KR102630101B1 - 아미노산을 포함하는 허비시딘 생산용 배지 조성물 - Google Patents
아미노산을 포함하는 허비시딘 생산용 배지 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 허비시딘 생산용 배지 조성물; 허비시딘 생산용 조성물; 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주를 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 허비시딘 생산 방법; 또는 허비시딘 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 허비시딘 생산용 배지 조성물; 허비시딘 생산용 조성물; 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주를 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 허비시딘 생산 방법; 또는 허비시딘 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
세계 인구 증가에 따른 식량 수요가 증가함에 따라, 제한된 경지 면적 내에서 작물의 생산성을 증대시키는 것은 식량의 안정적 공급 차원에서 중요한 과제 중 하나이다. 이러한 기술적 배경 하에서, 농경지에서 잡초의 발생은 작물과의 물, 양분 경합으로 인해 작물의 수량 감소와 품질의 저하를 야기한다. 잡초에 의한 작물의 수량 감소는 작물에 따라 편차가 존재하나, 약 30 내지 100%에 달하는 것으로 보고된 바 있으며, 이에 따라, 작물의 생산성을 증대시키는 기술로서 잡초의 방제는 매우 큰 비중을 차지하고 있다. 특히, 최근 농촌 인구의 급격한 감소에 따른 노동력 부족과 고령화에 따라 농업 생산비 절감을 위하여, 잡초의 방제를 위한 제초제 사용은 필수적이다.
그러나, 오랫동안 사용된 유기합성 제초제로 인한 환경오염 문제가 극심하여 최근에는 친환경 제초제의 필요성이 대두되고 있다. 그에 따라, 친환경 제초제 및 이의 제조방법에 대한 개발이 활발히 수행되고 있다(KR 10-2011-0006507 A). 그 중, 미생물이 생산하는 제초활성 성분의 경우 친환경적이면서도 제초활성이 우수하여 새로운 제초제 개발의 주성분으로 각광을 받고 있다.
한편, 허비시딘(Herbicidin)은 스트렙토마이세스 속 균주가 생산하는 대사체의 일종으로, 제초 활성 등 다양한 생물활성을 가진 것으로 알려진 성분이다. 허비시딘은 우수한 제초 활성 등의 유용한 생물활성을 나타내는 물질이나, 아직까지 허비시딘을 높은 생산량으로 생합성 할 수 있는 기술에 대한 개발이 미비한 실정이다. 이에, 허비시딘을 포함하는 친환경 제초제의 제조를 위해 미생물 발효를 통한 고효율 생산, 대량 생산 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 허비시딘 생산용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주 또는 이의 배양물 및 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 허비시딘 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주를 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 허비시딘 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주를 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 허비시딘 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 하나의 양태는 아미노산을 포함하는, 허비시딘 생산용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "허비시딘 (herbicidin)"은 스트렙토마이세스 속 토양 방선균 유래 대사산물로서, 제초 활성, 항조류 활성 및 항진균 활성 등을 나타내는 것으로 보고되었다. 허비시딘은 아데노신-유래 뉴클레오시드 항생제로서, 특이적인 트리사이클릭 코어 구조를 가진다. 상기 허비시딘은 허비시딘 A(herbicidin A), 허비시딘 B(herbicidin B), 허비시딘 C(herbicidin C), 허비시딘 F(herbicidin F), 허비시딘 H(herbicidin H) 또는 이들 중 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 허비시딘은 허비시딘 A 일 수 있다. 본 발명에서 용어 "허비시딘 A(herbicidin A)"는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 상기 허비시딘 중 가장 널리 알려진 성분으로, 살초력 및 향균력이 우수한 것으로 알려져 있다.
[화학식 1]
허비시딘은 강력한 살초력을 가진 친환경 제초제 성분으로 떠오르고 있으나, 이의 고수율 생산이 가능한 시스템에 대한 연구가 아직 미비한 실정이다. 본 발명은 특정 아미노산의 첨가를 통해 스트렙토마이세스 속 균주를 이용한 허비시딘 화합물 생합성 효율을 현격히 증가할 수 있음을 규명한 것에 주요한 기술적 의의를 가진다.
본 발명의 보다 구체적인 양태는 이소류신, 글루타민, 류신 및 프롤린 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 허비시딘 생산용 배지 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 배지 조성물은 허비시딘 생산용 균주를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "미생물" 또는 "균주"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 허비시딘 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물 역시 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 허비시딘 생산용 균주는 자연적으로 허비시딘 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 허시비딘 생산능이 없는 모균주에 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어나 허비시딘 생산능이 강화되거나 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 허비시딘 생산용 균주는 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) 속 균주일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 허비시딘 생산용 균주는 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 스트렙토마이세스 스코풀리리디스(Streptomyces scopuliridis) 균주는 수탁번호 KCTC 12156BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 KR-001 균주일 수 있으며, 다른 일 예로 KR-001 균주를 모균주로 하는 수탁번호 KCTC 13057BP로 기탁된 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 N29 균주일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "이소류신(isoleucine)"은 비극성 아미노산의 일종으로서 분자식은 C6H13NO2이다. 상기 이소류신은 하기 화학식 2로 표시된다. 이소류신은 아이소류신, 이소루신, 아이소루신 등의 명칭으로도 혼용되며, Ile, I 등으로 약기된다. L-이소류신은 각종 단백질에 존재한다. D-이소류신은 항생물질 바시트라신의 구성성분이지만 단백질 속에는 존재하지 않는다. 그 밖의 입체이성질체로 L- 및 D-알로이소류신이 있으며, L-이소류신은 필수아미노산의 하나이다.
[화학식 2]
본 발명에서 용어 "글루타민(glutamine)"은 극성 중성 아미노산의 일종으로서 글루탐산의 모노아미드이다. 글루타민은 Gln, Q 등으로 약기된다. 글루타민의 분자식은 C5H10N2O3으로, 하기 화학식 3으로 표시된다. 글루타민은 바늘 모양의 결정 형태이다. 글루타민은 생체 내에서는 아미노산의 저장 역할을 수행하며, 또한 핵산의 퓨린 핵 생성에 관여하며 해독기능 등을 수행한다.
[화학식 3]
본 발명에서 용어 "류신(leucine)"비극성 아미노산의 일종으로서 루신, α-아미노이소카프론산이라고도 명명되며, Leu, L 등으로 약기된다. 상기 류신의 분자식은 C6H13NO2이며, 하기 화학식 4로 표시된다. 류신은 유리 상태로 자연계에 널리 분포한다. 여러 방향 화합물의 전구 물질이며, 식품 첨가물 중의 하나로 영양 강화제, 향미 증진제로도 이용된다.
[화학식 4]
본 발명에서 용어 "프롤린(proline)"비극성 아미노산의 일종으로서, Pro, P 등으로 약기된다. 프롤린의 분자식은 C5H9NO2. 이며, 하기 화학식 5로 표시된다. 프롤린은 약간의 단맛이 있고 흡습성이 있는 기둥 모양 결정 형태이다. 프롤린은 생체 내에서는 글루탐산으로부터 만들어지며, 식품 첨가물의 하나로 영양 강화제 등으로도 이용된다.
[화학식 5]
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 첨가한 배지에서 허비시딘 생산용 균주를 배양하여 허비시딘을 생합성하였을 때, 이를 첨가하지 않은 배지에 비하여 허비시딘 생산량이 현저히 증대되었음을 확인하였다. 상기 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 외의 아미노산을 단독으로 첨가한 배지의 경우, 오히려 허비시딘 생산량이 감소하거나 허비시딘의 생산이 되지 않아, 이러한 허비시딘의 생합성량 증대가 상기 아미노산의 특이적인 효과임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 배지 조성물은 허비시딘 생산량이 현저히 증대된 허비시딘 고생산용 배지 조성물일 수 있다.
일 예로, 상기 배지 조성물은 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하지 않은 배지 조성물에 비하여, 허비시딘 생산능이 약 10% 이상, 구체적으로는 약 11%, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 또는 약 80% 이상 높아진 것일 수 있으나, 허비시딘 생산능이 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산의 첨가 전에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "배지"는 허비시딘 생산용 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다.
구체적으로, 상기 아미노산은 전체 배지 조성물 대비 0.001 내지 5.0 농도(%)로 포함될 수 있고, 구체적으로 전체 배지 조성물 대비 약 0.05 내지 5 농도(%), 약 0.05 내지 4 농도(%), 약 0.05 내지 3 농도(%), 약 0.05 내지 2 농도(%), 약 0.05 내지 1.5 농도(%),약 0.05 내지 1 농도(%) 약 0.08 내지 2 농도(%), 약 0.08 내지 1.5 농도(%), 약 0.08 내지 1 농도(%), 약 0.1 내지 1.5 농도(%), 약 0.1 내지 1.2 농도(%), 약 0.1 내지 1 농도(%), 또는 약 0.1 내지 0.9 농도(%)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 이소류신은 전체 배지 조성물 대비 0.1 내지 1.0 농도(%)로 포함될 수 있고, 구체적으로 전체 배지 조성물 대비 0.1 내지 0.7% 농도(%), 보다 구체적으로 전체 배지 조성물 대비 0.1 내지 0.5% 농도(%) 또는 0.17 내지 0.45 농도(%), 보다 더 구체적으로 0.18 내지 0.42 농도(%)로 포함될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 배지 조성물에 이소류신이 상기와 같은 같은 농도(%) 범위로 포함될 때, 상기 범위의 상한선 및 하한선을 전후로 허비시딘 생산량의 증가폭이 크게 증가함을 확인하여, 이소류신을 특정 농도 범위로 포함할 때 특히 허비시딘의 고생산이 가능할 수 있음을 시사한다.
일 구현예에서, 상기 글루타민은 전체 배지 조성물 대비 0.1 내지 1.0 농도(%)로 포함될 수 있고, 구체적으로 전체 배지 조성물 대비 0.1 내지 0.7% 농도(%), 보다 구체적으로 전체 배지 조성물 대비 0.2 내지 0.8% 농도(%) 또는 0.3 내지 0.75 농도(%), 보다 더 구체적으로 0.3 내지 0.7 농도(%)로 포함될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 배지 조성물에 글루타민이 상기와 같은 같은 농도(%) 범위로 포함될 때, 상기 범위의 상한선 및 하한선을 전후로 허비시딘 생산량의 증가폭이 크게 증가함을 확인하여, 글루타민을 특정 농도 범위로 포함할 때 특히 허비시딘의 고생산이 가능할 수 있음을 시사한다.
일 구현예에서, 상기 류신은 전체 배지 조성물 대비 0.1 내지 1.0 농도(%)로 포함될 수 있고, 구체적으로 전체 배지 조성물 대비 0.2 내지 1.0% 농도(%)로 포함될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 배지 조성물에 글루타민이 상기와 같은 같은 농도(%) 범위로 포함될 때 허비시딘 생산량이 우수함을 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 프롤린은 전체 배지 조성물 대비 0.1 내지 1.0 농도(%)로 포함될 수 있고, 구체적으로 전체 배지 조성물 대비 0.2 내지 1.0% 농도(%)로, 보다 구체적으로 전체 배지 조성물 대비 0.2 내지 0.7% 농도(%), 0.3 내지 0.8 농도(%), 0.4 내지 0.9 농도(%)로 포함될 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 특정 아미노산을 특정 범위의 농도로 배지에 첨가시 스트렙토마이세스 속 균주를 이용한 허비시딘 화합물 생합성 효율을 극대화할 수 있음을 규명한 것에 또 다른 주요한 기술적 의의를 가진다.
본 발명의 배지는 이소류신, 글루타민, 류신 및 프롤린 중 한 종류의 아미노산을 단독으로 포함하는 것일 수 있으며, 본 발명자들은 상기 이소류신, 글루타민, 류신 및 프롤린 중 한 종류를 배지 조성물에 단독으로 포함하는 경우에도 대조구에 비해 허비시딘의 생산량이 크게 증가함을 실시예에서 확인하였다.
본 발명의 배지는 이소류신, 글루타민, 류신 및 프롤린 중 두 종류 이상의 아미노산의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 배지는 a) 이소류신 및 글루타민, b) 이소류신 및 류신, c) 이소류신 및 프롤린, d) 글루타민 및 류신, e) 글루타민 및 프롤린, 또는 f) 류신 및 프롤린을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 이소류신, 글루타민, 류신 및 프롤린 중 두 종류 이상의 아미노산을 혼합하여 첨가한 경우에도 허비시딘에 대한 생산량이 우수하게 증가됨을 확인하였다.
다른 일 구현예에서, 본 발명의 배지는 이소류신, 글루타민, 류신 및 프롤린 중 세 종류 이상, 또는 네 종류의 아미노산의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
위와 같이 본 발명의 배지 조성물이 두 종류 이상의 아미노산의 혼합 시료를 포함하는 경우에도, 각 아미노산의 농도(%)는 전술한 바와 같이 포함될 수 있다. 또한, 상기 아미노산의 혼합 시료는 전체 배지 조성물 대비 0.001 내지 5.0 농도(%)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 본 발명의 배지 조성물은 허비시딘 생산에 필요한 물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 스트렙토마이세스 속 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 이미 포함하는 통상의 배지이거나, 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 더 포함할 수 있으면서 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있다.
본 발명의 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지에서 온도, pH 등이 조절된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 예로, 상기 탄소원은 포도당 및 감자전분을 포함하는 것일 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 예로, 상기 질소원은 대두분을 포함하는 것일 수 있다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 외의 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 배지는 미량의 ZnSO4-7H2O(Zinc sulfate heptahydrate), 니코틴산(Nicotinic acid), 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 허비시딘 생산용 균주 또는 이의 배양물; 및 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 허비시딘 생산용 조성물을 제공한다.
이 때, 허비시딘, 허비시딘 생산용 균주, 이소류신, 글루타민, 프롤린, 및 류신의 정의는 전술한 바와 동일하다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 허비시딘 생산용 균주를 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 허비시딘 생산 방법을 제공한다. 이 때, 상기 허비시딘 생산용 균주는 스트렙토마이세스 속 균주일 수 있으며, 보다 구체적으로 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 허비시딘 생산방법은, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 상기 허비시딘 생산용 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 허비시딘 생산 방법은, 상기 배양하는 단계 이전에, 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주를 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지에 접종하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "배양"은 본 발명의 스트렙토마이세스 속 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서, 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지를 이용하는 한, 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 스트렙토마이세스 속 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 외의 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양에서 배양온도는 20 내지 35℃구체적으로는 25 내지 30℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양은 약 10시간 내지 20일, 약 1일 내지 10일, 약 3일 내지 9일, 약 4일 내지 8일, 또는 약 5일 내지 7일의 배양기간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양에 의하여 생산된 허비시딘은 배지 중으로 분비되거나 미생물 내에 잔류할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 허비시딘 생산 방법은 상기 배지 또는 균주로부터 허비시딘 A를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에, 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 허비시딘을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 세포 파쇄, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 허비시딘을 회수할 수 있다.
또한, 본 발명의 허비시딘 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 발명의 허비시딘 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 이시적(또는 연속적)으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 스트렙토마이세스 속 균주를 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 허비시딘 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
이 때, 스트렙토마이세스 속 균주, 이소류신, 글루타민, 프롤린, 류신, 배지, 배양 및 허비시딘의 정의는 전술된 바와 동일하다.
본 발명의 배지 조성물은 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함함에 따라, 종래 배지 조성물에 비하여, 스트렙토마이세스 속 균주를 이용한 허비시딘 화합물의 생합성 효율을 현저히 증가시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미생물 제초제 대량 생산을 위한 배양 조건 최적화
먼저, 허비시딘 고생산을 위해 배지의 유효성분으로서 적합한 아미노산 성분을 탐구하고자 하였다.
구체적으로, 포도당, 감자전분, 대두분이 주성분으로, 미량성분으로 ZnSO4-7H2O(Zinc sulfate heptahydrate) 1.5mM 및 니코틴산(Nicotinic acid) 0.5mM가 포함된 기본배지에 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 N29 변이주를 접종하여 대조구로 사용하고, 상기의 기본배지에 17가지 아미노산 각각을 0.6% 농도로 첨가한 실험구를 제조하여 동량의 N29 변이주를 접종한 후 6일간 배양하였다.
배양 5일째, 6일째에 배양액을 수집하여 메탄올과 1대1로 혼합하고 원심분리한 후 허비시딘 함량을 조사하기 위하여 HPLC 분석을 실시하였다. 대조구 및 17가지 각각의 아미노산을 첨가하여 배양한 실험구의 허비시딘 생산량을 분석한 결과를 표 1에 나타내었다.
| Herbicidin | 5DAT (g/L) | 6DAT (g/L) | 대조구 대비 생산량(%)* |
| Control | 1.76 ± 0.02 | 1.837 ± 0.04 | 100 |
| Alanine | 0.56 ± 0.02 | 0.308 ± 0.06 | 17 |
| Arginine | 0.06 ± 0.01 | 0.023 ± 0.00 | 1 |
| Asparagine | 0.00 ± 0.00 | 0 ± 0.00 | 0 |
| Glutamic acid | 0.02 ± 0.00 | 0.016 ± 0.00 | 1 |
| Glutamine | 2.11 ± 0.06 | 2.441 ± 0.07 | 133 |
| Glycine | 0.00 ± 0.00 | 0.046 ± 0.03 | 2 |
| Histidine | 0.04 ± 0.01 | 0.027 ± 0.01 | 1 |
| Isoleucine | 2.29 ± 0.04 | 2.621 ± 0.04 | 142 |
| Leucine | 2.03 ± 0.00 | 2.314 ± 0.02 | 126 |
| Lysine | 1.76 ± 0.01 | 1.728 ± 0.00 | 94 |
| Methionine | 0.61 ± 0.01 | 0.725 ± 0.01 | 39 |
| Phenylalanine | 1.29 ± 0.02 | 1.449 ± 0.06 | 79 |
| Proline | 1.88 ± 0.04 | 2.187 ± 0.01 | 119 |
| Serine | 0.45 ± 0.13 | 0.522 ± 0.14 | 28 |
| Threonine | 1.40 ± 0.30 | 1.194 ± 0.03 | 65 |
| Tryptophan | 1.51 ± 0.01 | 1.809 ± 0.00 | 98 |
| Valine | 1.33 ± 0.07 | 1.412 ± 0.19 | 77 |
* 6DAT 생산량 기준
상기 표 1에서 볼 수 있듯, 17가지 아미노산 중 대부분의 아미노산에 대해서는 기본 배지에 비해 허비시딘의 생산량이 오히려 감소되거나, 허비시딘의 생산이 불가하였다. 그러나, 글루타민, 이소류신, 류신 또는 프롤린을 첨가하여 6일간 배양한 실험군의 경우 대조구 대비 각 33%, 42%, 26% 및 19%의 허비시딘 생산량 증가를 확인하였다. 특히, 대조구 대비 허비시딘 생산량이 가장 높았던 이소류신의 경우 대조구 대비 약 42% 이상 생산량이 증가되었다.
위와 같은 결과로부터, 글루타민, 이소류신, 류신 및 프롤린을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물의 허비시딘의 효율적인 생산 및 대량생산을 위한 활용가능성을 확인하였다.
실시예 2. 글루타민, 이소류신 및 류신의 첨가 농도별 허비시딘 생산량 분석
다음으로, 상기 실시예 1에서 허비시딘 생산량 증가가 가장 우수한 3가지 아미노산을 대상으로, 농도에 따른 생산량을 평가하여 첨가 농도를 최적화하고자 하였다.
표 1에서 대조군에 비하여 허비시딘의 생산량 증가가 크게 나타난 3가지 아미노산인 글루타민, 이소류신 및 류신을 배지에 각각 0.2~1.0% (0.2% 간격) 농도로 첨가하여 6일간 배양하였으며, 허비시딘 생산량 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| Herbicidin | 5DAT (g/L) | 6DAT (g/L) | 대조구 대비 생산량(%)* |
| Glutamine 0.0% | 1.50 ± 0.08 | 1.76 ± 0.10 | 100 |
| Glutamine 0.2% | 0.75 ± 0.05 | 0.86 ± 0.01 | 47 |
| Glutamine 0.4% | 1.95 ± 0.06 | 2.19 ± 0.09 | 125 |
| Glutamine 0.6% | 1.62 ± 0.06 | 1.98 ± 0.22 | 113 |
| Glutamine 0.8% | 1.55 ± 0.03 | 1.75 ± 0.06 | 99 |
| Glutamine 1.0% | 1.47 ± 0.15 | 1.66 ± 0.05 | 94 |
| Isoleucine 0.0% | 1.50 ± 0.08 | 1.76 ± 0.10 | 100 |
| Isoleucine 0.2% | 1.89 ± 0.03 | 2.34 ± 0.02 | 133 |
| Isoleucine 0.4% | 1.79 ± 0.06 | 2.36 ± 0.07 | 135 |
| Isoleucine 0.6% | 1.78 ± 0.05 | 2.26 ± 0.01 | 129 |
| Isoleucine 0.8% | 1.66 ± 0.08 | 2.22 ± 0.02 | 126 |
| Isoleucine 1.0% | 1.53 ± 0.03 | 2.17 ± 0.04 | 124 |
| Leucine 0.0% | 1.50 ± 0.08 | 1.76 ± 0.10 | 100 |
| Leucine 0.2% | 1.65 ± 0.04 | 1.96 ± 0.04 | 112 |
| Leucine 0.4% | 1.63 ± 0.05 | 2.10 ± 0.02 | 119 |
| Leucine 0.6% | 1.60 ± 0.10 | 2.14 ± 0.04 | 122 |
| Leucine 0.8% | 1.60 ± 0.05 | 2.08 ± 0.06 | 119 |
| Leucine 1.0% | 1.44 ± 0.25 | 2.01 ± 0.45 | 114 |
* 6DAT 생산량 기준
HPLC 분석 결과, 상기 표 2에서 볼 수 있듯, 특히 이소류신을 0.2% 내지 0.4% 첨가한 실험구에서 허비시딘의 생산량이 현저히 증가됨을 확인하였다. 아울러, 글루타민의 경우 0.4% 및 0.6% 첨가 실험구에서 가장 허비시딘 생산량이 현저히 증가됨을 확인하였다. 이와 같은 결과는 아미노산 종류에 따라 배지에 유효성분으로서 포함되는 특정 농도 범위에서 특히 허비시딘의 고생산이 가능할 수 있음을 시사한다.
상기 표 2에서 나타난 결과를 바탕으로 허비시딘 생산량 증가에 기여도가 가장 높은 이소류신을 대상으로 최적 첨가 농도를 보다 세밀히 확인하기 위해 0.05%에서 0.4% (0.05% 간격) 농도로 첨가한 실험구를 28도 150rpm에서 6일간 배양하여 HPLC 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| Herbicidin | 5DAT (g/L) | 6DAT (g/L) | 대조구 대비 생산량(%)* |
| Isoleucine 0.0% | 1.32 ± 0.02 | 1.35 ± 0.03 | 100 |
| Isoleucine 0.05% | 1.34 ± 0.00 | 1.42 ± 0.06 | 105 |
| Isoleucine 0.10% | 1.56 ± 0.06 | 1.68 ± 0.05 | 125 |
| Isoleucine 0.15% | 1.56 ± 0.04 | 1.66 ± 0.06 | 123 |
| Isoleucine 0.2% | 1.68 ± 0.02 | 1.79 ± 0.03 | 133 |
| Isoleucine 0.25% | 1.64 ± 0.03 | 1.81 ± 0.05 | 134 |
| Isoleucine 0.30% | 1.64 ± 0.05 | 1.88 ± 0.08 | 139 |
| Isoleucine 0.35% | 1.59 ± 0.10 | 1.78 ± 0.11 | 132 |
| Isoleucine 0.40% | 1.63 ± 0.00 | 1.84 ± 0.00 | 136 |
* 6DAT 생산량 기준
그 결과, 상기 표 3에서 볼 수 있듯, 배지 조성물에 이소류신이 0.2 내지 0.4 %로 포함되는 경우, 허비시딘 생산량이 대조구 대비 30% 이상으로 현저히 증가되었다. 특히, 이소류신을 0.3% 첨가한 실험구에서는 허비시딘 생산량이 대조구 대비 39% 이상 크게 증가함을 확인하였다.
실시예 3. 아미노산의 혼합 첨가에 따른 허비시딘 생산량 분석
상기 실시예 1 및 2에서 나타난 결과를 바탕으로, 허비시딘 생산량 증가에 기여도가 가장 높은 4가지 아미노산을 대상으로, 아미노산의 혼합 첨가에 대해서도 허비시딘 생산량 증가가 나타나는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 주성분인 포도당, 감자전분, 대두분에 이소류신을 0.2%, 0.3% 및 0.4% 농도로 첨가한 배지에 나머지 3가지 아미노산인 글루타민, 류신 및 프롤린을 각각 0.2% 농도로 첨가한 실험구를 제조하여 28℃, 150rpm에서 6일간 배양하여 생산된 허비시딘량을 HPLC로 분석하였으며, 그 결과를 아래 표 4에 나타내었다.
| Herbicidin | 5DAT (g/L) | 6DAT (g/L) | 대조구 대비 생산량(%)* |
| Control | 1.23 ± 0.06 | 1.25 ± 0.06 | 100 |
| Isoleucine 0.2%, Leu 0.2% | 1.42 ± 0.05 | 1.23 ± 0.06 | 116 |
| Isoleucine 0.2%, Pro 0.2% | 1.44 ± 0.01 | 1.49 ± 0.02 | 117 |
| Isoleucine 0.3%, Leu 0.2% | 1.43 ± 0.11 | 1.15 ± 0.14 | 116 |
| Isoleucine 0.3%, Pro 0.2% | 1.46 ± 0.00 | 1.48 ± 0.02 | 119 |
| Isoleucine 0.4%, Leu 0.2% | 1.27 ± 0.00 | 0.93 ± 0.01 | 104 |
| Isoleucine 0.4%, Pro 0.2% | 1.46 ± 0.04 | 1.40 ± 0.09 | 119 |
* 5DAT 생산량 기준
그 결과, 상기 표 4에서 볼 수 있듯, 아미노산을 혼합하여 사용한 경우에도 허비시딘 생산량 증가가 발생하였으며, 특히 이소류신 0.3% 및 0.4%에 플로린 0.2%를 첨가한 실험구에서 대조구 대비 약 19% 정도의 우수한 생산량 증가가 확인되었다. 이와 같은 결과는 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 선택된 2 이상의 아미노산의 조합을 포함한 배지 조성물의 경우에도 허비시딘 생산에 대한 우수한 효과가 있음을 시사한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (15)
- 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 허비시딘 생산용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주를 더 포함하는, 허비시딘 생산용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 아미노산은 전체 배지 조성물 대비 0.05 내지 1.0 농도(%)로 포함되는, 허비시딘 생산용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 아미노산은 전체 배지 조성물 대비 0.1 내지 1.0 농도(%)로 포함되는, 허비시딘 생산용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 이소류신은 전체 배지 조성물 대비 0.1 내지 0.5 농도(%)로 포함되는, 허비시딘 생산용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 이소류신은 전체 배지 조성물 대비 0.18 내지 0.42 농도(%)로 포함되는, 허비시딘 생산용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 글루타민은 전체 배지 조성물 대비 0.3 내지 0.7 농도(%)로 포함되는, 허비시딘 생산용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 허비시딘은 허비시딘 A(herbicidin A), 허비시딘 B(herbicidin B), 허비시딘 C(herbicidin C), 허비시딘 F(herbicidin F), 및 허비시딘 H(herbicidin H) 중 선택된 하나 이상인, 허비시딘 생산용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 허비시딘은 허비시딘 A(herbicidin A)인, 허비시딘 생산용 배지 조성물.
- 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주 또는 이의 배양물; 및
이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 허비시딘 생산용 조성물.
- 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주를 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 허비시딘 생산 방법.
- 제11항에 있어서, 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주를 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지에 접종하는 단계를 더 포함하는, 허비시딘 생산 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 배지 또는 균주로부터 허비시딘을 회수하는 단계를 더 포함하는, 허비시딘 생산 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 배양은 5 내지 7일의 배양 기간 동안 수행되는, 허비시딘 생산 방법.
- 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 균주를 이소류신, 글루타민, 프롤린 및 류신 중 하나 이상의 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 허비시딘 생산을 증가시키는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230195604A KR102630101B1 (ko) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 아미노산을 포함하는 허비시딘 생산용 배지 조성물 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230195604A KR102630101B1 (ko) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 아미노산을 포함하는 허비시딘 생산용 배지 조성물 |
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| KR102630101B1 true KR102630101B1 (ko) | 2024-01-29 |
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| KR1020230195604A KR102630101B1 (ko) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 아미노산을 포함하는 허비시딘 생산용 배지 조성물 |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US3963579A (en) * | 1973-10-17 | 1976-06-15 | Sanraku-Ocean Co., Ltd. | Microbiological process for the production of pepstatins |
| KR20150015310A (ko) * | 2013-07-31 | 2015-02-10 | 한국화학연구원 | 스트렙토마이세스 스코풀리리디스 kr-001 균주 대량생산용 배지 조성물 |
-
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- 2023-12-28 KR KR1020230195604A patent/KR102630101B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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| US3963579A (en) * | 1973-10-17 | 1976-06-15 | Sanraku-Ocean Co., Ltd. | Microbiological process for the production of pepstatins |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J Am Chem Soc. 2017 Nov 22; 139(46): 16450-16453 * |
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