CN116042740A - 一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法 - Google Patents

一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高ε‑聚赖氨酸产量的发酵方法，其方法步骤为：（1）将ε‑聚赖氨酸种子液转移到发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基中添加有谷朊粉和玉米浆；（2）在菌体开始产聚赖氨酸时流加培养基补料，使氨氮的控制范围为200～280mg/100mL；并配合碳源的补加、无机氮控制和pH调节工艺，至发酵结束；所述培养基补料中组分的质量浓度为：谷朊粉15～25%、玉米浆2～4%，余量为水。本方法在发酵中后期流加谷朊粉，谷朊粉中含量大量谷氨酸和其他氨基酸，其中谷氨酸可以加速ε‑PL的合成，其他氨基酸可以增强细胞活性，弥补了单一氮源在产物合成或菌体生长方面的不足，明显促进ε‑PL产生菌的生长和合成，显著提高中后期效价涨幅。

Description

一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种微生物发酵技术，尤其是一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法。
背景技术
1977年，日本科学家Shima.S和Sakai.H无意中从土壤中筛选得到一株能够产生生物碱类物质的白色链霉菌(Streptomyces albulus)346，通过研究发现，这是一种赖氨酸聚合物，是由25～35个L-赖氨酸残基通过α-COOH和ε-NH2脱水缩合形成的，分子量约为3500～4500，由于其肽键不同于一般蛋白质的α肽键，所以将这种物质称为ε-聚赖氨酸(ε-PL)。
截至目前，美国、日本、韩国、中国等国家已陆续批准ε-聚赖氨酸作为食品防腐剂应用于食品中。此外，ε-聚赖氨酸具有水溶性好、热稳定强、安全性能高等优点，在医学、农药等领域具有很好的应用潜力。在国内，虽然ε-PL及其盐酸盐作为新的食品添加剂使用才短短的几年时间，相对来说整体的行业规模还比较小，属于起步阶段；但是，随着食品工业对ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的认知度越来越高，除国外市场依旧很大外，国内市场的需求量也将不断增加；因此，ε-聚赖氨酸有着广泛的应用前景和巨大市场价值。
目前，ε-PL的获得仍然主要依靠微生物发酵技术。1989年日本智索股份有限公司(Chisso Corporation)首先利用白色链霉菌发酵技术实现了ε-PL的工业化生产，且于2001年形成了年产千吨级的规模。而国内虽然已有少数几家企业实现了ε-PL的工业化生产，但限于相对落后的技术水平，发酵水平普遍偏低；即使有报道产量相对高的，也仅主要在小试水平实现，难以放大生产；因此在我国进行ε-PL发酵工艺的研究开发以提高发酵水平，对提高ε-PL生产能力，扩大ε-PL的工业化生产规模，增大国产ε-PL的市场份额具有非常重要的意义。
近年来国内在提高ε-PL效价的研究上开展了大量工作：大多是菌株优化方面，也有补料方法的研究专利，例如：
公开号为CN103074393A的专利申请，公开了一种增强细胞生长及生物过程效率的ε-聚赖氨酸补料分批发酵方法；该方法用不吸水链霉菌Str-8进行发酵培养，当培养体系pH值下降至3.6～4.1之间时，按照每小时每升发酵培养基中补加0.025g～0.5g酵母粉或其他有机氮源至培养体系中直至发酵结束；同时自pH降至3.6～4.1之间开始，用氨水控制培养体系的pH维持在3.6～4.1之间直至发酵结束；并补加灭过菌的含葡萄糖和硫酸铵的补料培养基，维持培养体系的葡萄糖为5～30g/L直至发酵结束。采用该方法最高ε-聚赖氨酸为15天35.4g/L。
公开号为CN106434780A的专利申请公开了一种一种以pH调控结合有机氮源补料提高ε-聚赖氨酸产量的方法，该方法通过pH两阶段控制结合控制发酵液中NH4 +-N、葡萄糖浓度以发酵生产ε-聚赖氨酸。
公开号为CN108998481A的专利申请公开了一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε-聚赖氨酸的发酵方法”，该方法以丝瓜络或海绵作为细胞固定载体，并在ε-聚赖氨酸合成阶段间歇流加灭过菌的有机氮源溶液，结合离子交换树脂离位分离ε-聚赖氨酸的发酵方法。采用该方法最高ε-聚赖氨酸为20天44.3g/L。
目前，ε-PL发酵的补料方式，普遍使用常规的分批补料发酵，大多采用pH两阶段控制，且通过发酵中配合碳源的补入适当补入氮源，虽然能适当提高效价，但没有一个稳定的发酵方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：(1)将ε-聚赖氨酸种子液转移到发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基中添加有谷朊粉和玉米浆；
(2)在菌体开始产聚赖氨酸时流加培养基补料，使氨氮的控制范围为200～280mg/100mL；并配合碳源的补加、无机氮控制和pH调节工艺，至发酵结束；所述培养基补料中组分的质量浓度为：谷朊粉15～25％、玉米浆2～4％，余量为水。
进一步的，所述步骤(2)中，氨氮降至300mg/mL及以下开始流加培养基补料，每4h流加量为发酵培养基体积的2～4％。
进一步的，所述步骤(2)中，发酵过程中使菌浓维持在35～50％。
进一步的，所述步骤(1)中，发酵培养基中含有下述质量浓度的组分：葡萄糖3～5％，谷朊粉1～2％，玉米浆0.2～0.4％以及无机盐。
更进一步的，所述无机盐在发酵培养基中的质量浓度为：硫酸铵0.05～0.15％，七水硫酸镁0.06～0.1％，三水磷酸氢二钾0.004～0.006％，磷酸二氢钾0.1～0.2％，七水硫酸亚铁0.004～0.006％，七水硫酸锌0.004～0.006％。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明通过在基础料中和后期添加谷朊粉和玉米浆来促进ε-PL的合成。首先谷朊粉作为有机氮源可以构成菌体细胞的组成成分，维持整个发酵过程中细胞的生长，提高细胞密度，增大生产强度；二是谷朊粉中含有大量谷氨酸和其他氨基酸，其中谷氨酸能够为赖氨酸中间合成代谢物提供氨基，促进赖氨酸合成；三是其他小分子氨基酸弥补了单一氮源在产物合成或菌体生长方面的不足，同时多种小分子氨基酸更好吸收和利用，与玉米浆中含有的少量维生素等关键生长因子联合，增大了代谢强度，促进产生更多的ATP，增强了代谢流中ε-PL合成酶和ε-PL聚合酶的活性，明显促进ε-PL产生菌的生长和产物合成，提高代谢活性，显著提高中后期效价涨幅。本发明在发酵中后期流加谷朊粉，采用的谷朊粉成本较低，可节约发酵工艺成本，工艺易放大，易于实现绿色、高效、节能的产业化大规模生产。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明所述实施例与对比例发酵过程中ε-PL涨幅变化示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法采用下述工艺步骤：
(1)发酵培养基：所述发酵培养基的各组分的质量浓度(g/L)为：葡萄糖3～5％，谷朊粉1～2％，玉米浆0.2～0.4％，硫酸铵0.05～0.15％，七水硫酸镁0.06～0.1％，三水磷酸氢二钾0.004～0.006％，磷酸二氢钾0.1～0.2％，七水硫酸亚铁0.004～0.006％，七水硫酸锌0.004～0.006％，液体消沫剂0.04～0.06％，以及水；消毒结束后调节pH至6.0±0.1，最好采用浓度为18～22％(v/v)氨水节pH值。
按比例配制发酵培养基，无菌蒸汽121～123℃灭菌25～30min后冷却至室温，并用无菌空气保压；所述发酵培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮300～450mg/mL。
(2)发酵培养：将ε-聚赖氨酸种子液转移到发酵培养基中进行发酵培养；培养条件为：罐压0.025±0.005Mpa，培养温度30±0.5℃，初始转速200～220rpm，溶氧控制在20～30％，维持通气比0.5～1.5vvm，搅拌与溶氧关联。
(3)流加补料：发酵培养过程中采用流加培养基补料工艺，并配合碳源的补加、无机氮控制和pH调节工艺。
(A)在菌体开始产聚赖氨酸时流加培养基补料，最好为氨氮降至300mg/mL及以下开始流加培养基补料，每4h流加量为发酵培养基体积的2～4％，使氨氮的控制范围为200～280mg/100mL；所述培养基补料中组分的质量浓度(g/L)为：谷朊粉15～25％、玉米浆2～4％，余量为水。
(B)所述碳源的补加工艺：流加碳源以全程控制葡萄糖范围为0.9～1.1g/100mL；最好在发酵过程中浓度降至0.9～1.1g/100mL开始采用流加法补加浓度为50～60％(g/L)葡萄糖溶液，以全程控制葡萄糖范围为0.9～1.1g/100mL。
(C)所述无机氮控制工艺：流加无机氮以控制无机氮在80～140mg/100mL；最好在发酵开始后无机氮自然下降至150mg/100mL及以下时，采用流加法补加浓度为20～25％(g/L)硫酸铵控制无机氮80～140mg/100mL。
(D)所述pH调节工艺：流加氨水使pH维持在4.1～4.3；最好当发酵液pH降至4.1～4.3时，自动流加浓度为18～22％(v/v)氨水使pH维持在此范围。
(4)采用上述流加补料工艺将发酵过程中使菌体浓度维持在35～50％(g/L)，培养周期170～190h，发酵结束，得到ε-聚赖氨酸发酵液；采用本方法ε-聚赖氨酸产量范围为7～8天48～50g/L。
实施例1：本提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法采用下述具体工艺。
(1)发酵培养基：发酵培养基体积60L；发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖3％，谷朊粉1％，玉米浆0.2％，硫酸铵0.05％，七水硫酸镁0.06％，三水磷酸氢二钾0.004％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸亚铁0.004％，七水硫酸锌0.004％，液体消沫剂0.04％，以及水；消毒后，用18％(v/v)氨水调pH至5.98。
按比例配制发酵培养基，无菌蒸汽122℃灭菌25min后冷却至室温，并用无菌空气保压。所述发酵培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮300mg/mL。
(2)发酵培养：将培养好的种子液按10％的接种量接种于装有发酵培养基的机械搅拌式发酵罐中培养，培养条件为：罐压0.025Mpa，培养温度30℃，初始转速200rpm，溶氧控制在20～25％，维持通气比0.5vvm，搅拌与溶氧关联。
(3)流加补料：当发酵液pH降至4.1时，自动流加18％(v/v)氨水使pH维持在4.1～4.2；当发酵液中的葡萄糖浓度降至0.9g/100mL开始补加50％(g/L)葡萄糖溶液，控制葡萄糖范围至0.9～1.0g/100mL；发酵开始后无机氮自然下降至150mg/100mL及以下时，通过补加20％(g/L)硫酸铵控制无机氮80～100mg/100mL。发酵过程中氨氮降至300mg/mL及以下开始流加培养基补料，每4h流加量为发酵液体积的2％，氨氮的控制范围为200～220mg/100mL；所述培养基补料的质量浓度(g/L)为：谷朊粉15％、玉米浆2％，以及余量水。
(4)全程菌浓维持在35～38％，培养周期170h，发酵结束，得到ε-聚赖氨酸发酵液，经检测发酵液中ε-PL最高产量为48.71g/L。
实施例2：本提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法采用下述具体工艺。
(1)发酵培养基：发酵培养基体积60L；发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖4％，谷朊粉1.5％，玉米浆0.3％，硫酸铵0.1％，七水硫酸镁0.08％，三水磷酸氢二钾0.005％，磷酸二氢钾0.15％，七水硫酸亚铁0.005％，七水硫酸锌0.005％，液体消沫剂0.05％，以及水；消毒后，用20％(v/v)氨水调pH至6.02。
按比例配制发酵培养基，无菌蒸汽121℃灭菌27min后冷却至室温，并用无菌空气保压。所述发酵培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮380mg/mL。
(2)发酵培养：将培养好的种子液按10％的接种量接种于装有发酵培养基的机械搅拌式发酵罐中培养，培养条件为：罐压0.02Mpa，培养温度29.5℃，初始转速210rpm，溶氧控制在25～30％，维持通气比1.0vvm，搅拌与溶氧关联。
(3)流加补料：当发酵液pH降至4.2时，自动流加20％(v/v)氨水使pH维持在4.2～4.3；当发酵液中的葡萄糖浓度降至1.0g/100mL开始补加55％(g/L)葡萄糖溶液，控制葡萄糖范围至1.0～1.1g/100mL；发酵开始后无机氮自然下降至150mg/100mL及以下时，通过补加22％(g/L)硫酸铵控制无机氮100～120mg/100mL。发酵过程中氨氮降至300mg/mL及以下开始流加培养基补料，每4h流加量为发酵液体积的3％，氨氮的控制范围为220～250mg/100mL；所述培养基补料中组分的质量浓度(g/L)为：谷朊粉20％、玉米浆3％，以及余量水。
(4)使菌浓维持在40～45％，培养周期180h；发酵结束，得到ε-聚赖氨酸发酵液，经检测发酵液中ε-PL最高产量为49.44g/L。
实施例3：本提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法采用下述具体工艺。
(1)发酵培养基：发酵培养基体积60L；发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖5％，谷朊粉2％，玉米浆0.4％，硫酸铵0.15％，七水硫酸镁0.1％，三水磷酸氢二钾0.006％，磷酸二氢钾0.2％，七水硫酸亚铁0.006％，七水硫酸锌0.006％，液体消沫剂0.06％，以及水；消毒后，用22％(v/v)氨水调pH至6.1。
按比例配制发酵培养基，无菌蒸汽123℃灭菌30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。所述发酵培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮450mg/mL。
(2)发酵培养：将培养好的种子液按10％的接种量接种于装有发酵培养基的机械搅拌式发酵罐中培养，培养条件为：罐压0.03Mpa，培养温度30.5℃，初始转速220rpm，溶氧控制在22～27％，维持通气比1.5vvm，搅拌与溶氧关联。
(3)流加补料：当发酵液pH降至4.3时，自动流加22％(v/v)氨水使pH维持在4.1～4.3；当发酵液中的葡萄糖浓度降至1.1g/100mL开始补加60％葡萄糖溶液，控制葡萄糖范围至1.0～1.1g/100mL；发酵开始后无机氮自然下降至150mg/100mL及以下时，通过补加25％硫酸铵控制无机氮120～140mg/100mL。发酵过程中氨氮降至300mg/mL及以下开始流加培养基补料，每4h流加量为发酵液体积的4％，氨氮的控制范围为260～280mg/100mL；所述培养基补料中组分的质量浓度(g/L)为：谷朊粉25％、玉米浆4％，以及余量水。
(4)使菌浓维持在45～50％，培养周期190h；发酵结束，得到ε-聚赖氨酸发酵液，经检测发酵液中ε-PL最高产量为49.86g/L。
实施例4：本提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法采用下述具体工艺。
(1)发酵培养基：发酵培养基体积60L；发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖3.5％，谷朊粉1.8％，玉米浆0.3％，硫酸铵0.12％，七水硫酸镁0.07％，三水磷酸氢二钾0.005％，磷酸二氢钾0.12％，七水硫酸亚铁0.005％，七水硫酸锌0.005％，液体消沫剂0.04％以及水；消毒后，用20％(v/v)氨水调pH至5.9。
按比例配制发酵培养基，无菌蒸汽122℃灭菌28min后冷却至室温，并用无菌空气保压。所述发酵培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮400mg/mL。
(2)发酵培养：将培养好的种子液按10％的接种量接种于装有发酵培养基的机械搅拌式发酵罐中培养，培养条件为：罐压0.025Mpa，培养温度30℃，初始转速200rpm，溶氧控制在20～25％，维持通气比1.2vvm，搅拌与溶氧关联。
(3)流加补料：当发酵液pH降至4.2时，自动流加20％(v/v)氨水使pH维持在4.1～4.2；当发酵液中的葡萄糖浓度降至1.0g/100mL开始补加52％葡萄糖溶液，控制葡萄糖范围至0.9～1.0g/100mL；发酵开始后无机氮自然下降至150mg/100mL及以下时，通过补加20％硫酸铵控制无机氮90～110mg/100mL。发酵过程中氨氮降至300mg/mL及以下开始流加培养基补料，每4h流加量为发酵液体积的2.5％，氨氮的控制范围为240～270mg/100mL；所述培养基补料中组分的质量浓度(g/L)为：谷朊粉18％、玉米浆3.5％，以及余量水。
(4)使菌浓维持在38～42％，培养周期185h；发酵结束，得到ε-聚赖氨酸发酵液，经检测发酵液中ε-PL最高产量为48.83g/L。
对比例1：
发酵培养基体积60L；发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖4％，玉米浆0.3％，硫酸铵0.1％，七水硫酸镁0.08％，三水磷酸氢二钾0.005％，磷酸二氢钾0.15％，七水硫酸亚铁0.005％，七水硫酸锌0.005％，液体消沫剂0.05％，pH消后用20％(v/v)氨水调至6.04。按比例配制发酵培养基，无菌蒸汽121～123℃灭菌25～30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。所述发酵培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮370mg/mL。
将培养好的种子液按10％的接种量接种于装有发酵培养基的机械搅拌式发酵罐中培养，培养条件为：罐压0.025Mpa，培养温度30℃，初始转速200rpm，溶氧控制在20～30％，维持通气比1.0vvm，搅拌与溶氧关联。当发酵液pH降至4.1时，自动流加20％(v/v)氨水使pH维持在此范围；当发酵液中的葡萄糖浓度降至0.9g/100mL开始补糖，控制葡萄糖范围至0.9～1.0g/100mL；发酵开始后无机氮自然下降至150mg/100mL时，通过补加硫酸铵控制无机氮100～120mg/100mL。
过程中通过维持pH、糖点，全程菌浓维持在30～36％，培养周期180h，发酵结束，得到ε-聚赖氨酸发酵液，经检测发酵液中ε-PL最高产量为36.81g/L。
对比例2：
发酵培养基体积60L；发酵培养基组分(g/L)：发酵培养基：葡萄糖4％，酵母浸粉1.5％，玉米浆0.3％，硫酸铵0.1％，七水硫酸镁0.08％，三水磷酸氢二钾0.005％，磷酸二氢钾0.15％，七水硫酸亚铁0.005％，七水硫酸锌0.005％，液体消沫剂0.05％，pH消后用20％(v/v)氨水调至6.06。按比例配制发酵培养基，无菌蒸汽121-123℃灭菌25-30min后冷却至室温，并用无菌空气保压。所述发酵培养基的灭菌后质量要求为：氨基氮300-450mg/mL。
将培养好的种子液按10％的接种量接种于装有发酵培养基的机械搅拌式发酵罐中培养，培养条件为：罐压0.025Mpa，培养温度30℃，初始转速200rpm，溶氧控制在20-25％，维持通气比1.2vvm，搅拌与溶氧关联；当发酵液pH降至4.2时，自动流加20％(v/v)氨水使pH维持在此范围；当发酵液中的葡萄糖浓度降至1.0g/100mL开始补糖，控制葡萄糖范围至1.0-1.1g/100mL。发酵开始后无机氮自然下降至150mg/100mL时，通过补加20％硫酸铵控制无机氮120-140mg/100mL。
过程中通过维持pH、糖点、补加酵母浸粉溶液，使菌浓维持在35-40％，培养周期180h，发酵结束，得到ε-聚赖氨酸发酵液，经检测发酵液中ε-PL最高产量为40.09g/L。
图1是本上述实施例与对比例发酵过程中ε-PL涨幅变化示意图，由上述实施例和图1可见，本方法明显促进ε-PL产生菌的生长和产物合成，提高代谢活性，显著提高中后期效价涨幅。

Claims (5)

1.一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法，其特征在于，其方法步骤为：（1）将ε-聚赖氨酸种子液转移到发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基中添加有谷朊粉和玉米浆；
（2）在菌体开始产聚赖氨酸时流加培养基补料，使氨氮的控制范围为200～280mg/100mL；并配合碳源的补加、无机氮控制和pH调节工艺，至发酵结束；所述培养基补料中组分的质量浓度为：谷朊粉15～25%、玉米浆2～4%，余量为水。
2.根据权利要求1所述的一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（2）中，氨氮降至300mg/mL及以下开始流加培养基补料，每4h流加量为发酵培养基体积的2～4%。
3.根据权利要求1所述的一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（2）中，发酵过程中使菌浓维持在35～50%。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，发酵培养基中含有下述质量浓度的组分：葡萄糖3～5%，谷朊粉 1～2%，玉米浆0.2～0.4%以及无机盐。
5.根据权利要求4所述的一种提高ε-聚赖氨酸产量的发酵方法，其特征在于，所述无机盐在发酵培养基中的质量浓度为：硫酸铵0.05～0.15%，七水硫酸镁0.06～0.1%，三水磷酸氢二钾0.004～0.006%，磷酸二氢钾0.1～0.2%，七水硫酸亚铁0.004～0.006%，七水硫酸锌0.004～0.006%。
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