主要な中間体による阻害を除去するための阻害(Ki);所
望のフラックスを達成するように酵素反応速度を増大させる活性(kcat);タンパク質収率
及び全経路フラックスを増大させる発現レベル;好気的な条件下における空気感受性酵素
の作動のための酸素安定性;並びに酸素の非存在下における好気的酵素の作動のための嫌
気的活性が挙げられる。
特異的酵素の所望の特性を標的とする遺伝子の突然変異誘発及び多様化のためのいくつ
かの例示的な方法が開発されている。そのような方法は当業者に周知である。これらのい
ずれかを用いて、本明細書に記載されるタンパク質の活性を改変及び/又は最適化するこ
とができる。そのような方法としては、PCR反応におけるDNAポリメラーゼの忠実度を低下
させることにより、ランダムな点突然変異を導入する、EpPCR(Pritchardらの文献、J The
or.Biol. 234:497-509(2005));完全環状プラスミドを鋳型として使用し、最後の2つのヌ
クレオチドにエキソヌクレアーゼ耐性チオリン酸結合を有するランダムヘキサマーを該プ
ラスミドを増幅させるために使用し、その後、細胞に形質転換し、該細胞内で該プラスミ
ドがタンデムリピートにおいて再環状化されることを除き、epPCRと同様である、エラー
プローンローリングサイクル増幅(epRCA)(Fujiiらの文献、Nucleic Acids Res. 32:e145(
2004);及びFujiiらの文献、Nat. Protoc. 1:2493-2497(2006));典型的には、DnアーゼI又
はEndoVなどのヌクレアーゼで2以上の変異体遺伝子を消化して、DNAポリメラーゼの存在
下でのアニーリングと伸長のサイクルによって再集合するランダム断片のプールを生成さ
せて、キメラ遺伝子のライブラリーを作出することを伴う、DNA又はファミリーシャフリ
ング(Stemmerの文献、Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751(1994);及びStemmerの文
献、Nature 370:389-391(1994));鋳型プライミングと、その後の変性及び非常に短い期間
のアニーリング/伸長(5秒程度の短時間)を含む2段階PCRの反復サイクルを伴う、互い違い
伸長(StEP)(Zhaoらの文献、Nat. Biotechnol. 16:258-261(1998));ランダム配列プライマ
ーを用いて、鋳型の異なるセグメントに相補的な多くの短いDNA断片を生成させる、ラン
ダムプライミング組換え(RPR)(Shaoらの文献、Nucleic Acids Res 26:681-683(1998))が
挙げられるが、これに限定されない。
かの例示的な方法が開発されている。そのような方法は当業者に周知である。これらのい
ずれかを用いて、本明細書に記載されるタンパク質の活性を改変及び/又は最適化するこ
とができる。そのような方法としては、PCR反応におけるDNAポリメラーゼの忠実度を低下
させることにより、ランダムな点突然変異を導入する、EpPCR(Pritchardらの文献、J The
or.Biol. 234:497-509(2005));完全環状プラスミドを鋳型として使用し、最後の2つのヌ
クレオチドにエキソヌクレアーゼ耐性チオリン酸結合を有するランダムヘキサマーを該プ
ラスミドを増幅させるために使用し、その後、細胞に形質転換し、該細胞内で該プラスミ
ドがタンデムリピートにおいて再環状化されることを除き、epPCRと同様である、エラー
プローンローリングサイクル増幅(epRCA)(Fujiiらの文献、Nucleic Acids Res. 32:e145(
2004);及びFujiiらの文献、Nat. Protoc. 1:2493-2497(2006));典型的には、DnアーゼI又
はEndoVなどのヌクレアーゼで2以上の変異体遺伝子を消化して、DNAポリメラーゼの存在
下でのアニーリングと伸長のサイクルによって再集合するランダム断片のプールを生成さ
せて、キメラ遺伝子のライブラリーを作出することを伴う、DNA又はファミリーシャフリ
ング(Stemmerの文献、Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751(1994);及びStemmerの文
献、Nature 370:389-391(1994));鋳型プライミングと、その後の変性及び非常に短い期間
のアニーリング/伸長(5秒程度の短時間)を含む2段階PCRの反復サイクルを伴う、互い違い
伸長(StEP)(Zhaoらの文献、Nat. Biotechnol. 16:258-261(1998));ランダム配列プライマ
ーを用いて、鋳型の異なるセグメントに相補的な多くの短いDNA断片を生成させる、ラン
ダムプライミング組換え(RPR)(Shaoらの文献、Nucleic Acids Res 26:681-683(1998))が
挙げられるが、これに限定されない。
さらなる方法としては、線状化プラスミドDNAを用いて、ミスマッチ修復によって修復
されるヘテロ二本鎖を形成する、ヘテロ二本鎖組換え(Volkovの文献、Nucleic Acids Res
. 27:e18(1999);及びVolkovらの文献、Methods Enzymol. 328:456-463(2000)); Dnアーゼ
I断片化及び一本鎖DNA(ssDNA)のサイズ分画を利用する、一過性の鋳型上でのランダムな
キメラ生成(RACHITT)(Cocoらの文献、Nat. Biotechnol. 19:354-359(2001));鋳型のプー
ルとして使用される一方向のssDNA断片の存在下で、プライマーから一方向に成長する鎖
の鋳型スイッチングを伴う、切断された鋳型上での組換え伸長(RETT)(Leeらの文献、J. M
olec. Catalysis 26:119-129(2003));縮重プライマー用いて、分子間の組換えを制御する
、縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング(DOGS);(Bergquist及びGibbsの文献、Me
thods Mol.Biol 352:191-204(2007); Bergquistらの文献、Biomol.Eng 22:63-72(2005);
Gibbsらの文献、Gene 271:13-20(2001));対象となる遺伝子又は遺伝子断片の1塩基対の欠
失を有するコンビナトリアルライブラリーを作出する、ハイブリッド酵素の作出のための
漸増的切断(ITCHY)(Ostermeierらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-3567(19
99);及びOstermeierらの文献、Nat. Biotechnol. 17:1205-1209(1999));ホスホチオエー
トdNTPを用いて切断を生成させることを除き、ITCHYと同様である、ハイブリッド酵素の
作出のためのチオ-漸増的切断(THIO-ITCHY)(Lutzらの文献、Nucleic Acids Res 29:E16(2
001)); 2つの遺伝子組換え法であるITCHYとDNAシャッフリングを組み合わせたものである
、SCRATCHY(Lutzらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11248-11253(2001)); epPCR
によって作られた突然変異を、使用可能な活性を保持しているものについてスクリーニン
グ/選択によって追跡する、ランダムドリフト突然変異誘発(RNDM)(Bergquistらの文献、B
iomol. Eng. 22:63-72(2005));ホスホチオエートヌクレオチドのランダム組込み及び切断
を用いてランダムな長さの断片のプールを作製し、これを鋳型として用いて、イノシンな
どの「ユニバーサル」塩基の存在下で伸長させ、イノシン含有相補鎖の複製によって、ラ
ンダムな塩基の組込み、及びその結果として、突然変異誘発をもたらすランダム突然変異
誘発法である、配列飽和突然変異誘発(SeSaM)(Wongらの文献、Biotechnol. J. 3:74-82(2
008); Wongらの文献、Nucleic Acids Res. 32:e26(2004);及びWongらの文献、Anal. Bioc
hem. 341:187-189(2005));「標的の全ての遺伝的多様性」をコードするように設計された
オーバーラップオリゴヌクレオチドを使用し、シャッフルされた子孫について非常に高い
多様性を可能にする、合成シャッフリング(Nessらの文献、Nat. Biotechnol. 20:1251-12
55(2002)); dUTPの組込みに次ぐ、ウラシルDNAグリコシラーゼ及びその後のピペリジンに
よる処理との組合せを利用して、エンドポイントDNA断片化を行う、ヌクレオチド交換及
び切除技術NexT(Mullerらの文献、Nucleic Acids Res. 33:e117(2005))が挙げられる。
されるヘテロ二本鎖を形成する、ヘテロ二本鎖組換え(Volkovの文献、Nucleic Acids Res
. 27:e18(1999);及びVolkovらの文献、Methods Enzymol. 328:456-463(2000)); Dnアーゼ
I断片化及び一本鎖DNA(ssDNA)のサイズ分画を利用する、一過性の鋳型上でのランダムな
キメラ生成(RACHITT)(Cocoらの文献、Nat. Biotechnol. 19:354-359(2001));鋳型のプー
ルとして使用される一方向のssDNA断片の存在下で、プライマーから一方向に成長する鎖
の鋳型スイッチングを伴う、切断された鋳型上での組換え伸長(RETT)(Leeらの文献、J. M
olec. Catalysis 26:119-129(2003));縮重プライマー用いて、分子間の組換えを制御する
、縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング(DOGS);(Bergquist及びGibbsの文献、Me
thods Mol.Biol 352:191-204(2007); Bergquistらの文献、Biomol.Eng 22:63-72(2005);
Gibbsらの文献、Gene 271:13-20(2001));対象となる遺伝子又は遺伝子断片の1塩基対の欠
失を有するコンビナトリアルライブラリーを作出する、ハイブリッド酵素の作出のための
漸増的切断(ITCHY)(Ostermeierらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-3567(19
99);及びOstermeierらの文献、Nat. Biotechnol. 17:1205-1209(1999));ホスホチオエー
トdNTPを用いて切断を生成させることを除き、ITCHYと同様である、ハイブリッド酵素の
作出のためのチオ-漸増的切断(THIO-ITCHY)(Lutzらの文献、Nucleic Acids Res 29:E16(2
001)); 2つの遺伝子組換え法であるITCHYとDNAシャッフリングを組み合わせたものである
、SCRATCHY(Lutzらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11248-11253(2001)); epPCR
によって作られた突然変異を、使用可能な活性を保持しているものについてスクリーニン
グ/選択によって追跡する、ランダムドリフト突然変異誘発(RNDM)(Bergquistらの文献、B
iomol. Eng. 22:63-72(2005));ホスホチオエートヌクレオチドのランダム組込み及び切断
を用いてランダムな長さの断片のプールを作製し、これを鋳型として用いて、イノシンな
どの「ユニバーサル」塩基の存在下で伸長させ、イノシン含有相補鎖の複製によって、ラ
ンダムな塩基の組込み、及びその結果として、突然変異誘発をもたらすランダム突然変異
誘発法である、配列飽和突然変異誘発(SeSaM)(Wongらの文献、Biotechnol. J. 3:74-82(2
008); Wongらの文献、Nucleic Acids Res. 32:e26(2004);及びWongらの文献、Anal. Bioc
hem. 341:187-189(2005));「標的の全ての遺伝的多様性」をコードするように設計された
オーバーラップオリゴヌクレオチドを使用し、シャッフルされた子孫について非常に高い
多様性を可能にする、合成シャッフリング(Nessらの文献、Nat. Biotechnol. 20:1251-12
55(2002)); dUTPの組込みに次ぐ、ウラシルDNAグリコシラーゼ及びその後のピペリジンに
よる処理との組合せを利用して、エンドポイントDNA断片化を行う、ヌクレオチド交換及
び切除技術NexT(Mullerらの文献、Nucleic Acids Res. 33:e117(2005))が挙げられる。
さらなる方法としては、リンカーを用いて、2つの遠縁の又は関連のない遺伝子間の融
合を容易にし、この2つの遺伝子間の様々なキメラを作製して、単一交差ハイブリッドの
ライブラリーを生じさせる、配列相同性非依存的タンパク質組換え(SHIPREC)(Sieberらの
文献、Nat. Biotechnol. 19:456-460(2001));出発材料が、挿入を含有するスーパーコイ
ル二本鎖DNA(dsDNA)プラスミドと所望の突然変異部位で縮重している2つのプライマーと
を含む、遺伝子部位飽和突然変異誘発(商標)(GSSM(商標))(Kretzらの文献、Methods Enzy
mol. 388:3-11(2004));限定された領域を多数の考えられるアミノ酸配列改変で置き換え
るための短鎖オリゴヌクレオチドカセットの使用を伴う、コンビナトリアルカセット突然
変異誘発(CCM)(Reidhaar-Olsonらの文献、Methods Enzymol. 208:564-586(1991);及びRei
dhaar-Olsonらの文献、Science 241:53-57(1988));本質的にCCMと同様であり、高い突然
変異率のepPCRを用いて、多発点及び多発領域を特定し、その後、CMCMによる伸長を用い
て、規定のタンパク質配列空間領域を網羅する、コンビナトリアル多重カセット突然変異
誘発(CMCM)(Reetzらの文献、Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591(2001)); DNAポ
リメラーゼIIIの突然変異体サブユニットをコードするmutD5遺伝子を利用する、条件付き
ts突然変異誘発遺伝子プラスミドにより、選択の間に、ランダムな及び自然の突然変異の
頻度の20～4000倍の増大が可能になり、選択が必要とされない場合は有害な突然変異の蓄
積が阻止される、突然変異誘発遺伝子株(Mutator Strains)の技法(Selifonovaらの文献、
Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649(2001)); Lowらの文献、J. Mol. Biol. 260:35
9-3680(1996))が挙げられる。
合を容易にし、この2つの遺伝子間の様々なキメラを作製して、単一交差ハイブリッドの
ライブラリーを生じさせる、配列相同性非依存的タンパク質組換え(SHIPREC)(Sieberらの
文献、Nat. Biotechnol. 19:456-460(2001));出発材料が、挿入を含有するスーパーコイ
ル二本鎖DNA(dsDNA)プラスミドと所望の突然変異部位で縮重している2つのプライマーと
を含む、遺伝子部位飽和突然変異誘発(商標)(GSSM(商標))(Kretzらの文献、Methods Enzy
mol. 388:3-11(2004));限定された領域を多数の考えられるアミノ酸配列改変で置き換え
るための短鎖オリゴヌクレオチドカセットの使用を伴う、コンビナトリアルカセット突然
変異誘発(CCM)(Reidhaar-Olsonらの文献、Methods Enzymol. 208:564-586(1991);及びRei
dhaar-Olsonらの文献、Science 241:53-57(1988));本質的にCCMと同様であり、高い突然
変異率のepPCRを用いて、多発点及び多発領域を特定し、その後、CMCMによる伸長を用い
て、規定のタンパク質配列空間領域を網羅する、コンビナトリアル多重カセット突然変異
誘発(CMCM)(Reetzらの文献、Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591(2001)); DNAポ
リメラーゼIIIの突然変異体サブユニットをコードするmutD5遺伝子を利用する、条件付き
ts突然変異誘発遺伝子プラスミドにより、選択の間に、ランダムな及び自然の突然変異の
頻度の20～4000倍の増大が可能になり、選択が必要とされない場合は有害な突然変異の蓄
積が阻止される、突然変異誘発遺伝子株(Mutator Strains)の技法(Selifonovaらの文献、
Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649(2001)); Lowらの文献、J. Mol. Biol. 260:35
9-3680(1996))が挙げられる。
さらなる例示的な方法としては、選択されたアミノ酸のコンビナトリアル突然変異を評
価及び最適化する多次元突然変異誘発法である、ルックスルー突然変異誘発(LTM)(Rajpal
らの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:8466-8471(2005));遺伝子を一度に多重化す
るか、又は単一の遺伝子のキメラ(多重突然変異)の大きなライブラリーを作出するために
適用することができるDNAシャッフリング法である、遺伝子再集合(Verenium Corporation
によって供給されるTunable GeneReassembly(商標)(TGR(商標))技術)、特定のフォールド
を有する構造的に規定されタンパク質骨格を固定し、かつ該フォールド及びタンパク質全
体のエネルギー性を安定化することができるアミノ酸置換のための配列空間を検索する最
適化アルゴリズムであり、通常、既知の3次元構造を有するタンパク質に対して最も効果
的に作用する、インシリコタンパク質設計自動化(PDA)(Hayesらの文献、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 99:15926-15931(2002));並びに構造/機能の知識を用いて、酵素の改良に適
した部位を選択すること、Stratagene QuikChange(Stratagene; San Diego CA)などの突
然変異誘発法を用いて選択された部位における飽和突然変異誘発を実施すること、所望の
特性についてスクリーニング/選択すること、及び改良されたクローンを使用し、別の部
位でやり直し、所望の活性が得られるまで反復を継続することを伴う、反復飽和突然変異
誘発(ISM)(Reetzらの文献、Nat. Protoc. 2:891-903(2007);及びReetzらの文献、Angew.
Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751(2006))が挙げられる。
価及び最適化する多次元突然変異誘発法である、ルックスルー突然変異誘発(LTM)(Rajpal
らの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:8466-8471(2005));遺伝子を一度に多重化す
るか、又は単一の遺伝子のキメラ(多重突然変異)の大きなライブラリーを作出するために
適用することができるDNAシャッフリング法である、遺伝子再集合(Verenium Corporation
によって供給されるTunable GeneReassembly(商標)(TGR(商標))技術)、特定のフォールド
を有する構造的に規定されタンパク質骨格を固定し、かつ該フォールド及びタンパク質全
体のエネルギー性を安定化することができるアミノ酸置換のための配列空間を検索する最
適化アルゴリズムであり、通常、既知の3次元構造を有するタンパク質に対して最も効果
的に作用する、インシリコタンパク質設計自動化(PDA)(Hayesらの文献、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 99:15926-15931(2002));並びに構造/機能の知識を用いて、酵素の改良に適
した部位を選択すること、Stratagene QuikChange(Stratagene; San Diego CA)などの突
然変異誘発法を用いて選択された部位における飽和突然変異誘発を実施すること、所望の
特性についてスクリーニング/選択すること、及び改良されたクローンを使用し、別の部
位でやり直し、所望の活性が得られるまで反復を継続することを伴う、反復飽和突然変異
誘発(ISM)(Reetzらの文献、Nat. Protoc. 2:891-903(2007);及びReetzらの文献、Angew.
Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751(2006))が挙げられる。
前述の突然変異誘発方法のいずれかを単独又は任意の組合せで使用することができる。
さらに、有向進化の方法のいずれか1つ又は組合せを、本明細書に記載されているか又は
その他の形で当技術分野で公知の適応進化法と併せて使用することができる。
さらに、有向進化の方法のいずれか1つ又は組合せを、本明細書に記載されているか又は
その他の形で当技術分野で公知の適応進化法と併せて使用することができる。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるXyl1タンパク質をコードする核酸配
列及び本明細書に記載されるXYL1遺伝子の特定のコード核酸配列を有する単離された核酸
である。本明細書に提供される核酸には、配列表に提供されている核酸配列を有するもの
;高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件(例えば、42℃で2.5時間、6×SCC、0
.1％SDS)の下で、配列表に提供されている核酸配列にハイブリダイズするもの;及び配列
表に提供されている核酸配列と実質的な核酸配列同一性を有するものが含まれる。本明細
書に提供される核酸は、翻訳されて、同じアミノ酸配列を産生することができるコドンの
等価置換も包含する。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される核酸を含む
ベクターである。該ベクターは、宿主微生物での発現に好適な発現ベクターであることが
できる。該ベクターは、ウイルスベクターであることができる。
列及び本明細書に記載されるXYL1遺伝子の特定のコード核酸配列を有する単離された核酸
である。本明細書に提供される核酸には、配列表に提供されている核酸配列を有するもの
;高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件(例えば、42℃で2.5時間、6×SCC、0
.1％SDS)の下で、配列表に提供されている核酸配列にハイブリダイズするもの;及び配列
表に提供されている核酸配列と実質的な核酸配列同一性を有するものが含まれる。本明細
書に提供される核酸は、翻訳されて、同じアミノ酸配列を産生することができるコドンの
等価置換も包含する。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される核酸を含む
ベクターである。該ベクターは、宿主微生物での発現に好適な発現ベクターであることが
できる。該ベクターは、ウイルスベクターであることができる。
本明細書に提供される核酸には、本明細書に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク
質をコードするもの、及びその機能を保持するその変異体が含まれる。本明細書に提供さ
れる核酸は、cDNA、化学合成DNA、PCRによって増幅されるDNA、RNA、又はこれらの組合せ
であることができる。遺伝コードの縮重のために、2つのDNA配列は、異なっているが、そ
れでも同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
質をコードするもの、及びその機能を保持するその変異体が含まれる。本明細書に提供さ
れる核酸は、cDNA、化学合成DNA、PCRによって増幅されるDNA、RNA、又はこれらの組合せ
であることができる。遺伝コードの縮重のために、2つのDNA配列は、異なっているが、そ
れでも同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるタンパク質をコードする核酸の
有用な断片であり、これには、プローブ及びプライマーが含まれる。そのようなプローブ
及びプライマーを、例えば、PCR法で用いて、本明細書に記載されるタンパク質をコード
する核酸を増幅するか、又はその存在を、インビトロで並びに解析用のサザンブロット及
びノーザンブロットで検出することができる。本明細書に記載されるタンパク質を発現す
る細胞も、そのようなプローブの使用により同定することができる。そのようなプライマ
ー及びプローブの作製及び使用方法は周知である。
有用な断片であり、これには、プローブ及びプライマーが含まれる。そのようなプローブ
及びプライマーを、例えば、PCR法で用いて、本明細書に記載されるタンパク質をコード
する核酸を増幅するか、又はその存在を、インビトロで並びに解析用のサザンブロット及
びノーザンブロットで検出することができる。本明細書に記載されるタンパク質を発現す
る細胞も、そのようなプローブの使用により同定することができる。そのようなプライマ
ー及びプローブの作製及び使用方法は周知である。
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるタンパク質又は核酸配列の標的
mRNA又はDNA配列に結合することができる一本鎖核酸を有するアンチセンス又はセンスオ
リゴヌクレオチドである本明細書に記載されるタンパク質をコードする核酸の断片である
。
mRNA又はDNA配列に結合することができる一本鎖核酸を有するアンチセンス又はセンスオ
リゴヌクレオチドである本明細書に記載されるタンパク質をコードする核酸の断片である
。
本明細書に記載されるタンパク質をコードする核酸は、配列番号によって本明細書に開
示される核酸にハイブリダイズする核酸又は配列番号によって本明細書に開示されるアミ
ノ酸配列をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を含むことができる。ハイ
ブリダイゼーション条件は、当業者に周知である極めてストリンジェントな、中等度にス
トリンジェントな、又は低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば、
本明細書に記載されるものを含むことができる。
示される核酸にハイブリダイズする核酸又は配列番号によって本明細書に開示されるアミ
ノ酸配列をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を含むことができる。ハイ
ブリダイゼーション条件は、当業者に周知である極めてストリンジェントな、中等度にス
トリンジェントな、又は低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば、
本明細書に記載されるものを含むことができる。
ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド
が安定である条件を指す。当業者に知られているように、ハイブリダイズしたポリヌクレ
オチドの安定性は、ハイブリッドの融点(Tm)に反映される。一般に、ハイブリダイズした
ポリヌクレオチドの安定性は、塩濃度、例えば、ナトリウムイオン濃度と温度の関数であ
る。ハイブリダイゼーション反応をより低いストリンジェンシーの条件下で実施し、その
後、様々な、しかし、より高いストリンジェンシーで洗浄することができる。ハイブリダ
イゼーションストリンジェンシーへの言及は、そのような洗浄条件に関連する。極めてス
トリンジェントなハイブリダイゼーションは、0.018M NaCl中、65℃でハイブリダイズし
た安定なポリヌクレオチドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを許容する
条件を含み、例えば、ハイブリッドが、0.018M NaCl中、65℃で安定でない場合、それは
、本明細書で企図されるような、高ストリンジェンシー条件下で安定でない。高ストリン
ジェンシー条件は、例えば、50％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2％SDS
中、42℃でのハイブリダイゼーションと、その後の0.1×SSPE及び0.1％SDS中、65℃での
洗浄によって提供されることができる。極めてストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件以外のハイブリダイゼーション条件を用いて、本明細書に開示される核酸配列を説
明することもできる。例えば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションとい
う語句は、50％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2％SDS中、42℃でのハイ
ブリダイゼーションと、その後の0.2×SSPE、0.2％SDS中、42℃での洗浄と同等の条件を
指す。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションという語句は、10％ホルムアミド、
5×デンハルト溶液、6×SSPE、0.2％SDS中、22℃でのハイブリダイゼーションと、その後
の1×SSPE、0.2％SDS中、37℃での洗浄と同等の条件を指す。デンハルト溶液は、1％フィ
コール、1％ポリビニルピロリドン、及び1％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する。20×S
SPE(塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミド四酢酸(EDTA))は、3M塩化ナ
トリウム、0.2Mリン酸ナトリウム、及び0.025M(EDTA)を含有する。他の好適な低、中等度
、及び高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションバッファー及び条件は、当業者に
周知であり、例えば、Sambrookらの文献、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual)、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York(
2001);及びAusubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molec
ular Biology)、John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)に記載されている。
が安定である条件を指す。当業者に知られているように、ハイブリダイズしたポリヌクレ
オチドの安定性は、ハイブリッドの融点(Tm)に反映される。一般に、ハイブリダイズした
ポリヌクレオチドの安定性は、塩濃度、例えば、ナトリウムイオン濃度と温度の関数であ
る。ハイブリダイゼーション反応をより低いストリンジェンシーの条件下で実施し、その
後、様々な、しかし、より高いストリンジェンシーで洗浄することができる。ハイブリダ
イゼーションストリンジェンシーへの言及は、そのような洗浄条件に関連する。極めてス
トリンジェントなハイブリダイゼーションは、0.018M NaCl中、65℃でハイブリダイズし
た安定なポリヌクレオチドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを許容する
条件を含み、例えば、ハイブリッドが、0.018M NaCl中、65℃で安定でない場合、それは
、本明細書で企図されるような、高ストリンジェンシー条件下で安定でない。高ストリン
ジェンシー条件は、例えば、50％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2％SDS
中、42℃でのハイブリダイゼーションと、その後の0.1×SSPE及び0.1％SDS中、65℃での
洗浄によって提供されることができる。極めてストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件以外のハイブリダイゼーション条件を用いて、本明細書に開示される核酸配列を説
明することもできる。例えば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションとい
う語句は、50％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2％SDS中、42℃でのハイ
ブリダイゼーションと、その後の0.2×SSPE、0.2％SDS中、42℃での洗浄と同等の条件を
指す。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションという語句は、10％ホルムアミド、
5×デンハルト溶液、6×SSPE、0.2％SDS中、22℃でのハイブリダイゼーションと、その後
の1×SSPE、0.2％SDS中、37℃での洗浄と同等の条件を指す。デンハルト溶液は、1％フィ
コール、1％ポリビニルピロリドン、及び1％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する。20×S
SPE(塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミド四酢酸(EDTA))は、3M塩化ナ
トリウム、0.2Mリン酸ナトリウム、及び0.025M(EDTA)を含有する。他の好適な低、中等度
、及び高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションバッファー及び条件は、当業者に
周知であり、例えば、Sambrookらの文献、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual)、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York(
2001);及びAusubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molec
ular Biology)、John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)に記載されている。
本明細書に提供されるタンパク質をコードする核酸には、配列番号によって本明細書に
開示される核酸配列に対する特定のパーセント配列同一性を有するものが含まれる。例え
ば、核酸分子は、配列番号11から選択される配列に対する少なくとも95.0％、少なくとも
95.1％、少なくとも95.2％、少なくとも95.3％、少なくとも95.4％、少なくとも95.5％、
少なくとも95.6％、少なくとも95.7％、少なくとも95.8％、少なくとも95.9％、少なくと
も96.0％、少なくとも96.1％、少なくとも96.2％、少なくとも96.3％、少なくとも96.4％
、少なくとも96.5％、少なくとも96.6％、少なくとも96.7％、少なくとも96.8％、少なく
とも96.9％、少なくとも97.0％、少なくとも97.1％、少なくとも97.2％、少なくとも97.3
％、少なくとも97.4％、少なくとも97.5％、少なくとも97.6％、少なくとも97.7％、少な
くとも97.8％、少なくとも97.9％、少なくとも98.0％、少なくとも98.1％、少なくとも98
.2％、少なくとも98.3％、少なくとも98.4％、少なくとも98.5％、少なくとも98.6％、少
なくとも98.7％、少なくとも98.8％、少なくとも98.9％、少なくとも99.0％、少なくとも
99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、
少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、もしくは少なくとも99.8％の配列同一性を有する
ことができるか、又は配列番号11から選択される配列と同一である。
開示される核酸配列に対する特定のパーセント配列同一性を有するものが含まれる。例え
ば、核酸分子は、配列番号11から選択される配列に対する少なくとも95.0％、少なくとも
95.1％、少なくとも95.2％、少なくとも95.3％、少なくとも95.4％、少なくとも95.5％、
少なくとも95.6％、少なくとも95.7％、少なくとも95.8％、少なくとも95.9％、少なくと
も96.0％、少なくとも96.1％、少なくとも96.2％、少なくとも96.3％、少なくとも96.4％
、少なくとも96.5％、少なくとも96.6％、少なくとも96.7％、少なくとも96.8％、少なく
とも96.9％、少なくとも97.0％、少なくとも97.1％、少なくとも97.2％、少なくとも97.3
％、少なくとも97.4％、少なくとも97.5％、少なくとも97.6％、少なくとも97.7％、少な
くとも97.8％、少なくとも97.9％、少なくとも98.0％、少なくとも98.1％、少なくとも98
.2％、少なくとも98.3％、少なくとも98.4％、少なくとも98.5％、少なくとも98.6％、少
なくとも98.7％、少なくとも98.8％、少なくとも98.9％、少なくとも99.0％、少なくとも
99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、
少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、もしくは少なくとも99.8％の配列同一性を有する
ことができるか、又は配列番号11から選択される配列と同一である。
したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離された核酸は、
本明細書に開示されるH0メチニコビア属種のXYL1遺伝子の核酸配列を有する。したがって
、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、XYL1の核酸配列(配列番号1
1)を有する単離された核酸である。
本明細書に開示されるH0メチニコビア属種のXYL1遺伝子の核酸配列を有する。したがって
、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、XYL1の核酸配列(配列番号1
1)を有する単離された核酸である。
また本明細書に提供されるのは、メチニコビア種(例えば、H0メチニコビア属種)でポリ
ペプチドを発現させる方法であり、ここで、該ポリペプチドは、ロイシン(Leu; L)を含む
。そのような方法は、ポリペプチドをコードする外因性核酸配列を、該ポリペプチドの発
現を可能にする条件下で、メチニコビア種に導入することを含み、ここで、該外因性核酸
配列は、本明細書に例示されるように、ロイシンに対するCTGコドンの代わりに、CTT、CT
G、CTA、TTA、又はTTGコドンを有する。特定の実施態様において、CTGコドンの代わりの
コドンは、TTGである。コード核酸配列に対するそのような修飾を行う方法は、当技術分
野で周知である。
ペプチドを発現させる方法であり、ここで、該ポリペプチドは、ロイシン(Leu; L)を含む
。そのような方法は、ポリペプチドをコードする外因性核酸配列を、該ポリペプチドの発
現を可能にする条件下で、メチニコビア種に導入することを含み、ここで、該外因性核酸
配列は、本明細書に例示されるように、ロイシンに対するCTGコドンの代わりに、CTT、CT
G、CTA、TTA、又はTTGコドンを有する。特定の実施態様において、CTGコドンの代わりの
コドンは、TTGである。コード核酸配列に対するそのような修飾を行う方法は、当技術分
野で周知である。
また本明細書に提供されるのは、外因性核酸をメチニコビア種(例えば、H0メチニコビ
ア属種)に導入する方法である。そのような方法は、実施例Iに例示されているような改変
された酢酸リチウムプロトコル又はエレクトロポレーションプロトコルである。
ア属種)に導入する方法である。そのような方法は、実施例Iに例示されているような改変
された酢酸リチウムプロトコル又はエレクトロポレーションプロトコルである。
本発明の様々な実施態様の活性に実質的に影響を及ぼさない修飾も本明細書に提供され
る本発明の定義内に提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明
を例示するが、限定しないことが意図される。本出願の全体を通して、様々な刊行物が参
照されている。GenBank及びGI番号の公開を含む、これらの刊行物のその全体としての開
示は、本発明が関係する技術分野の現状をより完全に説明するために、本出願において、
引用により本明細書中に組み込まれる。
る本発明の定義内に提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明
を例示するが、限定しないことが意図される。本出願の全体を通して、様々な刊行物が参
照されている。GenBank及びGI番号の公開を含む、これらの刊行物のその全体としての開
示は、本発明が関係する技術分野の現状をより完全に説明するために、本出願において、
引用により本明細書中に組み込まれる。
(実施例I)
(H0メチニコビア属種のキシロースからのキシリトールの生産)
本実施例は、キシロースを含有するYEP培地中で培養したとき、H0メチニコビア属種が
キシロースからキシリトールを生産することを示している。
(H0メチニコビア属種のキシロースからのキシリトールの生産)
本実施例は、キシロースを含有するYEP培地中で培養したとき、H0メチニコビア属種が
キシロースからキシリトールを生産することを示している。
キシロースからのキシリトールの生産を、H0メチニコビア属種について、4％w/v又は10
％w/vキシロースが補充された酵母抽出物ペプトン(YEP)培地中でアッセイした。対照とし
て、出芽酵母のワイン酵母M2もアッセイした。
％w/vキシロースが補充された酵母抽出物ペプトン(YEP)培地中でアッセイした。対照とし
て、出芽酵母のワイン酵母M2もアッセイした。
H0メチニコビア属種の細胞を125mlフラスコ中の50mlのYEP＋4％w/v又は10％w/vキシロ
ース培地中に接種し、120rpmで振盪させながら、30℃インキュベーターで成長させた。1m
lの試料を培養物から採取し、細胞を遠心分離により除去した。上清を0.22μmナイロンシ
リンジフィルターに通して、HPLC試料バイアル中に濾過した。上清中のキシリトール含有
量を、水を移動相として0.6ml/分の速度で用いる80℃でのRezex RPM-単糖Pb＋2カラム(Ph
enomenex)上でのHPLCにより解析した。Agilent G1362A示差屈折率検出器(Agilent)でピー
クを検出した。
ース培地中に接種し、120rpmで振盪させながら、30℃インキュベーターで成長させた。1m
lの試料を培養物から採取し、細胞を遠心分離により除去した。上清を0.22μmナイロンシ
リンジフィルターに通して、HPLC試料バイアル中に濾過した。上清中のキシリトール含有
量を、水を移動相として0.6ml/分の速度で用いる80℃でのRezex RPM-単糖Pb＋2カラム(Ph
enomenex)上でのHPLCにより解析した。Agilent G1362A示差屈折率検出器(Agilent)でピー
クを検出した。
H0メチニコビア属種は、キシロース依存的経路を介してキシリトールを生産した。例え
ば、4％キシロース培地中で、H0メチニコビア属種は、5日間で約13.8g/Lのキシリトール
を40g/Lのキシロースから生産したのに対し、10％キシロース中では、それは、10日間で
約23g/Lのキシリトールを100g/Lのキシロースから生産した(図1)。キシロースが使い果た
されたとき、H0メチニコビア属種は、培地中のキシリトールを消費し始めた(図1)。両方
の培地中で、出芽酵母M2種は、キシリトールを生産しなかった(図1)。
ば、4％キシロース培地中で、H0メチニコビア属種は、5日間で約13.8g/Lのキシリトール
を40g/Lのキシロースから生産したのに対し、10％キシロース中では、それは、10日間で
約23g/Lのキシリトールを100g/Lのキシロースから生産した(図1)。キシロースが使い果た
されたとき、H0メチニコビア属種は、培地中のキシリトールを消費し始めた(図1)。両方
の培地中で、出芽酵母M2種は、キシリトールを生産しなかった(図1)。
(実施例II)
(キシリトール経路を有する組換えメチニコビア種の構築)
実施例Iに例示されているH0メチニコビア属種によるキシリトールの収率及び生産性を
増大させるために、キシリトール生産経路をH0メチニコビア属種ゲノム中で修飾した。こ
の修飾には、キシリトールデヒドロゲナーゼ(XDH; 配列番号1)をコードするXYL2遺伝子(
配列番号6)を欠失させること、及びキシロースレダクターゼ(XR; 配列番号11)をコードす
るXYL1遺伝子(配列番号19)を過剰発現させること、及びいくつかの実験においては、キシ
ローストランスポーター(GXF1;配列番号42、又はGXF2 配列番号44)を過剰発現させるこ
とが含まれた(図2)。細胞の代謝を支持し、キシロースレダクターゼのための酸化還元バ
ランスを供給するために、共基質を供給した(図2)。
(キシリトール経路を有する組換えメチニコビア種の構築)
実施例Iに例示されているH0メチニコビア属種によるキシリトールの収率及び生産性を
増大させるために、キシリトール生産経路をH0メチニコビア属種ゲノム中で修飾した。こ
の修飾には、キシリトールデヒドロゲナーゼ(XDH; 配列番号1)をコードするXYL2遺伝子(
配列番号6)を欠失させること、及びキシロースレダクターゼ(XR; 配列番号11)をコードす
るXYL1遺伝子(配列番号19)を過剰発現させること、及びいくつかの実験においては、キシ
ローストランスポーター(GXF1;配列番号42、又はGXF2 配列番号44)を過剰発現させるこ
とが含まれた(図2)。細胞の代謝を支持し、キシロースレダクターゼのための酸化還元バ
ランスを供給するために、共基質を供給した(図2)。
H0メチニコビア属種のキシリトール経路を改変するために、遺伝子操作用の選択マーカ
ーとして使用可能な抗真菌薬耐性遺伝子を同定する必要があった。まず、既知の様々な抗
真菌薬に対するH0メチニコビア属種の感受性を試験した。単一の酵母コロニーを、様々な
濃度の抗生物質(50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL、300ug/mL、350ug/
mL、400ug/mL、450ug/mL)を含有する5mlのYPDブロスに接種した。培養物を30℃で2日間好
気的に成長させ、600nmにおける培養物の光学密度をアッセイすることにより、成長をモ
ニタリングした。H0メチニコビア属種は、それぞれ、100ug/mLのノーセオスリシン(cloNA
T)、300ug/mLのハイグロマイシン、200ug/mLのフレオマイシン、及び400ug/mlのジェネテ
ィシンに感受性があると決定された。
ーとして使用可能な抗真菌薬耐性遺伝子を同定する必要があった。まず、既知の様々な抗
真菌薬に対するH0メチニコビア属種の感受性を試験した。単一の酵母コロニーを、様々な
濃度の抗生物質(50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL、300ug/mL、350ug/
mL、400ug/mL、450ug/mL)を含有する5mlのYPDブロスに接種した。培養物を30℃で2日間好
気的に成長させ、600nmにおける培養物の光学密度をアッセイすることにより、成長をモ
ニタリングした。H0メチニコビア属種は、それぞれ、100ug/mLのノーセオスリシン(cloNA
T)、300ug/mLのハイグロマイシン、200ug/mLのフレオマイシン、及び400ug/mlのジェネテ
ィシンに感受性があると決定された。
この感受性プロファイルに基づいて、出芽酵母で耐性を提供することが知られている遺
伝子－それぞれ、通常、ノーセオスリシン及びハイグロマイシンに対する耐性を提供する
natMX及びhphMX遺伝子をH0メチニコビア属種に導入した。しかしながら、natMX及びhphMX
遺伝子の導入は、生存可能なコロニーを生じさせなかった。H0メチニコビア属種は真菌CT
Gクレード種に属する可能性があると仮定された。このクレード種では、近縁種のC.ルシ
タニアエ(C.lusitaniae)と同じように(Youngらの文献、2000, Genetics, 155:17-29)、普
遍的なロイシンCUGコドンが主にセリンとして翻訳され、ロイシンとしては稀にしか翻訳
されない(Santosらの文献、2011, C.R. Bio., 334:607-611)。CTGコドンをロイシンコー
ド化のためにTTGに変更し(表4参照)、H0メチニコビア属種の全ゲノムアノテーションが利
用可能でないため、複数のH0メチニコビア属種オープンリーディングフレームから予測さ
れたコドン選好に基づいて、他のコドンを最適化した。
(表4: H0メチニコビア属種のコドン)
伝子－それぞれ、通常、ノーセオスリシン及びハイグロマイシンに対する耐性を提供する
natMX及びhphMX遺伝子をH0メチニコビア属種に導入した。しかしながら、natMX及びhphMX
遺伝子の導入は、生存可能なコロニーを生じさせなかった。H0メチニコビア属種は真菌CT
Gクレード種に属する可能性があると仮定された。このクレード種では、近縁種のC.ルシ
タニアエ(C.lusitaniae)と同じように(Youngらの文献、2000, Genetics, 155:17-29)、普
遍的なロイシンCUGコドンが主にセリンとして翻訳され、ロイシンとしては稀にしか翻訳
されない(Santosらの文献、2011, C.R. Bio., 334:607-611)。CTGコドンをロイシンコー
ド化のためにTTGに変更し(表4参照)、H0メチニコビア属種の全ゲノムアノテーションが利
用可能でないため、複数のH0メチニコビア属種オープンリーディングフレームから予測さ
れたコドン選好に基づいて、他のコドンを最適化した。
(表4: H0メチニコビア属種のコドン)
コドンが最適化された抗生物質の遺伝子配列は、次の通りであった:
改変された酢酸リチウムプロトコル(以下で論じられている)を用いて、PGK1、ADH1、及
びTEFプロモーター並びにPGK1ターミネーターの制御下の新しい抗ノーセオスリシン遺伝
子(メチニコビアnatMX4を表す、MeNATと命名)(図3)をH0メチニコビア属種に入れて高効率
で形質転換し、ノーセオスリシン耐性コロニーを生じさせることに成功した。同じプロト
コルを用いて、様々なプロモーター及びターミネーターの制御下のコドン最適化された抗
ハイグロマイシン遺伝子(MeHPH)、抗ジェネティシン遺伝子(MeKAN)、及び抗フレオマイシ
ン遺伝子(MeBLE)(図3)を作製し、H0メチニコビア属種に入れて形質転換し、対応する耐性
コロニーを生じさせることに成功した。マーカー遺伝子発現カセットの両側には、相同組
換えによる特異的なゲノム組込みのためのH0メチニコビア属種遺伝子配列が配置されてい
た(図3)。隣接する配列の長さは、組込みの効率に影響を及ぼした。H0メチニコビア属種
における相同組換えには、少なくとも200塩基のヌクレオチドが必要とされる。
びTEFプロモーター並びにPGK1ターミネーターの制御下の新しい抗ノーセオスリシン遺伝
子(メチニコビアnatMX4を表す、MeNATと命名)(図3)をH0メチニコビア属種に入れて高効率
で形質転換し、ノーセオスリシン耐性コロニーを生じさせることに成功した。同じプロト
コルを用いて、様々なプロモーター及びターミネーターの制御下のコドン最適化された抗
ハイグロマイシン遺伝子(MeHPH)、抗ジェネティシン遺伝子(MeKAN)、及び抗フレオマイシ
ン遺伝子(MeBLE)(図3)を作製し、H0メチニコビア属種に入れて形質転換し、対応する耐性
コロニーを生じさせることに成功した。マーカー遺伝子発現カセットの両側には、相同組
換えによる特異的なゲノム組込みのためのH0メチニコビア属種遺伝子配列が配置されてい
た(図3)。隣接する配列の長さは、組込みの効率に影響を及ぼした。H0メチニコビア属種
における相同組換えには、少なくとも200塩基のヌクレオチドが必要とされる。
H0メチニコビア属種を形質転換するために、改変された酢酸リチウムプロトコル及びエ
レクトロポレーションプロトコルを開発した。改変された酢酸リチウムプロトコルは、以
下の工程を含んだ:
1.単一のコロニーをYPDブロスに接種し、30℃で一晩成長させる。
2.酵母細胞をOD600＝0.4までYPDに希釈し、OD600＝1.5～1.8まで、もう2世代の間(5～6
時間)、成長させる。
3.各々の形質転換について、5～10 ODの細胞を収集し、それを200μlの前処理溶液(0.1
M酢酸リチウム、1×TE pH7.5、及び10mM DTT)に再懸濁させる。細胞を振盪させながら30
℃で1時間インキュベートする。
4.細胞を13000rpmで1.5分間の遠心分離によって収集する。細胞を500μlの冷滅菌水で
洗浄し、細胞を13000rpmで1.5分間の遠心分離によって収集する。このとき、細胞は形質
転換の準備が整っており、4℃で数時間保存することができる。
5.各々の形質転換について、以下の混合物を調製し、細胞に添加する:
50％PEG: 240μl
1M酢酸リチウム: 36μl
形質転換されるDNA: 1～4μg
10mg/ml精子DNA 10μl
滅菌H2Oを添加する: 360μl
6. 1分間ボルテックス処理することにより、細胞を激しく混合する。
7.細胞を、振盪させないで、30℃で30分間インキュベートする。
8.細胞に、42℃で20～25分間、熱ショックを与える。
9.細胞を収集し、それを1mlのYPDブロスに再懸濁させる。
10.細胞を振盪させながら30℃で1時間インキュベートする(その後、工程11～14が続く)
か、又は細胞を振盪させながら30℃で6時間インキュベートし、細胞を収集し、それを200
μlのdH2Oに再懸濁させ、100μlの細胞を選択プレートに直接プレーティングし、30℃で2
～3日間インキュベートする。
11.細胞を収集し、200μlのdH2Oに再懸濁させる。
12. 100μlの細胞をYPDプレートにプレーティングし、30℃で一晩インキュベートする
。(必要ならば、2回目のプレーティングのために、残りの100μlの細胞を4℃で取ってお
く)。
13.細胞を選択プレートにレプリカプレーティングする。
14. 30℃で2～3日間インキュベートする。
15.複数の抗生物質遺伝子カセットを形質転換する場合、選択プレートは、YPD＋100ug/
mLノーセオスリシン(cloNAT)、又は300ug/mLハイグロマイシン、又は200ug/mLフレオマイ
シン、又は400ug/mlジェネティシン、又はこれらの抗生物質の組合せであることができる
。
レクトロポレーションプロトコルを開発した。改変された酢酸リチウムプロトコルは、以
下の工程を含んだ:
1.単一のコロニーをYPDブロスに接種し、30℃で一晩成長させる。
2.酵母細胞をOD600＝0.4までYPDに希釈し、OD600＝1.5～1.8まで、もう2世代の間(5～6
時間)、成長させる。
3.各々の形質転換について、5～10 ODの細胞を収集し、それを200μlの前処理溶液(0.1
M酢酸リチウム、1×TE pH7.5、及び10mM DTT)に再懸濁させる。細胞を振盪させながら30
℃で1時間インキュベートする。
4.細胞を13000rpmで1.5分間の遠心分離によって収集する。細胞を500μlの冷滅菌水で
洗浄し、細胞を13000rpmで1.5分間の遠心分離によって収集する。このとき、細胞は形質
転換の準備が整っており、4℃で数時間保存することができる。
5.各々の形質転換について、以下の混合物を調製し、細胞に添加する:
50％PEG: 240μl
1M酢酸リチウム: 36μl
形質転換されるDNA: 1～4μg
10mg/ml精子DNA 10μl
滅菌H2Oを添加する: 360μl
6. 1分間ボルテックス処理することにより、細胞を激しく混合する。
7.細胞を、振盪させないで、30℃で30分間インキュベートする。
8.細胞に、42℃で20～25分間、熱ショックを与える。
9.細胞を収集し、それを1mlのYPDブロスに再懸濁させる。
10.細胞を振盪させながら30℃で1時間インキュベートする(その後、工程11～14が続く)
か、又は細胞を振盪させながら30℃で6時間インキュベートし、細胞を収集し、それを200
μlのdH2Oに再懸濁させ、100μlの細胞を選択プレートに直接プレーティングし、30℃で2
～3日間インキュベートする。
11.細胞を収集し、200μlのdH2Oに再懸濁させる。
12. 100μlの細胞をYPDプレートにプレーティングし、30℃で一晩インキュベートする
。(必要ならば、2回目のプレーティングのために、残りの100μlの細胞を4℃で取ってお
く)。
13.細胞を選択プレートにレプリカプレーティングする。
14. 30℃で2～3日間インキュベートする。
15.複数の抗生物質遺伝子カセットを形質転換する場合、選択プレートは、YPD＋100ug/
mLノーセオスリシン(cloNAT)、又は300ug/mLハイグロマイシン、又は200ug/mLフレオマイ
シン、又は400ug/mlジェネティシン、又はこれらの抗生物質の組合せであることができる
。
エレクトロポレーションプロトコルは、以下の工程を含んだ:
1.単一のコロニーをYPDブロスに接種し、30℃で一晩成長させる。
2.酵母細胞をOD600＝0.4までYPDに希釈し、OD600＝1.5～1.8まで、もう2世代の間(5～6
時間)、成長させる。
3. 5～10 ODの細胞を収集し、水で洗浄し、細胞を200μlのLiAC-TE-DTT溶液(0.1M酢酸
リチウム、1×TE pH7.5、及び10mM DTT)で処理する。細胞を振盪させながら30℃で1時間
インキュベートする。
4.細胞を200μlの1M冷ソルビトールで洗浄し、それを50μlの1M冷ソルビトールに再懸
濁させる。
5.細胞を5μl DNA(1～3μg)と混合する。
6.該混合物を0.2cmの冷えたエレクトロポレーションキュベットの底に添加する。細胞
を1.8kV、25μF、200Ωでエレクトロポレートする。
7.直後に、1Mソルビトールを含有する1mlの冷YPDブロスを添加する。30℃で1時間回復
させる。
8.細胞を収集し、それを200μlの1Mソルビトールに再懸濁させる。
9. 100μlの細胞をYPD寒天プレートにプレーティングし、該プレートを30℃で一晩イン
キュベートする。(必要ならば、2回目のプレーティングのために、残りの100μlの細胞を
4℃で取っておく)。
10.細胞を選択プレートにレプリカ処理し、30℃で2～3日間インキュベートする。
1.単一のコロニーをYPDブロスに接種し、30℃で一晩成長させる。
2.酵母細胞をOD600＝0.4までYPDに希釈し、OD600＝1.5～1.8まで、もう2世代の間(5～6
時間)、成長させる。
3. 5～10 ODの細胞を収集し、水で洗浄し、細胞を200μlのLiAC-TE-DTT溶液(0.1M酢酸
リチウム、1×TE pH7.5、及び10mM DTT)で処理する。細胞を振盪させながら30℃で1時間
インキュベートする。
4.細胞を200μlの1M冷ソルビトールで洗浄し、それを50μlの1M冷ソルビトールに再懸
濁させる。
5.細胞を5μl DNA(1～3μg)と混合する。
6.該混合物を0.2cmの冷えたエレクトロポレーションキュベットの底に添加する。細胞
を1.8kV、25μF、200Ωでエレクトロポレートする。
7.直後に、1Mソルビトールを含有する1mlの冷YPDブロスを添加する。30℃で1時間回復
させる。
8.細胞を収集し、それを200μlの1Mソルビトールに再懸濁させる。
9. 100μlの細胞をYPD寒天プレートにプレーティングし、該プレートを30℃で一晩イン
キュベートする。(必要ならば、2回目のプレーティングのために、残りの100μlの細胞を
4℃で取っておく)。
10.細胞を選択プレートにレプリカ処理し、30℃で2～3日間インキュベートする。
次に、XYL2遺伝子の欠失を実施した。例示的な欠失戦略は、図4に示されている。簡潔
に述べると、XYL2のオープンリーディングフレーム(ORF)の最初の309ntを、XYL2の上流及
び下流配列に相同な配列が両側に配置された抗真菌薬耐性遺伝子カセットに置き換えた。
に述べると、XYL2のオープンリーディングフレーム(ORF)の最初の309ntを、XYL2の上流及
び下流配列に相同な配列が両側に配置された抗真菌薬耐性遺伝子カセットに置き換えた。
その後、XYL1遺伝子の過剰発現をxyl2欠失株に導入した。H0メチニコビア属種由来のキ
シロースレダクターゼ遺伝子(XYL1)ORF(配列番号19)をPGK1プロモーター及びターミネー
ターに連結させた。このXYL1発現カセットを上で論じられているXYL2欠失カセットに挿入
した(図5)。
シロースレダクターゼ遺伝子(XYL1)ORF(配列番号19)をPGK1プロモーター及びターミネー
ターに連結させた。このXYL1発現カセットを上で論じられているXYL2欠失カセットに挿入
した(図5)。
全てのH0メチニコビア属種遺伝子配列を、New England Biolabs製のQ5高忠実度DNAポリ
メラーゼを使用することにより、H0メチニコビア属種の酵母ゲノムDNAからPCRによって増
幅させた。プライマーを、M.フルクチコラ277の全ゲノムショットガンコンティグ(ANFW01
000000)及びH0メチニコビア属種の全ゲノムショットガンコンティグを用いる配列相同性
検索によって設計した。H0メチニコビア属種のゲノムから増幅され、かつ上で論じられ、
図3～5に示された欠失及び過剰発現カセット構築のために使用された配列は、次の通りで
あった:
メラーゼを使用することにより、H0メチニコビア属種の酵母ゲノムDNAからPCRによって増
幅させた。プライマーを、M.フルクチコラ277の全ゲノムショットガンコンティグ(ANFW01
000000)及びH0メチニコビア属種の全ゲノムショットガンコンティグを用いる配列相同性
検索によって設計した。H0メチニコビア属種のゲノムから増幅され、かつ上で論じられ、
図3～5に示された欠失及び過剰発現カセット構築のために使用された配列は、次の通りで
あった:
TEFプロモーター及びターミネーター配列は、プラスミドpUG6から増幅された(Guldener
らの文献、1996, Nucleic Acids res., 24:2519-2524)。
らの文献、1996, Nucleic Acids res., 24:2519-2524)。
(実施例III)
(セロビオースを共基質として用いる組換えメチニコビア種によるキシロースからのキシ
リトールの生産)
本実施例は、キシリトール経路を有する組換えメチニコビア種が、キシロース及びセロ
ビオースとともに培養したとき、キシロースからのキシリトールの生産を増大させること
を示している。
(セロビオースを共基質として用いる組換えメチニコビア種によるキシロースからのキシ
リトールの生産)
本実施例は、キシリトール経路を有する組換えメチニコビア種が、キシロース及びセロ
ビオースとともに培養したとき、キシロースからのキシリトールの生産を増大させること
を示している。
キシリトールデヒドロゲナーゼ不活化株は、キシロースを唯一の炭素源として有する培
地中で成長することができない(データは示さない)。それゆえに、いくつかの異なる共基
質をスクリーニングし、セロビオースが共基質として良好に作用することが分かった(デ
ータは示さない)。
地中で成長することができない(データは示さない)。それゆえに、いくつかの異なる共基
質をスクリーニングし、セロビオースが共基質として良好に作用することが分かった(デ
ータは示さない)。
野生型H0メチニコビア属種、xyl2欠失株、及びxyl2欠失＋XYL1過剰発現株を、OD600＝
～10まで、YPD中、30℃で予め成長させた。細胞(120 OD)を収集し、15mlの試験管中の6ml
のキシロース＋セロビオース培地溶液に再度接種し、150rpm/分のスピードのローテータ
ーで30℃でインキュベートした。培地は、それぞれ、4％、6％、8％、及び10％(w/v)のキ
シロース＋半分の量のセルビオース(cellubiose)を含有していた。600μLの試料を解析用
に毎回採取し、酵母細胞を遠心分離によって除去した。上清を2μmシリンジフィルターを
用いて濾過し、4μlをHPLCによって解析して、キシロース、セロビオース、及びキシリト
ールを定量した。
～10まで、YPD中、30℃で予め成長させた。細胞(120 OD)を収集し、15mlの試験管中の6ml
のキシロース＋セロビオース培地溶液に再度接種し、150rpm/分のスピードのローテータ
ーで30℃でインキュベートした。培地は、それぞれ、4％、6％、8％、及び10％(w/v)のキ
シロース＋半分の量のセルビオース(cellubiose)を含有していた。600μLの試料を解析用
に毎回採取し、酵母細胞を遠心分離によって除去した。上清を2μmシリンジフィルターを
用いて濾過し、4μlをHPLCによって解析して、キシロース、セロビオース、及びキシリト
ールを定量した。
3つの株は全て、若干のキシロースを消費したが、xyl2欠失株(xyl2Δ/xyl2Δ)は、最小
量のキシロースを消費し、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せると(xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ
::XYL1↑)、H0メチニコビア属種が8％キシロース及び4％セロビオースで最も効率的にキ
シロースを消費するようになった(図6A)。
量のキシロースを消費し、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せると(xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ
::XYL1↑)、H0メチニコビア属種が8％キシロース及び4％セロビオースで最も効率的にキ
シロースを消費するようになった(図6A)。
野生型H0メチニコビア属種については、キシリトール濃度が増加し、その後、時間経過
に沿って減少した。これは、野生型H0メチニコビア属種が、キシロースレダクターゼによ
ってキシロースをキシリトールに変換し、同時にキシリトールデヒドロゲナーゼによって
キシリトールからキシルロースへと脱水素した証拠である(図6B)。H0メチニコビア属種の
野生型酵母によって生産されたキシリトールの最大量は、4％キシロースから3日間で1.45
％、6％キシロースから4日間で2.76％、8％キシロースから5日間で4.23％、及び10％から
6日間で5.63％であった(図6A及び6B)。xyl2欠失株によって8日間で生産されたキシリトー
ルの最大量は、4％キシロースから4％、6％キシロースから4.4％、8％キシロースから2.3
5％、及び10％キシロースから1.25％であり、一方、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せた
株によって8日間で生産されたキシリトールの最大量は、4％キシロースから4％、6％キシ
ロースから6％、8％キシロースから8％、及び10％キシロースから5.1％であった。
に沿って減少した。これは、野生型H0メチニコビア属種が、キシロースレダクターゼによ
ってキシロースをキシリトールに変換し、同時にキシリトールデヒドロゲナーゼによって
キシリトールからキシルロースへと脱水素した証拠である(図6B)。H0メチニコビア属種の
野生型酵母によって生産されたキシリトールの最大量は、4％キシロースから3日間で1.45
％、6％キシロースから4日間で2.76％、8％キシロースから5日間で4.23％、及び10％から
6日間で5.63％であった(図6A及び6B)。xyl2欠失株によって8日間で生産されたキシリトー
ルの最大量は、4％キシロースから4％、6％キシロースから4.4％、8％キシロースから2.3
5％、及び10％キシロースから1.25％であり、一方、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せた
株によって8日間で生産されたキシリトールの最大量は、4％キシロースから4％、6％キシ
ロースから6％、8％キシロースから8％、及び10％キシロースから5.1％であった。
理論によって束縛されるものではないが、高すぎる濃度のキシロースは、キシロースか
らのキシリトールの生産を阻害するように思われた。例えば、xyl2欠失株は、4％キシロ
ース培地中で全てのキシロースをキシリトールに変換したが、6％キシロースから4.4％、
8％キシロースから2.35％、及び10％キシロースから1.25％しか、キシリトールに変換し
なかった(図6A及び6B)。また、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せたものは、80g/Lのキシ
ロースから6日間で79.5g/Lのキシリトールを生産し、そのため、変換率は、0.99gキシリ
トール/gキシロースであり、容量生産性は0.55g/L/hであった(図6B)。しかしながら、10
％キシロース培地では、同じ株が6日間で半分の量のキシロースをキシリトール(5.1％)に
変換するに過ぎなかった。したがって、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せると、H0メチニ
コビア属種が、セロビオースを共基質として用いて、最大8％のキシロースでキシリトー
ル生産において良好に作用するようになった(図6B)。
らのキシリトールの生産を阻害するように思われた。例えば、xyl2欠失株は、4％キシロ
ース培地中で全てのキシロースをキシリトールに変換したが、6％キシロースから4.4％、
8％キシロースから2.35％、及び10％キシロースから1.25％しか、キシリトールに変換し
なかった(図6A及び6B)。また、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せたものは、80g/Lのキシ
ロースから6日間で79.5g/Lのキシリトールを生産し、そのため、変換率は、0.99gキシリ
トール/gキシロースであり、容量生産性は0.55g/L/hであった(図6B)。しかしながら、10
％キシロース培地では、同じ株が6日間で半分の量のキシロースをキシリトール(5.1％)に
変換するに過ぎなかった。したがって、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せると、H0メチニ
コビア属種が、セロビオースを共基質として用いて、最大8％のキシロースでキシリトー
ル生産において良好に作用するようになった(図6B)。
セロビオース代謝は、野生型H0メチニコビア属種で抑制されたが、他の組換えH0メチニ
コビア属種株によって、キシロースレダクターゼの活性を支持するために利用された(図6
C)。培地中にセロビオースが残っていることから、添加されるセロビオースが多すぎたこ
とが示される。
コビア属種株によって、キシロースレダクターゼの活性を支持するために利用された(図6
C)。培地中にセロビオースが残っていることから、添加されるセロビオースが多すぎたこ
とが示される。
セロビオースとキシロースの比を1:2から1:3及び1:4に低下させ、1:3(8％キシロースに
つき2.4％セロビオース)でより良好に作用することが分かった。これらの実験を50ml培養
物中の8％キシロース＋2.4％セロビオース中で繰り返した。XYL1の過剰発現をxyl2欠失と
併せたH0メチニコビア属種株は、5日間で80g/Lのキシロースから77.7g/Lのキシリトール
を生産し、0.97g/gのキシロースのキシリトール収率及び0.65g/L/hの生産性であった(図7
)。
つき2.4％セロビオース)でより良好に作用することが分かった。これらの実験を50ml培養
物中の8％キシロース＋2.4％セロビオース中で繰り返した。XYL1の過剰発現をxyl2欠失と
併せたH0メチニコビア属種株は、5日間で80g/Lのキシロースから77.7g/Lのキシリトール
を生産し、0.97g/gのキシロースのキシリトール収率及び0.65g/L/hの生産性であった(図7
)。
したがって、H0メチニコビア属種におけるXYL2遺伝子の欠失及びXYL1遺伝子の過剰発現
は、セロビオースを共基質として用いて、キシリトールの生産を0.97～0.99g/gのキシロ
ースの収率及び0.55～0.65g/L/hの生産性まで増大させた。XYL2遺伝子の欠失及びXYL1遺
伝子の過剰発現を有する組換えH0メチニコビア属種を使用することの1つのさらなる利点
は、生産用培地がキシロースとセロビオースと水のみからなっていることであり、これに
より、簡単な精製及び費用効率の高い生産が可能になる。
は、セロビオースを共基質として用いて、キシリトールの生産を0.97～0.99g/gのキシロ
ースの収率及び0.55～0.65g/L/hの生産性まで増大させた。XYL2遺伝子の欠失及びXYL1遺
伝子の過剰発現を有する組換えH0メチニコビア属種を使用することの1つのさらなる利点
は、生産用培地がキシロースとセロビオースと水のみからなっていることであり、これに
より、簡単な精製及び費用効率の高い生産が可能になる。
(実施例IV)
(ガラクトースを共基質として用いる組換えメチニコビア種によるキシロースからのキシ
リトールの生産)
本実施例は、共基質としてのガラクトースの使用がキシリトール経路を有する組換えメ
チニコビア種におけるキシリトールの生産を顕著に増強することを示している。
(ガラクトースを共基質として用いる組換えメチニコビア種によるキシロースからのキシ
リトールの生産)
本実施例は、共基質としてのガラクトースの使用がキシリトール経路を有する組換えメ
チニコビア種におけるキシリトールの生産を顕著に増強することを示している。
野生型H0メチニコビア属種、xyl2欠失株、及びxyl2欠失＋XYL1過剰発現株を、YPD中、3
0℃で、OD600＝～10まで予め成長させた。細胞(120 OD)を収集し、15mlの試験管中の6ml
の培地に再度接種し、150rpm/分のスピードのローテーターで30℃で成長させた。培地は
、それぞれ、10％、12％、14％、16％、18％、及び20％(w/v)のキシロース＋5分の1量の
ガラクトースを含有していた。600μLの試料を毎日採取し、細胞を遠心分離によって除去
した。上清を2μmシリンジフィルターによって濾過し、4μlをHPLCに適用して、キシロー
ス、セロビオース、及びキシリトールを定量した。
0℃で、OD600＝～10まで予め成長させた。細胞(120 OD)を収集し、15mlの試験管中の6ml
の培地に再度接種し、150rpm/分のスピードのローテーターで30℃で成長させた。培地は
、それぞれ、10％、12％、14％、16％、18％、及び20％(w/v)のキシロース＋5分の1量の
ガラクトースを含有していた。600μLの試料を毎日採取し、細胞を遠心分離によって除去
した。上清を2μmシリンジフィルターによって濾過し、4μlをHPLCに適用して、キシロー
ス、セロビオース、及びキシリトールを定量した。
ガラクトースを共基質として用いることにより、10日以内に、生産されたキシリトール
の最大量は、xyl2欠失＋XYL1過剰発現によって、12％キシロース培地から得られた(図8、
H0＝野生型; H091＝xyl2Δ/xyl2Δ; H4316＝xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)。xyl2欠失
＋XYL1過剰発現株(H4316)は、200g/Lを超えるキシリトールを生産し、0.98g/gの収率及び
0.53g/L/hの生産性であった。
の最大量は、xyl2欠失＋XYL1過剰発現によって、12％キシロース培地から得られた(図8、
H0＝野生型; H091＝xyl2Δ/xyl2Δ; H4316＝xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)。xyl2欠失
＋XYL1過剰発現株(H4316)は、200g/Lを超えるキシリトールを生産し、0.98g/gの収率及び
0.53g/L/hの生産性であった。
12％キシロース＋4％ガラクトースを用いるさらなる実験は、xyl2欠失株(H091)が6日間
で7.6％のキシリトールを生産し、一方、xyl2欠失＋XYL1過剰発現株(H4316)が6日間で120
gのキシロースから113gのキシリトールを生産したことを示し(図9)、これは、セロビオー
スを共基質として用いる改変出芽酵母株による以前に報告された93g/Lのキシリトール生
産を超えた(Ohらの文献、2013, Metab. Eng., 15:226-234)。
で7.6％のキシリトールを生産し、一方、xyl2欠失＋XYL1過剰発現株(H4316)が6日間で120
gのキシロースから113gのキシリトールを生産したことを示し(図9)、これは、セロビオー
スを共基質として用いる改変出芽酵母株による以前に報告された93g/Lのキシリトール生
産を超えた(Ohらの文献、2013, Metab. Eng., 15:226-234)。
キシロースからのキシリトールの生産は、流加法での改変培地の使用によってさらに増
大した。野生型H0メチニコビア属種、xyl2欠失株、及びxyl2欠失＋XYL1過剰発現株を、YP
D中、30℃で一晩、前培養し、細胞(30 OD)を収集し、15mlの試験管中の4ml H2Oに懸濁さ
せた。2mlの培地(24％キシロース、8％ガラクトース、0.5％酵母抽出物、1％ペプトン、0
.05％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.05％(NH4)2SO4、及び1％グルコース)を添加し、試験管を3
0℃で150rpmのスピードの回転ドラムでインキュベートした。500μlの試料をHPLC分析用
に採取した。2日目から始めて10日目まで、500μlの生産用培地をサンプリング後に毎日
添加した。以前の研究に準拠して、8％キシロースを培地中の初期濃度として使用し、0.5
mlの培地を2日目～10日目まで毎日添加して(流加)、キシロースレベルを3％超かつ8％未
満に維持した。
大した。野生型H0メチニコビア属種、xyl2欠失株、及びxyl2欠失＋XYL1過剰発現株を、YP
D中、30℃で一晩、前培養し、細胞(30 OD)を収集し、15mlの試験管中の4ml H2Oに懸濁さ
せた。2mlの培地(24％キシロース、8％ガラクトース、0.5％酵母抽出物、1％ペプトン、0
.05％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.05％(NH4)2SO4、及び1％グルコース)を添加し、試験管を3
0℃で150rpmのスピードの回転ドラムでインキュベートした。500μlの試料をHPLC分析用
に採取した。2日目から始めて10日目まで、500μlの生産用培地をサンプリング後に毎日
添加した。以前の研究に準拠して、8％キシロースを培地中の初期濃度として使用し、0.5
mlの培地を2日目～10日目まで毎日添加して(流加)、キシロースレベルを3％超かつ8％未
満に維持した。
上記の実験は、少量のグルコース及び他の栄養素の添加により、野生型H0メチニコビア
属種及び両方の組換えH0メチニコビア属種株が、キシロースを連続的に消費し、キシリト
ールを生産することができることを示した(図10A～10C)。野生型H0メチニコビア属種は、
16日間で8.1％のキシリトールを生産し、一方、xyl2欠失突然変異体(H091)は、16日間で2
0.3％キシリトールを生産し、0.98g/gの収率及び0.53g/L/hの生産性であった。XYL1の過
剰発現＋xyl2欠失(H4316)は、xyl2欠失突然変異体と同様のキシリトール生産を示した。1
7日後、約0.8％のキシロースと1.3％のガラクトースがxyl2欠失株によって培地中に残さ
れており、このことは、ガラクトースをさらに低下させることができることを示している
。
属種及び両方の組換えH0メチニコビア属種株が、キシロースを連続的に消費し、キシリト
ールを生産することができることを示した(図10A～10C)。野生型H0メチニコビア属種は、
16日間で8.1％のキシリトールを生産し、一方、xyl2欠失突然変異体(H091)は、16日間で2
0.3％キシリトールを生産し、0.98g/gの収率及び0.53g/L/hの生産性であった。XYL1の過
剰発現＋xyl2欠失(H4316)は、xyl2欠失突然変異体と同様のキシリトール生産を示した。1
7日後、約0.8％のキシロースと1.3％のガラクトースがxyl2欠失株によって培地中に残さ
れており、このことは、ガラクトースをさらに低下させることができることを示している
。
キシロースからのキシリトールの生産は、固形キシロースの再補給によってさらに増大
した。野生型H0メチニコビア属種及びxyl2欠失株を、YPD中、30℃で一晩、前培養し、細
胞(30 OD)を収集し、125mlフラスコ中の20mlの水に懸濁させた。10mlの培地(24％キシロ
ース、8％ガラクトース、0.5％酵母抽出物、1％ペプトン、0.05％KH2PO4、0.05％MgSO4、
0.05％(NH4)2SO4、及び1％グルコース)を添加し、フラスコを、120rpmで振盪させながら
、30℃インキュベーター中でインキュベートした。600μlの試料をHPLC分析用に採取して
、培地中のキシロース含有量をモニタリングした。上記の培地と同じ比率のキシロース粉
末及び他の栄養素を5回フラスコに添加して、キシロース濃度を2％～10％に維持した。
した。野生型H0メチニコビア属種及びxyl2欠失株を、YPD中、30℃で一晩、前培養し、細
胞(30 OD)を収集し、125mlフラスコ中の20mlの水に懸濁させた。10mlの培地(24％キシロ
ース、8％ガラクトース、0.5％酵母抽出物、1％ペプトン、0.05％KH2PO4、0.05％MgSO4、
0.05％(NH4)2SO4、及び1％グルコース)を添加し、フラスコを、120rpmで振盪させながら
、30℃インキュベーター中でインキュベートした。600μlの試料をHPLC分析用に採取して
、培地中のキシロース含有量をモニタリングした。上記の培地と同じ比率のキシロース粉
末及び他の栄養素を5回フラスコに添加して、キシロース濃度を2％～10％に維持した。
上記の実験は、固形キシロースを培地に添加すると、野生型H0メチニコビア属種及びxy
l2欠失株がキシロースを連続的に消費し、20日間で、それぞれ、17％(w/v)及び27％(w/v)
を超えるキシリトールを生産することができることをを示した(図11)。
l2欠失株がキシロースを連続的に消費し、20日間で、それぞれ、17％(w/v)及び27％(w/v)
を超えるキシリトールを生産することができることをを示した(図11)。
上記のことに基づいて、ガラクトースを共基質として用いて、さらなるキシロースを含
む栄養素を添加して、XYL2欠失H0メチニコビア属種を用いることにより、27％を上回るキ
シリトールが0.56g/L/hの生産性で得られた。
む栄養素を添加して、XYL2欠失H0メチニコビア属種を用いることにより、27％を上回るキ
シリトールが0.56g/L/hの生産性で得られた。
ガラクトースは、海洋バイオマス、とりわけ、紅海藻に最も豊富に存在する糖のうちの
1つである。したがって、海洋バイオマスは、キシリトールの生産のための魅力的な再生
可能源である。したがって、本実施例に記載されている方法を用いて、海洋バイオマスを
利用して、キシロースをキシリトールに変換するキシリトール経路を有する組換えメチニ
コビア種により、キシリトールを生産することができる。
1つである。したがって、海洋バイオマスは、キシリトールの生産のための魅力的な再生
可能源である。したがって、本実施例に記載されている方法を用いて、海洋バイオマスを
利用して、キシロースをキシリトールに変換するキシリトール経路を有する組換えメチニ
コビア種により、キシリトールを生産することができる。
(実施例V)
(キシローストランスポーターを過剰発現することによるキシロースからのキシリトール
の生産の増大)
本実施例は、キシリトール経路を有する組換えメチニコビア種へのキシロースの輸送を
増大させることが、キシリトールの生産のスピードを上げることができることを示してい
る。
(キシローストランスポーターを過剰発現することによるキシロースからのキシリトール
の生産の増大)
本実施例は、キシリトール経路を有する組換えメチニコビア種へのキシロースの輸送を
増大させることが、キシリトールの生産のスピードを上げることができることを示してい
る。
この株は、H0メチニコビア属種の野生型株のXYL2の一方のコピーをGXF1-XYl1過剰発現
カセット(XYL2p-MeHPH-TEF1t-TPIp-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1-XYL2t)又はGXF2-XYL1過剰発
現カセット((XYL2p-MeHPH-TEF1t-TPIp-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1-XYL2t)と置き換えること
により構築された。XYL2のもう一方のコピーは、野生型のまま保持するか又はADH1p-MeNA
T-PGK1tカセットに置き換えた。
カセット(XYL2p-MeHPH-TEF1t-TPIp-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1-XYL2t)又はGXF2-XYL1過剰発
現カセット((XYL2p-MeHPH-TEF1t-TPIp-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1-XYL2t)と置き換えること
により構築された。XYL2のもう一方のコピーは、野生型のまま保持するか又はADH1p-MeNA
T-PGK1tカセットに置き換えた。
H0メチニコビア属種の野生型株、xyl2欠失株、及びトランスポーター-キシロースレダ
クターゼ過剰発現をxyl2欠失と併せた株をYPD培地中で予め成長させた。酵母細胞を収集
し、6mlのYPキシロース(8％)培地＋共基質としての4％ガラクトース又は4％セロビオース
又は4％グリセロールに再懸濁させた。600μlの試料をHPLC分析用に採取して、キシロー
スの消費及びキシリトールの生産を測定した。
クターゼ過剰発現をxyl2欠失と併せた株をYPD培地中で予め成長させた。酵母細胞を収集
し、6mlのYPキシロース(8％)培地＋共基質としての4％ガラクトース又は4％セロビオース
又は4％グリセロールに再懸濁させた。600μlの試料をHPLC分析用に採取して、キシロー
スの消費及びキシリトールの生産を測定した。
上記の実験は、キシロース及び共基質のガラクトース(図12A)又はセロビオース(図12B)
もしくはグリセロール(図12C)を有する培地中で培養したとき、xyl2欠失＋XYL1過剰発現
株におけるGXF1キシローストランスポーターの過剰発現により、xyl2欠失株と比較して、
約5％～10％速いキシリトールの生産が得られるが、共基質のセロビオースの使用により
、改変された株でキシリトール生産が改善されないことを示した(図12A～12C、H0＝野生
型; H091＝xyl2欠失株; H016＝1コピーのXYL2がGXF1及びXYL1過剰発現に置き換えられて
いる株; H016-21＝xyl2欠失＋GXF1及びXYL1過剰発現株)。さらに、キシロース及びガラク
トースを共基質として有する培地中で培養したとき、xyl2欠失＋XYL1過剰発現株における
GXF2キシローストランスポーターの過剰発現により、約5％～10％速いキシリトールの生
産が得られた(図13、H0＝野生型; H091＝xyl2欠失株; H2-2＝1コピーのXYL2がGXF2及びXY
L1過剰発現に置き換えられている株; 2c1D3＝xyl2欠失＋GXF2及びXYL1過剰発現株)。
もしくはグリセロール(図12C)を有する培地中で培養したとき、xyl2欠失＋XYL1過剰発現
株におけるGXF1キシローストランスポーターの過剰発現により、xyl2欠失株と比較して、
約5％～10％速いキシリトールの生産が得られるが、共基質のセロビオースの使用により
、改変された株でキシリトール生産が改善されないことを示した(図12A～12C、H0＝野生
型; H091＝xyl2欠失株; H016＝1コピーのXYL2がGXF1及びXYL1過剰発現に置き換えられて
いる株; H016-21＝xyl2欠失＋GXF1及びXYL1過剰発現株)。さらに、キシロース及びガラク
トースを共基質として有する培地中で培養したとき、xyl2欠失＋XYL1過剰発現株における
GXF2キシローストランスポーターの過剰発現により、約5％～10％速いキシリトールの生
産が得られた(図13、H0＝野生型; H091＝xyl2欠失株; H2-2＝1コピーのXYL2がGXF2及びXY
L1過剰発現に置き換えられている株; 2c1D3＝xyl2欠失＋GXF2及びXYL1過剰発現株)。
上記のことに基づいて、キシローストランスポーターの過剰発現は、キシリトールがキ
シリトール経路を有する組換えメチニコビア種によって生産されることができるスピード
を改善することができる。
シリトール経路を有する組換えメチニコビア種によって生産されることができるスピード
を改善することができる。
(実施例VI)
(3Lバイオリアクターにおける流加発酵)
本実施例は、流加発酵法を用いて、キシロースからのキシリトールの生産を少なくとも
30％キシリトールまで増大させることができることを示している。
(3Lバイオリアクターにおける流加発酵)
本実施例は、流加発酵法を用いて、キシロースからのキシリトールの生産を少なくとも
30％キシリトールまで増大させることができることを示している。
組換えメチニコビア種株H016-21(1コピーのTPI1p-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1を含むxyl2欠
失株)を用いて、2Lの流加発酵を3Lのバイオリアクター(Applikon Biotechnology)中で実
施した。2つの独立した実験を実施した。
失株)を用いて、2Lの流加発酵を3Lのバイオリアクター(Applikon Biotechnology)中で実
施した。2つの独立した実験を実施した。
第一の流加発酵の手順は、以下の通りである:酵母細胞を、50mlのYPD中、30℃で一晩成
長させ、500mlのYPDに移した。その後、167mlの培養物を50mlの40％キシロース及び33ml
の20％ガラクトースと混合し、3L容器中の750mlのYPDに移し、最終的な接種材料をOD600
＝2.0とした。該容器の培地に、大気又は酸素をスパージした。最小撹拌速度は300rpmで
あり、溶存酸素(DO)レベルを50％飽和に維持するように自動調整した。pHを5.5～6.0に維
持した。補給ストックは、36％キシロース、12％ガラクトース、1.5％グルコース、1.5％
ペプトン、0.75％酵母抽出物、0.075％KH2PO4、0.075％MgSO4.7H2O、0.075％(NH4)2SO4を
含有している。補給スピードは、6％より低いキシロースレベルを維持するように調整し
た。1Lのストック培地を7日間で添加し、発酵をさらに3日間継続して、培地中の残りのキ
シロースを消費させた。発酵全体は10日間持続し、20％のキシリトールが2Lの容量で生産
された(図14A)。これは、過去の最も良好な結果よりも3日短い。
長させ、500mlのYPDに移した。その後、167mlの培養物を50mlの40％キシロース及び33ml
の20％ガラクトースと混合し、3L容器中の750mlのYPDに移し、最終的な接種材料をOD600
＝2.0とした。該容器の培地に、大気又は酸素をスパージした。最小撹拌速度は300rpmで
あり、溶存酸素(DO)レベルを50％飽和に維持するように自動調整した。pHを5.5～6.0に維
持した。補給ストックは、36％キシロース、12％ガラクトース、1.5％グルコース、1.5％
ペプトン、0.75％酵母抽出物、0.075％KH2PO4、0.075％MgSO4.7H2O、0.075％(NH4)2SO4を
含有している。補給スピードは、6％より低いキシロースレベルを維持するように調整し
た。1Lのストック培地を7日間で添加し、発酵をさらに3日間継続して、培地中の残りのキ
シロースを消費させた。発酵全体は10日間持続し、20％のキシリトールが2Lの容量で生産
された(図14A)。これは、過去の最も良好な結果よりも3日短い。
第二の流加発酵では、生産性を向上させるために、プロセスを改変した:細胞を、10ml
のYPD中、30℃で20時間成長させ、400mlのYPD＋4％キシロース及び2％ガラクトースに移
した。培養物を150rpmで振盪させながら30℃で24時間成長させた。前培養物を、680mlの
培地(YPD＋4％キシロース＋2％ガラクトース)を含有する3Lのバイオリアクター容器にポ
ンプで入れて、最終的な接種材料をOD600＝3.0とした。補給ストックは、36％キシロース
、12％ガラクトース、3％グルコース、3％ペプトン、1.5％酵母抽出物、0.075％KH2PO4、
0.075％MgSO4.7H2O、0.075％(NH4)2SO4を含有していた。補給スピードは、6ml/hrであっ
た。通気速度は、DOを70％飽和に維持するように自動調整した。1Lのストック培地を7日
間で添加し、発酵をキシロースがほぼ使い尽くされるまで継続した。追加の固形培地化合
物を10日目に添加して、キシロース濃度を7％にまで増大させた。発酵全体は18日間持続
した。キシリトール収率は8日目で20％に達した。これは、先の流加発酵よりも2日短い。
より多くのキシロースを添加することにより、30.5％のキシリトールが18日目に生産され
た。これは、本発明者らがこれまでに達成した最大の量である(図14B)。
のYPD中、30℃で20時間成長させ、400mlのYPD＋4％キシロース及び2％ガラクトースに移
した。培養物を150rpmで振盪させながら30℃で24時間成長させた。前培養物を、680mlの
培地(YPD＋4％キシロース＋2％ガラクトース)を含有する3Lのバイオリアクター容器にポ
ンプで入れて、最終的な接種材料をOD600＝3.0とした。補給ストックは、36％キシロース
、12％ガラクトース、3％グルコース、3％ペプトン、1.5％酵母抽出物、0.075％KH2PO4、
0.075％MgSO4.7H2O、0.075％(NH4)2SO4を含有していた。補給スピードは、6ml/hrであっ
た。通気速度は、DOを70％飽和に維持するように自動調整した。1Lのストック培地を7日
間で添加し、発酵をキシロースがほぼ使い尽くされるまで継続した。追加の固形培地化合
物を10日目に添加して、キシロース濃度を7％にまで増大させた。発酵全体は18日間持続
した。キシリトール収率は8日目で20％に達した。これは、先の流加発酵よりも2日短い。
より多くのキシロースを添加することにより、30.5％のキシリトールが18日目に生産され
た。これは、本発明者らがこれまでに達成した最大の量である(図14B)。
上記のことに基づいて、流加発酵法の使用は、キシリトール経路を有する組換えメチニ
コビア種によって生産されるキシリトールの割合及び全体の濃度を改善することができる
。
コビア種によって生産されるキシリトールの割合及び全体の濃度を改善することができる
。
(実施例VII)
(成長及びH0メチニコビア属種に特異的な代謝物の生産)
本実施例は、近縁のメチニコビア種(メチニコビア・プルケリマフラウィア)と比較した
とき、H0メチニコビア属種が異なる形で成長し、かつ異なる代謝物を生産することを示し
ている。
(成長及びH0メチニコビア属種に特異的な代謝物の生産)
本実施例は、近縁のメチニコビア種(メチニコビア・プルケリマフラウィア)と比較した
とき、H0メチニコビア属種が異なる形で成長し、かつ異なる代謝物を生産することを示し
ている。
H0メチニコビア属種及びメチニコビア・プルケリマフラウィア(FL)の3つの単一コロニ
ーを、それぞれ、5mlの酵母抽出物ペプトンデキストロース(YEPD)培地中に接種し、30℃
で一晩成長させた。培養物を100ml YEPDに移し、30℃で4時間成長させた。細胞を収集し
、OD600＝1.0を有する500mlフラスコ中の200mlの培地中に接種した。4つの異なる培地の
タイプ: 1)YNBG: 4％グルコースを含む酵母窒素塩基、2)YNBX: 4％キシロースを含む酵母
窒素塩基、3)YNBGX: 2％グルコース及び2％キシロースを含む酵母窒素塩基、並びに4) YP
DX: 2％デキストロース及び2％キシロースを含むYEPを使用した。培養物を、180rpmで振
盪させながら、30℃で成長させた。試料を毎日採取して、OD600により測定される成長及
び高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定される代謝物含有量をモニタリングした
。H0メチニコビア属種及びFLによって生産される揮発性化合物をヘッドスペースGC-MSに
より測定した。OD600及びHPLCデータは、3つの生物学的複製物の平均である。標準偏差も
計算した。GC-MSデータをピーク高さによって大まかに比較した。
ーを、それぞれ、5mlの酵母抽出物ペプトンデキストロース(YEPD)培地中に接種し、30℃
で一晩成長させた。培養物を100ml YEPDに移し、30℃で4時間成長させた。細胞を収集し
、OD600＝1.0を有する500mlフラスコ中の200mlの培地中に接種した。4つの異なる培地の
タイプ: 1)YNBG: 4％グルコースを含む酵母窒素塩基、2)YNBX: 4％キシロースを含む酵母
窒素塩基、3)YNBGX: 2％グルコース及び2％キシロースを含む酵母窒素塩基、並びに4) YP
DX: 2％デキストロース及び2％キシロースを含むYEPを使用した。培養物を、180rpmで振
盪させながら、30℃で成長させた。試料を毎日採取して、OD600により測定される成長及
び高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定される代謝物含有量をモニタリングした
。H0メチニコビア属種及びFLによって生産される揮発性化合物をヘッドスペースGC-MSに
より測定した。OD600及びHPLCデータは、3つの生物学的複製物の平均である。標準偏差も
計算した。GC-MSデータをピーク高さによって大まかに比較した。
試験した全ての培地中でのH0メチニコビア属種とFL株の成長速度に違いが認められた。
具体的には、H0メチニコビア属種は、FLよりも速く成長する(図15A～15D)。例えば、3日
目に、FLと比べたH0メチニコビア属種のOD600の比は、YNBG中で1.17(図15A)、YNBX中で1.
30(図15B)、YNBGX中で1.26(図15C)、及びYPDX中で1.19(図15D)であった。
具体的には、H0メチニコビア属種は、FLよりも速く成長する(図15A～15D)。例えば、3日
目に、FLと比べたH0メチニコビア属種のOD600の比は、YNBG中で1.17(図15A)、YNBX中で1.
30(図15B)、YNBGX中で1.26(図15C)、及びYPDX中で1.19(図15D)であった。
グリセロール及びエタノールは、1日目に、YNBG培地、YNBGX培地、及びYPDX培地中で検
出された。これらの濃度は、YNBG及びYNBGX培地中では、両株間で同様であった(図16A及
び16B)。しかしながら、YPDX培地中では、H0メチニコビア属種は、FLよりも45％多いグリ
セロールを生産した(905mg/L対624mg/L;図16A)。
出された。これらの濃度は、YNBG及びYNBGX培地中では、両株間で同様であった(図16A及
び16B)。しかしながら、YPDX培地中では、H0メチニコビア属種は、FLよりも45％多いグリ
セロールを生産した(905mg/L対624mg/L;図16A)。
H0メチニコビア属種とFLは両方とも、全ての成長培地中でアラビトールを生産した(図1
7A～17D)。しかしながら、YNBG培地中では、H0メチニコビア属種は、1日目に、異なる量
のアラビトールを生産し－H0メチニコビア属種は、FLよりも60mg/L多いアラビトールを生
産した(図17A)。最も劇的には、YNBGX培地中で、H0メチニコビア属種は、1日目、2日目、
及び3日目に、顕著により多い量のアラビトールを生産し－H0メチニコビア属種は、FLよ
りも約40mg/L多いアラビトールを生産した(図17C)。YNBX及びYPDX培地中では、アラビト
ールレベルは、これら2つの種間で同様であった(図17B及び17D)。
7A～17D)。しかしながら、YNBG培地中では、H0メチニコビア属種は、1日目に、異なる量
のアラビトールを生産し－H0メチニコビア属種は、FLよりも60mg/L多いアラビトールを生
産した(図17A)。最も劇的には、YNBGX培地中で、H0メチニコビア属種は、1日目、2日目、
及び3日目に、顕著により多い量のアラビトールを生産し－H0メチニコビア属種は、FLよ
りも約40mg/L多いアラビトールを生産した(図17C)。YNBX及びYPDX培地中では、アラビト
ールレベルは、これら2つの種間で同様であった(図17B及び17D)。
H0メチニコビア属種は、最大量のキシリトールを、YNBX培地中では3日目に(1.61g/L)、
YNBGX培地中では2日目に(1.43g/L)、及びYPDX培地中では4日目に(21.5g/L)生産したが、F
Lは、最大のキシリトールを、YNBX中では6日目に(2.33g/L)、YNBGX中では2日目に(0.73g/
L)、及びYPDX中では4日目に(21.9g/L)生産した(図18A～18C)。H0メチニコビア属種とFLの
間での3日目のキシリトール含有量の比は、YNBX中で4.39、YNBGX中で5.43、及びYPDX中で
0.87であった。
YNBGX培地中では2日目に(1.43g/L)、及びYPDX培地中では4日目に(21.5g/L)生産したが、F
Lは、最大のキシリトールを、YNBX中では6日目に(2.33g/L)、YNBGX中では2日目に(0.73g/
L)、及びYPDX中では4日目に(21.9g/L)生産した(図18A～18C)。H0メチニコビア属種とFLの
間での3日目のキシリトール含有量の比は、YNBX中で4.39、YNBGX中で5.43、及びYPDX中で
0.87であった。
それぞれ、YNBG中で1日間、並びにYNBX、YNBGX、及びYPDX中で3日間成長させた後の培
地中の揮発性化合物をヘッドスペースGC-MSにより測定した。ピーク高さの比を計算し、F
LとH0メチニコビア属種の間で比較した。この解析により、FLがH0メチニコビア属種より
も多くの揮発性化合物を生産することが示された(図19A～19D)。具体的には、FLは、YNBG
培地中でより多くのアセトアルデヒド、酢酸エチル、アセタール、1-(1-エトキシエトキ
シ)ペンタン、及びフェニルエチルアルコール(図19A); YNBX培地中でより多くの酢酸イソ
アミル、2-メチル-1-ブタノール、及び3-メチル-1-ブタノール(図19B); YNBGX培地中でよ
り多くの酢酸エチル、エチルプロパノエート、酢酸イソアミル、2-メチル-1-ブタノール
、3-メチル-1-ブタノール、及びフェニルエチルアルコール(図19C)、並びにYPDX培地中で
より多くのアセトアルデヒド、イソブタノール、酢酸イソアミル、3-メチル-1-ブタノー
ル、エチルノナノエート、及びフェニルエチルアルコール(図19D)を生産した。
地中の揮発性化合物をヘッドスペースGC-MSにより測定した。ピーク高さの比を計算し、F
LとH0メチニコビア属種の間で比較した。この解析により、FLがH0メチニコビア属種より
も多くの揮発性化合物を生産することが示された(図19A～19D)。具体的には、FLは、YNBG
培地中でより多くのアセトアルデヒド、酢酸エチル、アセタール、1-(1-エトキシエトキ
シ)ペンタン、及びフェニルエチルアルコール(図19A); YNBX培地中でより多くの酢酸イソ
アミル、2-メチル-1-ブタノール、及び3-メチル-1-ブタノール(図19B); YNBGX培地中でよ
り多くの酢酸エチル、エチルプロパノエート、酢酸イソアミル、2-メチル-1-ブタノール
、3-メチル-1-ブタノール、及びフェニルエチルアルコール(図19C)、並びにYPDX培地中で
より多くのアセトアルデヒド、イソブタノール、酢酸イソアミル、3-メチル-1-ブタノー
ル、エチルノナノエート、及びフェニルエチルアルコール(図19D)を生産した。
上の結果に基づいて、H0メチニコビア属種とメチニコビア・プルケリマフラウィア種の
間の成長及び分泌された代謝物のプロファイルは、成長速度並びに様々な培地中での成長
時のいくつかの代謝産物の含有量及び動態の違いを示している。
間の成長及び分泌された代謝物のプロファイルは、成長速度並びに様々な培地中での成長
時のいくつかの代謝産物の含有量及び動態の違いを示している。
(実施例VIII)
(メチニコビア種によるキシロースの代謝)
本実施例は、メチニコビア種がキシロースを炭素源として消費し、代謝すること、並び
にH0メチニコビア属種及びメチニコビア・ジジフィコラがキシリトール経路を用いるキシ
ロースからのキシリトールの生産のための特に有用な宿主種であることを示している。
(メチニコビア種によるキシロースの代謝)
本実施例は、メチニコビア種がキシロースを炭素源として消費し、代謝すること、並び
にH0メチニコビア属種及びメチニコビア・ジジフィコラがキシリトール経路を用いるキシ
ロースからのキシリトールの生産のための特に有用な宿主種であることを示している。
いくつかの既知のメチニコビア・プルケリマクレード種(メチニコビア・プルケリマ、
メチニコビア・アンダウエンシス、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・シネ
ンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、及びメチニコビア・ジジフィコラ)並びに
本明細書に記載される新しいH0メチニコビア属種を、2％キシロースを有するYP培地上で
長時間成長させ、ここで、細胞培養物の成長を、10、13、16、19、34、及び41時間でのOD
600をアッセイすることによりモニタリングした。
メチニコビア・アンダウエンシス、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・シネ
ンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、及びメチニコビア・ジジフィコラ)並びに
本明細書に記載される新しいH0メチニコビア属種を、2％キシロースを有するYP培地上で
長時間成長させ、ここで、細胞培養物の成長を、10、13、16、19、34、及び41時間でのOD
600をアッセイすることによりモニタリングした。
これらの実験は、アッセイした全ての種が成長のためにキシロースを消費することを示
した(図20)。H0メチニコビア属種は、その成長によって、ほとんどのメチニコビア・プル
ケリマクレード種から区別され、これは、後期(41時間)に、初期の0.03のOD600から、約2
5のOD600に達した(図20)。メチニコビア・ジジフィコラ培養物とH0メチニコビア属種培養
物のOD600も類似しており、どちらも、アッセイした他の種の培養物のOD600よりもずっと
高かった(図20)。
した(図20)。H0メチニコビア属種は、その成長によって、ほとんどのメチニコビア・プル
ケリマクレード種から区別され、これは、後期(41時間)に、初期の0.03のOD600から、約2
5のOD600に達した(図20)。メチニコビア・ジジフィコラ培養物とH0メチニコビア属種培養
物のOD600も類似しており、どちらも、アッセイした他の種の培養物のOD600よりもずっと
高かった(図20)。
これらの実験は、アッセイした全ての種が成長のためにキシロースを消費することを示
した(図20)。H0メチニコビア属種は、その成長によって、ほとんどのメチニコビア・プル
ケリマクレード種から区別され、これは、後期(41時間)に、初期の0.03のOD600から、約2
5のOD600に達した(図20)。メチニコビア・ジジフィコラ培養物とH0メチニコビア属種培養
物のOD600も類似しており、どちらも、アッセイした他の種の培養物のOD600よりもずっと
高かった(図20)。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
単離されたメチニコビア種であって:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくと
も1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発
現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;及び(b)該単離されたメチニコビア種のキシリ
トールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を含む、前記単離され
たメチニコビア種。
（態様２）
前記単離されたメチニコビア種が、培養したとき、少なくとも0.50g/L/h、少なくとも0
.60g/L/h、少なくとも0.70g/L/h、少なくとも0.80g/L/h、少なくとも0.90g/L/h、少なく
とも1.00g/L/h、少なくとも1.50g/L/h、少なくとも2.00g/L/h、少なくとも2.50g/L/h、少
なくとも3.00g/L/h、少なくとも3.50g/L/h、少なくとも4.00g/L/h、少なくとも5.00g/L/h
、少なくとも6.00g/L/h、少なくとも7.00g/L/h、少なくとも8.00g/L/h、少なくとも9.00g
/L/h、又は少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する、態様1記載
の単離されたメチニコビア種。
（態様３）
前記単離されたメチニコビア種が、培養したとき、少なくとも75g/L、少なくとも80g/L
、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なくとも100g/L、少なくと
も110g/L、少なくとも120g/L、少なくとも130g/L、少なくとも140g/L、少なくとも150g/L
、少なくとも160g/L、少なくとも170g/L、少なくとも180g/L、少なくとも190g/L、少なく
とも200g/L、少なくとも250g/L、少なくとも300g/Lのキシリトールをキシロースから生産
する、態様1記載の単離されたメチニコビア種。
（態様４）
前記単離されたメチニコビア種が、メチニコビア・プルケリマ、メチニコビア・フルク
ティコラ、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・ロイカウフィイ、メチニコビ
ア・アンダウエンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、メチニコビア・シネンシス
、メチニコビア・ジジフィコラ、メチニコビア・ビクスピダータ、メチニコビア・ルナー
タ、メチニコビア・ゾベルリイ、メチニコビア・アウストラリス、メチニコビア・アガウ
ェアエ、メチニコビア・グルエスシイ、メチニコビア・ハワイエンシス、メチニコビア・
クリスシイ、メチニコビア属種株NS-O-85、及びメチニコビア属種株NS-O-89からなる群か
ら選択される、態様1～3のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
（態様５）
前記単離されたメチニコビア種が、ブダペスト条約の条項の下で、2016年11月8日に、
国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(International Depositary Authority of Canad
a)に寄託された、アクセッション番号081116-01に指定されたメチニコビア種である、態
様1～3のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
（態様６）
前記キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸であ
る、態様1～5のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
（態様７）
前記キシロースレダクターゼが配列番号11～18からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含む、態様1～5のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
（態様８）
前記キシロースレダクターゼが配列番号11のアミノ酸配列又は配列番号11と少なくとも
95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様1～5のいずれか一項記載の単離され
たメチニコビア種。
（態様９）
前記遺伝子修飾が前記単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又は
その部分をコードする少なくとも1つのアレルの欠失を含む、態様1～8のいずれか一項記
載の単離されたメチニコビア種。
（態様１０）
前記遺伝子修飾が前記単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又は
その部分をコードする両方のアレルの欠失を含む、態様1～8のいずれか一項記載の単離さ
れたメチニコビア種。
（態様１１）
前記単離されたメチニコビア種がキシローストランスポーターをコードする少なくとも
1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシローストランスポーターの過剰
発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸をさらに含む、態様1～10のいずれか一項記載
の単離されたメチニコビア種。
（態様１２）
前記キシローストランスポーターが配列番号27～40からなる群から選択されるアミノ酸
配列を含む、態様11記載の単離されたメチニコビア種。
（態様１３）
前記キシローストランスポーターが配列番号27～36のいずれか1つのアミノ酸配列又は
配列番号27～36のいずれか1つと少なくとも30％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
む、態様11記載の単離されたメチニコビア種。
（態様１４）
キシリトールを生産する方法であって、態様1～13のいずれか一項記載の単離されたメ
チニコビア種を、キシロースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに十
分な期間培養することを含む、前記方法。
（態様１５）
前記条件が、前記単離されたメチニコビア種を、キシロース及びC3炭素源、C4炭素源、
C5炭素源、C6炭素源、又はこれらの組合せを含む培地中で培養することを含む、態様14の
方法。
（態様１６）
前記条件が、前記単離されたメチニコビア種を、キシロース並びにセロビオース、ガラ
クトース、グルコース、エタノール、アセテート、アラビトール、ソルビトール、及びグ
リセロール、又はこれらの組合せからなる群から選択される共基質を含む培地中で培養す
ることを含む、態様14記載の方法。
（態様１７）
前記共基質がグルコースである、態様16記載の方法。
（態様１８）
前記培地がキシロースとセロビオースの組合せを含む、態様16記載の方法。
（態様１９）
前記培地がキシロースとガラクトースの組合せを含む、態様16記載の方法。
（態様２０）
前記培地がキシロースとグリセロールの組合せを含む、態様16記載の方法。
（態様２１）
前記培養することが好気的培養条件を含む、態様14～20のいずれか一項記載の方法。
（態様２２）
前記培養することが、回分培養、流加培養、又は連続培養を含む、態様14～21のいずれ
か一項記載の方法。
（態様２３）
前記キシリトールを前記培養物中の他の成分から分離することをさらに含む、態様14～
22のいずれか一項記載の方法。
（態様２４）
前記分離することが、抽出、連続液液抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気
透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸収クロマ
トグラフィー、又は限外濾過を含む、態様23記載の方法。
（態様２５）
態様14～24のいずれか一項記載の方法によって生産される生物由来キシリトール。
（態様２６）
態様1～13のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種もしくは態様25記載の生物
由来キシリトールを含む、組成物。
（態様２７）
キシロースを含む培養培地である、態様26記載の組成物。
（態様２８）
態様1～13のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種が除去されている培養培地
である、態様26記載の組成物。
（態様２９）
グリセロール、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せを、態様14～24の
いずれか一項記載の方法からの不純物として含む、態様26～28のいずれか一項記載の組成
物。
（態様３０）
前記C7糖アルコールがボレミトール又はその異性体である、態様29記載の組成物。
（態様３１）
グリセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量が、態様1～13のいずれか一項
記載の単離されたメチニコビア種以外の微生物によって生産されるそれぞれのグリセロー
ルもしくはアラビトール、又はその両方の量よりも少なくとも10％、20％、30％、又は40
％多い、態様29記載の組成物。
した(図20)。H0メチニコビア属種は、その成長によって、ほとんどのメチニコビア・プル
ケリマクレード種から区別され、これは、後期(41時間)に、初期の0.03のOD600から、約2
5のOD600に達した(図20)。メチニコビア・ジジフィコラ培養物とH0メチニコビア属種培養
物のOD600も類似しており、どちらも、アッセイした他の種の培養物のOD600よりもずっと
高かった(図20)。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
単離されたメチニコビア種であって:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくと
も1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発
現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;及び(b)該単離されたメチニコビア種のキシリ
トールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を含む、前記単離され
たメチニコビア種。
（態様２）
前記単離されたメチニコビア種が、培養したとき、少なくとも0.50g/L/h、少なくとも0
.60g/L/h、少なくとも0.70g/L/h、少なくとも0.80g/L/h、少なくとも0.90g/L/h、少なく
とも1.00g/L/h、少なくとも1.50g/L/h、少なくとも2.00g/L/h、少なくとも2.50g/L/h、少
なくとも3.00g/L/h、少なくとも3.50g/L/h、少なくとも4.00g/L/h、少なくとも5.00g/L/h
、少なくとも6.00g/L/h、少なくとも7.00g/L/h、少なくとも8.00g/L/h、少なくとも9.00g
/L/h、又は少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する、態様1記載
の単離されたメチニコビア種。
（態様３）
前記単離されたメチニコビア種が、培養したとき、少なくとも75g/L、少なくとも80g/L
、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なくとも100g/L、少なくと
も110g/L、少なくとも120g/L、少なくとも130g/L、少なくとも140g/L、少なくとも150g/L
、少なくとも160g/L、少なくとも170g/L、少なくとも180g/L、少なくとも190g/L、少なく
とも200g/L、少なくとも250g/L、少なくとも300g/Lのキシリトールをキシロースから生産
する、態様1記載の単離されたメチニコビア種。
（態様４）
前記単離されたメチニコビア種が、メチニコビア・プルケリマ、メチニコビア・フルク
ティコラ、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・ロイカウフィイ、メチニコビ
ア・アンダウエンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、メチニコビア・シネンシス
、メチニコビア・ジジフィコラ、メチニコビア・ビクスピダータ、メチニコビア・ルナー
タ、メチニコビア・ゾベルリイ、メチニコビア・アウストラリス、メチニコビア・アガウ
ェアエ、メチニコビア・グルエスシイ、メチニコビア・ハワイエンシス、メチニコビア・
クリスシイ、メチニコビア属種株NS-O-85、及びメチニコビア属種株NS-O-89からなる群か
ら選択される、態様1～3のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
（態様５）
前記単離されたメチニコビア種が、ブダペスト条約の条項の下で、2016年11月8日に、
国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(International Depositary Authority of Canad
a)に寄託された、アクセッション番号081116-01に指定されたメチニコビア種である、態
様1～3のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
（態様６）
前記キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸であ
る、態様1～5のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
（態様７）
前記キシロースレダクターゼが配列番号11～18からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含む、態様1～5のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
（態様８）
前記キシロースレダクターゼが配列番号11のアミノ酸配列又は配列番号11と少なくとも
95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様1～5のいずれか一項記載の単離され
たメチニコビア種。
（態様９）
前記遺伝子修飾が前記単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又は
その部分をコードする少なくとも1つのアレルの欠失を含む、態様1～8のいずれか一項記
載の単離されたメチニコビア種。
（態様１０）
前記遺伝子修飾が前記単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又は
その部分をコードする両方のアレルの欠失を含む、態様1～8のいずれか一項記載の単離さ
れたメチニコビア種。
（態様１１）
前記単離されたメチニコビア種がキシローストランスポーターをコードする少なくとも
1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシローストランスポーターの過剰
発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸をさらに含む、態様1～10のいずれか一項記載
の単離されたメチニコビア種。
（態様１２）
前記キシローストランスポーターが配列番号27～40からなる群から選択されるアミノ酸
配列を含む、態様11記載の単離されたメチニコビア種。
（態様１３）
前記キシローストランスポーターが配列番号27～36のいずれか1つのアミノ酸配列又は
配列番号27～36のいずれか1つと少なくとも30％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
む、態様11記載の単離されたメチニコビア種。
（態様１４）
キシリトールを生産する方法であって、態様1～13のいずれか一項記載の単離されたメ
チニコビア種を、キシロースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに十
分な期間培養することを含む、前記方法。
（態様１５）
前記条件が、前記単離されたメチニコビア種を、キシロース及びC3炭素源、C4炭素源、
C5炭素源、C6炭素源、又はこれらの組合せを含む培地中で培養することを含む、態様14の
方法。
（態様１６）
前記条件が、前記単離されたメチニコビア種を、キシロース並びにセロビオース、ガラ
クトース、グルコース、エタノール、アセテート、アラビトール、ソルビトール、及びグ
リセロール、又はこれらの組合せからなる群から選択される共基質を含む培地中で培養す
ることを含む、態様14記載の方法。
（態様１７）
前記共基質がグルコースである、態様16記載の方法。
（態様１８）
前記培地がキシロースとセロビオースの組合せを含む、態様16記載の方法。
（態様１９）
前記培地がキシロースとガラクトースの組合せを含む、態様16記載の方法。
（態様２０）
前記培地がキシロースとグリセロールの組合せを含む、態様16記載の方法。
（態様２１）
前記培養することが好気的培養条件を含む、態様14～20のいずれか一項記載の方法。
（態様２２）
前記培養することが、回分培養、流加培養、又は連続培養を含む、態様14～21のいずれ
か一項記載の方法。
（態様２３）
前記キシリトールを前記培養物中の他の成分から分離することをさらに含む、態様14～
22のいずれか一項記載の方法。
（態様２４）
前記分離することが、抽出、連続液液抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気
透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸収クロマ
トグラフィー、又は限外濾過を含む、態様23記載の方法。
（態様２５）
態様14～24のいずれか一項記載の方法によって生産される生物由来キシリトール。
（態様２６）
態様1～13のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種もしくは態様25記載の生物
由来キシリトールを含む、組成物。
（態様２７）
キシロースを含む培養培地である、態様26記載の組成物。
（態様２８）
態様1～13のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種が除去されている培養培地
である、態様26記載の組成物。
（態様２９）
グリセロール、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せを、態様14～24の
いずれか一項記載の方法からの不純物として含む、態様26～28のいずれか一項記載の組成
物。
（態様３０）
前記C7糖アルコールがボレミトール又はその異性体である、態様29記載の組成物。
（態様３１）
グリセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量が、態様1～13のいずれか一項
記載の単離されたメチニコビア種以外の微生物によって生産されるそれぞれのグリセロー
ルもしくはアラビトール、又はその両方の量よりも少なくとも10％、20％、30％、又は40
％多い、態様29記載の組成物。
Claims (31)
- 単離されたメチニコビア種であって:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくと
も1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発
現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;及び(b)該単離されたメチニコビア種のキシリ
トールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を含む、前記単離され
たメチニコビア種。 - 前記単離されたメチニコビア種が、培養したとき、少なくとも0.50g/L/h、少なくとも0
.60g/L/h、少なくとも0.70g/L/h、少なくとも0.80g/L/h、少なくとも0.90g/L/h、少なく
とも1.00g/L/h、少なくとも1.50g/L/h、少なくとも2.00g/L/h、少なくとも2.50g/L/h、少
なくとも3.00g/L/h、少なくとも3.50g/L/h、少なくとも4.00g/L/h、少なくとも5.00g/L/h
、少なくとも6.00g/L/h、少なくとも7.00g/L/h、少なくとも8.00g/L/h、少なくとも9.00g
/L/h、又は少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する、請求項1記
載の単離されたメチニコビア種。 - 前記単離されたメチニコビア種が、培養したとき、少なくとも75g/L、少なくとも80g/L
、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なくとも100g/L、少なくと
も110g/L、少なくとも120g/L、少なくとも130g/L、少なくとも140g/L、少なくとも150g/L
、少なくとも160g/L、少なくとも170g/L、少なくとも180g/L、少なくとも190g/L、少なく
とも200g/L、少なくとも250g/L、少なくとも300g/Lのキシリトールをキシロースから生産
する、請求項1記載の単離されたメチニコビア種。 - 前記単離されたメチニコビア種が、メチニコビア・プルケリマ、メチニコビア・フルク
ティコラ、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・ロイカウフィイ、メチニコビ
ア・アンダウエンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、メチニコビア・シネンシス
、メチニコビア・ジジフィコラ、メチニコビア・ビクスピダータ、メチニコビア・ルナー
タ、メチニコビア・ゾベルリイ、メチニコビア・アウストラリス、メチニコビア・アガウ
ェアエ、メチニコビア・グルエスシイ、メチニコビア・ハワイエンシス、メチニコビア・
クリスシイ、メチニコビア属種株NS-O-85、及びメチニコビア属種株NS-O-89からなる群か
ら選択される、請求項1～3のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。 - 前記単離されたメチニコビア種が、ブダペスト条約の条項の下で、2016年11月8日に、
国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(International Depositary Authority of Canad
a)に寄託された、アクセッション番号081116-01に指定されたメチニコビア種である、請
求項1～3のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。 - 前記キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸であ
る、請求項1～5のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。 - 前記キシロースレダクターゼが配列番号11～18からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含む、請求項1～5のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。 - 前記キシロースレダクターゼが配列番号11のアミノ酸配列又は配列番号11と少なくとも
95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1～5のいずれか一項記載の単離さ
れたメチニコビア種。 - 前記遺伝子修飾が前記単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又は
その部分をコードする少なくとも1つのアレルの欠失を含む、請求項1～8のいずれか一項
記載の単離されたメチニコビア種。 - 前記遺伝子修飾が前記単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又は
その部分をコードする両方のアレルの欠失を含む、請求項1～8のいずれか一項記載の単離
されたメチニコビア種。 - 前記単離されたメチニコビア種がキシローストランスポーターをコードする少なくとも
1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシローストランスポーターの過剰
発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸をさらに含む、請求項1～10のいずれか一項記
載の単離されたメチニコビア種。 - 前記キシローストランスポーターが配列番号27～40からなる群から選択されるアミノ酸
配列を含む、請求項11記載の単離されたメチニコビア種。 - 前記キシローストランスポーターが配列番号27～36のいずれか1つのアミノ酸配列又は
配列番号27～36のいずれか1つと少なくとも30％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
む、請求項11記載の単離されたメチニコビア種。 - キシリトールを生産する方法であって、請求項1～13のいずれか一項記載の単離された
メチニコビア種を、キシロースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに
十分な期間培養することを含む、前記方法。 - 前記条件が、前記単離されたメチニコビア種を、キシロース及びC3炭素源、C4炭素源、
C5炭素源、C6炭素源、又はこれらの組合せを含む培地中で培養することを含む、請求項14
の方法。 - 前記条件が、前記単離されたメチニコビア種を、キシロース並びにセロビオース、ガラ
クトース、グルコース、エタノール、アセテート、アラビトール、ソルビトール、及びグ
リセロール、又はこれらの組合せからなる群から選択される共基質を含む培地中で培養す
ることを含む、請求項14記載の方法。 - 前記共基質がグルコースである、請求項16記載の方法。
- 前記培地がキシロースとセロビオースの組合せを含む、請求項16記載の方法。
- 前記培地がキシロースとガラクトースの組合せを含む、請求項16記載の方法。
- 前記培地がキシロースとグリセロールの組合せを含む、請求項16記載の方法。
- 前記培養することが好気的培養条件を含む、請求項14～20のいずれか一項記載の方法。
- 前記培養することが、回分培養、流加培養、又は連続培養を含む、請求項14～21のいず
れか一項記載の方法。 - 前記キシリトールを前記培養物中の他の成分から分離することをさらに含む、請求項14
～22のいずれか一項記載の方法。 - 前記分離することが、抽出、連続液液抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気
透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸収クロマ
トグラフィー、又は限外濾過を含む、請求項23記載の方法。 - 請求項14～24のいずれか一項記載の方法によって生産される生物由来キシリトール。
- 請求項1～13のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種もしくは請求項25記載の
生物由来キシリトールを含む、組成物。 - キシロースを含む培養培地である、請求項26記載の組成物。
- 請求項1～13のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種が除去されている培養培
地である、請求項26記載の組成物。 - グリセロール、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せを、請求項14～24
のいずれか一項記載の方法からの不純物として含む、請求項26～28のいずれか一項記載の
組成物。 - 前記C7糖アルコールがボレミトール又はその異性体である、請求項29記載の組成物。
- グリセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量が、請求項1～13のいずれか一
項記載の単離されたメチニコビア種以外の微生物によって生産されるそれぞれのグリセロ
ールもしくはアラビトール、又はその両方の量よりも少なくとも10％、20％、30％、又は
40％多い、請求項29記載の組成物。
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