KR0153091B1 - 산소분압의 조절을 이용한 자일리톨의 생물공학적 제조방법 - Google Patents

산소분압의 조절을 이용한 자일리톨의 생물공학적 제조방법

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Abstract

본 발명은 캔디다 파랍실로시스 변이주(KFCC-10875호)를 탄소원으로 자일로스를 함유한 배지에서 용존산소의 농도가 0.1-5.0중량% 되도록 산소분압을 일정하게 유지하면서 발효조에서 배양함을 특징으로 하는 자일리톨의 제조방법에 관한 것이다.

Description

산소분압의 조절을 이용한 자일리롤의 생물공학적 제조방법
본 발명은 캔디다속 효모균주인 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis) 야생주를 돌연변이시켜 생성된 변이주를 이용하여 배양액 내의 산소분압을 일정하게 조절하여 변이주를 배양함으로써 고농도, 고수율로 자일리톨(xylitol)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
오탄당인 자일리톨은 높은 감미도로 인하여 식품의 여러분야에서 감미료로 응용되고 있고 특히 당뇨병 환자의 대용당과 충치의 감소에 사용되고 있다.
지금까지 자일리톨은 자일로스(xylose)로부터 환원에 의한 화학적 방법으로 생산하여 왔으나, 화학적 방법은 자일로스와 자일리톨의 분리 정제가 어렵고 알칼리를 이용한 고온 고압의 반응이므로 위험성과 폐기물 문제가 존재하는 단점이 있다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 미생물에 의한 생물공학적인 방법으로 자일리톨을 생산하고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다.
미생물에 의한 자일리톨의 생산은 효모를 이용하여 자일로스나 자일로스가 많이 함유된 반섬유소 가수분해물(Hemicellulose hydrolysate)로부터 이루어지고 있다. 공(Gong)의 논문 Biotechnol. Bioeng., 25, 87(1983)와 프리즈(Preez)의 논문 Enzyme Microb. Technol., 16, 944(1994)에 의하면 자일리톨을 비교적 많이 생산할 수 있는 효모는 캔디다 속의 블랑키(Blankii), 길리몬디(guilliermondii), 트롭피칼리스(tropicalis), 유틸리스(utilis)와 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 바알리(bailii), 룩시(rouxii), 우바리움(uvarium)과 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속의 폼브(pombe)등이 있다. 이들 균주는 다른 균주보다는 비교적 자일리톨의 생산수율이 높으나 그 생성속도가 비교적 느리며 부산물로 에탄올을 생산하는 단점을 가지고 있다.
미생물에 의한 자일리톨의 생합성은 자일로스 리덕데이지(xylose reductase)에 의하여 자일로스가 환원되어 자일리톨로 전환되어 일어난다. 생성된 자일리톨의 일부는 자일리톨 디하이드로게네이즈(xylitol dehydrogenase)에 의하여 자일룰로스(xylulose)로 산화된 후 대사경로를 거쳐 세포구성 성분이 된다. 이때 자일로스 리덕데이즈의 조효소로는 NADH와 NADPH가 관여하고, 자일리톨 디하이드로게네이즈의 조효소로는 NAD+가 관여한다. 자일로스 전환과정에서 과량의 산소가 공급되면 NAD(P)H/NAD+의 비율이 감소하여 생성된 자일리톨의 많은 부분이 자일룰로스가 되고 그 결과 균체농도가 증가하고 자일리톨의 생산성은 감소한다. 반면에 산소 공급을 제한하면 미생물의 성장속도가 떨어지고 자일리톨 생산성이 떨어진다. 그러므로 적당한 산소 분압조절은 미생물에 의한 자일리톨 생산에 매우 중요한 공정변수이다.
따라서, 본 발명자들은 성장속도가 빠르고 자일리톨을 생산할 때 에탄올을 생산하지 않는 장점을 지닌 효모 캔디다 파랍실로시스 균주를 사용하여 배양기에서 배양할 때에 산소분압을 일정농도로 조절함으로서 고농도 고수율로 자일리톨이 생성됨을 발견하였다.
한편 본 발명의 자일리톨 생성에 사용되는 균주는 캔디다 파랍실로시스의 야생균주도 사용 가능하나, 캔디다 파랍실로시스의 야생균주는 산소분압의 조절에도 불구하고 자일리톨의 생성농도가 상업화 가능할 정도로 충분치 못하였기에, 캔디다 파랍실로시스 야생균주를 돌연변이시켜 고농도, 고수율로 자일리톨이 생성 가능한 변이주를 개발하였다.
본 발명의 자일리를 생성 변이주는 NTG(Nitroso methyl Guanidine) 0.1%를 포함한 YM 배지에 야생균주를 도말하고 생성된 콜로니를 분리하는 작업을 3회 이상 반복하며 여기에서 얻어진 돌연변이주를 250-270㎚의 자외선(UV) 조사하에 자일로스를 포함하는 YM배지 도말하여 생장하는 콜로니를 다시 분리하여 수득하였다.
변이주 생성을 위해 사용되는 야생균주는 캔디다 파랍실로시스(ATCC-7336, ATCC-22019, ATCC-28474)등이 사용되고, 돌연변이시켜 얻어진 변이주의 경우 야생주에 비해 약3-5배의 자일리톨 생성효과가 있었으며 균주에서 생성되는 자일로스 리덕데이즈의 역가도 4배 이상임이 확인되었다. 또한 본 발명에 사용된 균주는 종래의 캔디다 파랍실로시스보다 자일리톨 생성효과가 최소 3배 이상 향상된 돌연변이주로서 한국미생물보존협회에 1995년 10월 27일 기탁번호 KFCC-10875호로 기탁하였다.
따라서 본 발명의 목적은 캔디다 파랍실로시스 변이주(KFCC-10875호)를 탄소원으로 자일로스를 함유한 배지에서 용존산소의 농도가 0.1-5.0% 중량% 되도록 산소분압을 일정하게 유지하면서 배양하여 고농도, 고수율로 자일리톨을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
냉동보관(-70℃ 증인) 캔디다 파랍실로시스 변이주(KFCC-10875호)를 YM배지(포도당 20g/1, 펩톤 5g/1, 효모 추출물 3g/1, 맥아 추출물 3g/1로 구성) 50ml가 들어있는 250ml 플라스크를 진탕 배양기에서 240rpm, 28-32℃로 14-18시간 종배양하였다. 이 배양액을 발효배지(자일로스 50g/1, 효모 추출물 5g/1, 이인산칼륨 5g/1, 황산암모늄 2g/1, 황산마그네슘 0.4g/1 등을 포함)가 50ml 들어있는 250ml 플라스크 또는 발효배지가 3L 들어있는 5L 발효조에 접종하여 28-32℃로 본배양하였다. 플라스크 배양에서는 산소공급정도를 교반속도로 조절하였고, 발효조 배양에서는 통기량(0.2-1.0vvm)과 교반속도 (100-500rpm)를 조절하여 산소전달속도 계수(KLA) 용존산소 농도를 일정하게 유지하여 배양하였다. 플라스크의 pH는 조절하지 않았고 발효조의 pH는 발효 전과정 동안 4-5로 조절하였다.
특히 플라스크 배양시 교반속도를 100-200rpm으로 조절하여 산소공급정도를 조절하였으며, 발효조 배양시 산소전달속도 계수(KLA)는 10-70/hr로 조절하고, 용존산소의 농도도 0.1-5.0중량% 범위로 조절하여 배양하였다.
또한 발효조를 이용한 본 발명의 배양시 생성되는 자일로스 농도를 100-1200g/L로 조절하여 회분식 또는 유가식(fed batch) 방법으로 배양하는 것이 바람직하다.
발효가 끝난 발효액은 원심분리기(Beckman Co.)에서 8500-10000rpm의 회전 속도로 균체와 분리하고 상등액을 취하여 막여과기로 20-28시간 투석한 후 액을 취하여 30℃에서 5℃까지 순차적으로 온도를 조절하여 결정을 만들고 이 결정을 여과에 의하여 농축한 후 열풍건조기로 건조하여 결정형 분말을 제조하였다.
자일로스와 자일리톨의 농도는 Sugar-Pak 1 칼럼이 장착된 HPLC(Shimadzy C-R7A, Japan)을 이용하여 측정하였다. 이 때, 용매는 물을 사용하였고, 온도는 90℃이고, 유속은 0.5ml/분이였다. 균체농도는 탁도계를 이용하여 600㎚에서 현탁도를 측정하여 미리 측정한 표준곡선과 비교하여 건조중량으로 환산하였다. 용존산소농도 및 산소전달속도 계수는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소 전극을 사용하여 측정하였다.
다음 실시예와 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예1]
종배양 : 냉동보관(-70℃)중인 변이주 캔디다 파랍실로시스(KFCC-10875호)를 YM 배지 50ml가 들어있는 250ml 플라스크에 250rpm의 교반속도로 30℃로 16시간 배양하였다.
본배양 : 종 배양액을 발효배지 50ml가 들어있는 250ml 플라스크에 접종한 후, 진탕배양기에서 교반속도를 변화시키면서 30℃의 온도로 통기량은 1.0-1.2vvm, 교반속도는 100-240rpm으로 변화시켜 자일로스가 완전히 소모될 때까지 배양한 결과를 표1에 나타내었다.
[실시예2]
종배양은 실시예1과 같고, 본 배양에서 발효배지가 3L인 5L 발효조를 사용 배양하였다. 배지의 pH는 발효 전과정 동안 4.5로 조절하였고 배양온도는 30℃, 통기량은1.0vvm하고 교반속도를 조절하여(100-300rpm) 산소전달속도 계수를 변화시키면서 자일로스가 완전히 소모될 때까지 배양한 결과를 표2에 표시하였다.
[실시예3]
배양방법은 실시예 2와 같고, 배양초기에서는 용존산소 농도를 충분히 유지시켰고, 균체농도가 3g/1되는 시점부터 통기량(0.2-1.0vvm)과 교반속도(100-500rpm)를 조절하여 용존산소 농도를 일정하게 유지시켰다. 용존산소 농도를 변화시켜 자일로스가 완전히 소모될 때까지 배양한 결과를 표3에 표시하였다.
이러한 결과는 현재까지 문헌에 보고된 다른 결과들에 비하여 용적 생산성이 약 2-3배 정도 높은 고생산성 제조방법이다.
[비교예1]
실시예 2와 3과 같은 방법으로 서로 다른 4개의 공시 효모균주를 선발하여 용존산소 농도를 0.5%에서 2.5% 범위로 조절하면서 배양한 결과 50g/1의 자일로스로부터 다음과 같은 결과를 얻었다.
[실시예4]
고농도의 자일로스에서는 자일리튤의 생산은 저해 받지 않지만 균체성장이 저해를 받으므로 배양초기에는 150g 자일로스가 첨가된 2L 배양액으로 배양하였고, 균체농도가 7g/1되는 시점(배양시간 10시간)부터 750g의 자일로스를 30시간 동안 첨가하여 최종 배양액이 3L가 되게 하는(총 첨가된 자일로스 농도는 300g/1에 해당)유가식 배양을 수행하였다. 배양초기에는 용존산소 농도를 충분히 유지시켰고, 배양시간 10시간 이후에서는 통기량(0.2-0.5vvm)과 교반속도(100-500rpm)를 조절하여 용존산소 농도를 0.8-1.2%로 일정하에 유지시켰다. 나머지 배지성분 및 방법은 실시예2와 같았다. 배양결과 272시간에서 자일로스를 모두 소모하였으며 자일리톨의 생산성은 242/1이였고, 자일로스로부터 자일리톨의 생산수율은 80.7%이였고 평균 용적 생산성은 0.9g-자일로스/1-hr를 얻었다.

Claims (4)

  1. 탄소원으로 자일로스를 함유한 배지에서 용존산소의 농도가 0.1-5.0중량% 되도록 발효조내의 산소전달계수(KLA)를 10-70/hr로 조절하여 산소분압을 일정하게 유지하면서 캔디다 파랍실로시스 변이주(KFCC-10875호)를 배양하여 자일리톨을 생성시키고, 배양조내의 균체 등을 제거하여 생성된 자일리톨을 분리 정제시킴을 특징으로 하는 자일리톨의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 캔디다 파랍실로시스 변이주(KFCC-10875호)는 야생균주를 NTG(Nitroso methyl Guanidine) 0.1%를 포함한 YM배지에 야생균주를 도말 생성된 콜롤니를 분리하는 작업을 3회 이상 반복하고, 얻어진 돌연변이주를 250-270㎚의 자외선(UV)에 조사 자일로스를 포함하는 YM배지에 도말하여 생장하는 콜로니를 다시 분리하여 수득됨을 특징으로 하는 자일리톨의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 발효조를 이용한 배양은 배양액 내의 자일로스 농도를 100-1200g/L로 조절하여 회분식 또는 유가식(fed batch) 방법으로 배양하는 것임을 특징으로 하는 자일리톨의 제조방법.
  4. 자일리톨을 생성하는 캔디다 파랍실로시스 변이주(KFCC-10875호).
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