CN1035320A - 酰基氨基酸外消旋酶，其生产方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酰基氨基酸外消旋酶，其生产方法及应用。

本发明的酰基氨基酸外消旋酶在旋光氨基酸存在下，于常温常压下在pH值接近中性水平时仅外消旋旋光N-酰基-α-氨基羧酸；其与D-或L-酰化氨基酸水解酶结合使用可能以高效率由DL-酰基-α-氨基羧酸生产旋光D-或L-α-氨基酸。

Description

本发明涉及一种酰基氨基酸外消旋酶，其生产方法及应用。

使旋光N-酰基-α-氨基羧酸（下文简称N^α-酰基氨基酸）外消旋成为非旋光DL-N-酰基氨基酸的反应是用于生产旋光氨基酸的主要反应。

经旋光N^α-酰基氨基酸的外消旋作用生产DL-N^α-酰基氨基酸的已知方法限于在严格条件下的物理学和化学方法，例如，在乙酸中将原料与较低当量数的乙酐一起加热的方法[Biochem.Z.，203，280（1929）]、在室温下将原料加大量乙酐处理的方法[J.Am.Chem.Soc.，54，1630（1932）]、在磷酸三酯或低级脂肪酸等溶剂中加热原料的方法[日本已公告专利申请No.18402/1976]、于大约160℃在氮气流中直接加热旋光N^α-酰基氨基酸的方法[日本已公开未审查专利申请No.126058/1986]以及在芳香烃存在下将原料连同催化量脱水剂一起加热到130℃以上的方法[日本已公开未审查专利申请No.165354/1986]。

已使用D-N^α-酰基氨基酸的外消旋作用与酰化氨基酸水解酶结合以生产旋光L-α-氨基酸。因此，借助酰化氨基酸水解酶的催化作用，使价格便宜的原料DL-N^α-酰基氨基酸转化为L-α-氨基酸和D-N^α-酰基氨基酸，并基于物理性质的差异将两者分离开。然后应用任何一种物理或化学消旋方法将D-N^α-酰基氨基酸转化成原料DL-N^α-酰基氨基酸，并再次用酰化氨基酸水解酶处理之。如此反复进行这一操作，即可使原料DL-N^α-酰基氨基酸完全转化成旋光的L-α-氨基酸。但这一方法具有一个重要缺点，即使用酰化氨基酸水解酶处理后须经一分离程序以使L-α-氨基酸与N-酰基氨基酸彼此分离开。另外，在以固态形式分离后，还必须在严格的物理或化学条件下完成D-N^α-酰基氨基酸的外消旋过程。

如果能在一种旋光氨基酸存在下，于酰化氨基酸水解酶不被失活的条件下（如在常压室温下，近于中性水溶液中）单单选择性地使D-N^α-酰基氨基酸完成这种消旋作用，这一选择性消旋作用即可与酰化氨基酸水解酶协同作用，不经分离程序使原料DL-N^α-酰基氨基酸以单一步骤100%转化为预期产物L-α-氨基酸。这样将有可能省去现有技术中必不可少的分离和外消旋程序，并可大大提高旋光氨基酸之生产工艺的效率。

然而，在现有技术的任何工艺条件下均不可能实现选择性外消旋作用。一种可能的办法是得到一种具有选择性作用酶或外消旋剂，以使之仅对旋光N^α-酰基氨基酸起作用而对相应的旋光α-氨基酸则不起作用，但迄今尚未找到表现有这样一种催化作用的酶或外消旋剂。已知有一类称为氨基酸外消旋酶的酶，其对N^α-酰基氨基酸不起作用，但可使旋光α-氨基酸产生外消旋作用[如见Biochem.Biophys.Res.Comm.，35，363（1969）]，但有证据表明这些氨基酸外消旋酶并不适用于这一目的。

本发明人对此进行了研究，第一次证明有一种天然存在的酶，其对旋光氨基酸没有作用，但可作用于旋光N^α-酰基氨基酸使之转化为相应的对映体，已将该酶定名为酰基氨基酸外消旋酶。本发明人进一步研究并建立了使用酰基氨基酸外消旋酶由DL-N^α-酰基氨基酸生产旋光α-氨基酸的方法。

因此，本发明涉及一种具有下列性质的酰基氨基酸外消旋酶：

（1）将D-N^α-酰基氨基酸转化为相应的L-N^α-酰基氨基酸，

（2）将L-N^α-酰基氨基酸转化为相应的D-N^α-酰基氨基酸，

（3）不能将D-α-氨基酸转化为相应的L-α-氨基酸，

（4）不能将L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸;

一种生产酰基氨基酸外消旋酶的方法，其包括在培养基中培养能产生上述酶的微生物以在培养液积聚上述的酶并收获之;以及一种生产旋光D-或L-氨基酸的方法，该方法包括于D或L-酰基氨基酸水解酶存在下使DL-N^α-酰基氨基酸与酰基氨基酸外消旋酶接触。

就上述N^α-酰基氨基酸和α-氨基酸来说，α-氨基酸可以是天然的或非天然的。另外，α-氨基酸可以是中性的、碱性的或酸性的。

例如，上述N^α-酰基氨基酸可用下列结构通式来表示：

其中X是羧酸衍生的酰基，其可以是被取代的，R是可被取代的C_1-20烷基。

N^α-酰基氨基酸的酰基基团（X）包括羧酸酰基如烷酰基、苯甲酰基和芳基烷酰基。这些酰基可至少有一个取代基（如囟素、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、硝基）。烷酰基的例子包括C_1-3烷酰基如甲酰基、乙酰基、丙酰基和氯代乙酰基。苯甲酰基的例子包括苯甲酰基和对位氯代苯甲酰基。芳基烷酰基的例子包括苯基-C_1-3烷酰基如苯基乙酰基和苯基丙酰基。

另外，式（Ⅰ）中R可以是直链或分枝链的C_1-6烷基、用羟基、C_1-3烷硫基、硫羟基、苯基、羟苯基或吲哚基取代的C_1-3烷基，或用氨基、羧基、胍基或咪唑基取代的C_1-4烷基。

可按下面讨论的方法找到酰基氨基酸外消旋酶生产微生物，用标准方法（必要时向培养基内加入一种可诱导所说的酶或促进所说的酶产生的化合物，如一种适用于该酶的底物或金属盐）培养自天然来源分离的或自保藏机构得到的微生物;由各所得培养物中收获细胞;用缓冲液等洗涤细胞后，必要时将细胞悬浮于含有适量N-乙酰基-D-蛋氨酸和硫酸镁的磷酸盐缓冲溶液（pH7）中;将悬液于30℃振荡过夜以使之反应。由反应液中除去细胞后，向上清液中加入给定量的L-酰化氨基酸水解酶，且必要时加入氯化钴，并使反应于37℃进行几小时，然后对反应混合物作薄层层析（TLC，正丁醇∶乙酸∶水＝3∶1∶1）。选择经茚三酮反应显现蛋氨酸斑点的反应溶液，然后通过茚三酮反应和/或高效液相层析法检测其中蛋氨酸含量。向呈现蛋氨酸阳性反应的培养液内加入D-氨基酸氧化酶溶液，并使反应于30℃进行20小时以分解D-蛋氨酸，然后再次对各反应混合物作茚三酮反应、高效液相层析和/或使用乳酸片球菌ATCC8042作生物检测[J.Biol.Chem.，177，533（1949）]，以测定反应混合物中残留的蛋氨酸（即L-蛋氨酸）。这些在反应液中有一定量L-蛋氨酸的菌株能够自N-乙酰基-D-蛋氨酸产生L-蛋氨酸，它们就一定能产生酰基氨基酸外消旋酶和/或氨基酸外消旋酶。

然后使用如上述的同样条件再次培养L-蛋氨酸阳性菌株并制备细胞悬液。向各悬液内加入L-蛋氨酸以代替N-乙酰基-D-蛋氨酸，并以上述的同样方式进行反应。除去细胞后，使用D-氨基酸氧化酶、过氧化物酶、苯酚和4-氨基-氨替比林以比色法[Clin.Chem.，20，470（1974）]检测反应混合物中D-蛋氨酸量，并选择D-蛋氨酸阴性菌株。

另外可用D-N^α-酰基氨基酸代替N-乙酰基-D-蛋氨酸。这样经选择不表现氨基酸外消旋酶活性并可由D-N^α-酰基氨基酸产生相应L-α-氨基酸的菌株，即可得到酰基氨基酸外消旋酶生产微生物。

表1中列出了已用这一方法找到的N-酰基氨基酸外消旋酶生产微生物。

虽然表1中列出的酰基氨基酸外消旋酶生产微生物均出乎预料地属于放线菌属，任何微生物，无论是放线菌、细菌、真菌、酵母还是磨菇，只要依上述方法检测证明其为酰基氨基酸外消旋酶生产微生物，都可用于本发明。

下面给出了由Arashiyama（Kyoto，Japan）的土壤中分离的酰基氨基酸外消旋酶生产微生物的微生物学特征。

（a）形态学

携带孢子的菌丝显示总状分枝式，并形成钩、环或少见的原始螺旋（2或3圈）[Retinaculum-Apertum（RA）]。成熟孢子链每个链有10个以上孢子且孢子均显示为有平滑表面的圆柱形（0.7至0.9×1.1至1.5μm）。未观察到游动元件、特异器官或结构。该菌株具有LL-二氨基庚二酸作为细胞壁成分并且没有特征性糖（Ⅰ型细胞壁）。

（b）培养特征

表2中显示了Y-53菌株在各种培养基上的培养特征。表2中给出的颜色是使之与“Color    Harmony    Manual”（4th    edition，Container    Corporation    of    America）的色片相比较而确定的。

（c）生理学特征

（1）生长温度范围：在酵母浸膏-麦芽汁琼脂培养基上，14到37℃（最适生长温度：20至30℃）

（2）明胶液化：阳性

（3）淀粉水解：阳性

（4）脱脂乳凝固作用：阴性

脱脂乳胨化作用：阳性

（5）类黑素形成：阴性

（d）碳源的利用

阳性：葡萄糖、木糖、鼠李糖

未确定的：果糖

阴性：阿拉伯糖、蔗糖、棉子糖、甘露醇、肌醇

根据上述微生物学特征，Y-53菌株被鉴定为链霉菌属菌株;本发明人将其定各为链霉属Y-53菌株。Y-53菌株已寄存于发酵研究所（Osaka），寄存登记号为IFO-14596;并于1987年8月13日寄存于日本国际贸易和工业厅工业科学技术局发酵研究所，登记号为FERM-P9518，该寄存物按布达佩斯条约的规定同时寄存于FRI，登记号为FERM    BP-1889，并寄存于CCTCC，登记号为CCTCC    M88066。

应提到的是，只要能产生酰基氨基酸外消旋酶，任何借助于细胞融合技术或将菌株基因之一部分（含有酰基氨基酸外消旋酶编码区）插入适当宿主微生物所得到的转化体自上述Y-53菌株或表Ⅰ所列出的其他酰基氨基酸外消旋酶生产微生物衍生的突变株或接合子均可用于本发明。

用于培养上述微生物的培养基可以是液体的或固体的，只要其含能被相关菌株利用的营养源并促进酰基氨基酸外消旋酶产生都是适用的。为进行大批量培养，使用液体培养基更为方便。

用于制备培养基的物质是一般适用于培养微生物的物质，如碳源、氮源和无机营养素。如葡萄糖、甘油、糊精、淀粉、糖蜜及动物和植物油可用作碳源;大豆粉、玉米浆、棉籽粉、肉汁、蛋白胨、酵母浸膏、硫酸铵、硝酸钠和尿素等可用作氮源。如必要时可进一步加入钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锰盐、铁盐、钴盐、锌盐、磷酸盐将其他盐。

可用静止培养法、振荡培养法或需氧深层培养法进行培养。对于大批量处理最好用需氧深层培养法。培养温度为15-37℃，最好是20至37℃。培养基的pH最好保持在5至9。培养进行18小时到4天，并当积聚的酰基氨基酸外消旋酶的量达到最大时终止培养。

为了从培养物中收获酰基氨基酸外消旋酶，首先以离心或其他方法将培养物分离成细胞和培养滤液两部分，如细胞中存在所说的酶可单独或结合使用溶解酶处理、超声处理、French压滤处理及Dyno-Mill压榨处理等各种细胞破碎方法破碎细胞，以使酶溶出。如所说的酶存在于培养物滤液中，则可直接对培养物滤液进行纯化处理。

为了纯化溶解的或存在于培养物滤液中的所说的酶，可结合使用已知的酶纯化方法，如利用硫酸铵等的盐析法、利用羧甲基纤维素等的阳离子交换层析法、利用二乙氨基乙基纤维素等的阴离子交换层析法、利用葡聚糖凝胶等的凝胶过滤法、利用疏水树脂的疏水层析法以及亲合层析法，从而可得到具有所要求之纯化程度的酰基氨基酸外消旋酶标准样品。

按本发明的方法制得的酰基氨基酸外消旋酶具有下述物理化学性质：

（1）作用

所说的酶作用于L-N^α-酰基氨基酸使之转化成相应的D-N^α-酰基氨基酸，并作用于D-N^α-酰基氨基酸使之转化为相应的L-N^α-酰基氨基酸。即该酶催化由下式显示的可逆反应：

L-N^α-酰基氨基酸 ()/() D-N^α-酰基氨基酸

（2）底物特异性

如下列表3中所示，该酶可作用于旋光N^α-酰基氨基酸，但对相应的旋光α-氨基酸则不起作用。

应提到的是，表3中的相对活性是用N^α-酰基氨基酸作底物，以（3）中所述的酶活性检测法测定的，其中代表所产生之α-氨基酸量（mM）（相当于各底物者）的数值是基于将所产生的蛋氨酸的量定为100而计算的。当底物是L-N^α-酰基氨基酸时，用Y-53菌株产生的D-酰化氨基酸水解酶代替L-酰化氨基酸水解酶。当底物是旋光氨基酸时，在用D或L-氨基酸氧化酶（均由Sigma公司生产）处理后，即可将反应液作高效液相层析，以确定是否已形成了底物的光学对映体。

（3）酶活性测定方法

酰基氨基酸外消旋酶催化可逆反应。即是说，当用D-N^α-酰基氨基酸作底物时，随着反应进行而产生并积聚的L-N^α-酰基氨基酸成为所说酶的另一种底物，因此它也受到酶的作用并转化成D-N^α-酰基氨基酸，即底物。为了测定真空反应速度，必须将反应产物直接转化成其他化合物并将其从反应系统中除去。

为此目的，当产物是L-或D-N^α-酰基氨基酸时，本发明人向反应系统中加入了过量的L-或D-酰化氨基酸水解酶以检测酶的活性，从而使产物的脱酰反应得以同时进行，并检测了最终积聚的L-或D-氨基酸的量，该数值（μM）被看作是相等于已产生的L-或的D-N^α-酰基氨基酸的量。

使用包含50μl酶溶液、40μl底物溶液、10μl    L-酰化氨基酸水解酶溶液和400μl    50mM    Tris-HCl缓冲液（pH7.5）的混合反应系统测定酶活性。作为酶溶液，使用了将酰基氨基酸外消旋酶标准样品以1-0.2单位/ml的浓度溶解于Tris-HCl缓冲液（pH7.5）中所制成的溶液;作为L-酰化氨基酸水解酶溶液，则使用了将L-酰化氨基酸水解酶标准样品（如可用由Sigma公司生产的商品酶，但本发明中使用的是由Y-53菌株提取并纯化的L-酰化氨基酸水解酶）以40-8单位/ml的浓度溶解在Tris-HCl缓冲液（pH7.5）中所制成的溶液。

按照Tris-HCl缓冲液、底物溶液、L-酰化氨基酸水解酶溶液和酶溶液的顺序依次加入各溶液并混合之，在加入酶溶液的同时于30℃开始反应。如果酶溶液的活性低，可使反应持续120分钟;如果酶活性高则持续10分钟，并于100℃加热处理3分钟以终止反应。

为测定酶活性，用高效液相层析法检测反应系统中所产生的蛋氨酸的量，并将相当于产生1μmol/分蛋氨酸的酶活性定为1个单位。当在x分钟的反应时间内反应系统中已产生了ymM浓度的蛋氨酸时，则可用下列公式计算50μl溶液中所含酶活性（a单位）：

a＝ (y)/(2x)

（4）酶活性的最适pH和保持酶稳定性的pH范围

按上述检测酶活性的方法使反应进行2或4小时，但分别使用乙酸钠-HCl缓冲液（pH4.0，5.0）、磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液（pH6.0、7.0、8.0）、磷酸二氢钾-硼酸钠（pH6.3、7.8、8.3、9.0）和碳酸钠-硼酸钠（pH9.2、10.0、10.9）代替Tris-HCl缓冲液（pH7.5），并根据所产生之蛋氨酸的量的比例计算各溶液中酶的相对活性。

图1显示当反应进行2小时时各pH值的溶液中的相对酶活性;由图1可知最适pH为大约8。

图2显示当反应时间由2小时延长到4小时时，所产生之蛋氨酸的量增加的程度。反应进行4小时所产生的蛋氨酸的量为2小时反应所得蛋氨酸量的近2倍，故可以说在该反应条件下酶是稳定的。由图2可知在pH6至9时酰基氨基酸外消旋酶是稳定的。

（5）作用的适宜温度范围

在25、30、35、40、50、60或70℃等不同反应温度（30℃）用检测酶活性的标准方法（见（3）中所述）检测由N-酰基-D-蛋氨酸产生的L-蛋氨酸的量。所用的酶的量逐渐增加，反应时间为5分钟。实验结果如图3所示。由图3可以看出，作用的适宜温度范围为30至50℃。

（6）不同温度对酶活性的影响

于30、35、40、50、60或70℃加热处理30分钟后，用检测酶活性的标准方法检测酶溶液的残留活性。所得结果以黑色点线示于图4中。

由该曲线可以看出，在40℃以下的酶是稳定的，但温度高于50℃则酶失活。另外使用如上所述的同样条件但向酶溶液内加入1mM钴离子，进行加热处理并测定残留活性;如此所得结果与没有Co⁺⁺离子条件下所得结果不同。图4中用白色点线示出了存在所加Co⁺⁺离子时得到的结果;由此可知存在Co⁺⁺离子的情况下酶在50℃以下是稳定的并在60℃时失活。

（7）金属离子的影响

使用无金属盐溶液作对照，按（3）中所述的检测酶活性的方法进行反应，但除去加到底物溶液内的12.5mM（在反应混合物中的终浓度为1mM）氯化钴，代之以加入12.5mM或125mM（在反应混合物中的终浓度分别为1mM或10mM）各种金属盐或EDTA，并检测金属离子对酶活性的影响。应提到的是，业已证明用于本实验的L-酰化氨基酸水解酶的活性不受这些添加物的影响。结果如表4中所示。表4所示的酶活性是在将无添加物时所得到的值定为100的基础，以相对活性的形式给出的。

表4

金属离子对酶活性的影响

如表4所示，在某一限定的浓度范围的几种金属离子存在下，所说的酶显著地被激活了。即，钴离子在低浓度（约1mM）时具有显著的活化作用，但浓度为10mM时则很难激活该酶。锌离子和镍离子具有相似的倾向。镁离子浓度为10mM时比1mM时活化作用大。锰离子和二价铁离子具有相似的倾向。被检测的几种金属离子中，铜离子表现有明显的抑制作用。铝离子和钼离子在浓度为10mM时也抑制酶活性。EDTA在浓度为10mM时具有显著的抑制作用。

（8）分子量

约200，000：其为按照Davis[Ann.N.Y.Acad.Sci.，121，404（1964）]所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得的实施例2中表5第5步骤所制得之酶的分子量;电泳所用的条件是：聚丙烯酰胺梯度凝胶，PAG平板4/15（由日本Daiichi    Pure    Chemicals公司生产）;30m    A（恒定电流）2小时。酶的分子量是根据比较样品酶与标准蛋白的迁移率来估计的。

使用SDS-PAG平板4/20（日本Daiichi    Pure    Chemicals公司），在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下以同样方法并在同样条件下检测该酶之亚单位的分子量。估计亚单位的分子量为大约40，000道尔顿。

（9）等电点

使用载体两性电解质以琼脂糖凝胶电泳法测得等电点为4.8。电泳使用电泳装置（2117型MultiphorⅡ，LKB）和Pharmalyte，pH3到10（Pharmacia，瑞典）以恒定电泳（2W）进行2.5小时。

本发明的酰基氨基酸外消旋酶，当与L-酰化氨基酸水解酶或D-酰化氨基酸水解酶结合使用时，能够以一步骤由廉价的DL-N^α-酰基氨基酸生产旋光L-α-氨基酸或旋光D-α-氨基酸。

用已知方法很容易制得L酰化氨基酸水解酶，但亦可使用市售产品。据报导，可由链霉菌属[日本已公开未审查专利申请No.126969/1987和126976/1987]、假单胞菌属[Nature，170，888（1952）;日本已公告专利申请No.31477/1985]和产碱杆菌属[Proceedings    of    the    annual    meeting    of    the    Agricultural    Chemical    Society    of    Japan，1987，pp.659]的细菌产生D-酰化氨基酸水解酶。此外，本发明中作为酰基氨基酸外消旋酶生产微生物分离的大多数菌株不仅可产生酰基氨基酸外消旋酶，且可产生D-酰化氨基酸水解酶和/或L-酰化氨基酸水解酶。

因此，为了由作为原料的DL-N^α-酰基氨基酸生产旋光α-氨基酸，须由以本发明之方法生产的具有不同纯化程度的酰基氨基酸外消旋酶标准样品中选择一种适用于这一目的和使用方式的标准样品。例如欲生产L-α-氨基酸时，所选择的标准酶样品和L-酰化氨基酸水解酶（其为由市场上购得的或自某种适当L-酰化氨基酸生产微生物中分离的）是结合形式的或另外用DL-N^α-酰基氨基酸处理过的。当原料已最后100%转化为L-α-氨基酸时，终止反应并由反应混合物中回收所需的L-α-氨基酸。

这里，当标准样品的使用目的是生产L-氨基酸时，它必须符合这样的要求，即标准样品中不含有L-酰化氨基酸水解酶。如将酶固定作为生物反应器使用，标准样品可以是含酶的细胞，且在使用俘获固定法中其可以是无细胞提取物，而标准样品的纯化程度必须稍高于使用离子交换树脂吸附法或不溶性载体共价结合法时的纯化程度。

如果酰基氨基酸外消旋酶生产微生物即不产生L-酰化氨基酸水解酶也不产生D-酰化氨基酸水解酶，则用于本发明之旋光氨基酸生产方法的酰基氨基酸外消旋酶标准样品可包括培养的微生物细胞、其加工产品以及自细胞中提取和纯化至不同纯度的标准样品。

如果酰基氨基酸外消旋酶生产微生物还产生L-酰化氨基酸水解酶或D-酰化氨基酸水解酶，则可按使用上述微生物的同样方法将其用于生产L-α-氨基酸或D-α-氨基酸。在这种情况下，如果所产生的L-酰化氨基酸水解酶或D-酰化氨基酸水解酶的活性远比酰基氨基酸外消旋酶的活性强，则不必另外再加L-或D-酰化氨基酸水解酶。

如果酰基氨基酸外消旋酶生产微生物还产生L-酰化氨基酸水解酶或D-酰化氨基酸水解酶，可用常规方法突变诱导缺乏D-或L-酰化氨基酸水解酶的菌株，以分别产生L-氨基酸或D-氨基酸。根据需要还可使用包括培养的细胞和标准酶样品在内的各种处于不同纯化水平的加工产物。

应注意的是，如加工产物是培养的细胞或无细胞提取物，则可含有一种分解所需氨基酸的酶;在这种情况下，必须去掉该氨基酸分解活性。如果微生物不是缺乏酰化氨基酸水解酶的菌株，便难于用它在细胞水平上直接生产旋光α-氨基酸，但可以在不影响酰基氨基酸外消旋酶的情况下用加热处理或加入抑制剂等方法使一种或两种酰化氨基酸水解酶失活之后使用之。为了由共产生L-和D-酰化氨基酸水解酶的菌株中制备酰基氨基酸外消旋酶的标准样品，可先由培养的细胞中提取酰基氨基酸外消旋酶，然后分离并除去影响生产预期氨基酸的酰化氨基酸水解酶，且必要时可再增加某种纯化步骤，从而制得标准样品。

用酰基氨基酸外消旋酶和L-或D-酰化氨基酸水解酶生产L-或D-α-氨基酸时，通常可使用这样一些方法：如（1）将酰基氨基酸外消旋酶的标准样品及L-或D-酰化氨基酸水解酶溶解于pH为6-9含有适当量原料DL-N^α-酰基氨基酸及Co⁺⁺或其他金属离子的缓冲液中，将该溶液放置于适当温度下直到反应完成;（2）用已知方法一起或分别固定酰基氨基酸外消旋酶的标准样品和L-或D-酰化氨基酸水解酶，然后以一或多阶段将其装入反应容器中，以制成生物反应器，使pH为6至9含有DL-N^α-酰基氨基酸和Co⁺⁺或其他金属离子的缓冲液通过该反应器以引起反应;（3）将两种溶解于被超滤膜分成2个室之反应器的一个室中，加入原料溶液以引起反应，并回收已通过超滤膜的产物。无论使用哪种方法，反应混合物都要灭菌并尽可能地无菌操作。

因为如此制得的最终反应混合物只含有由所需之旋光氨基酸的水解作用而产生的有机酸和酰基基团，所以很容易用常规方法回收所要的氨基酸。

图1显示酰基氨基酸外消旋酶的pH依赖性。

图2显示在不同pH值条件下借助酰基氨基酸外消旋酶所产生的蛋氨酸的量;这些量是以基于将2小时反应（

）的量定为1而计算的4小时反应（ ）的量的相对值表示的。

图3显示反应温度与酰基氨基酸外消旋酶之酶活性之间的关系。

图4显示酰基氨基酸外消旋酶的热稳定性。

实施例1

向200ml锥形瓶内各加入20ml含BBL胰酶解酪蛋白一大豆培养液（购自Becton    Dickinson公司）和0.1%N-乙酰基-D-蛋氨酸的培养基（pH7.0）并于120℃消毒20分钟。另外，经液体培养后，将链霉菌属Y-53菌株储存于冷却条件（-80℃）下，以备需要时用作种菌接种物溶液。

向30个含上述培养基的培养瓶内以每瓶0.7ml的量无菌接种冷冻的微生物（在溶液中）于28℃振荡培养2天以产生种子菌培养物。然后将各种子菌培养物以每瓶1ml的量移入含同样培养基的500个培养瓶中，并于28℃振荡培养42小时。收集培养瓶内容物并经离心（4℃，10，000rpm、15分钟）收集细胞。用生理盐水洗细胞并得到216g湿细胞。以下程序均在4℃以下完成。

将216g湿细胞悬浮于1升50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）中并加于Dyno-Mill细胞破碎器（Milly    A.Bachofen    AG生产）中以破碎细胞。所用玻璃珠直径为0.1至0.2mm，流速为60ml/分。于4℃将处理的细胞液以10，000rpm离心20分钟，得到1700ml无细胞提取物。该提取物的酰基氨基酸外消旋酶活性为4.9单位，比活性为0.52毫单位/mg蛋白。用Bio-Rad蛋白分析法测定总蛋白量。

实施例2

于冷却和搅拌下向1700ml实施例1中制得的无细胞提取物内缓慢加入300g硫酸铵。全部加完后，继续搅拌30分钟以上，于4℃以10，000rpm将混合物离心30分钟，得到1660ml澄清的上清液。

将1660ml上清液吸附于用50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0，含30%饱和硫酸铵）平衡过的TSKHW65C柱（4.8cm×30cm）（日本Tosoh公司，）上，用1000ml上述磷酸盐缓冲液洗柱，然后用不含硫酸铵的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白组分，并收集显示有预期之酶活性的洗脱部分。于冷却和搅拌下向所得330ml活性部分中缓慢加128g硫酸铵。以10，000rpm离心30分钟以收集所得沉淀。将沉淀物溶解于50ml50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）中并过Sephadex    G25柱（Phamacia，瑞典）除盐。将如此制得的粗酶溶液吸附于用50mM磷酸盐缓冲液平衡过的DEAE    Toyopearl650M柱（Tosoh公司，日本）上。用1000ml同样缓冲液洗柱，然后用含有0.2M    NaCl的同样缓冲液洗脱得到340ml活性部分。用常规方法向该活性部分中加入133g硫酸铵。离心（4℃、10，000rpm、30分钟）收集所得沉淀并溶解于30ml同样的缓冲液。使该溶液通过一个Sephadex    G5柱脱盐，并得到59ml粗酶溶液。使该粗酶溶液吸附于用同样缓冲液平衡过的DEAE-5PW柱（日本Tosoh公司，2.15cm×15cm）上进行制备高效液相层析（HLC-837型，日本Tosoh公司），并用0至0.5M线性浓度梯度Na    Cl洗脱。洗脱速度为每分钟4ml。回收在32至36分钟时洗脱的部分，得到16ml活性部分。该部分中的酰基氨基酸外消旋酶活性为大约7.2单位，且比活性为大约63毫单位/mg蛋白。比活性增加到无细胞提取物之比活性的约122倍。

将该活性部分进一步加到用50mM磷酸盐缓冲液平衡过的TSK-G3000SW柱（日本Tosoh公司，5.5cm×60cm）上，以1ml/分的流速进行凝胶过滤，并分别得到活性部分。因该部分在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈现出单一的带，故可推断酰基氨基酸外消旋酶已得到纯化。该部分中酰基氨基酸外消旋酶活性为1.2单位，比活性为2.8单位/mg蛋白。

表5中给出了各个纯化步骤中所得部分的酰基氨基酸外消旋酶总活性、总蛋白含量和比活性以及各样品溶液的体积。

实施例3

在10升培养基中按实施例1的同样方法培养链霉菌属Y-53菌株。培养24小时后收集细胞并用0.8%Na    Cl溶液洗一次。得到300g湿细胞。

按实施例1中所述同样方法用Dyno-Mill（一种细胞破碎器）破碎湿细胞并离心（10，000rpm，20分钟）得到1680ml上清液。该上清液中含21单位酰基氨基酸外消旋酶、315单位L-酰化氨基酸水解酶和75单位D-酰化氨基酸水解酶。向该上清中加入硫酸铵达到30%饱和度，并离心除去沉淀物。再向离心的上清中加入硫酸铵达到60%饱和度并离心除去所得沉淀物。将得到的沉淀物溶解于50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）中并使用已经过同样缓冲液平衡过的Sephadex    G25柱凝胶过滤脱盐。对所得溶液进行离子交换层析。

将上述已除盐的溶液（490ml）加至用50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）平衡过的DEAE    Toyopearl    650M柱（树脂体积：700ml）上并用2升同样磷酸盐缓冲液洗柱，从而洗出非吸附的组分。由洗出液中回收到114单位D-酰化氨基酸水解酶。该DEAE    Toyopearl    650M柱上相当强地吸附了酰基氨基酸外消旋酶（约20单位）和L-酰化氨基酸水解酶（约900单位），除非使用大于0.2摩尔的盐溶液否则便不能将它们洗脱下来。

将上述柱置于30℃下，使含有0.5%N-乙酰基-DL-蛋氨酸和1mM氯化钴的20mM磷酸盐缓冲液以每小时30ml的流速通过柱。收集3升洗脱液并过IR120阳离子交换树脂柱，然后在减压下浓缩使之干燥成为固态。用10ml冷的无水乙醇洗两次后将所得残留物溶解于约100ml热水中，并过滤收集冷却后析出的结晶。此外，向滤液内逐滴加入乙醇并将所得混合物放置过夜。收集析出的结晶并干燥之，得到9.6g L-蛋氨酸。其熔点为280至281℃，[α]²⁵ _D-8.2°（C＝1%）。该产物在高效液相层析及薄层层析中显示有与L-蛋氨酸的标准样品同样的行为。另外，当该产物与标准样品一起熔融时，未显示熔点下降。

实施例4

向置于200ml锥形瓶中之20ml含1.5%甘油、1.0%蛋白胨、1.0%酵母浸膏、0.5%Na Cl、0.25%K₂HPO₄、0.25%MgSO₄·7H₂O和0.05%N-乙酰基-DL-蛋氨酸的种子菌培养基（pH7.0）中接种0.7ml实施例1中制备的原培养物并在旋转振荡器上（200rpm）28℃培养18小时。将1ml所得培养物移入200ml锥形瓶中之25ml含0.5%甘油、1.0%蛋白胨、0.5% Na Cl、0.25%K₂HPO₄和0.05%N-乙酰基-DL-蛋氨酸的生产培养基（pH7.0）中。于上述的同样条件下进行培养。于0至4℃下完成以下程序。

离心（10，000rpm，15分钟）收获5升培养液中的细胞并用0.85%Na Cl水溶液洗涤。将洗过的细胞（385g，湿重）悬浮于1升50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）中并用Dyno-Mill（Willy A.Bachofen AG）于下述条件下破碎之：玻璃珠直径0.1至0.2mm;细胞悬浮液流速60ml/分;转速3，000rpm。离心（10，000rpm，20分钟）除去已破碎的细胞。所得上清液（1280ml）含75单位酰基氨基酸外消旋酶活性和1，500单位L-酰化氨基酸水解酶活性。按实施例2中所述的方法向该无细胞提取液（1280ml）中加入500g（NH₄）₂SO₄达到60%饱和度。离心（10，000rpm，30分钟）收集所得沉淀并溶解于600ml之50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）中。用纤维素袋对同样缓冲液将酶溶液透析18小时。将除盐后的酶溶液加于用50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）平衡过的DEAE-Toyopearl 650M柱（3cm×30cm）（日本Tosoh公司）上。用1，000ml同样缓冲液并进一步用1，000ml含1mM Co Cl₂的20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）洗柱。

吸附于该柱上的酰基氨基酸外消旋酶和L-酰化氨基酸水解酶的总活性分别为43和800单位。将上述柱置于28℃下，使2，000ml含0.5% N-氯乙酰基-D-缬氨酸、1mM Co Cl₂和1μg/ml硫酸双氢链霉素的20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）以60ml/小时的流速通过柱。反应终止后，用500ml含有1mM Co Cl₂的20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）洗柱。收集洗脱物并用高效液相层析法分析之，但在该溶液中并没有测到N-氯乙酰基-D-缬氨酸。洗脱物于真空中浓缩后，向其中加入冷乙醇。过滤收集所得沉淀的白色固体物，用冷乙醇洗涤并溶解于小量水-乙醇中。将其放置于4℃下得到无色小叶状结晶物。过滤收集结晶并干燥之。产量为4.5g。熔点为315℃（分解），[α]²⁵ _D+64°（C＝1，H₂O）。该结晶的样品溶液在高效液相层析和薄层层析中分别显示有与L-缬氨酸标准样品同样的滞留时间和Rf值。

Claims (9)

1、生产具有下列特性之酰基氨基酸外消旋酶的方法：

(1)使D-N-酰基-α-氨基羧酸转化为相应的L-N-酰基-α-氨基羧酸，

(2)使L-N-酰基-α-氨基羧酸转化为相应的D-N-酰基-α-氨基羧酸，

(3)不能使D-α-氨基酸转化为相应的L-α-氨基酸，

(4)不能使L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸，

该方法包括在培养基中培养能产生所说的酶的微生物，以在培养液中积聚所说的酶并收获所说的酶。

2、根据权利要求1的方法，其中作为底物的N-酰基-α-氨基羧酸具有下列结构通式：

其中X是可被取代的羧酸衍生的酰基，R是可被取代的C_1-20烷基。

3、根据权利要求2的方法，其中X是可被囟素、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基和/或硝基取代的C_1-3烷酰基或苯甲酰基。

4、根据权利要求2的方法，其中R是直链或分枝链C_1-6烷基。

5、根据权利要求2的方法，其中R是被羟基、C_1-3烷基硫代、硫羟、苯基、羟苯基或吲哚基取代的C_1-3烷基。

6、根据权利要求2的方法，其中R是被氨基、羟基、胍基或咪唑基取代的C_1-4烷基。

7、根据权利要求1的方法，其为由能产生酶的微生物产生的发酵产物。

8、根据权利要求1的方法，其中酰基氨基酸外消旋酶还含有酰化氨基酸水解酶。

9、生产旋光D-或L-氨基酸的方法，其包括使依据权利要求1的酰基氨基酸外消旋酶在D-或L-酰化氨基酸水解酶存在下与DL-N-酰基-α-氨基羧酸接触。

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