KR0169061B1

KR0169061B1 - 배양조건 최적화를 통한 자일리톨의 제조방법

Info

Publication number: KR0169061B1
Application number: KR1019960013638A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 김상용; 최진환
Original assignee: 정기련; 주식회사보락; 담철곤; 동양제과주식회사
Priority date: 1996-04-30
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 1999-01-15
Also published as: KR970070186A

Abstract

본 발명은 YM 배지에서 종배양된 캔디다 파랍실로시스 변이주 KFCC-10875호를 자일로스 5~12(w/v)%, 효모추출물 0.2~2.0(w/v)%, 황산암모늄 0.2~2.0(w/v)%, 이인산칼륨(0.2~2.0(w/v)% 및 황산마그네슘 0.01~0.2(w/v)%를 포함하는 배양 배지에서 배양함을 특징으로 하는 고수율 자일리톨의 제조방법에 관한 것이다.

Description

배양조건 최적화를 통한 자일리톨의 제조방법

본 발명은 캔디다 팔랍실로시스 변이주(Candida parapsilosis ATCC-21019호 돌연변이주로 한국미생물보존협회 기탁번호 KFCC-10875호로 기탁)에 의한 자일리톨(xylitol) 생산시 특수한 배양조건을 유지시켜 줌으로서 자일리톨의 생산성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

감미료, 당료병 환자의 대용당, 충치의 감소용당 등으로 사용되고 있는 오탄당인 자일리톨은 자일로스(xylose)가 많이 함유된 반섬유소 가수분해물(hemicellulose hydrolysate)을 환원시키는 화학적 방법으로부터 생산하여 왔으나, 화학적 방법은 자일로스 또는 자일리톨과 반섬유소 부분에서 생기는 다른당의 고분자들과의 분리와 정제가 어렵고 그수율도 50~60% 정도로 낮다. 또한 알칼리를 이용한 고온고압의 반응이므로 위험성과 폐기물 문제가 존재하는 단점이 있다.

이러한 단점을 해결하기 위하여 미생물에 의한 자일리톨 생산방법에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 미생물에 의하여 자일리톨을 생산할 때에는 배지에 탄소원, 질소원, 무기염 및 여러 가지 비타민을 적당량 첨가해 주어야 하고, pH, 온도, 교반속도 및 통기량 등을 적절히 조절하여야만 자일리톨의 생산성을 향상시킬 수 있다. 그러나, 아직까지 미생물에 의한 자일리톨 생산시 배지 및 배양조건의 최적화에 대한 단편적인 보고는 되어 있으나 배양조건의 전반적인 검토를 시도한 예는 보고된바 없다.

자일리톨 생산시 탄소원의 경우는 자일로스나 자일로스가 많이 함유된 반섬유소 가수분해물로 국한되므로 질소원이나 무기염의 조절은 자일리톨 생산에 중요한 인자이다. 또한 캔디다 파랍실로시스의 영양요구성은 비교적 복잡하여 화학합성배지(chemical synthetic medium)에서는 거의 생산되지 않아 여러 가지 비타민을 첨가해 주어야만 한다. 이러한 문제점은 효모 추출물, 맥아 추출물, 대두박등 여러 가지 비타민이 함유된 복합 질소원을 사용하면 된다. 돌연변이주 캔디다 파랍실로시드 KFCC-10875호를 사용한 배양조건 실험중 일부인 교반속도 및 산소분압에 대하여는 본 발명자들이 이미 최적화를 수행하여 고농도 자일리톨이 생산하여 특허출원(한국특허 출원번호 제95-37516호)을 하였다.

따라서, 본 발명자들은 캔디다 파랍실로시스 KFCC-10875호를 이용하여 발효배지 및 배양조건을 적절히 조절하면 자일리톨의 생산성이 증감됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 YM 배지에서 종배양된 캔디다 파랍실로시스 변이주 KFCC-10875를 자일로스 5~12(w/v)%, 효모추출물 0.2~2.0(w/v)%, 황산암모늄 0.2~2.0(w/v)%, 이인산칼륨 0.2~2.0(w/v)% 및 황산마그네슘 0.01~0.2(w/v)%를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 고수율로 자일리톨을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 이때 배양 배지의 pH는 4.5~5.5로 조절하는 것이 가장 바람직하며, 배양온도 역시 27~33℃로 조절하는 것이 자일리톨의 생성에 최적임을 발견하였다.

위와 같은 조건으로 자일리톨을 발효 생성시 종래의 자일리톨 생산에 많이 사용되는 YMP 배지(yeast extract-malt extract-pepton)를 이용하여 자일리톨을 발효 생성시 보다 약 30~50%의 수율의 향상이 있었다. 따라서 본 발명은 종래의 자일리톨 생성 배지 조성에서 일부 조성을 변화시켜 최적의 배양 배지를 제공함을 또다른 목적으로 한다.

본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

냉동보관(-70℃)중인 돌연변이주 캔디다 파랍실로시스 KFCC-10875호를 YM배지(포도당 18~22g/L, 펩톤 4~6g/L, 효모추출물 2.5~3.5g/L, 맥아 추출물 2.5~3.5g/L로 구성) 40~60ml가 들어있는 250ml 플라스크를 진탕 배양기에 220~260, 28~32℃로 12~18시간 배양하였다. 이 배양액을 자일로스 5~12(w/v)%, 효모추출물 0.2~2.0(w/v)%, 황산암모늄 02.~2.0(w/v)%, 이인산칼륨 0.2~2.0(w/v)% 및 황산마그네슘 0.01~0.2(w/v)%를 포함하는 배양 배지에 배양하였고, 동 배양의 자일리톨 생성을 비교하기 위해 배양액 내의 질소원 및 무기염의 농도를 변화시키며 자일리톨 생성 정도를 비교하였다. 플라스크 배양에서는 발효배지 40~60ml 가 들어있는 250ml 플라스크를 이용하였고, 발효조 배양에서는 발효배지가 3L인 5L 발효조를 이용하여 배양 조건인 pH와 온도를 달리하여 배양하였다.

이때, 플라스크 배양에서는 산소공급정도를 교반속도로 조절하였고, 발효조 배양에서는 통기량(0.2~1.0vvm)과 교반속도(100~500rpm)를 조절하여 용존산소 농도를 0.8~1.2%로 일정하게 유지하여 배양하였다. 플라스크 pH는 초기를 5.0으로 한후 조절하지 않았고 발효조의 pH는 발효 전과정 동안 일정하게 조절하였다.

자일로스와 자일리톨의 농도는 Sugar-Pak I 칼럼이 장착된 HPLC(Shimadzu C-R7A, Japan)를 이용하여 측정하였다. 이때, 용매는 물을 사용하였고, 온도는 90℃이고, 유속은 0.5ml/분 이었다. 균체농도는 탁도계를 이용하여 600nm에서 현탁도를 측정하여 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 건조중량으로 환산하였다. 용존산소농도는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소 전극을 사용하여 측정하였다.

이하 본 발명을 실시예 및 비교예에 따라 상술한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

종 배양 : 냉동보간(-70℃)중인 균주 캔디다 파랍실로시트 KFCC 10875호를 YM 배지 50ml 가 들어있는 250ml 플라스크 250rpm에서 30℃로 16시간 배양하였다.

본 배양 : 종 배양액을 발효배지 50ml 함유된 250ml 플라스크에 접종한 후, 진탕배양기로 190rpm에서 30℃로 72시간 동안 배양하였고 배지의 pH는 발효초기에 5.0으로 조절한 후 조절하지 않았다. 이때 배지성분은 자일로스 50g/L, 황산암모늄 2g/L, 이인살칼륨 5g/L, 황산마그네슘 0.4g/L 이었고, 질소원으로 효모추출물 (yeast extract)을 5g/L 첨가하여 72시간 동안 배양한 결과를 표 1에 나타내었다.

[비교예 1]

질소원으로 효모추출물 대신 효모질소(yeast nitrogen base), 맥아추출물(malt extract), 펩톤(pepton), 트립톤(trypton), 대두박(soybean flour), 옥수수침지액(corn steep liquor) 중 하나를 선택한 후 실시예 1과 동일하게 배양하였다. 배양한 결과를 표 1에 나타내었다.

[실시예 2]

배양방법은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효배지를 자일로스 50g/L, 효모추출물, 황산암모늄 2g/L, 이인산칼륨 5g/L, 황산마그네슘 0.4g/L로하여 이중 효모 추출물의 농도를 변화시켜 72시간 동안 배양한 결과를 표2에 표시하였다.

[실시예 3]

배양방법을 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효배지를 자일로스 50g/L, 효모추출물 5g/L, 황산암모늄, 이인산칼륨 5g/L, 황산마그네슘 0.4g/L로 하고 이 중에 황산암모늄의 농도를 변화시켜 72시간 동안 배양한 결과를 표 3에 표시하였다.

[실시예 4]

배양방법을 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효배지를 자일로스 50g/L, 효모추출물 5g/L, 황산암모늄 5g/L, 이인산칼륨 황산마그네슘 0.4g/L로 하고 이 중 이인산칼륨의 농도를 변화시키면서 72시간 동안 배양한 결과를 표 4에 표시하였다.

[실시예 5]

배양방법을 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효배지를 자일로스 50g/L, 효모추출물 5g/L, 이인산칼륨 5g/L, 황산암모늄 5g/L, 황산마그네슘로 하고 이 중 황산마그네슘의 농도를 변화시키면서 72시간 동안 배양한 결과를 표 5에 표시하였다.

[실시예 6]

종 배양은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효배지(자일로스 50g/L, 효모추출물 5g/L, 황산암모늄 5g/L, 이인산칼륨 5g/L, 황산마그네슘 0.2g/L)가 3L인 5L 발효조를 사용하여 배양하였다. 배양온도 30℃에서 pH는 5로하여 실험을 수행하였다. 배양초기에서는 용존산소 농도를 충분히 유지시켰고, 균체농도가 3g/L되는 시점부터 통기량(0.2~1.0vvm)과 교반속도(100~500rpm)를 조절하여 용존산소 농도를 0.8~1.2% 유지시켰다. 결과는 표6에 나타내었다.

[비교예 2]

배양방법과 발효배지는 실시예 6과 같고, 배양온도 30℃에서 여러 pH별로 실험을 실시하였다. pH를 변화시켜 자일로스가 완전히 소모될 때가지 배양한 결과를 표 6에 나타내었다.

[실시예 7]

배양방법과 발효배지는 실시예 6과 같고, 본 배양에서 배양 pH는 5로하여 배양온도별 실험을 수행하였고 배양한 결과를 표 7에 표시하였다.

[실시예 8]

고농도의 자일로스에서는 자일리톨의 생산은 저해 받지 않지만 균체성장이 저해를 받으므로 배양초기에는 150g 자일로스가 첨가된 2L 배양액으로 배양하였고, 균체농도가 7g/L 되는시점(배양시간 10시간)부터 750g의 자일로스를 30시간 동안 첨가하여 최종 배양액이 3L가 되게 하는(총 첨가된 자일로스 농도는 300g/L에 해당)유가식 배양을 수행하였다. 배양 pH와 온도는 각각 5와 30℃로 하여 배양하였다. 배양초기에는 용존산소 농도를 충분히 유지시켰고, 배양시간 10시간 이후에서는 통기량(0.2~0.5vvm)과 교반속도(100~500rpm)를 조절하여 용존산소 농도를 0.8~1.2%로 일정하게 유지시켰다. 나머지 배지성분 및 방법은 실시예 6과 같았다. 배양결과 265시간에서 자일로스를 모두 소모하였으며 자일리톨의 생산량은 248g/L 이였고, 자일로스로부터 자일리톨의 생산수율은 82.7% 이였고 평균 용적 생산량은 0.94-자일로스/L-hr를 얻었다.

[실시예 9]

종 배양은 실시예 1과 같고, 균체 농축을 위한 전단계 배양에서는 발효배지(자일로스 30g/L, 효모추출물 5g/L, 황산암모늄 5g/L, 이인산칼륨 5g/L, 황산마그네슘 0.2g/L)가 3L인 5L 발효조 3대를 사용하여 배양하였다. 배양액 6000rpm에서 10분간 원심분리한 후 농축된 균체를 접종하여 5L 발효조에 발효배지 (자일로스 50g/L 그외의 성분은 전단계 배양과 동일)가 2L 되게 하였다. 발효조건은 실시예 8과 같았다. 시간에 따른 균체농도, 자일로스 농도 및 자일리톨 농도는 표9와 같다. 배양결과 자일로스로부터 자일리톨의 생산수율은 80% 이였고 평균 용적 생산성은 2.22g-자일로스/L-hr를 얻었다.

Claims

YM 배지에서 종배양된 캔디다 파랍실로시스 변이주 KFCC-10875호를 자일로스 5~12(w/v)%, 효모추출물 0.2~2.0(w/v)%, 황산암모늄 0.2~2.0(w/v)%, 이인산칼륨 0.2~2.0(w/v)% 및 황산마그네슘 0.01~0.2(w/v)%를 포함하는 배양 배지에서 배양함을 특징으로 하는 고수율 자일리톨의 제조방법.
제1항에 있어서, YM 배지는 포도당 18~22g/L, 펩톤 4~6g/L, 효모추출물 2.5~3.5g/L, 맥아 추출물 2.5~3.5g/L로 구성되어 있음을 특징으로 하는 고수율 자일리톨의 제조방법.
제1항에 있어서, 배양배지의 pH는 4.5~5.5로 조절하고, 배양온도는 27~33℃로 조절함을 특징으로 하는 고수율 자일리톨의 제조방법.