CN1308682A - 在低浓度游离氨基酸下生产棒酸的发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过链霉菌属的发酵产生次级代谢产物的方法。如果将游离氨基酸浓度保持在低水平,则可获得出人意料地高产量。

Description

在低浓度游离氨基酸下生产棒酸的发酵工艺
                        发明领域
本发明涉及在含有碳源和氮源的适当培养基上，由链霉菌属的菌株发酵生产次级代谢产物的领域。
                        发明背景
链霉菌属的微生物发酵产生大量的多种不同的次级代谢产物，例如β-内酰胺类、聚酮类化合物以及大环内酯类，如棒酸、匹马菌素和红霉素。棒酸是重要的β-内酰胺酶抑制剂，由属于链霉菌属的多种微生物菌株产生，诸如带小棒链霉菌(S.clavuligerus)  ATCC 27064、S.jumonjinensis(英国专利1563103)、桂滨链霉菌(S.katsurahamanus)IFO13716 FERM 3944(日本专利83009679B)和链霉菌属的株P6621 FERM2804(日本专利申请55162993A)。
已经能够大量生产棒酸，并且生产条件正在进行不断的优化，以便提高产量及终产物的纯度。已经进行了关于连续发酵(GB 1508977)、对分批工艺中碳的补料(EP-182522)、低浓度氨的维持(WO 96/18743和Romero J.，Liras P.和Martin J.F.，应用微生物学和生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1984)，第20卷，318-325)、生长和生产期间发酵培养基中磷酸盐浓度的降低(Romero(1984)，参见上文，Lebrihi A.，Germain P.和Lefebre G.，应用微生物学和生物技术(1987)，第26卷，130-135和国际专利申请WO 97/19187和WO 97/39137)方面的棒酸生产的优化。就碳源而言，已知与甘油相比甘油三酯类是优选的碳源(Butterworth(1984)；工业抗生素生物技术(Biotecnology of Industrialantibiotics)，E.J.Vandamme，第一版，Marcel Dekker公司225-235页和专利申请WO 97/19187)。
就氮源而言，Brana A.F.，Paiva N.和Demain A.L.已经进行了大量研究，普通微生物学杂志(J.of General Microbiology(1986)，第132卷，1305-1317。已发现在含有一种氨基酸的培养基上的生长比以氨作为唯一氮源的生长迅速。
而且，在含有氨作为唯一氮源的培养基上，最大比生长速率小于每小时0.05，Brana(1986)参见上文，以及Aharonowitz Y.和Demain A.L.加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)(1979)，第25卷，61-67，而在含有至少一种氨基酸(如，天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、组氨酸、脯氨酸、苏氨酸或者精氨酸)的培养基中，最大比生长速率大于每小时0.05。因此，优选使用含有一种或者多种氨基酸的培养基。与只含有氨的无机培养基相比，在这种培养基中生物量的生产花费的时间较少，这理所当然比较慢的生产工艺更具有优势。
在未预先公开的国际申请WO 98/37179中描述了精氨酸是棒酸生产以及头孢菌素生产的(例如来自带小棒链霉菌的头孢霉素C)发酵配料(Aharonowitz y.和Demain A.L.，参见上文)。除此之外，在分批工艺中谷氨酸抑制棒酸的形成(Romero(1984)，参见上文)，所以不能够直接使用谷氨酸或谷氨酰胺。
而且，甚至更为普遍的是使用蛋白质作为氨基酸的来源，因为这比使用单个氨基酸便宜得多。显而易见的缺点是蛋白质的不均一性，以及一般与这些复合营养物相关的不可再现的质量。棒酸生产所使用的典型复合氮源是：用于带小棒链霉菌(EP 0 182 522 B1和WO 97/19187)的鱼粉、大豆粉、花生粉，用于S.jumonjinensis(英国专利1563103)的大豆粉，用于链霉菌的种P6621 FERM 2804(WO 97/39137+日本专利申请55162993)的大豆粉和玉米浆，以及用于桂滨链霉菌(日本专利83009679B)的大豆粉和棉籽粉。在一篇综述文章中，报道了大豆蛋白质是棒酸生产最重要的蛋白质(Butterworth(1984)，参见上文)。
此处，我们描述在产生次级代谢产物的链霉菌属的发酵液中，优选富含谷氨酸和脯氨酸的水解蛋白质的令人惊奇的有利应用，以及谷蛋白水解产物与酪蛋白水解产物在这个方面的特定优势。另外，我们还描述了使用特定的氨基酸来源(尤其是将谷氨酸)作为生产这些化合物的分批-补料工艺中的补料营养物质的出乎意料的有利应用。
                       附图描述
图1：低水平游离谷氨酸下分批发酵中棒酸的效价。
图2：低水平游离谷氨酸下分批-补料(fed-batch)发酵中棒酸的效价。
                        发明概述
本发明提供了一种通过将一种能产生次级代谢产物的链霉菌属菌株在适当的培养基上发酵来生产次级代谢产物的方法，方法是将游离氨基酸浓度维持在低于5克/升发酵液，优选地，低于2.5克/升，更优选地，低于0.5克/升发酵液来产生次级代谢产物，前提是排除了向带小棒链霉菌发酵液中加入4g/L浓度游离天冬氨酸的情况。这种工艺尤其有利于生产β-内酰胺类、聚酮类化合物以及大环内酯类，优选地，棒酸、匹马菌素、红霉素、制霉菌素或两性霉素。根据本发明的一个方面，以分批-补料或者连续方式应用一种或者多种氨基酸，优选谷氨酸或者脯氨酸以在发酵液中维持这样低的浓度。根据本发明的另一个方面，除氨基酸本身以外，还可以分批、分批-补料、半连续或者连续方式加入蛋白质水解产物，更优选地，谷蛋白水解产物或者酪蛋白水解产物，最优选地小麦谷蛋白水解产物。
                       发明详述
本发明描述通过以分批-补料或者连续方式应用所述氨基酸或者通过以任一方式应用蛋白质水解产物的方法利用缺乏游离氨基酸的培养基。
本发明的申请中，将蛋白质定义为具有用分子量大于20,000道尔顿来表示其大小的氨基酸多聚体，它没有经过任何方式的将蛋白质降解成较小片段的加工。将蛋白质水解产物定义为具有平均大小在300至20,000道尔顿之间的氨基酸多聚体，并且游离的氨基酸含量低于总氨基酸的30％。这些蛋白质水解产物可通过相应蛋白质的酶促水解或化学水解而产生。或者通过在工艺中采用非水解蛋白质作为原料，采用增强了蛋白酶活性的菌株来实现使用水解蛋白质的优势。而且，在本申请中，谷氨酸代表glutam类化合物，例如谷氨酸和谷氨酰胺。本申请中，将蛋白质提取物定义为具有低于300道尔顿分子量的蛋白质水解产物，并且其中30％以上的氨基酸以游离氨基酸存在。
当某种蛋白质或者其水解产物被定义为富含谷氨酸时，这就意味着大于15％的氨基酸成分是由谷氨酸和谷氨酰胺组成。所描述的富含谷氨酸的蛋白质是酪蛋白(21％)和小麦谷蛋白(35％)。
根据本发明的一个方面，令人惊奇地发现当培养基中含有蛋白质水解产物时，尤其是所述水解产物来源于小麦谷蛋白或者酪蛋白时，棒酸的产量非常高。因为当使用其它蛋白质来源如酵母和玉米的蛋白质提取物时，尤其是在与肽(＜30％游离氨基酸)相比高水解度(35％)时，生产水平大大地下降，这表明蛋白质水解产物应该优选地含有低于30％的游离氨基酸，甚至更优选地，低于5％的游离氨基酸，最优选地低于1％的游离氨基酸。可以任何加料形式，即分批、分批-补料、连续或者半连续形式，使用和补加优选地富含谷氨酸的蛋白质水解产物。半连续加料是指连续向发酵液中加入营养物质，同时间歇地移出少量的发酵液。
发酵培养基可以是含有(NH4)2SO4、游离氨基酸、KH2PO4、MgSO4.7H2O、CaCl.2H2O、3-(N-玛啉代)丙磺酸、甘油、琥珀酸钠和微量元素溶液，并具有低浓度氨基酸的确定培养基，或者因含有蛋白质水解产物而形成的复合培养基。本发明的一部分也包括复合培养基的使用，例如将蛋白质水解产物加入到坚果粉、蔬菜粉、种子粉、谷物粉、如那些在发酵工业中有用的草粉、大豆粉、Iineseed粉、花生粉、马铃薯粉、向日葵、豌豆或者菜豆粉、棉籽粉、小麦谷蛋白、全麦、稻米粉中，其中游离氨基酸的浓度低。培养基还可按照所要求达到的最佳结果，含有多种来源或多种肽大小的蛋白质水解产物混合物与所述粉末的混合物。
除野生型菌株之外，在本发明工艺中，还可以使用能够在化学成分上确定的培养基中发酵的微生物菌株，和/或使用通过将目的亲本菌株经过使用物理方法，(例如紫外线照射)或者适当的化学诱变剂(例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或甲磺酸乙酯)的经典诱变处理而得到的改良微生物菌株。同样还可对目的亲本菌株应用重组DNA技术，由此用一种或多种目的功能基因转化亲本菌株。
在上述的混合物中还可以加入任何可同化的碳源，如糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖；或者多糖，例如淀粉、麦芽糖糊精和菊糖或其它果糖多聚体；甘油三酯类，例如豆油、向日葵油、橄榄油、三油酸酯等；(多元)醇类，例如乙醇、丙醇、甘油、甘露醇；或者有机酸类或其盐，例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙二酸、丙二酸、柠檬酸、乳酸、葡糖酸等。
还可以在培养基中加入无机氮源，例如，氨和/或硝酸或者它们的任何一种盐。也可以使用ureum。而且还可以在培养基中添加维生素和多种无机阴离子，例如，硫酸根离子、磷酸根离子、氯离子、硼酸根离子、钼酸根离子、碘酸根离子或者它们的盐，以及阳离子，钾、钠、锌、锰、镁、铁、铜、钴、镍等。
通过从预培养物或者种子培养物发酵中，以占主发酵培养基大约1％至50％，尤其是5％至20％的体积来接种，开始发酵。该工艺可以持续大约24至400小时，尤其是48至168小时。温度将维持在20℃至40℃之间，优选25℃至35℃之间，甚至更为优选在26℃至30℃之间。通过用碱性物质(例如氨、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙)或者有机碱(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)以及酸性物质(例如非有机酸，如硫酸和盐酸)滴定，可将pH维持在pH6至8。或者也可以使用有机酸例如，谷氨酸、柠檬酸、葡糖酸或乙酸等。
可以通过改变入口气体中的氧浓度、过压的使用、改变搅拌速度和气流将溶解氧浓度控制在最佳的范围。范围可在0％至100％空气饱和度之间变动。
该工艺还可以通过控制多种非生长限制性营养物质的最适浓度来进行。依据所选生长限制性营养物质，这些生长非限制性营养物质可能含有任何相关的碳源、氮源、磷源、硫源或氧。
二氧化碳应该维持在无毒性的浓度，方法是通过例如增加穿过发酵罐的气流，以便使出口气体中的二氧化碳浓度低于5％，优选地低于2.5％。
发酵可通过分批、分批-补料、或(半)连续发酵工艺的方式来进行。
当然，由本发明的发酵工艺生成的不纯棒酸的回收，以及通过本领域公知的方法随后将其转化成药学可接受的盐，均构成本发明的一个方面。最有利的方法之一是通过加入相应的胺盐形成化合物，例如，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、1，3-双(二甲氨基)-2-丙醇、叔丁胺、叔辛胺、二苯甲基胺和双((2-二甲氨基)乙基)醚，将不纯的棒酸转化为它的氨基盐，并且将棒酸胺与无毒的药学可接受的盐(例如乙基己酸钾)反应以生成相应的纯净盐，例如棒酸钾。
                        实施例1
比较使用蛋白质、蛋白质水解产物和蛋白质提取物的棒酸分批发酵
通过多轮经典诱变(紫外线、亚硝基胍(NTG))以及在摇瓶培养中采用本领域公知的咪唑方法测定棒酸产量进行选育，来改良带小棒链霉菌ATCC 27064以用于棒酸的生产。将在胰胨豆胨内汤培养基(TSB-培养基)中，28℃下在转速为280转/分的摇床培养箱中生长48小时的该菌株营养菌丝在-80℃下冷冻保存。
将1毫升冷冻的菌丝接种到100毫升经灭菌的(30分钟，121℃)的含有5-20克/升麦芽糖1 H2O、15-30克/升bacto胰蛋白胨、15-30克/升bacto蛋白胨、1-10克/升bacto豆胨、1-5克/升磷酸二氢钾和0.2克/升合成防泡剂的预培养基中。
27℃至28℃培养72小时后，将2.5％的这种预培养物转种到无菌的生产培养基中，其中含有2.5克所的复合氮源，例如蛋白质、蛋白质水解产物和/或蛋白质提取物。生产培养基还含有50-100克/升甘油、5-20克/升大豆粉、0.5-2克/升磷酸二氢钾、适当的微量元素混合物和0.2-2克/升合成防泡剂。28℃及适当的摇动条件下培养4天后，收集培养物并通过标准的HPLC方法分析棒酸。
当比较分批工艺中不同的氮源时，令人惊奇地发现，与使用蛋白质相比，使用蛋白质水解产物增加棒酸产量至少10％。最好的蛋白质水解产物来自谷蛋白，其次分别是来自酪蛋白和大豆蛋白(参见表1)。
表1.带小棒链霉菌ATCC 27064的一株突变株在除大豆粉外还使用不同复合氮源时的棒酸产量。
营养物质名称 类型 供应商 种类 游离氨基酸(克/升) 产率百分比
马铃薯粉 Alburex Roquette Freres 蛋白质 ＜1 100
酵母提取物 Baker’s YE(65％游离氨基酸) Gist brocades 提取物 13.0 7
Baker’s YE(50％游离氨基酸) Gist brocades 提取物 7.9 11
Maxarome(35％游离氨基酸) Gist brocades 提取物 5.1 20
玉米浆 肌醇六磷酸酶处理的玉米浆 Roquette Frères 提取物 5.7 4
玉米浸出粉 Roquette Frères 提取物 5.4 5
谷氨酸 氨基酸 25 0
酪蛋白水解产物 酪蛋白hydrolysee ArmorPreteines 水解产物 2.0 115
小麦谷蛋白水解产物 GPU Marcor公司 水解产物 0.1 121
GPN Marcor公司 水解产物 0.3 136
GPA Marcor公司 水解产物 0.3 132
大豆蛋白水解产物 HXP-90 PTI公司 水解产物 115
                        实施例2
          在低水平游离谷氨酸培养基中的棒酸发酵棒酸的分批发酵
将带小棒链霉菌ATCC 27064在28℃的温度下于转速为220转/分的摇床培养箱中预培养26小时，起始pH为6.8，培养基中含有5至30克/升甘油、5至30克/升大豆蛋白胨、2至6克/升氯化钠，和0.5至3克/升碳酸钙。
将预培养物以10％的体积接种到1升含有10-30克/升甘油、0.5至3克/升KH2PO4、1至3克/升(NH4)2SO4、15-25克/升谷氨酸单钠、0.05至0.2克/升FeSO4.7H2O、0.1至1克/升MgSO4.7H2O、10-20克/升2-(N-玛啉代)丙磺酸(MOPS)、0.2-1克/升basildon防泡剂，和适当的微量元素溶液的化学组分确定培养基中。用4N NaOH将pH调至6.8。在28℃的温度下在转速为220转/分的摇床培养箱中将二次预培养物培养20小时，起始pH为6.8。
将二次预培养物以3.3％的体积接种到29升含有10-30克/升甘油、0.5至1克/升KH2PO4、0.5至3克/升(NH4)2SO4、10-30克/升谷氨酸单钠、0.05-0.15克/升FeSO4.7H2O、0.1至1克/升MgSO4.7H2O、0.1-1克/升basildon防泡剂，和适当的微量元素溶液的化学组分确定培养基中。
发酵在30℃下进行，通过用4N NaOH和4N H2SO4滴定将pH控制在6.95至7.05。通过控制搅拌速率将溶解氧压力维持在50％空气饱和度之上或调整到50％的空气饱和度。棒酸的分批-补料发酵
将带小棒链霉菌ATCC27064在28℃的温度下在转速为220转/分的摇床培养箱中预培养26小时，起始pH为6.8，培养基中含有5至30克/升甘油、5至30克/升大豆蛋白胨、2至6克/升氯化钠，和0.5至3克/升碳酸钙。
将预培养物以10％的体积接种到1升含有10-30克/升甘油、0.5至3克/升KH2PO4、1至3克/升(NH4)2SO4、15-25克/升谷氨酸单钠、0.05至0.2克/升FeSO4.7H2O、0.1至1克/升MgSO4.7H2O、10-20克/升2-(N-玛啉代)丙磺酸(MOPS)、0.2-1克/升basildon防泡剂，和适当的微量元素溶液的化学组分确定培养基中。用4N NaOH将pH调至6.8。在28℃的温度下在转速为220转份的摇床培养箱中进行二次预培养20小时，起始pH为6.8。
将二次预培养物以4％的体积接种到24升含有5至15克/升甘油、0.5-2克/升KH2PO4、0.5至3克/升(NH4)2SO4、10克/升谷氨酸单钠、0.05至0.15克/升FeSO4.7H2O、0.1至1克/升MgSO4.7H2O、0.05至-1克/升basildon防泡剂，和适当的微量元素溶液的化学组分确定培养基中。
发酵在30℃下进行，通过用4N NaOH和4N H2SO4滴定将pH控制在6.95至7.05。通过控制搅拌速率将溶解氧压力维持在50％空气饱和度之上或调整到50％的空气饱和度。
当分批培养基中的磷酸盐耗尽后5小时，以30-60克/小时的速率加入含有300至500克甘油/千克物料的碳物料，以50-150克/小时的速率加入含有50至100克谷氨酸钠/千克物料、5至10克NH4)2SO4/千克物料，以及5至10克KH2PO4/千克物料的氮-磷酸物料。
图1和图2分别表示在分批工艺和分批-补料工艺培养基中的棒酸和谷氨酸浓度。从图1中可以看出，当谷氨酸浓度降到5克/升并且甚至更优选地低于2.5克/升时，棒酸开始产生，最终棒酸浓度为250-300毫克/升。图2表明当将谷氨酸加入到发酵罐中并使其维持在很低的浓度(＜1克/升)，30小时后，这个实验中的棒酸效价能够增加到500毫克/升，与分批实验相比提高了1倍。

Claims (14)

1.一种在含有碳源和氮源的适当培养基上通过链霉菌属菌株的发酵生产次级代谢产物的方法，其中将供给产生次级代谢产物的链霉菌属的游离氨基酸浓度保持在低于5克/升发酵液，更优选地低于2.5克/升，最优选地低于0.5克/升，前提是排除了带小棒链霉菌发酵液之浓度为4克/升游离天冬氨酸的情况。
2.根据权利要求1所述的方法，其中产生的次级代谢产物是β-内酰胺、聚酮化合物或大环内酯。
3.根据权利要求2所述的方法，其中产生的次级代谢产物是棒酸、匹马菌素、红霉素、制霉菌素或两性霉素。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于以分批、分批-补料、半连续或者连续方式应用蛋白质水解产物作为游离氨基酸的来源。
5.根据权利要求4所述的方法，其中通过向与相应的野生型菌株相比具有增强的蛋白酶活性的菌株应用蛋白质，形成蛋白质水解产物。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于应用富含谷氨酸或脯氨酸中任意一种的蛋白质水解产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于应用谷蛋白水解产物或者酪蛋白水解产物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于使用小麦谷蛋白水解产物。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于以分批-补料、半连续或连续方式应用游离氨基酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于应用谷氨酸或者脯氨酸。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于通过带小棒链霉菌的发酵生产棒酸。
12.一种在适当培养基上通过带小棒链霉菌的发酵生产棒酸的方法，其特征在于使用谷蛋白水解产物或者酪蛋白水解产物。
13.一种进一步纯化棒酸的方法，其特征在于纯化由权利要求11或者12的方法获得的棒酸。
14.根据权利要求13的棒酸纯化以及随后转化为其盐的工艺，其特征在于使不纯棒酸转化为其胺盐，方法是通过加入相应的胺盐形成化合物，并将所述的棒酸胺与无毒的药学可接受的盐反应，生成相应的纯的棒酸盐。
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