DE3880585T2

DE3880585T2 - Acylaminosaeure-racemase, herstellung und verwendung.

Info

Publication number: DE3880585T2
Application number: DE8888113315T
Authority: DE
Inventors: Kazunori Hatano; Takeshi Takahashi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-08-21
Filing date: 1988-08-17
Publication date: 1993-08-12
Anticipated expiration: 2008-08-18
Also published as: DK462488A; EP0304021A2; ATE88753T1; CN1034183C; CN1035320A; EP0304021A3; DK462488D0; KR890003948A; EP0304021B1; DE3880585D1; KR970000185B1; HU204558B; US4981799A; HUT47317A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Acylaminosäureracemase, deren Herstellung und deren Verwendung.
Die Reaktion, bei der optisch aktive N-Acyl-α-aminocarbonsäure (im folgenden als Nα-Acylaminosäure bezeichnet) zu optisch inaktiver DL-N-Acylaminosäure racemisiert wird, ist eine wichtige Reaktion, die verwendet wird, um optisch aktive Aminosäuren herzustellen.
Die bekannten Herstellungsverfahren für DL-Nα-Acylaminosäuren durch Racemisierung optisch aktiver Nα-Acylaminosäuren sind auf chemische oder physikalische Verfahren unter drastischen Bedingungen beschränkt, wie zum Beispiel das verfahren, bei welchem das Ausgangsmaterial zusammen mit weniger als der äquivalenten Menge Acetanhydrid in Essigsäure erhitzt wird [Biochem. z., 203, 280 (1929)], das Verfahren, bei welchem das Ausgangsmaterial zusammen mit einer großen Menge Acetanhydrid bei Raumtemperatur behandelt wird [J. Am. Chem. Soc., 54, 1630 (1932)], das Verfahren, bei welchem das Ausgangsmaterial in einem Lösungsmittel, wie einem Triester der phosphorigen Säure oder einer niedrigen Fettsäure erhitzt wird [japanische Auslegeschrift Nr. 18402/1976], das Verfahren, bei welchem optisch aktive Nα-Acylaminosäure in einem Stickstoff-Gasstrom direkt auf etwa 160 ºC erhitzt wird [japanische Offenlegungsschrift Nr. 126058/1986] und das Verfahren, in welchem das Ausgangsmaterial zusammen mit einer katalytischen Menge eines Dehydratisierungmittels in Gegenwart eines aromatischen Kohlenwasserstoffs über 130 ºC erhitzt wird [japanische Offenlegungsschrift Nr. 165354/1986].
Die Racemisierung von D-Nα-Acylaminosäuren in Kombination mit Aminoacylase ist verwendet worden, um optisch aktive L-α- Aminosäuren herzustellen. So wird durch die katalytische Wirkung von Aminoacylase das preisgünstige Ausgangsmaterial DL-Nα-Acylaminosäure in L-α-Aminosäure und D-Nα-Aminosäure umgewandelt, die aufgrund von unterschieden in den physikalischen Eigenschaften getrennt und einzeln isoliert werden. Dann findet eines der physikalischen oder chemischen Racemisierungsverfahren auf die D-Nα-Acylaminosäure Anwendung, um sie in das Ausgangsmaterial DL- Nα-Acylaminosäure umzuwandeln, welche wieder mit Aminoacylase behandelt wird. Durch Wiederholen dieser Prozedur kann das Ausgangsmaterial DL-Nα-Acylaminosäure vollständig in die optisch aktive L-α-Aminosäure umgewandelt werden. Dieses Verfahren hat dennoch einen großen Nachteil; für die der Reaktion mit Aminoacylase folgende Trennung der L-α-Aminosäure von der N-Acylaminosäure ist ein Trennungsverfahren erforderlich. Außerdem muß das Racemisierungsverfahren für die D-Nα-Acylaminosäure nach deren Isolierung in fester Form unter chemisch oder physikalisch drastischen Bedingungen durchgeführt werden.
Wenn diese Racemisierung für D-Nα-Acylaminosäure allein in Gegenwart einer optisch aktiven Aminosäure unter solchen Bedingungen, wo Aminoacylase nicht inaktiviert wird (in nahezu neutraler wäßriger Lösung bei Raumtemperatur unter Normaldruck), selektiv durchgeführt werden kann, ermöglicht eine solche selektive Racemisierung unter Mitwirkung von Aminoacylase in einem Schritt die 100 %ige Umwandlung des Ausgangsmaterials DL-NαAcylaminosäure ohne ein Trennungsverfahren in das gewünschte Produkt L-α-Aminosäure. Es ist dann möglich, auf im Stand der Technik obligatorische Trennungs- und Racemisierungsverfahren zu verzichten; und die Effizienz des Verfahrens zur Herstellung optisch aktiver Aminosäuren wird dadurch sehr stark zunehmen.
Unter Bedingungen des Standes der Technik ist es aber nicht möglich, eine selektive Racemisierung zu erzielen. Ein möglicher Weg zur Erreichung dieses Zieles wäre, ein Enzym oder Racemisierungsmittel in die Hände zu bekommen, welches eine solche Selektivität besitzt, daß es auf eine optisch aktive Nα-Acylaminosäure unter deren Racemisierung einwirkt, ohne aber einen Einfluß auf die entsprechenden optisch aktiven α-Aminosäuren zu haben. Man hat jedoch bisher noch kein Enzym oder Racemisierungsmittel mit einer solchen katalytischen Wirkung entdecken können. Es ist hinreichend bekannt, daß es Enzyme gibt, nämlich die sogenannten Aminosäureracemasen, die auf Nα-Acylaminosäure keine Wirkung haben, aber auf eine optisch aktive α-Aminosäure unter deren Racemisierung einwirken [zum Beispiel Biochem. Biophys. Res. Comm., 35, 363 (1969)]. Es ist aber einleuchtend, daß diese Aminosäureracemasen nicht für diesen Zweck benutzt werden können.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten Untersuchungen durch und konnten zu ersten Mal zeigen, daß es ein natürlich vorkommendes Enzym gibt, das keine Wirkung auf optisch aktive Aminosäuren hat, die aber auf optisch aktive Nα-Acylaminosäuren unter deren Umwandlung in die entsprechenden Enatiomorphen einwirkt; und sie haben dieses Enzym als Acylaminosäureracemase bezeichnet. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung machten weitere Studien und erarbeiteten ein Verfahren, um mit Hilfe von Acylaminosäureracemase eine optisch aktive α-Aminosäure aus einer DL-Nα-Acylaminosäure herzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ein Enzym Acylaminosäureracemase, isoliert aus einem aus den Actinomycetes ausgewählten Mikroorganismus, das die folgenden Eigenschaften hat:
(1) Es wandelt eine D-Nα-Acylaminosäure in die entsprechende L- Nα-Acylaminosäure um;
(2) es wandelt eine L-α-Acylaminosäure in die entsprechende D- Nα-Acylaminosäure um;
(3) es wandelt eine D-α-Aminosäure nicht in die entsprechende L-α-Aminosäure um; und
(4) es wandelt eine L-α-Aminosäure nicht in die entsprechende D-α-Aminosäure um;
ein Verfahren zur Herstellung der Acylaminosäureracemase, umfassend das Kultivieren eines aus Actinomycetes ausgewählten Mikroorganismus, der zur Produktion des genannten Enzyms befähigt ist, in einem Kulturmedium, um das Enzym in der Brühe anzureichern und das Ernten des Enzyms; und ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven D- oder L-Aminosäure, umfassend das In-Berührung-Bringen der DL-Nα-Acylaminosäure mit der Acylaminosäureracemase in Gegenwart von D- oder L-Aminoacylase.
Für die obige Nα-Acylaminosäure und α-Aminosäure gilt, daß die α-Aminosäure entweder vom natürlichen Typ oder vom nicht natürlichen Typ sein kann. Es spielt auch keine Rolle, ob die α- Aminosäure neutral, basisch oder sauer ist.
Die obige Nα-Acylaminosäure kann zum Beispiel durch die Formel,
worin X von einer Carbonsäure abgeleitetes Acyl ist, welches substituiert sein kann, und R C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl ist, welches substituiert sein kann.
Zu den Acylgruppen X der α-Acylaminosäure zählen Carbonsäure-Acyle, wie Alkanoyl, Benzoyl und Arylalkanoyl. Diese Acylgruppen können mindestens einen Substituenten besitzen (z.B. Halogen, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkoxy, Nitro). Zu den Beispielen für Alkanoyl zählen C&sub1;&submin;&sub3;-Alkanoyl, wie Formyl, Acetyl, Propionyl und Chloracetyl. Zu den Beispielen für Benzoyl zählen Benzoyl und p- Chlorbenzoyl. Zu den Beispielen für Arylalkanoyl zählen Phenyl- C&sub1;&submin;&sub3;-alkanoyl, wie Phenylacetyl und Phenylpropionyl.
Was weiter Formel (I) angeht, so kann R C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, welches geradkettiges Alkyl oder verzweigt ist, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl , welches mit Hydroxy, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkylthio, Thiol, Phenyl, Hydroxyphenyl oder Indolyl substituiert ist, oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, welches mit Amino, Carboxyl, Guanidyl oder Imidazolyl substituiert ist, bedeutet.
Acylaminosäureracemase produzierende Mikroorganismen können zum Beispiel durch das unten diskutierte Verfahren aufgefunden werden. Aus natürlichen Quellen isolierte Mikroorganismen oder von einem Hinterlegungsinstitut erhältliche Mikroorganismen werden durch ein Standardverfahren kultiviert (eine Verbindung, die das genannte Enzym induziert oder die Produktion des genannten Enzyms fördert, z.B. ein Substrat für das genannte Enzym oder ein Metallsalz, wird, falls dies notwendig ist, zum Medium zugegeben); von jeder erhaltenen Kultur werden Zellen geerntet; die Zellen werden, nach Waschen mit einem Puffer usw., falls erforderlich, in einer geeignete Menge von N-Acetyl-D-methionin und Magnesiumsulfat enthaltenden Phosphatpuffer-Lösung (pH 7) suspendiert; die Suspension wird bei 30 ºC über Nacht geschüttelt, um die Reaktion zu bewirken. Nach Zellentfernung aus der Reaktionsbrühe, werden bestimmte Mengen an L-Aminoacylase und, falls erforderlich, Kobaltchlorid zum Überstand zugefügt, und man läßt mehrere Stunden lang bei 37 ºC reagieren, wonach man die Reaktionsmischung einer TLC (Dünnschichtchromatographie) (n- Butanol : Essigsäure : Wasser = 3:1:1) unterzieht. Die Reaktionsbrühen, die in der Ninhydrin-Reaktion einen Methioninfleck zeigen, werden ausgewählt, danach werden sie mit der Ninhydrin- Reaktion und/oder der Hochleistungs-Flüssigkeitchromatographie auf die Menge an Methionin geprüft. Zu den methionin-positiven Reaktionsbrühen wird D-Aminosäureoxydase-Lösung gegeben und man läßt 20 Stunden lang bei 30 ºC reagieren, um das D-Methionin zu zersetzen, wonach mit jeder Reaktionsmischung wieder die Ninhydrin-Reaktion, die Hochleistungs-Flüssigkeitchromatographie und/oder das Bioassay unter Verwendung von Pediococcus acidilacti ATCC 8042 [J. Biol. Chem., 177, 533 (1949)] durchgeführt wird, um das restliche Methionin, d.h. L-Methionin, in der Reaktionsmischung zu bestimmen. Die Stämme, die in einer Reaktionsbrühe N-Methionin gebildet haben, sind befähigt, L-Methionin aus N-Acetyl-D-methionin zu produzieren; diese Stämme müssen Acylaminosäureracemase und/oder Aminosäureracemase produzieren.
Die L-methionin-positiven Stämme werden dann wieder unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie oben kultiviert, und es werden Zellsuspensionen hergestellt. Zu jeder Suspension wird an Stelle von N-Acetyl-D-methionin L-Methionin gegeben, und man läßt in der gleichen Weise wie oben reagieren. Nach der Zellentfernung wird die Reaktionsmischung durch ein colorimetrisches Verfahren unter Verwendung von D-Aminosäureoxidase, Peroxidase, Phenol und 4-Aminoantipyrin [Clin. Chem., 20, 470 (1974)] auf den Gehalt an D-Methionin geprüft, und die D-methionin-negativen Stämme werden selektiert.
An Stelle des hier verwendeten N-Acetyl-D-methionins kann eine andere D-Nα-Acylaminosäure verwendet werden. Acylaminosäureracemase produzierende Mikroorganismen können durch Selektion von Stämmen erhalten werden, welche keine Aminosäureracemase- Aktivitäten zeigen und welche aus der D-Nα-Acylaminosäure die entsprechende L-α-Aminosäure produzieren.
Die N-Acylaminosäureracemase produzierenden Mikroorganismen, die durch dieses Verfahren gefunden worden sind, sind in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1 Acylaminosäureracemase produziernder Mikroorganismus Produktion von L-Methionin aus N-Acyl-D-methionin (25 mM) Produktion von D-Methionin aus L-Methionin (25 mM) Streptomyces sp. Y-53 (FERM P-9518) Actinomadura roseoviolacea (IFO 14098) Actinomyces aureomonopodiales (IFO 13020) Jensenia canicruria (IFO 13914) Amycolatopsis orientalis (IFO 12806) Sebekia benihana (IFO 14309) Streptomyces coelescens (IFO 13378) Streptomyces celluloflavus (IFO 13780) Streptomyces alboflavus (IFO 13196) Streptomyces aureocirculatus (IFO 13018) Streptomyces diastatochromogenes (IFO 13389) Streptomyces spectabilis (IFO 13424) Streptomyces tuirus (IFO 13418) Streptomyces griseoaurantiacus (IFO 13381)
Obwohl alle der in Tabelle 1 aufgelisteten Acylaminosäureracemase produzierenden Mikroorganismen unvermuteterweise zu den Actinomyceten gehören, kann doch jeder Mikroorganismus, ob er zu den Actinomyceten, Bakterien, Hefen oder Ständerpilzen gehört, für die vorliegende Erfindung benutzt werden, solange er, wie nach dem obigen Verfahren bestimmt, ein Acylaminosäureracemase produziernder Mikroorganismus ist.
Die mikrobiologischen Merkmale eines aus Boden in Arashiyama, Kyoto, Japan isolierten, Acylaminosäureracemase produzierenden Mikroorganismus (in Tabelle 1 als Streptomyces sp. Y-53 aufgelistet) sind wie unten gezeigt.

(a) Morphologie

Die sporentragenden Hyphen zeigen monopodiales Verzweigen und bilden Haken, Schleifen und selten primitive Spiralen (2 oder 3 Drehungen) [Retinaculum-Apertum(RA)]. Die reifen Sporenketten haben mehr als 10 Sporen pro Ketten, und die Spore besitzt eine Zylindrische Form (0,7 bis 0,9 x 1,1 bis 1,5 um) mit glatter Oberfläche. Freibewegliche Elemente, spezielle Organe oder Strukturen werden nicht beobachtet. Dieser Stamm besitzt LL-Diaminopimelinsäure als Zellwandkomponente und hat keinen charakteristischen Zucker (Zellwandtyp I).

(b) Kulturmerkmale

In Tabelle 2 werden die Kulturmerkmale des Y-53-Stamms auf verschiedenen Medien gezeigt. Die in Tabelle 2 aufgeführten Farben werden durch Farbvergleich mit Farbchips des "Color Harmony Manual", 4. Auflage, Container Corporation of America bestimmt. Tabelle 2 Kulturmerkmale auf verschiedenen Medien Medium Wachstum Farbe des Luftmyces Farbe des Substratmycels (umgekehrte Farbe) diffusionsfähiges Pigment in dem Medium Saccharosenitrat-Agar Glucose-Asparagin-Agar Glycerin-Aspargin-Agar anorganische Salze-Stärke-Agar Tyrosin-Agar Nähragar Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar Hafermehl-Agar schlecht gut mittel silbergrau grau hellgrau bis grau gedeckt grau keine gedeckt braun bis dunkelbraun schieferlohfarben senbraun bis gedeckt braun dunkelbraun hellelfenbeinfarbig gedeckt lohfarben bis schieferlohfarben braun zartbraun kastanienbraun
(c) Physiologische Merkmale
(1) Temperaturbereich für das Wachstum: von 14 bis 37ºC (Temperturoptimum für das Wachstum: 20 bis 30 ºC), auf Hefextrakt-Malzextrakt-Agar
(2) Gelatineverflüssigung: positiv
(3) Stärkehydrolyse: positiv
(4) Koagulation entfetteter Milch: negativ
Peptonisierung entfetteter Milch: positiv
(5) Melanoidbildung: negativ
(d) Verwertung von Kohlenstoffquellen
positiv: Glucose, Xylose, Rhamnose
zweifelhaft: Fructose
negativ: Arabinose, Saccharose, Raffinose, Mannit, Inosit
Nach den obigen mikrobiologischen Merkmalen wurde der Y-53- Stamm als zu Gattung Streptomyces gehörend identifiziert; die Erfinder der vorliegenden Erfindung bezeichneten diesen Stamm als Streptomyces sp. Y-53. Der Stamm Y-53 ist beim Institut für Fermentation, Osaka unter der Zugangsnummer IFO-14595 hinterlegt worden, und ist auch beim Fermentations-Forschungsinstitut (FRI), Amt für Industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie, Japan unter der Zugangsnummer FERM-P9518 ab dem 13. August 1987 hinterlegt worden, welche in eine Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag umgewandelt worden ist und beim FRI unter der Zugangsnummer FERM BP-1889 aufbewahrt wird.
Angemerkt sei, daß für die vorliegende Erfindung jede der vom obengenannten Y-53 oder einem anderen in Tabelle 1 aufgelisteten, Acylaminosäureracemase produzierenden Mikroorganismus mittels der Zellfusionstechniken gewonnenen Mutanten und Zygoten, oder die durch Insertion eines Teils (die für Acylaminosäureracemase kodierende Region enthaltend) des Gens dieser Stämme in einen geeigneten Wirtsmikroorganismus erhaltenen Transformanten geeignet sind, solange diese Acylaminosäureracemase produzieren.
Das Medium zur Kultivierung der obengenannten Mikrorganismen kann ein flüssiges oder ein festes sein, solange es Nährstoffquellen enthält, die durch den einschlägigem Stamm verwertbar sind und es die Acylaminosäureracemase-Produktion fördert. Für die Massenkultiverung ist ein flüssiges Medium zweckmäßig.
Für das Medium sind jene Substanzen verwendbar, die allgemein zu Kultivierung von Mikroorganismen verwendet werden, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Nährstoffe. Glucose, Glycerin, Dextrin, Stärke, Melasse und tierische und pflanzliche Öle können zum Beispiel als Kohlenstoffquelle dienen. Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Baumwollsaatmehl, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Harnstoff können zum Beispiel als Stickstoffquelle verwendet werden. Weiter können, falls erforderlich, Natriumsalze, Kaliumsalze, Calciumsalze, Magnesiumsalze, Mangansalze, Eisensalze, Kobaltsalze, Zinksalze, Phosphatsalze oder andere Salze zugesetzt werden.
Die Kultivierung kann mittels stationärer Kultur, Schüttelkultur oder aerober Submersionskultur durchgeführt werden. Für die Durchführung in der Masse wird die aerobe Submersionskultur bevorzugt. Die Kultivierungstemperatur kann im Bereich von 15 bis 37 ºC, vorzugsweise 20 bis 37 ºC liegen. Das Medium wird vorzugsweise bei einem pH im Bereich von 5 bis 9 gehalten. Die Kultivierung wird 18 Stunden bis 4 Tage lang durchgeführt und sie wird abgebrochen, wenn die akkumulierte Menge an Acylaminosäureracemase das Maximum erreicht hat.
Um die Acylaminosäureracemase aus der Kultur zu ernten, wird die Kultur zuerst durch Zentrifugieren oder ein anderes Verfahren in die Zellen und das Kulturfiltrat fraktioniert, und, wenn das Enzym in den Zellen vorliegt, werden die Zellen durch verschiedene Zellaufschlußverfahren, wie lytischer Enzymbehandlung, Ultraschallbehandlung, French-Press-Behandlung und Dyno- Mühlen-Behandlung, welche allein oder in Kombination verwendet werden, desintegriert, um auf diese Weise das Enzym löslich zu machen. Wenn das genannte Enzyme im Kulturfiltrat vorliegt, kann das Kulturfiltrat direkt dem nächsten Reinigungsverfahren zugeführt werden.
Zur Reinigung des genannten Enzyms, das löslich gemacht ist oder wie im Kulturfiltrat vorliegt, können geeignete Kombinationen bekannter Enzymreinigungsverfahren angewandt werden, wie zum Beispiel das Aussalzverfahren unter Verwendung von Ammoniumsulfat usw., die Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Diethylaminoethylcellulose usw., die Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung von Carboxymethylcellulose usw., Gelfiltrationen unter Verwendung von Dextrangel usw., die hydrophobe Chromatographie unter Verwendung eines hydrophoben Harzes und die Affinitätchromatographie, wodurch Acylaminosäureracemase-Standardproben mit einem für den Zweck geeigneten Reinheitsgrad erhalten werden können.
Die durch diese Erfindung erhaltene Acylaminosäureracemase hat die unten beschriebenen physikochemischen Merkmale.

(1) Wirkung

Das genannte Enzym wirkt auf die L-Nα-Acylaminosäure ein, um sie in die entsprechende D-Nα-Acylaminosäure umzuwandeln, und sie wirkt auf die D-Nα-Acylaminosäure ein, um sie in die entsprechende L-Nα-Acylaminosäure umzuwandeln. Das heißt, das Enzym katalysiert die durch die folgende Formel wiedergegebene reversible Reaktion:
L-Nα-Acylaminosäure D-Nα-Acylaminosäure

(2) Substratspezifität

Wie unten in Tabelle 3 gezeigt wird, wirkt das Enzym auf optisch aktive Nα-Acylaminosäuren ein, hat aber keine Wirkung auf die entsprechenden optisch aktiven α-Aminosäuren.
Angemerkt sei, daß die relativen Aktivitäten in Tabelle 3, wo Nα-Acylaminosäuren als Substrate verwendet wurden, durch das in Abschnitt (3) beschriebene Verfahren der Enzymaktivitätsbestimmung bestimmt wurden, mit den Werten, die die gefundene Menge (mM) der produzierten, zu den jeweiligen Substraten korrespondierenden α-Aminosäuren repräsentieren, wie sie auf Grundlage der als 100 genommenen Menge des produzierten Methionins berechnet wurde. Wenn das Substrat eine L-Nα-Acylaminosäure war, wurde die D-Aminoacylase, wie sie durch den Y-53-Stamm produziert wurde, an Stelle der L-Aminoacylase verwendet. Wenn das Substrat eine optisch aktive Aminosäure war, wurde die Reaktionsbrühe, nach Behandlung mit D- oder L-Aminosäureoxidase (beide durch Sigma Co. hergestellt), einer Hochleistungs-Flüssigkeitchromatographie unterworfen, um zu bestätigen, ob das optische Enantiomer des Substrats gebildet worden ist. Tabelle 3 Substrat relative Aktivät N-Acetyl-D-methionin N-Formyl-D-methionin N-Acetyl-D-alanin N-Benzoyl-D-alanin N-Acetyl-D-leucin N-Acetyl-D-phenylalanin N-Chloracetyl-D-phenylalanin N-Acetyl-D-tryptophan N-Acetyl-D-valin N-Chloracetyl-D-valin N-Acetyl-D-alloisoleucin D-Methionin D-Alanin D-Leucin D-Phenylalanin D-Tryptophan D-Valin N-Acetyl-L-methionin N-Formyl-L-methionin N-Acetyl-L-alanin N-Benzoyl-L-alanin N-Acetyl-L-leucin N-Acetyl-L-phenylalanin N-Chloracetyl-L-phenylalanin N-Acetyl-L-tryptophan N-Acetyl-L-valin N-Chloracetyl-L-valin N-Acetyl-L-alloisoleucin L-Methionin L-Alanin L-Leucin L-Phenylalanin L-Tryptophan L-Valin ND: nicht bestimmt

(3) Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität

Acylaminosäureracemase katalysiert die reversible Reaktion. Das heißt, wenn man eine D-Nα-Acylaminosäure als Substrat verwendet, wird die mit dem Fortschritt der Reaktion produzierte und akkumulierte L-Nα-Acylaminosäure zu einem weiteren Substrat für das genannte Enzym, und es ist auch der Wirkung des Enzyms ausgesetzt und wird in die D-Nα-Acylaminosäure, d.h. das Substrat umgewandelt. Zur Bestimmung der wahren Reaktionsgeschwindigkeit ist es erforderlich, das Reaktionsprodukt unmittelbar in andere Verbindungen zu überführen und es aus dem Reaktionssystem zu entfernen.
Wenn das Produkt eine L- oder D-Nα-Acylaminosäure war, gaben die Erfinder der vorliegenden Erfindung zu diesem Zweck eine überschüssige Menge von L- oder D-Aminoacylase zum Reaktions-System zur Bestimmung der Enzymaktivität zu, um auf diese Weise die Deacylierungsreaktion für das Produkt simultan ablaufen zu lassen, und sie bestimmten die Menge der schließlich akkumulierten L- oder D-Aminosäure; dieser Wert (uM) wird gleich der Menge der produzierten L- oder D-Nα-Acylaminosäure angesehen.
Die Enzymaktivitäten werden mit Hilfe eines 50 ul einer Lösung des Enzyms, 40 ul einer Lösung des Substrats, 10 ul einer L-Aminoacylase-Lösung und 400 ul an 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) umfassenden, gemischten Reaktionssystems bestimmt. Als Enzymlösung wurde ein durch Verdünnen einer Acylaminosäureracemase-Standardprobe mit einem Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) bis auf 1 bis 0,2 Einheiten/ml verwendet; als L-Aminoacylase-Lösung wurde eine durch Verdünnen einer L-Aminoacylase-Standardprobe (es kann ein im Handel erhältliches Produkt, wie das von Sigma Co. hergestellte, verwendet werden, aber in der vorliegenden Erfindung wurde aus dem Y-53-Stamm isolierte und gereinigte L-Aminoacylase verwendet) mit einem Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) bis auf 40 bis 8 Einheiten/ml verwendet.
Man mischt die obigen Lösungen durch aufeinanderfolgende Zugabe des Tris-HCl-Puffers, der Substratlösung, der L-Aminoacylase-Lösung und der Enzymlösung in dieser Reihenfolge zusammen und leitet gleichzeitig bei 30 ºC die Reaktion durch Zugabe der Enzymlösung ein. Man läßt weitere 120 Minuten reagieren, wenn die Aktivität der Enzymlösung gering ist, oder 10 Minuten, wenn die Aktivität hoch ist, und man beendet die Reaktion durch 3- minütige Hitzebehandlung bei 100 ºC.
Zur Bestimmung der Enzymaktivität wird die Menge des im Reaktionssystem produzierten Methionins durch Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie bestimmt, und der Produktion von 1umol/Min. Methionin entsprechende Enzymaktivität als 1 Einheit bezeichnet. Wenn eine y mM-Konzentration an Methionin während einer Reaktionszeit von x Minuten im Reaktionssystem produziert worden ist, wird die Aktivität (a Einheiten) des Enzyms in 50ul Lösung durch folgende Gleichung berechnet:
a=y/2x

(4) pH-Optimum für die Enzymaktivität und pH-Bereich für die Enzymstabilität

Man führte die Reaktion 2 oder 4 Stunden lang mit dem oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität durch, verwendete aber an Stelle des Tris-HCl-puffers (pH 7,5) jeweils Natriumacetat-HCl-puffer (pH 4,0; 5,0), primär-Kaliumphosphat- sekundär-Natriumphosphat-Puffer (pH 6,0; 7,0; 8,0), primär-Kaliumphosphat-Natriumborat (pH 6,3; 7,8; 8,3; 9,0) und Natriumcarbonat-Natriumborat (pH 9,2; 10,0; 10,9) und berechnete die relative Aktivität in jeder Lösung aus dem Verhältnis der Menge des produzierten Methionins.
Fig. 1 zeigt die relativen Enzymaktivitäten in den Lösungen der jeweiligen pH-Werte, wenn die Reaktion 2 Stunden lang fortgesetzt wurde; aus Fig. 1 ist zu erkennen, daß das pH-Optimum etwa 8 ist.
Fig. 2 zeigt das Maß der Zunahme der Menge produzierten Methionins, wenn die Reaktionszeit von 2 Stunden auf 4 Stunden verlängert wurde. Man kann sagen, daß das Enzym unter den Bedingungen stabil ist, weil die 4-stündige Reaktion Methionin annähernd das zweifache jener Menge ergab, die in der 2-stündigen Reaktion erhalten wurde. Man erkennt aus Fig. 2, daß die Acylaminosäureracemase zwischen pH 6 und 9 stabil ist.

(5) Geeigneter Temperaturbereich für die Wirkung

Man bestimmte die Menge des aus N-Acyl-D-methionin produzierten L-Methionins mit dem von der Reaktionstemperatur (30 ºC) auf 25, 30, 35, 40, 50, 60 und 70 ºC abgewandelten Standardverfahren der Enzymbestimmung (in Abschnitt (3) beschrieben). Die Reaktionszeit war 5 Minuten, und die verwendete Menge an Enzym war erhöht. Die erhaltenen Ergebnisse werden in Fig. 3 gezeigt. Wie aus Fig. 3 erkennbar ist, liegt der für die Wirkung geeignete Temperaturbereich zwischen 30 und 50 ºC.

(6) Der Einfluß verschiedener Temperaturen auf die Enzymaktivität

Die Enzymlösung wurde nach 30-minütiger Hitzebehandlung bei 30, 35, 40, 50, 60 oder 70 ºC durch das Standardverfahren der Aktivitätsbestimmung auf Restaktivität geprüft. Die Ergebnisse werden als schwarz gepunktete Kurve in Fig. 4 gezeigt.
Wie aus dieser Kurve ersichtlich ist, ist das Enzyme unterhalb von 40 ºC stabil, wird aber oberhalb von 50 ºC inaktiv. Getrennt davon wurde eine Hitzebehandlung unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie oben, aber unter Zugabe von 1 mM Kobaltionen zur Enzymlösung durchgeführt und die Restaktivität bestimmt; die erhaltenen Ergebnisse unterschieden sich von jenen, die unter Co&spplus;&spplus;-freien Bedingungen erhalten wurden. Die in Gegenwart von zugesetztem Co&spplus;&spplus; erhaltenen Ergebnisse werden als weiß gepunktete Kurve in Fig. 4 gezeigt; es ist zu erkennen, daß das Enzym in Gegenwart von Co&spplus;&spplus; unterhalb von 50 ºC stabil ist und bei 60 ºC inaktiv wird.

(7) Einflüsse von Metallionen

Unter Verwendung von metallsalzfreier Lösungen als Kontrolle führte man die Reaktion mit dem in Abschnitt (3) beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität durch, ließ aber die 12,5 mM (Endkonzentration in der Reaktionsmischung: 1 mM) des zur Substratlösung zugegebenen Kobaltchlorids weg, und gab an dessen Stelle 12,5 mM oder 125 mM (die Endkonzentration in der Reaktionsmischung ist 1 mM bzw. 10 mM) verschiedener Metallsalze oder EDTA zu und untersuchte den Einfluß der Metallionen auf die Enzymaktivität. Es sei darauf hingewiesen, daß bestätigt wurde, daß die Aktivitäten der in diesem Experiment verwendeten L-Aminoacylase durch diese Zusätze nicht beeinflußt werden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Die Enzymaktivitäten in Tabelle 4 werden als relative Aktivitäten dargestellt auf Basis des als 100 angenommenen, im Falle von keinen Zusätzen erhaltenen Werte. Tabelle 4: Einflüsse von Metallionen auf die Enzymaktivitäten Zusatz Konzentration an Zusatz kein
Wie in Tabelle 4 gezeigt, wird das genannte Enzym in bestimmten begrenzten Konzentrationsbereichen verschiedener Arten von Metallionen merklich aktiviert. Das heißt, Kobaltionen haben bei niedrigen Konzentrationen (um 1 mM) einen merklich aktivierenden Effekt, aber bei 10 mM aktivieren sie das Enzym kaum. Zinkionen und Nickelionen weisen eine ähnliche Tendenz auf. Im Falle der Magnesiumionen ist der aktivierende Effekt bei 10 mM größer als bei 1 mM. Manganionen und bivalente Eisenionen weisen eine ähnliche Tendenz auf. Unter den geprüften Metallionenarten zeigten Kupferionen einen merklich hemmenden Effekt. Aluminiumionen und Molybdationen hemmen bei 10 mM auch die Enzymaktivität. EDTA hat bei 10 mM einen merklich hemmenden Effekt.

(8) Molekulargewicht

Etwa 200 000: Das Molekulargewicht des im Schritt 5 von Tabelle 5 im Beispiel 2 erhaltenen Enzyms wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese gemäß dem Verfahren von Davis [Ann. N.Y. Acad. Sci., 121, 404 (1964)] unter den folgenden Bedingungen gemessen: Polyamidgradientengel, PAG-Platte 4/15, hergestellt durch Daiichi Pure Chemicals, Co., Japan; 30 mA (Konstantstrom) während 2 Stunden. Das Molekulargewicht des Enzyms wurde basierend auf dem Mobilitätsvergleich zwischen der Enzymprobe und den Standardproteinen geschätzt.
Das Molekulargewicht der Untereinheit dieses Enzyms wurde durch das gleiche Verfahren bei Verwendung von SDS-pAG-Platte 4/20 (Daiichi Pure Chemicals, Co., Japan) in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) unter den gleichen Bedingungen gemessen. Das Molekulargewicht der Untereinheit wurde auf etwa 40 000 geschätzt.

(8) Isoelektrischer Punkt

4,8 (bestimmt durch Agarose-Elektrophorese mit dem Träger Ampholit). Für die Bestimmung wurde die Elektrophorese 2,5 Stunden lang bei konstanter Stromversorgung (2 W) unter Verwendung der Elektrolyseeinheit (Modell 2117 Multiphor II, LKB) und Pharmalyte, pH 3 bis 10 (Pharmacia, Schweden) durchgeführt.
Bei Verwendung in Kombination mit L-Aminoacylase oder D- Aminoacylase ermöglicht die Acylaminosäureracemase der vorliegenden Erfindung optisch aktive L-α-Aminosäure oder optisch aktive D-α-Aminosäure in einem Schritt aus preisgünstiger DL-Nα- Acylaminosäure herzustellen.
L-Aminoacylase ist leicht durch bekannte Verfahren erhältlich, aber auch im Handel erhältliches Produkt kann verwendet werden. Wie berichtet wurde, wird D-Aminoacylase durch Bakterien der Gattung Streptomyces [japanische Offenlegungsschriften Nr. 126969/1987 und 126976/1987], der Gattung Pseudomonas [Nature, 170, 888 (1952), japanische Auslegeschrift Nr. 31477/1985] und die Gattung Alcaligenes [Proceedings of the annual meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan, 1987, S. 659] produziert. Außerdem produzieren die meisten der in der vorliegenden Erfindung als Acylaminosäureracemase produzierende Mikroorganismen isolierten Stämme nicht nur Acylaminosäureracemase sondern auch D-Aminoacylase und/oder L-Aminoacylase.
Zur Herstellung optisch aktiver α-Aminosäure aus DL-Nα- Acylaminosäure als Ausgangsmaterial wird daher eine für den Zweck und die Anwendungsweise passende Standardprobe aus den Acylaminosäureracemase-Standardproben mit verschiedenen Reinheitsgraden, wie sie durch das Verfahren dieser Erfindung hergestellt werden, ausgewählt. Wenn zum Beispiel eine L-α-Aminosäure hergestellt werden soll, wird die ausgewählte Enzym- Standardprobe und L-Aminoacylase, die im Handel erhältlich ist oder aus einem geeigneten L-Aminoacylase produzierenden Mikroorganismus abgetrennt wird, in Kombination oder alternativ mit der DL-Nα-Acylaminosäure umgesetzt. Wenn so gut wie 100 % des Ausgangsmaterials in L-α-Aminosäure umgewandelt worden ist, wird die Reaktion abgebrochen und die gewünschte L-α-Aminosäure wird aus der Reaktionsmischung gewonnen.
Hier muß die dafür geeignete Standardprobe die Voraussetzung erfüllen, daß in ihr keine D-Aminoacylase enthalten ist, wenn der Zweck ihrer Verwendung die Herstellung von L-Aminosäure ist. In Fällen, wo das Enzym für die Verwendung als Bioreaktor immobilisiert wird, kann die Standardprobe entweder das Enzym enthaltende Zellen selbst oder, im Fall der Einschluß-Immobilisierungsmethode, zellfreier Extrakt sein, während der Reinheitsgrad der Enzym-Standardprobe im Falle des Ionenaustauschharz- Adsorptionsverfahrens oder des Verfahren der kovalenten Bindung an einen unlöslichen Träger geringfügig höher sein muß.
Zu den Acylaminosäureracemase-Standardproben, die für das Herstellungsverfahren für optisch aktive Aminosäuren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, zählen, wenn der Acylaminosäureracemase produzierende Mikroorganismus weder L- Aminoacylase noch D-Aminoacylase produziert, die kultivierten Zellen des Mikroorganismus, deren Umwandlungsprodukte und aus den Zellen extrahierte und bis zu verschiedenen Graden gereinigte Standardproben
Wenn er L-Aminoacylase oder auch D-Aminoacylase produziert, kann der Acylaminosäureracemase produzierende Mikroorganismus verwendet werden, um L-α-Aminosäure oder D-α-Aminosäure in genau der gleichen Weise wie mit dem oben erwähnten Mikroorganismus herzustellen. In diesem Fall ist es nicht notwendig, L-Aminoacylase oder D-Aminoacylase separat zuzusetzen, wenn die Aktivität der mitproduzierten L-Aminoacylase oder D-Aminoacylase bei weitem höher ist, als jene der Acylaminosäureracemase.
Wenn der Acylaminosäureracemase produzierende Mikroorganismus sowohl L-Aminoacylase als auch D-Aminoacylase produziert, kann ein Stamm mit D-Aminoacylase oder L-Aminoacylase-Mangel mit Routinemethoden zur Mutation induziert werden, um L-Aminosäure bzw. D-Aminosäure zu produzieren. Sofern geeignet, können auch Verfahrensprodukte verschiedener Reinheitsgrade, die von Kulturzellen bis zu Enzym-Standardproben reichen, verwendet werden.
Es sei erwähnt, daß das Verfahrensprodukt, wenn es sich auf dem Niveau der kultivierten Zelle oder des zellfreien Extraktes befindet, Enzyme enthalten kann, welche die gewünschte Aminosäure zersetzen; in diesem Fall muß die Aminosäure zersetzende Aktivität beseitigt oder entfernt werden. Wenn es sich bei dem Mikroorganismus nicht um einen aminoacylase-defizienten Stamm handelt, ist es schwierig, ihn auf dem Zellniveau direkt dazu zu benutzen, um optisch aktive α-Aminosäure zu produzieren, aber der Mikroorganismus kann nach Inaktivierung einer oder beider Aminoacylasen durch Hitzebehandlung oder Zusatz von Inhibitoren usw. ohne Beeinträchtigung der Acylaminosäureracemase verwendet werden. Zur Herstellung einer Standardprobe der Acylaminosäureracemase aus einem Stamm, der L- und D-Aminoacylase koproduziert, wird die Acylaminosäureracemase zuerst aus den kultivierten Zellen extrahiert, worauf die die Produktion der gewünschten Aminosäure störenden Aminoacylasen abgetrennt und entfernt werden, und falls erforderlich, sich weiter ein geeignetes Reinigungsverfahren anschließt, wodurch die Standardprobe hergestellt wird.
Wenn eine L- oder D-Aminosäure mittels Acylaminosäureracemase und L- oder D-Aminoacylase hergestellt wird, werden normalerweise solche Verfahren verwendet, wie (1) das Verfahren, bei welchem eine Standardprobe der Acylaminosäureracemase und Doder L-Aminoacylase bei pH 6 bis 9 in einem Puffer, der geeignete Mengen des Ausgangsmaterials DL-Nα-Acylaminosäure und Co&spplus;&spplus; oder Metallionen anderer Art enthält, gelöst wird, und man diese Lösung bei einer geeigneten Temperatur bis zur Vervollständigung der Reaktion stehen läßt; (2) das Verfahren, bei welchem eine Standardprobe der Acylaminosäureracemase und L- oder D-Aminoacylase zusammen oder getrennt durch bekannte Verfahren immobilisiert werden, wonach sie in einem oder mehreren Stufen in das Reaktionsgefäß gefüllt werden, um auf diese Weise einen Bioreaktor herzustellen, und man läßt einen DL-Nα-Acylaminosäure und Co&spplus;&spplus; oder Metallionen anderer Art enthaltenden Puffer bei pH 6 bis 9 diesen Reaktor passieren, um die Reaktion zu bewirken; und (3) das Verfahren, bei welchem beide Enzyme in einer der Abteilungen eines durch eine Ultrafiltrationsmembran in 2 Abteilungen unterteilten Reaktionsgefäßes gelöst werden, eine Lösung des Ausgangsmaterials für die Reaktion zugegeben wird, und das durch die Ultrafiltrationsmembran hindurchgetretene Produkt gewonnen wird. Es ist in jedem Fall wünschenswert, daß die Reaktionsmischung sterilisiert ist und so keimfrei wie möglich gehandhabt wird.
Da die so erhaltene Endreaktionsmischung außer der organischen Säure, die durch Hydrolyse der gewünschten optisch aktiven Aminosäure mit Acylgruppen hergestellt worden ist, nichts mehr enthält, kann daraus leicht durch ein herkömmliches Verfahren die gewünschte Aminosäure gewonnen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die pH-Abhängigkeit der Acylaminosäureracemase.
Fig. 2 zeigt die Mengen des mit Hilfe von Acylaminosäureracemase bei verschiedenen pH-Werten produzierten Methionins, die als relative Werte für die Mengen der 4-stündigen Reaktion ( )
(auf Basis der als 1 angenommen Mengen der 2-stündigen Reaktion ( ) berechnet) ausgedrückt werden.
Fig. 3 zeigt die Beziehung zwischen Reaktionstemperatur und Enzymaktivität in der Acylaminosäureracemase.
Fig. 4 zeigt die Hitzestabilität der Acylaminosäureracemase.

Beispiele

Beispiel 1

Ein BBL-Trypticase-Sojabrühe (pH 7,0) (erhältlich von Becton Dickinson Co.) enthaltendes Medium und 0,1 % N-Acetyl-D- methionin wurden in 20 ml-Portionen in 200 ml-Erlenmeyerkolben verteilt und bei 120 ºC 20 Minuten lang sterilisiert. Getrennt davon, wurde der Stamm Streptomyces sp. Y-53, nach Kultivierung durch Flüssigkultur, unter Gefrierbedingungen (-80 ºC) gelagert und, falls erforderlich, als Ausgangsinokulum verwendet.
Der gefrorene Mikroorganismus wurde in Lösung in einer Menge von 0,7 ml pro Kolben in 30 Kolben des obigen Mediums keimfrei eingeimpft, und diesern schloß sich 2 Tage Schüttelkultur bei 28 ºC an, um die Impfkultur herzustellen. Jede Impfkultur wurde dann in einer Menge von 1 ml pro Kolben in 500 Kolben des gleichen Mediums transferiert und einer 42-stündigen Schüttelkultur bei 28 ºC unterworfen. Der Inhalt der Kolben wurde vereinigt, und man trennte die Zellen durch Zentrifugieren (4 ºC, 10000 UpM, 15 Minuten) ab. Die Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, und man erhielt 216 g nasse Zellen. Die folgenden Verfahrensschritte wurden alle bei niedriger Temperatur unterhalb von 4 ºC durchgeführt.
Die 216 g nasse Zellen wurden in 1 l eines 50 mM Phosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert und in die Dyno-Mühle (durch die Willy A. Bachofen AG hergestellter Zell-Desintegrator) gegeben, um auf diese Weise die Zellen zu zerstören. Die verwendeten Glasperlen hatten einen Durchmesser von 0,1 bis 0,2 mm, und die Fließgeschwindigkeit war 60 ml/Min. Die verarbeitete Flüssigkeit wurde bei 4 ºC, 10000 UpM 20 Minuten lang zentrifugiert, um 1700 ml zellfreien Extrakt zu bilden. Die Acylaminosäureracemase- Aktivität dieses Extrakts betrug 4,9 Einheiten und die spezische Aktivität betrug 0,52 Millieinheiten/mg protein. Die Proteingesamtmenge wurde mit dem Bio-Rad Proteinprüfverfahren bestimmt.

Beispiel 2

Zu den im Beispiel 1 erhaltenen 1700 ml zellfreien Extrakts wurden unter Rühren und Kühlen des Extrakts nach und nach 300 g Ammoniumsulfat gegeben. Nach Zugabe der gesamten Menge wurde weitere 30 Minuten lang gerührt, und die Mischung bei 4 ºC, 10000 UpM 30 Minuten lang zentrifugiert, um 1660 ml eines klaren Überstandes zu ergeben.
Man adsorbierte die 1660 ml des Überstands an einer mit einem 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; 30 % gesättigtes Ammoniumsulfat enthaltend) äquilibrierten Säule (4,8 x 30 cm) aus TSKHW65C (Tosoh Co., Japan), und wusch die Säule mit 1000 ml des obigen Phosphatpuffers, worauf dann die Proteinkomponente mit einem Phosphatpuffer, der kein Ammoniumsulfat enthielt, eluiert und die Eluatfraktion, die eine Aktivität des gewünschten Enzyms zeigte, gesammelt wurde. Zu 330 ml der so erhaltenen aktiven Fraktion wurden unter Kühlen und Rühren der Fraktion nach und nach 128 g Ammoniumsulfat gegeben. Man trennte das resultierende Präzipitat durch 30-minütiges Zentrifugieren mit 10000 UpM ab. Dieses Präzipitat wurde in 50 ml eines 50 mM Phosphatpuffers (pH 7,0) gelöst und durch eine Sephadex G25-Säule (Pharmacia, Schweden) entsalzt. Die so erhaltene rohe Enzymlösung wurde an einer mit einem 50 mM Phosphatpuffer äquilibrierten Säule (4,8 x 30 cm) aus DEAE Toyopearl 650M (Tosoh Co., Japan) adsorbiert. Die Säule wurde mit 1000 ml des gleichen Puffer gewaschen, wonach sie mit dem gleichen, 0,2 mM NaCl enthaltenden Puffer eluiert wurde, um 340 ml einer aktiven Fraktion zu ergeben. Zu dieser aktiven Fraktion wurden nach der üblichen Methode 133 g Ammoniumsulfat zugegeben. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugieren (4 ºC, 10000 UpM, 30 Minuten) abgetrennt und in 30 ml des gleichen Puffers gelöst. Diese Lösung wurde durch eine Säule aus Sephadex G5 entsalzt, und es wurden 59 ml einer rohen Enzymlösung erhalten. Diese rohe Enzymlösung wurde an einer mit dem gleichen Puffer äquilibrierten DEAE-5PW-Säule (Tosoh Co., Japan, 2,15 cm Durchmesser x 15 cm) adsorbiert, es kam Hochleistungs-Flüssigkeitchromatographie (Modell HLC-837, Tosoh Co., Japan) zur Anwendung, und man führte die Elution mit einer linear von 0 bis 0,5 M steigenden Konzentration von NaCl durch. Die Elutionsgeschwindigkeit war 4 ml pro Minute. Man gewann die zwischen 32 und 36 Minuten eluierte Fraktion, um 16 ml einer aktiven Fraktion zu erhalten. Die Acylaminosäureracemase-Aktivität in dieser Fraktion betrug etwa 7,2 Einheiten, und die spezifische Aktivität betrug etwa 63 Millieinheiten/mg Protein. Die spezifische Aktivität stieg auf etwa das 122-fache jener des zellfreien Extrakts.
Diese aktive Fraktion wurde dann auf eine mit 50 mM Phosphat äquilibrierte TSK-G3000SW-Säule (Tosoh Co., Japan, 5,5 cm Durchmesser x 60 cm) gegeben, und man führte die Gelfiltration bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml pro Min. durch, und man trennte die aktive Fraktion ab. Da diese Fraktion in der Polyacrylamidgel-Elektrophorese eine einzelne Bande zeigte, schloß man, daß sie nahezu rein war. Diese Fraktion enthielt 1,2 Einheiten Acylaminosäureracemase-Aktivität mit einer spezifischen Aktivität von 2,8 Einheiten/mg Protein.
Tabelle 5 zeigt die Gesamtaktivitäten der Acylaminosäureracemase, die Gesamtgehalte an Protein und die spezifischen Aktivitäten in den jeweiligen Trennprozessen sowie die Volumina der jeweiligen Probelösungen. Tabelle 5 - Reinigung des Enzyms Verfahren Volumen (ml) Gesamtaktivität (Einh.) Gesamtprotein (mg) spezifische Aktivität (mEinh./mg) zellfreier Extrakt 65C-Säule Toyopearl Säule 5PW-Säule G3000SW-Säule

Beispiel 3

Man kultivierte in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 den Streptomvces sp. Y-53-Stamm in 10 Liter des Mediums. Die nach 42-stündigem Kultivieren erhaltenen Zellen wurden abgetrennt und einmal mit 0,8 %iger NaCl-Lösung gewaschen, um 300 g nasser Zellen zu erhalten.
Die nassen Zellen wurden mit Hilfe einer Dyno-Mühle (ein Zell-Desintigrator) in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 zerstört und zentrifugiert (10000 UpM, 20 Minuten), um 1680 ml eines Überstands zu erhalten. Dieser Überstand enthielt 21 Einheiten der Acylaminosäureracemase, 315 Einheiten der L-Aminoacylase und 75 Einheiten der D-Aminoacylase. Zu diesem Überstand wurde Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 30 % gegeben, und man entfernte das resultierende Präzipitat durch Zentrifugieren. Zum Überstand der Zentrifugation gab man weiteres Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 60 % und gewann das resultierende Präzipitat durch Zentrifugieren. Das erhaltene Präzipitat wurde in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und durch Gelfiltration unter Verwendung von mit dem gleichen Puffer äquilibriertem Sephadex G25 entsalzt. Man unterwarf die erhaltene Lösung einer Ionenaustauschchromatographie.
Eine mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibrierte DEAE Toyapearl 650 M-Säule (Harzvolumen: 700 ml) wurde mit der obigen entsalzten Lösung (490 ml) beladen und mit 2 l des gleichen Phosphatpuffers gewaschen, um auf diese Weise die nicht adsorbierbaren Komponenten auszuwaschen. Aus dieser Waschflüssigkeit wurden 114 Einheiten D-Aminoacylase gewonnen. Diese DEAE Toyopearl 650 M-Säule weist Acylaminosäureracemase (etwa 20 Einheiten) und L-Aminoracemase (etwa 900 Einheiten) auf, die relativ fest darauf adsorbiert sind, und, wenn man nicht eine mehr als 0,2 Mol Salz enthaltende Lösung durch die Säule fließen läßt, werden diese nicht eluiert
Während man die obige Säule bei 30 ºC hält, läßt man 0,5 % N-Acetyl-DL-methionin und 1 mM Kobaltchlorid enthaltenden 20 mM Phosphatpuffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde durch die Säule fließen. Es werden 3 l der auslaufenden Flüssigkeit gesammelt und durch ein IR 120 Kationenaustauschharz passiert, wonach sie dann unter reduziertem Druck konzentriert wurde, bis sie trocken und fest war. Der erhaltene Rückstand wurde nach zweimaligem Waschen mit 10 ml gekühltem absolutem Alkohol in etwa 100 ml heißem Wasser gelöst, und die beim Abkühlen abgeschiedenen Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt. Man gab außerdem tropfenweise Alkohol zum Filtrat und ließ diese Mischung über Nacht stehen. Die abgeschiedenen Kristalle wurden gesammelt und getrocknet, um 9,8 g L-Methionin zu erhalten. Der Schmelzpunkt betrug 280 bis 281 ºC, [α]25D -8,2 º (C = 1 %). Dieses Produkt zeigte in der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bzw. der Dünnschichtchromatographie das völlig gleiche Verhalten wie eine Standardprobe L-Methionin. Außerdem zeigte dieses Produkt, wenn es zusammen mit einer Standardprobe geschmolzen wurde, keine Erniedrigung des Schmelzpunktes.

Beispiel 4

Zu einem aus 1,5 % Glycerin, 1,0 % Pepton, 1,0 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl, 0,25 % K&sub2;HPO&sub4;, 0,25 % MgSO&sub4; 7H&sub2;O und 0,05 % N- Acetyl-DL-methionin (pH 7,0) bestehendem 20 ml-Impfkulturmedium in einem 200 ml-Erlenmeyerkolben, wurde eine im Beispiel 1 hergestellte 0,7 ml-Vorratskultur eingeimpft und man kultivierte diese auf einem Rotationsschüttelapparat (200 UpM) bei 28 ºC 18 Stunden lang. Ein Milliliter der resultierenden Kultur wurde in einen 25 ml eines aus 0,5 % Glycerin, 1,0 % Pepton, 0,5 % NaCl, 0,25 % K&sub2;HPO&sub4; und 0,05 % N-Acetyl-DL-Methionin (pH 7,0) bestehenden Kulturmediums enthaltenden 200 ml-Erlenmeyerkolben transferiert. Die Kultivierung wurde unter den gleichen, oben erwähnten Bedingungen durchgeführt. Die folgenden Verfahrensschritte wurden bei 0 bis 4 ºC durchgeführt.
Die Zellen aus 5 Liter der kultivierten Brühe wurden durch Zentrifugieren (10000 UpM, 15 Min.) geerntet und mit 0,85 %iger wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen (385 g, Naßgewicht) wurden in einem Liter 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und mit einer Dyno-Mühle (Willy A. Bachofen AG) unter den folgenden Bedingungen desintegriert: Größe der Glasperlen, 0,1 bis 0,2 mm; Fließgeschwindigkeit der Zellsuspension, 60 ml/min; Umdrehungszahl, 3000 UpM. Die zerstörten Zellen wurden durch Zentrifugieren (10000 UpM, 20 Min.) entfernt. Der erhaltene Überstand (1280 ml) wies 75 Einheiten Acylaminosäureracemase-Aktivität und 1500 Einheiten L-Aminoacylase-Aktivität auf. Man setzte dem zellfreien Extrakt (1280 ml) in der gleichen Weise, wie im Beispiel 2 beschrieben, 500 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub2; zu, um einen Sättigungsgrad von 60 % zu erhalten. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugieren (10000 UpM, 30 Min.) abgetrennt und in 600 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgelöst. Die Enzymlösung wurde mit Cellulosebeuteln 18 Stunden lang gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die entsalzte Enzymlösung wurde auf eine mit DEAE-Toyapearl 650M (Tosoh Co., Japan) gefüllte, mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibrierte Säule (3 cm x 30 cm) geladen. Die Säule wurde mit 1000 ml des gleichen Puffers und außerdem mit 1000 ml eines 1 mM CoCl&sub2; enthaltendem 20 mM-Tris- HCl-Puffer gewaschen.
Die Gesamtaktivitäten der auf dieser Säule adsorbierten Acylaminosäureracemase bzw. L-Aminoacylase waren 43 bzw. 800 Einheiten. Während man die obige Säule bei 28 ºC hielt, wurden 2000 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 0,5 % N-Chloracetyl- D-valin, 1mM CoCl2 und 1 ;ig/ml Dihydrostreptomycinsulfat enthielt, bei einer Fließgeschwindigkeit von 60 ml/Stunde durch die Säule gegeben. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Säule mit 500 ml 1mM CoCl&sub2; enthaltendem 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gewaschen. Das Eluat wurde gesammelt und mittels Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie analysiert. Es wurde überhaupt kein N-Chloracetyl-D-valin in dieser Lösung gefunden. Nachdem das Eluat im Vakuum konzentriert worden war, gab man kaltes Ethanol zu. Der erhaltene, weiß ausgefallene Feststoff wurde durch Filtration abgetrennt, mit kaltem Ethanol gewaschen und in einer kleinen Menge Wasser-Ethanol aufgelöst. Wenn man es bei 4 ºC stehen ließ, erhielt man die farblosen, blättrigen Kristalle. Die Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt und getrocknet. Die Ausbeute ist 4,5 g. Der Schmelzpunkt betrug 315 ºC (Zersetzung).
[α]25D + 6,4 º (c = 1, H&sub2;O). Die Probelösung dieser Kristalle zeigte in der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bzw. in der Dünnschichtchromatographie die gleiche Retentionszeit bzw. den gleichen Rf-Wert wie die Standardprobe von L-Valin.

Claims

1. Ein Enzym Acylaminosäureracemase, isoliert aus einem aus Actinomycetes ausgewählten Mikroorganismus, das die folgenden Eigenschaften hat:

(1) Es wandelt eine D-N-Acyl-α-aminocarbonsäure in die entsprechende L-N-Acyl-α-aminocarbonsäure um;

(2) es wandelt eine L-N-Acyl-α-aminocarbonsäure in die entsprechende D-N-Acyl-α-aminocarbonsäure um;

(3) es wandelt eine D-α-Aminosäure nicht in die entsprechende L-α-Aminosäure um; und

(4) es wandelt eine L-α-Aninosäure nicht in die entsprechende D-α-Aminosäure um.

2. Acylaminosäureracemase nach Anspruch 1, worin die N-Acyl-α-aminocarbonsäure als Substrat die folgende Formel hat

worin

X ein von einer Carbonsäure abgeleitetes Acyl ist, das substituiert sein kann, und

R ein C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl ist, das substituiert sein kann.

3. Acylaminosäureracemase nach Anspruch 2, worin

X C&sub1;&submin;&sub3;-Alkanoyl oder Benzoyl ist, das mit einem Halogen, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkoxyl oder/und Nitro substituiert sein kann.

4. Acylaminosäureracemase nach Anspruch 2, worin

R C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl ist, das ein geradkettiges Alkyl oder ein verzweigtes Alkyl ist.

5. Acylaminosäureracemase nach Anspruch 2, worin

R C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl ist, das mit Hydroxy, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkylthio, Thiol, Phenyl, Hydroxyphenyl oder Indolyl substituiert ist.

6. Acylaminosäureracemase nach Anspruch 2, worin

R C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist, das mit Amino, Carboxyl, Guanidyl oder Imidazolyl substituiert ist.

7. Acylaminosäureracemase nach Anspruch 1, weiterhin enthaltend Aminoacylase.

8. Verfahren zur Herstellung der Acylaminosäureracemase nach Anspruch 1, umfassend das Kultivieren eines aus Actinomycetes ausgewählten Mikroorganismus, der zur Produktion des genannten Enzyms befähigt ist, in einem Kulturmedium, um das Enzym in der Brühe anzureichern, und das Ernten des Enzyms.

9. Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven D- oder L-Aminosäure, umfassend das In-Berührung-Bringen der Acylaminosäureracemase nach Anspruch 1 mit einer DL-N-Acyl-α-aminocarbonsäure in Gegenwart von D- oder L-Aminoacylase.