TWI439547B - 一種未去毒性纖維原料水解液生產木糖醇的方法 - Google Patents

Description

一種未去毒性纖維原料水解液生產木糖醇的方法

一種未去毒性纖維原料水解液生產木糖醇的方法，利用木糖發酵菌株Candida sp .將未去毒性之纖維原料水解液中的木糖轉化為木糖醇。

木糖醇是一種自然界存在的少量稀有糖類，可在蔬果等植物組成中發現，也是哺乳類代謝醣類的中間代謝產物之一，其化學性質屬於五碳糖醇(Pentitol)類。木糖醇吸引全球關注乃是因其是一種與蔗糖甜度相當，但熱量只有蔗糖60%的天然甜味劑。醫學研究顯示，木糖醇對於預防蛀牙有顯著的幫助，因其不易被口腔中造成蛀牙的鏈球菌(Streptococcus mutans )及其他微生物利用，且在口腔中有維持酸鹼平衡的功能，而能達到預防蛀牙的功能。此外研究也指出木糖醇能迅速氧化產生能量，但在人體的代謝過程中並不需胰島素參與，目前在臨床上廣泛被用作糖尿病患者食物中蔗糖的替代品。概括而言，發展工業產製木糖醇至少可應用於三大產業，即食品加工業(如烘培業、乳化劑、安定劑及口香糖等)、口腔疾病防治(抗齲齒、促進牙齒再礦化特性)與製藥工業(可預防上呼吸道感染、高甜度低熱量特性、營養品藥劑、維他命配方等)。

現階段工業量產木糖醇之方法乃利用富含半纖維素之纖維生質原料，經酸水解前處理轉化為以木糖為主要組成之水解液後，再以高溫高壓條件及鎳金屬催化下加氫還原反應之化學合成法製造木糖醇。以此化學合成方式生產之木糖醇產率約在40~50%，同時化學反應中也將原料中所有糖類還原成相對應的糖醇，因此產物中除木糖醇外，尚可能出現阿拉伯糖醇(Arabitol)及山梨醇(Sorbitol)等其他糖醇。這些糖醇類的化學性質相當類似，相對上分離較為困難。另外利用化學合成方法其製造過程繁複，需耗費大量能源，再加上諸多設備成本造成木糖醇的價格無法降低。為了降低生產成本及日益增加的木糖醇市場需求，工業界正積極發展高產率、低能耗的木糖醇生產替代方法。

以微生物直接發酵纖維原料水解液生產木糖醇的生物轉化方式是目前最具優勢及競爭力的替代方法，利用自然界存在並可利用木糖的微生物，以微生物本身的生理代謝反應將木糖直接轉化為木糖醇，後續再以純化結晶的方式回收木糖醇產物。生物轉化的方式除產率較高外，也可免除化學法中木糖醇產物可能受重金屬汙染的風險，以食品添加物的標準而言，生物轉化方式製造的木糖醇產物會是比較安全的。

在目前所收集之相關文獻中，以微生物轉化木糖為木糖醇的研究所探討的水解液種類涵蓋了玉米穗軸(Corncob)、玉米纖(Corn fiber)、蔗渣(Sugarcane bagasse)、硬木(Hardwood)、桉樹(Eucalyptus)、胡桃殼(Walnut shell)、啤酒糟(Brewer’s spent grain)、牧草(Prairie grass)、麥稈(Wheat straw)及稻稈(Rice straw)等種類，其相關的木糖醇產率存在極大差距(0.2~0.8g/g)。

一般纖維生質原料主要含有60-80%的纖維素、半纖維素及15-25%的木質素，其中的半纖維素需先以前處理程序(Pretreatment process)轉化五碳糖(主要為木糖)後，才能以生物發酵技術將這些單糖進一步轉化為木糖醇。在半纖維素轉化糖類的前處理技術中，現階段多採用稀酸水解(Dilute hydrolysis)、稀酸催化蒸汽爆裂(Acid-catalyzed steam explosion)等高溫高壓熱化學前處理技術(Thermal chemical pretreatment)將半纖維素分解為木糖，由於此類前處理技術的反應過程中，通常係先將一定比例的生質原料與水溶液裝填於反應器內，再於高溫高壓反應條件下會加入1-3%(w/w)的稀硫酸，反應後所得之液體即稱為水解液。此外，此類前處理技術亦會隨反應條件的不同而產生若干濃度的醋酸(acetic acid)、糠醛(Furfural)及羥甲基糠醛(Hydroxymethyl furfural)等發酵抑制物，因此現階段前處理所得之木糖水解液均必須先經過鹼化法(Overliming)、活性碳吸附法、離子交換樹酯等單一或合併數種不同去毒化調理技術處理後，方能使微生物順利進行木糖發酵以轉化成木糖醇產物。以目前最常使用的過鹼化法為例(如圖1A及圖1B所示)，其調理木糖水解液須依次進行加熱、添加過量石灰、固液分離及添加酸劑調整木糖水解液酸鹼值至弱酸性等多個步驟，同時所生成之硫酸鈣污泥尚需另行處理及處置。由於過鹼化法調理的過程中，通常會造成木糖損失，且同時會產生硫酸鈣污泥，故需要投入額外的經費與設備，予以處理及處置，因而增加了木糖醇的生產成本；而相較之下未去毒性調理之步驟則較為單純，僅需添加鹼劑將木糖水解液之酸鹼值由酸性調整至弱酸性，但因水解液中會含有較高濃度的糠醛及硫酸根離子等發酵抑制物，因此以發酵技術將木糖轉化為酒精的困難度相對提高，所以在如何降低木糖損失及其生產木糖醇的成本，將為提升木糖醇生物轉化產製競爭力的重要研究議題。

有鑑於此，為解決上述問題，本發明提供一種未去毒性纖維原料水解液生產木糖醇的方法，利用自核研所實驗型纖維酒精研發設施之100公升五碳醣發酵槽的發酵泥渣中，分離篩選出之一株木糖醇發酵菌株，經分子生物方法分析該菌株之18S rDNA基因序列後，經資料庫比對鑑定為屬於Candida 菌屬之酵母菌株(Candidα sp. )，此菌株來發酵人工合成之木糖溶液可生產木糖醇，其最大產率可將近0.8g/g，比同屬於Candida 菌屬之木糖醇生產菌株菌株如Candida boidinii 、Candida guilliermondii 、Candida utilis 、Cαndida maltosa 等為佳(木糖醇產率多在0.7g/g以下)，同時也較其他具生產木糖醇能力之不同屬菌株相較，其木糖醇產率亦達領先水準。

本發明之該菌株對生質纖維原料前處理水解液中常存在之毒性抑制物糠醛(Furfural)有較高的耐受力，以人工合成之木糖溶液，外添加糠醛的發酵實驗證實此菌株可在含3g/L糠醛的木糖溶液中生長且發酵產生木糖醇，其產率與未含糠醛的發酵結果非常接近。

另一方面，本發明以稻稈(Rice straw)、芒草(Silvergrass)、蔗渣(Sugarcane bagasse)、狼尾草(Napiergrass)、鳳梨皮(Pineapple peel)等多種生質纖維原料前處理水解液進行發酵，經確認該菌確實能夠直接生長於未經去毒性處理之纖維原料水解液，並且能夠有效地將纖維原料水解液中的木糖轉化為木糖醇。

有關本發明的特徵與實作，茲以最佳實施例詳細說明如下：

一、Candida sp .菌株於木糖溶液發酵生產木糖醇的結果

利用人工合成之木糖溶液(medium of Yeast extract,Peptone and Xylose)檢視Candida sp .菌株於木糖發酵生產木糖醇，以50mL瓶杯測試菌株在不同初始木糖濃度下的木糖醇生成情形。實驗條件控制在發酵溫度攝氏30度(℃)、培養箱震盪速度每分鐘100轉(100rpm)、發酵菌株接種量與發酵液體積比為1：6(v/v)，結果如圖2所示。發酵液中初始木糖濃度會決定木糖醇產率的高低，初始木糖濃度越高時，該菌株發酵所得之木糖醇產率會呈線性趨勢而隨之增加。在木糖濃度介於20~80g/L之間時，該菌株生產木糖醇的產率約在0.55~0.8g/g；在木糖濃度大於80g/L時，菌株生產木糖醇的產率可達0.75g/g，因此初始木糖濃度確實影響木糖醇的產率。

二、Candida sp .菌株對毒性抑制物糠醛的耐受力程度。

發酵液為滅菌配製的97g/L人工合成木糖溶液分別添加糠醛至1~3g/L的濃度範圍，發酵溫度控制在攝氏30度(℃)，培養箱震盪速度維持在每分鐘150轉(150rpm)，發酵菌株接種量與發酵液體積比為1：6(v/v)，結果由圖3所示，即使存在有3g/L高濃度的糠醛環境下，該菌株的木糖發酵能力與沒有存在糠醛時的發酵能力一樣，木糖醇產率皆能在0.7g/g以上，顯見該菌株對糠醛的耐受力達3g/L以上。

三、Candida sp .菌株利用未去毒性調理之稻稈(Rice straw)木糖水解液發酵木糖醇生成的情形

稻稈木糖水解液係以雙軸螺旋擠壓機，搭配溶洗反應槽做為前處理設備所得之液態溶液。其反應過程中，經裁切至適當尺寸的稻稈(Rice straw)首先以雙軸螺旋擠壓機破壞其結構，其操作之稀酸濃度為1~3%(w/w)；螺桿轉速為每分鐘40轉(40rpm)，反應溫度在攝氏120~130度(120~130℃)，反應時間則在10~20分鐘；進料稻稈乾重與水溶液之比例約為50:100。當上述稻稈經擠壓機處理後，再送入溶洗反應槽，並通入適量蒸汽，使稻稈乾重與水溶液之比例降至約30:100，同時提高反應溫度至攝氏160度(160℃)，並在此高溫下蒸煮20分鐘後，隨即將反應後之稻稈及水溶液排出，再經固液分離設備將反應後之稻稈及水溶液予以分離，其所得之水溶液即稱為木糖水解液，其主要組成如表1所示，其中，該水解液之木糖濃度約30~35g/L左右，將此稻稈水解液添加氫氧化鈉(NaOH)將水解液之酸鹼值調整至6.0，發酵溫度控制在攝氏30度(30℃)，培養箱震盪速度維持在每分鐘100~150轉(100~150rpm)，發酵菌株接種量與發酵液體積比為1：6(v/v)。結果如圖4所示，菌株能在合理的時間內將未去毒性水解液中之木糖完全消耗並且生成木糖醇。進一步與人工合成木糖溶液發酵比較(與圖2相對比)，在相同木糖含量的發酵情形，Candida sp .菌株利用未去毒性稻稈水解液發酵生成木糖醇的產率甚至比人工合成木糖溶液生產木糖醇的產率還高。

四、Candida sp .菌株利用未去毒性調理之蔗渣(Sugarcane bagasse)木糖水解液發酵木糖醇生成的情形

發酵液為稀酸前處理製備之蔗渣水解液，其前處理使用之稀酸濃度為1-4%，操作溫度攝氏130度(130℃)，並在此高溫下反應時間15分鐘。本案例添加氫氧化鈉(NaOH)將水解液之酸鹼值調整至6.0，發酵溫度控制在攝氏30度(30℃)，培養箱震盪速度維持在每分鐘100轉(100rpm)，發酵菌株接種量與發酵液體積比為1：6(v/v)。蔗渣水解液中木糖含量19.8~25.8g/L，抑制物糠醛含量0.14~0.52g/L，木糖醇生成量7.74~12.51g/L，整體木糖利用率為97.6~99%，如表2所示。

五、Candida 菌株利用未去毒性調理之芒草(Silvergrass)木糖水解液發酵木糖醇生成的情形。

發酵液為稀酸前處理製備之芒草水解液，其前處理使用之稀酸濃度為1-4%，操作溫度攝氏130度(130℃)，並在此高溫下反應時間15分鐘。本案例添加氫氧化鈉(NaOH)將水解液之酸鹼值調整至6.0，發酵溫度控制在攝氏30度(30℃)，培養箱震盪速度維持在每分鐘100轉(100rpm)，發酵菌株接種量與發酵液體積比為1：6(v/v)。芒草水解液中木糖含量17.5~23.14g/L，抑制物糠醛含量0.17~0.67g/L，木糖醇生成量5.59~6.13g/L，整體木糖利用率為97%，如表3所示。

六、Candida 菌株利用未去毒性調理之鳳梨皮(Pineapple peel)木糖水解液發酵木糖醇生成的情形

發酵液為稀酸前處理製備之鳳梨皮水解液，其前處理使用之稀酸濃度為2%，操作溫度攝氏130度(130℃)，並在此高溫下反應時間15分鐘。本案例添加氫氧化鈉(NaOH)將水解液之酸鹼值調整至6.0，發酵溫度控制在攝氏30度(30℃)，培養箱震盪速度維持在每分鐘100轉(100rpm)，發酵菌株接種量與發酵液體積比為1：6(v/v)。鳳梨皮水解液中木糖含量19.8g/L，發酵65小時時木糖醇生成量7.5g/L，整體木糖利用率可達97.4%，如表4所示。

七、Candida 菌株利用未去毒性調理之狼尾草(Napiergrass)木糖水解液發酵木糖醇生成的情形。

發酵液的製備方法係酸催化蒸汽爆裂做為前處理設備所得之液態溶液。前處理反應條件為稀酸濃度為2%，操作溫度攝氏180度(180℃)，在此高溫下反應時間5分鐘，後瞬間爆裂，產物經固液分離設備處理後所取得之水解液。本案例將狼尾草水解液添加氫氧化鈉(NaOH)將水解液之酸鹼值調整至6.0，發酵溫度控制在攝氏30度(30℃)，培養箱震盪速度維持在每分鐘100轉(100rpm)，發酵菌株接種量與發酵液體積比為1：6(v/v)。蔗渣水解液中木糖含量15.55g/L，抑制物糠醛含量1.19g/L，發酵40小時時木糖醇生成量5.11g/L，整體木糖利用率可達95.2%，如表5所示。

由於不同纖維原料的組成有很大差異，因此所產生之水解液的組成中，除了對菌株會具有抑制作用的糠醛存在外，亦可能有不同類型且尚未檢測出的微量抑制物。上述說明可知，本發明之Candida 菌株可應用於多種未去毒性調理之纖維水解液的木糖發酵，且皆能獲取95%以上的木糖利用效率，並維持合理的木糖醇生成效率，此顯示本發明之Candida 菌株確實對於纖維原料水解液中普遍存在的發酵抑制物具一定程度的耐受力，若應用於木糖發酵將有助於簡化木糖水解液的調理步驟，進而減少水解液調理設備的設置成本。

雖然已說明且描述了本發明之實施例，但是熟悉此項技術者可作各種修改及改良。並不意欲將本發明限制於如所說明之特殊形式，且所有不背離本發明之精神及範圍的修改都屬於如隨附之申請專利範圍中所界定之範圍內。

綜觀上述，本發明以其整體之組合與特徵而言，既未曾見諸於同類產品中，申請前亦未公開，誠已符合專利法之法定要件，依法提出發明專利之申請。

圖1木糖水解液過鹼化法調理及未去毒性調理之步驟；

圖2人工合成木糖溶液及未去毒性稻稈水解液木糖醇的產率；

圖3糠醛對木糖醇產率的影響；以及

圖4未去毒性稻稈水解液發酵生成木糖醇情形。

Claims (2)

1. 一種未去毒性纖維原料水解液生產木糖醇的方法，該方法包括將未去毒性之纖維原料以選自雙軸螺旋擠壓混酸搭配熱水溶洗反應槽、稀酸催化反應槽、酸催化蒸汽爆裂系統及其他稀酸前處理設備所組成之群組進行前處理，而獲得未去毒性之纖維原料水解液，接著於該未去毒性之纖維原料水解液中添加鹼劑將酸鹼(pH)值調整至4.5-7.0之間，並利用屬於Candida 菌屬之酵母菌株Candida sp. 作為木糖發酵菌株將未去毒性之纖維原料水解液中的木糖轉化為木糖醇之步驟。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該纖維原料係取自稻稈、蔗渣、芒草、狼尾草、鳳梨皮、柳枝稷、木材、竹子及其他生質纖維原料所組成之群組。