CN1034589C - 生产抗肿瘤抗菌素克达西啶的方法 - Google Patents

Abstract

克达西啶是一种蛋白质抗肿瘤抗菌素，由streptoalloteichus的新种，菌株L585-6(CCTCCNO.M89022)所产生。抗菌素包括一种非蛋白质的发色团和一种具有114氨基酸残基的单链多肽。

Description

生产抗肿瘤抗菌素克达西啶的方法

本申请是在1988年4月12日提交的美国USSN 180519的部分继续申请。

本发明涉及本文称为克达西啶(Kedarcidin)的一种抗肿瘤抗菌素、通过用Streptoalloteichus新种的菌株L585-6生产该抗菌素、含有该抗菌素的药物组合物、以及用所说抗菌素抑制肿瘤生长的方法。本发明也涉及生产克达西啶的微生物Strep-toalloteichus新种菌株L585-6，CCTCC NO.M89022。

本发明提供的抗肿瘤抗菌素克达西啶，其特征如下：

(a)外观：浅黄色固体；

(b)分子量：用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定为

12400道尔顿；用凝胶过滤/高效色谱法(HPLC)

测定为17,000道尔顿；

(c)紫外光谱：基本上如图1所示；

(d)等电点：3.65

(e)包括一种具有如下氨基酸序列的多肽：X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH；

式中X选自H-ala-ser、H-ser和H。

上述物理化学特征区别了本发明的抗菌素与其他的已知具有抗肿瘤活性的肽类抗菌素，如新制癌菌素、巨毛霉素、广霉素、放线黄质素及AN-7D。

本发明还提供了一种生产抗菌素克达西啶的方法，该方法包括在一种含有可同化碳和氮源的介质中，在浸没式好氧条件下培养产生克达西啶的Streptoalloteichus的菌株，并从该发酵液中回收所说的蛋白质。

本发明的另一方面是提供一种产生克达西啶的Streptoallo-teichus新种的菌株L585-6，CTCC NO.M89022。

本发明的另一方面是提供了一种包含了抑制肿瘤量的抗菌素克达西啶和一种药用载体的药物组合物。

本发明还有一方面是提供一种在哺乳动物宿主中抑制肿瘤生长的方法，包括对所说的患肿瘤的宿主施用能抑制肿瘤量的抗菌素克达西啶。

图1给出了抗菌素克达西啶的紫外光谱。

本文所用的以下缩语及代表的氨基酸如下：

asx：天冬氨酸+天冬酰胺

thr：苏氨酸

ser：丝氨酸

glx：谷氨酸+谷氨酰胺

asp：天冬氨酸

asn：天冬酰胺

glu：谷氨酸

gln：谷氨酰胺

pro：脯氨酸

gly：甘氨酸

ala：丙氨酸

val：缬氨酸

met：蛋氨酸

ile：异亮氨酸

leu：亮氨酸

tyr：酪氨酸

phe：苯丙氨酸

his：组氨酸

lys：赖氨酸

arg：精氨酸

cys：半胱氨酸

trp：色氨酸

菌株L585-6是由印度，Maharastra州收集的土壤样中分离出来的。菌株L585-6的特征详述于下：形态学：

菌株L585-6是一种革兰氏阳性的能形成基底和气生菌丝体的丝状有机体。基底菌丝体穿过琼脂而不分节。观察到菌丝的球状密集的聚集体，其直径为5-25微米，与结合的营养菌丝一起。这种气生菌丝体充分地分枝并生长成直的旋转的或螺旋形的长菌丝，在其中形成连续或不连续链状的孢子。分支的短孢子链的密集团主要是在ISP5号培养基中生成。两种类型的孢子都是卵形到短园柱形(0.4-0.6×1.0-2.0μm)，是不游动的而且具有光滑的表面。

培养5-10天以后在气生菌丝体上观察到单独的或聚集的无色的类似气球形体(直径为5-20微米)。在培养三星期或更长时间后，这些气球形体发展成黄棕色的硬颗粒(直径为40-100微米)，该颗粒由更细长的气生菌丝所覆盖。培养特征：

生长一般是中等的，但是在Czapek  的蔗糖-硝酸盐琼脂、燕麦琼脂和淀粉-无机盐琼脂上的生长很不好。这种气生菌丝体在酪氨酸琼脂和丙三醇-天冬酰胺琼脂上形成，而不在ISP培养基2、3、4和6号培养基及Bennett的琼脂上形成。气生菌丝体的颜色是黄白色的。在6和7号ISP培养基中形成黑色的类黑色素，不形成其他不同的颜色。菌株L585-6的培养特性列于表1。

表1.菌株L585-6的培养特性

培养基              特性¹⁾蔗糖-硝酸盐琼脂    2)G：没有或稀少(Czapek-Dox琼脂)     A：没有

                 S：无色

                 D：没有胰化胨-酵母提取液     G：中等；不混浊；(ISP1号)                绒毛丛

                 A：没有

                 S：无色

                 D：深黄棕色(75)³酵母提取物-麦芽提     G：中等取物琼脂(ISP2号)      A：没有

                 S：深黄棕色(78)

                 D：深黄棕色(75)燕麦糊琼脂(ISP3号)    G：稀少的

                 A：没有或稀少的；如有，

                    则为白色

                 S：无色

                 D：没有无机盐-淀粉琼脂       G：稀少(ISP4号)             A：没有或稀少；如有，

                    则为白色

                 S：无色

                 D：没有丙三醇-天冬酰胺       G：中等

                 A：中等；黄白色(92)

                 S：无色

                 D：没有胨-酵母提取物-        G：中等铁琼脂(ISP6号)        A：没有

                 S：浅灰-黄棕色(79)

                 D：棕黑色(65)酪氨酸琼脂            G：中等(ISP7号)             A：大量；黄白色(92)

                 S：黑色

                 D：黑色葡萄糖-天冬酰胺       G：不好琼脂                 A：没有

                 S：深橙黄色(72)

                 D：没有贝内特(Bennet)琼脂    G：中等

                 A：没有或稀少；如有，

                    则为白色

                 S：深灰-黄棕色(81)

                 D：中等；黄棕色(77)1)在28℃培养3星期后观察2)G＝生长；A＝气生菌丝体；S＝基层菌丝体；D＝弥漫性色素3)颜色和在括弧中的数目是按ISCC-NBS的规定。生理特性

在30-35℃观察到最佳生长。生长的温度范围是180℃-39℃。在15℃和41℃时不生长。在添加有大于5％NaCl的培养基上不生长。明胶被液化，但淀粉不被水解。在所试验的25种糖中，只有D-核糖和D-葡萄糖可用于生长。生理特性和碳水化合物的利用列于表II和表III。

表II  菌株L585-4的生理特性水解                     利用：*2明胶             +    L-鼠李糖    -淀粉：溶解淀粉    -    D-葡萄糖    +马铃薯淀粉        -    D-半乳糖    -牛奶凝聚            +    D-果糖      -胨化作用          +    D-甘露糖    -生产                     L-山梨糖    -硝酸盐还原酶      -    蔗糖        -

          或+(W)^*1 乳糖        -酪氨酸酶          +    纤维素二糖  -忍受                     蜜二糖      -溶菌酶0.01％(W/V) +     海藻糖     -NaCl，1％-4％(W/V)+    棉子糖      -

    5％         -    D-松三糖    -pH，5.0-11.0      +    可溶性淀粉  -

   4.5和12      -    纤维素      -温度                     半乳糖醇    -生产范围18℃-39℃      肌醇        -不生长15℃和41℃       D-甘露糖醇  -最佳生长30℃-35℃      D-山梨醇    -

                    水扬苷       -

                    丙三醇       -

                 D-阿糖    -

                 L-阿糖    -

                 D-木糖    -

                 D-核糖    +*1在查贝克氏(Czapek)蔗糖-硝酸盐液中是阴性、而在胨-硝酸液中是阳性*2基础培养基：Pridham-Gottlieb培养基(＝ISP9号

培养基)

表III菌株L585-6的其他生理特性^*水解：             酸来自；腺嘌呤        -    丙三醇        -酪蛋白        +    D-阿糖        -七叶苷        +    L-阿糖        -马尿酸        +    D-木糖        -次黄嘌呤      -    L-鼠李糖      -酪氨酸        +    D-葡萄糖      +脲            -    D-甘露糖      -黄嘌呤        -    乳糖          -

               纤维素二糖    -利用：             蜜二糖        -苯甲酸盐    -    海藻糖        -柠檬酸盐    -    棉子糖        -粘酸盐      -    D-松三糖      -琥珀酸盐             +    肌醇          -酒石酸盐             -    D-甘露糖醇    -

D-山梨醇         -

赤藓醇           -

阿东糖醇         -

甲基α-葡糖苷    -^*试验由Gordon等人描述(J.Gen.Mierob.，1978，109：69-78细胞壁化学

菌株L585-6的细胞壁含量是根据Becker等人〔Appl.Microbiol，13：236-243(1965)〕、Yamaguchi〔J.Bacteriol 89：444-453(1965))和Lechevalier和Lechevalier〔Biology of theActinomycetes and Related Organisms 11：78-92(1976)〕所描述的方法测定的。细胞壁肽聚糖含有消旋(meso)二氨基庚二酸。全部细胞糖包括半乳糖、葡萄糖和核糖。因此，细胞壁的类型属IIIc型。磷脂是含有磷脂酰基乙醇胺、磷脂酰基丙三醇和磷脂酰基肌醇的P-II型。主要的甲基萘醌是MK-9(H4)和MK-9(H6)。羟基乙酸盐试验是阴性的。分类学

具有孢子长链的放线菌目(Actinomycetales)属中，假诺卡氏菌属(pseudonocardia)，酵母菌多孢霉属(Saccharopolyspora)，放线菌多胞霉属(Actinopolyspora)链霉菌(Streptomyces)，马杜拉放线菌(Actinomadura)、Glycomyces、诺卡氏菌(Nocardiopsis)和Amycolata在细胞化学方面是明显地不同于菌株L585-6，包括细胞壁型、细胞糖的型式、磷脂和甲基萘醌。Kibdelosporangium(Shearer等人、Iht.J.Syst.Bacterol.36：47-54，1986)，孢北里菌(Kitasatosporia)(Takahashi等人，J.Gen.Appl.Microbiol，30：377-387；1984)和Amycolatopsis(Lechevalier等人，Iht.J.Syst.Bacteriol.36：29-37，1986)在磷脂和甲基萘醌的组成方面是与L585-6菌株有关，但是Kibdclosporangium和Amyeolatopsis在细胞壁糖中存在阿糖这方面与该菌株不同，而孢北里菌在细胞壁中存在LL-和内消旋二氨基庚二酸方面是不同于该菌种的。此外，Kibdelosporangium有带有真膜的包有菌丝的类孢子囊体而孢北里菌形成浸没的孢子。在菌株L585-6中没有观察到这些独特的结构。根据化学分类学，stretoalloteichus(Tomite等人，Iht.J.Syst.Bacteriol.37：211-213，1987)联丝体放线菌(Actinosynnema)(Hasegawa等人，Iht.J.Syst.Bacteriol.28：304-310，1978)和丝状糖杆菌(Saccharothrix)(Labeda等人，Int.J.Syst.Bacteriol.34：426-431，1984)与菌株L585-6是最相关的。联丝体放线菌由联丝体端部形成气生孢子链。丝状糖杆菌在营养的和气生的菌丝体中都形成分裂的球形体单元的链而不形成分支和短孢子链群或硬颗粒。在澳大利亚丝状糖杆菌(Saccharothrix australiensis)和气生群丝状杆菌(S.aerocolonigenes)(Labeda.Int.J.Syst.Bacteriol.36：109-110，1986)中的球形体单元链的形态学与诺卡氏菌的相关而与链霉菌属的任何种类都没有关系。因此菌株L585-6既不能列入放线菌属也不能列入丝状糖杆菌属。

Streptoalloteichus hindustanus在气生菌丝体中具有节孢子的长螺旋形孢子链，分支的短孢子链，在营养菌丝体中有硬颗粒以及浓密的菌丝球体和小的类孢子囊体，该囊体包有1-4个带有鞭毛的孢子。菌株L585-6形成全部小的类孢子囊。类似于Streptoalloteichus，菌株L585-6形成气球形体，该球体发展成硬颗粒。这种结构在许多种链霉菌属，如卡那霉素链霉菌(S.Kanamyceticus)(Shirling等人，Int.J.Syst.Bacteriol.22：265-394，1972)和红色钦氏菌(S.roseiscleroticus)(chainia rubra)(Shirling等人，Int.J.Syst.Bacterial.22：265-394，1972)中却已观察到。

基于上述比较的考虑，菌株L585-6被分类入Streptoalloteiehus属。在不能在ISP2，3和4号培养基以及Bennett琼脂中形成气生菌丝体、在形成黑色素、淀粉不水解、在41℃不生长以及在25种试验的糖中只能利用D-核糖和D-葡萄糖等方面，菌株L585-6不同于Streptoalloteichushindustanus。因此，菌株L585-6可以认为是Streptoalloteichus属的一个新菌种。

鉴定为Streptoalloteichus属的一种新菌种的菌株L585-6的生物纯培养已保藏在美国标准菌种收藏所(Rockville，MD)并给予它的微生物的永久保藏为ATCC53650。并于1989年4月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.M89022。抗菌素的生产

本发明的抗肿瘤抗菌素是在水性营养基中，在浸没条件下培养L585-6菌株或其突变体而生产的。该微生物在含有一种可同化的碳源，如一种可同化的碳水化合物的营养基中生长。适宜的碳源实例包括西端糖和丙三醇。营养基还应含有一种可同化的氮源，如鱼粉，酵母提取物或铵盐。如有必要，可以加入无机盐，如氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸钙，磷酸盐等。如需要时，在培养基中可加入微量元素如铜、锰、铁、锌等，或者它们可以以培养基其他组份的杂质形式存在。培养的温度可以是在任意的温度，只要在该温度下该生产菌株能生长即可，例如18℃-39℃，但是进行发酵的优选温度在25°-35℃，最好是在27℃-32℃，在培养基中最好选用中性pH，而且抗菌素的生产一般是在约4-8天时间内完成。一般来说，最好的生产是在约5-6天达到。在制备较少量的抗菌素时，可以使用摇瓶和表面培养，而对较大量的制备来源，选用在灭菌罐中浸没式好氧培养。当进行罐发酵时，最好通过用该微生物产生的孢子接种培养液在营养液中产生一种营养接种物，并且当获得了一种幼小的活性营养接种物时，用无菌操作方式将该接种物转移到发酵罐的培养基中。用机械搅拌器进一步搅拌，如需要，可加入消泡剂，如猪油或硅油。

在发酵介质中抗菌素克达西啶的产生可以在发酵过程中使用枯草杆菌作试验微生物而进行抗微生物试验，或用鼠(B16-F10)或人(如HCT-116，KB)肿瘤细胞系进行细胞的细胞毒性检测而容易地进行监测。

应当理解，本发明不限于使用上述特定的推荐的菌株L585-6或完全适应上面描述的微生物，而且打算包括其他能产生克达西啶的菌株或所说微生物的突变体，这些突变体可以通过诸如X-射线辐照、紫外辐照、用氮芥处理、噬菌体曝光等这样一些一般方法产生。抗菌素的分离和纯化

本发明的抗肿瘤蛋白质可以用一般的蛋白质分离方法如渗析、超滤、凝胶过滤、等电沉淀、盐析、电泳、离子交换色谱和亲合色谱法，从发酵液中被分离。通常使用这些技术的顺次结合纯化蛋白质达到表现均一性。分离和纯化过程可以通过使用诸如枯草杆菌的微生物测试、对离体的鼠或人肿瘤细胞系的胞毒性测试、在体内的抗肿瘤测试、或用物理方法如紫外或高效液体色谱技术进行监视控制。流程图1描绘了一种典型的分离纯化程序。这种特定的程序仅用以说明，本领域的技术人员懂得，其他方法的不同程序也可以使用，只要以高纯度获得该蛋白质并保持其生物活性。流程图1蛋白质的分离和纯化

对流程图1的详细说明，全部发酵液的不溶物用通常方法如离心或过滤方法除去。如果培养液要过滤，则可以有效地使用助滤剂，如代卡利特(Dicalite)。然后滤液进行阴离子交换层析，使用一种pH值为7-8的阳离子缓冲液作为洗脱液，接着用含有氯化钠的同样缓冲液作为提洗液。在该pH范围内适宜的阴离子缓冲液例如是Tris HCl。收集用含NaCl的缓冲液洗脱的组分，浓缩并使用同样的阳离子缓冲溶液通过凝胶过滤色谱而进一步纯化。收集这些组份并检测其活性组分的存在。用以监测洗脱液的一种方便的初始系统是对枯草杆菌检测。集中呈现抑制区的组分，浓缩并用阴离子交换色谱法进一步纯化，用pH值为7-8的阳离子缓冲液作为初始洗脱液，并使用离子强度增加的线性梯度液继续洗脱。活性组分用硫酸十二烷基聚丙酰胺钠凝胶电泳(SDS-PAGE)等电聚焦和高效液体色谱技术检查其均一性。集中判断为均一的部分并冷冻干燥以得到活性蛋白质。抗菌素

克达西啶是一种有效的蛋白质抗肿瘤抗菌素，它由一种单链多肽和一种非蛋白质发色团所组成。虽然提交作物理化学特征和生物试验的抗菌素样品已由SDS-PAGE、等电聚焦和高效液体色谱判断是均一的，但是在定序实验中发现该抗菌素包含一种主要的变种和1或2种次要的变种。这些变种在该多肽的起始N一端氨基酸序列上是不同的，这在下面要描述的。对抗肿瘤活性来说，各变种的分离或离析是不必要的。

本发明也包括可以通过现有技术中的已知手段来改变该抗生素的肽部份以产生其片段及其衍生物的克达西啶的变种，即沿着肽的一级结构通过删除、增加或取代某些氨基酸而基本上不改变抗菌素的如本文所描述的抗肿瘤活性。氨基酸组成

使用现有技术中熟知的标准方法测定已纯化的蛋白质的氨基酸组成并列于表VI。

表VI克达西啶的氨基酸组成

   产      率          残   基

 nmol      mol％  (a)    (b)asp                               (6)

 2.765     8.1    10.1   9.3asn                               (3)thr  3.18      9.3    11.6   10.6 (11)ser  3.163     9.3    11.5   10.6 (12)glu                               (4)

 1.928     5.7    7.0    6.5gln                               (2)pro  1.615     4.7    5.9    5.4  (4)gly  5.529     16.2   20.1   18.5 (18)ala  5.566     16.3   20.3   18.6 (18)val  3.731     11     13.6   12.5 (13)met  0.2873    0.8    1.1    1.0  (1)ile  0.8531    2.5    3.1    2.9  (3)leu  1.298     3.8    4.7    4.3  (4)tyr  0.6274    1.8    2.3    2.1  (2)phe  1.565     4.6    5.7    5.2  (5)his  0.6235    1.8    2.3    2.1  (1)lys  0.3196    0.9    1.2    1.1  (0)arg  1.001     2.9    3.7    3.3  (3)cys   0         0      0      0   (4)trp   0         0      0      0   (0)(a)假定肽的分子量为12000时每个肽的残基数。(b)假定总数为114残基时每个肽的残基数。括弧中的值表明由

氨基酸顺序分析测定的每个肽的残基数。氨基酸顺序

对于氨基端顺序的分析，将克达西啶用2-巯基乙醇还原并用SDS-PAGE(1.5％丙烯酰胺)进一步纯化和通过电泳洗脱或电泳印迹转移从凝胶中回收。

对大部份酶催化裂解的克达西啶不用进一步纯化即被使用。在含有6M盐酸胍、0.1％Na₂EDTA的100微升0.4MTris-HCl缓冲液(pH8.5)中用20mM二硫苏糖醇在50℃时还原克达西啶2小时，接着用100m M4-乙烯吡啶在室温下过夜进行S-吡啶基乙基化。在50℃时加入10微升2-巯基乙醇-小时而停止反应。通过对5％(V/V)乙酸渗析24小时而除去试剂，然后将修饰的克达西啶在一个Speedvac离心浓缩器(SavantInstruments)中干燥。

用ASP-N酶或金黄色酿脓葡萄球菌(S.aureas)V8蛋白酶对S-吡啶乙基化的克达西啶进行催化裂解是在40微升含有0.7M尿素的0.1M Tris-乙酸缓冲溶液，pH8.0，在37℃过夜进行的，所使用的酶/底物之比是1∶100(ASP-N)或1∶10(V8蛋白酶)。胰蛋白酶的消化是在40微升的0.1M Tris-乙酸缓冲液(pH＝8.0)中，在37℃过夜进行的，其酶/底物之比为1-20。酶催化消化液用三氟乙酸(TFA)酸化到pH2.0并用反相高效液相色谱分离。

用rp HPLC(反相高效液相色谱)纯化肽是在130A型分离系统(应用生物系统公司)上完成并在40℃在一个RP-300柱(2.1×100毫米，由Biosystems公司提供)上实现。由0.1％TFA的水溶液作起始缓冲液和含有0.085％TFA的60％乙腈液为极限缓冲液组成的线性乙腈梯度液用于洗脱。手工操作收集肽。氨基酸顺序测定是在一种自动的氨基酸定序器(475A型，Applied Biosystems公司)上使用标准技术进行的。

主要的变种的多肽包括114氨基酸残基。氨基酸顺序被测定如下：N-端

H-ala-ser-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-

ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-

phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-

ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-

phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-

ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-

pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-

ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-

gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH.

C-端

二个次要的变种已被鉴别，一个缺少主要变种的第一个丙氨酸，而另一个缺少最初的二个氨基酸，即，主要变种的丙氨酸和丝氨酸。分子量测定(a)用凝胶过滤/HPLC法

使用一个TSK-G2000SW柱(7.5×300毫米)(瑞典LKB Produkter AB)进行凝胶过滤并使用50毫摩的Tris HCl缓冲液〔内含0.5M NaCl(pH7.4)〕以0.5ml/min的流速进行提洗。或者使用一个WatersAssociates蛋白分析柱I-125，以0.2M Tris乙酸作洗脱液，流速为1ml/min。由标准分子量标记物(Bio BadLaboratories)所得的参考曲线测定得其分子量为17000道尔顿。(b)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

该蛋白质样品和分子量标记物(由Maine的DiversifiedBiotech公司购得)与等体积的Seprasol(含有蔗糖和一种显迹颜料的备用蛋白质增溶液体)混合，并在即将电泳之前在90℃加热3分钟。电泳是在Seprabuff(Tris-甘氨酸-SDS，pH8.3)中，300伏下进行直到显迹颜料到达凝胶底部。然后将凝胶浸在一种着色溶液(1.25克Comassie BB R-250，92毫升冰醋酸在908毫升的含水甲醇中)中至少10小时，然后浸在-脱色溶液(75毫升乙酸和50毫升甲醇在875毫升水中)直到凝胶变为透明为止。Seprasol和Seprebuff是由Massachusetts的Integrated SeparationSystem公司购得。由这方法测定的分子量是12400道尔顿。等电点聚焦

用于聚焦的凝胶是由混合以下试剂而制备的：

29.1％丙烯酰胺水溶液                    10ml

0.9％N，N′-亚甲基-双-丙烯酰胺水溶液    10ml

丙三醇                      7ml

1802两性电介质(Ampholine)

pH2.5-4                     3ml

水                          加至60ml所得溶液除气10分钟并加入1.5ml1％过硫酸铵水溶液和10μl的N，N，N′，N′-四甲基乙二胺。将混合物倒入铸模，并使之聚合。所用的电极溶液在阴极为1M磷酸，而在阳极为2％1809两性电解质pH6-8。聚焦实验在25瓦恒功率的条件下进行2小时。百分率是指体积的百分重量。等电点测定为3.65而从阴极迁移的距离是6.25cm。生物活性

该蛋自质的抗肿瘤活性是对可移植的鼠P388白血病进行评价的。给CDF₁小鼠以腹腔或静脉接种10⁶P388白血病细胞，该细胞是由带有这种可移植的鼠白血病的DBA/2供体鼠中得到的。对腹腔移植P388白血病的小鼠，在接种肿瘤后一天开始以腹腔注入盐水(对照鼠)或克达西啶药剂进行处理，每天一次，连续五天。对静脉注射移植P388白血病的小鼠，在植入后的1，3和5天给予克达西啶静脉注射。每天观察这些动物并记录其死亡。作为药物毒性反映的一个方法，测定所有组的平均体重的变化(由植入白血病的当天到最后处理的一天)。记录在移植肿瘤后第5天，在每个组中小鼠的存活率作为评定药物毒性的补充方法。如果每个治疗组中有多于1只小鼠到5天已死亡，则认为不具有有意义的治疗效果。治疗组由4只或6只小鼠组成，对照组有10只小鼠。如果有的活，也要记录存活到第30天(实验的最后一天)的鼠数。在实验终了时测定每一组的平均存活时间(MST)并用以计算％T/C值，它是治疗组的MST与对照组的MST之比乘以100。％T/C值为125或更大表明有显著的抗肿瘤活性。体内测试数据列于表IV和表V。

表IV对腹腔植入P388白血病的抗癌活性批号       剂量^a)    平均存活   ％    平均体重 第5天存活

       稀释或     时间(天)   T/C   变化(g)    的鼠数

       mg/Kg/注射D16F411    Dil 1-40   7.0        74   -1.9       4/4

       Dil 1-80   10.0       105  -1.2       4/4

       Dil 1-160  12.5       132  -1.0       4/4

       Dil 1-320  18.5       195  -1.9       4/4

       Control    9.5        -     0.2       10/10D18F413    0.27       7.0        70   -1.9       4/6

       0.09       15.0       150  -0.8       6/6

       0.03       17.0       170  -1.7       6/6

       0.01       15.0       150  -0.3       6/6D18G414^b) 0.09       9.5        95   -1.3       6/6

       0.03       15.5       155  -1.2       6/6

       0.01       14.5       145  -0.5       6/6

       0.0033     14.0       140  -0.2       6/6对照                  10.0       -       0       10/10a)腹腔注入药品，从接种肿瘤后一天开始，每天一次，连续5天。b)以批号D18F413代表的同样样品的冷冻干燥并重新回复的制剂。

表V对静脉注入P388白血病的抗肿瘤活性批号         剂量^c)       平均存活     ％        平均重量        在第5天

         稀释或        时间(天)     T/C       变化(g)         存活的

         mg/Kg注射                                            鼠数D18F413      0.32            6.0        75        -3.1            6/6

         0.16            7.5        94        -3.2            6/6

         0.08           11.0        138       -1.4            6/6

         0.04           12.5        156       -0.6            6/6

         0.02           10.0        125       0.1             6/6

         0.01            8.0        100       1.2             6/6D16F411      Dil.1-25        7.0        88        -2.9            6/6

         Dil.1-50       10.5        131       -1.6            6/6

         Dil.1-100      13.0        163       -1.2            6/6

         Dil.1-200        9.5       119       -0.2            6/6

         Dil.1-400        9.0       113       0.5             6/6

         Dil.1-800        8.0       100       0.8             6/6

         对  照           8.0       -         -               10/10a)在接种肿瘤后的1，3，5天将静脉给药。

克达西啶也用鼠的B16黑素瘤进行评价，该瘤是用0.5毫升10％肿瘤浆在腹腔内接种的。对每一种剂量水平都用10只小鼠。药物通过腹腔内给予，从植入肿瘤后一天开始，每天一次，连续9天。记录在第10天存活的和在实验终了即60天存活的鼠数。实验结果列于表VI。％T/C值为12.5或更大值表明有显著的抗肿瘤活性。

表VI克达西啶对腹腔接种B16黑素瘤的抗癌活性剂量          MST     ％    平均重量的  在第5(60)^*天(mg/Kg/剂量)  (天)    T/C   变化(g)     存活的鼠数0.256         16.0    97    -2.7          9/100.128         24.5    148   -1.3          10/100.064         26.5    161   0.3           10/100.032         31.5    191   1.0           10/100.016         32.5    197   0.6           10/100.008         34.0    206   0.6           9/100.004         27.0    164   0.3           10/10(1)0.002         21.5    130    0            10/10Control      16.5     -     1.3^*括弧中的数值＝肿瘤植入后第60天存活的鼠数。

在表IV、V和VI所列的试验结果表明，抗菌素克达西啶是一种对鼠白血癌P388和B16黑素瘤显示出体内可再现抗癌活性的有效药物。其活性通过观察到对于腹腔接种B16黑素瘤和对于腹腔以及肌肉注入P388的小鼠都能增加寿命而得以证明，后者由于其播散性质而代表了一种有效治疗较困难的疾病形式。克达西啶对于皮下植入的B16黑素瘤、M5076鼠肺肿瘤以及颅内植入的P388白血病进行了评价，但在这些动物试验品中未显示出显著的活性。

在本发明范围内还包括含有有效抑制肿瘤量的该抗菌素与一种惰性药用载体或稀释剂组合而成的本发明组合物。这种组合物也可以含有其他活性抗癌剂，并且可以制成适合于给药途径的任何药物形式。这种组合物的实例包括用于口服的固体组合物如片剂、胶囊、凡剂、粉剂和颗粒剂，用于口服的液体组合物如溶液悬浮液、糖浆或酏剂以及用于非肠道给药的制剂，如消毒溶液、悬浮液或乳化液。它们也能制成灭菌的固体组合物的形式，这种组合物在使用前立即能溶解在灭菌水、生理盐水或某些其他可注射的灭菌介质中。

对于用作一种抗癌剂，对给定哺乳动物宿主的最适宜的剂量和方式是那些本领域的专业人员易于确定的。当然所使用的实际剂量可以根据特定组合物制剂、施药方式和特殊部位、宿主以及要治疗的疾病而变化。要考虑到改变药物作用的许多因素，包括年令、体重、性别、饮食、给药时间、给药方式、排泄速度、病人的状态、药物组合、反应灵敏度以及疾病的严重性。

本发明以下列的实施例来说明，这些实施例不能解释为对本发明范围的限制。实施例1 Streptoalloteichus菌株L585-6的营养培养物的制备将Streptoalloteichus新种菌株L585-6(CCTCNO.M89022)保持并转移到试管中的酵母-麦芽提取物琼脂斜面上，该琼脂组成为；

右旋糖        4.0克

酵母提取物    4.0克

麦芽提取物    10.0克

CaCO₃        1.5克

琼脂          15克

蒸馏水        加到1升随着每次转移，将琼脂斜面在28℃下培养2星期。营养培养物是通过将表面生长物由斜面培养转移到500毫升的锥形烧瓶中而制备的，该烧瓶中含有100毫升灭菌介质，该介质含有：

西瑞糖(Corn Products)               30克

药物介质(Traders oil Mill公司)      10克

Nutrisoy(Archer Daniels Midland公司)

                                    10克

CaCO₃                              3克

蒸馏水                              加到1升将这种营养培养物在一旋转振荡器上，以转速为250转/分于28℃培养72小时。实施例2在摇瓶中发酵

把5毫升实施例1的营养培养物接种到500毫升锥形烧瓶中，每个烧瓶中含有100毫升生产介质，该介质含有：

丙三醇                     30克

药物介质                   10克

Distiller′s solubles

(Nutrition Product公司)    15克

鱼粉(Menhadeu)    10克

CaCo₃             6克

蒸馏水           加至1升该生产培养物在一旋转振荡器上，以转速为250转/分，在28℃下培养。蛋白质抗菌素的生产是用使用枯草杆菌的微生物测试和使用鼠黑素瘤细胞系B16-F10与人肿瘤细胞系的体外胞毒素测试来监测的。最佳生产一般要在144-168小时达到。实施例3在罐中发酵。

把例1的25毫升营养培养物接种到一个2升的Vitro瓶中，该瓶中含有500毫升同样的营养介质。第二阶段种子培养物进一步在一旋转振荡器上，以搅拌速率为250转/分，在28℃下培养72小时。将500毫升第二阶段的种子培养物接种到一个NewBrunswick Microgcn发酵器(16升标准体积)，该发酵器中含有10升具有例2所示的组成的生产介质。发酵是在28℃，每分钟1体积的充气和250转/分的搅拌条件下进行的。抗菌素克达西啶的生产是用体外生物测试进行监测的。实施例4克达西啶的分离和纯化

10升粗发酵液与6升Dicalite相混合，所得稀浆料在Dicalite填料上过滤，弃去不溶物，将滤液泵往一个Zetaprep250QAE离子交换筒，(LKB-Produkter AB，Sweden)，流速为30毫升/分。交换筒事先已用2升50mMTris-HCl，pH＝7.4的缓冲液平衡。收集流出液，用1升50mM Tris-HCl pH＝7.4的缓冲液洗涤该筒，然后用500毫升含有0.5M NaCl的50mM Tris-HCl，pH＝7.4的缓冲液洗脱。收集洗脱液，并用一种装有AmiconTMS膜的Amicon标准超滤单元将500毫升浓缩到100毫升。将浓缩溶液渗滤到一个凝胶过滤粒中(5×100cm)，该柱装有1400毫升的在等体积的50mM Tris HCl缓冲液中的Vltrogel AcA54(LKB-Produkter AB，瑞典)。Vltrogel床已用5升50mM Tris-HCl，pH7.4的缓冲液平衡过。进过料的柱子用2升50mM Tris-HClpH7.4的缓冲液以60ml/min流速洗脱。在起始450毫升液体后，收集10毫升1份的组分，每份都对枯草杆菌进行测试。集中那些有抑制作用区的组分(组分83-133)，然后用超滤法浓缩到100毫升。浓缩液渗滤到离子交换柱(2.5×15厘米)，该柱装有70毫升在等体积50mM Tris-HCl缓冲液中的DEAE Trisacryl(LKB-Produkter AB，瑞典)浆料，Trisacryl已用10个柱体积的50mM Tris-HCl缓冲液平衡过。进了料的柱子，开始用10个柱体积的50mMTris-HCl缓冲液洗脱，接着用300毫升100％50mMTris-HCl缓冲液到含有50M NaCl的100％50mMTris-HCl缓冲液的线性梯度(斜率＝0.1M/小时)溶液洗脱，流速为60ml/hr。总共收集47份，每份5毫升的组份，并对枯草杆菌进行测试。集中活性组份25-37，并进行分析凝胶过滤/HPLC，使用Waters的蛋白分析柱I-125，以0.2M Tris乙酸，pH7.0作洗脱液，流速为1毫升/分，以及在260nm进行紫外检测。在这些条件下，色谱图显示，在保留时间8.3分时有一个单峰。还通过等电聚焦和SDS-PAGE并用上面描述的条件判断所收集的部份是均一的。活性组成的浓度通过冷冻干燥10毫升的等分试样并校正其缓冲液重量后测定为4.25毫克/毫升。

Claims (1)

1。一种生产具有如下特征的抗菌素克达西啶的方法

   (a)外观：浅黄色固体

   (b)分子量：用SDS-聚丙烯酰胺凝酶电泳法测定为

      12400道尔顿；用凝胶过滤/高效液相色谱法

      (HPLC)测定为17000。

   (c)紫外光谱：基本上如图1所示。

   (d)等电点：3.65

   (e)包括一种具有如下顺序氨基酸的多肽：

X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-

ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-

phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-

ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-

phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-

ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-

pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-

ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-

gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH；

该方法包括在一种含有可同化的碳氮源的介质中，以浸没式好氧条件下培养Streptoalloteichus的能产生克达西啶的L585-6菌株CCTCC NO.M89022并由发酵液中回收所说的抗菌素。