JP2850132B2 - 抗腫瘍性抗生物質ケダルシジン - Google Patents
抗腫瘍性抗生物質ケダルシジンInfo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はケダルシジン（kedarcidin）と命名された抗
腫瘍抗生物質、ストレプトアロテイクス（Streptoallot
eichus）菌株L585−６によるその生産、該抗生物質を含
む医薬組成物及び該抗生物質による腫瘍の成長を阻止す
る方法に関する。本発明はまたケダルシジンを生産し得
るストレプトアロテイクス菌株L585−６、ATCC53650に
関する。
腫瘍抗生物質、ストレプトアロテイクス（Streptoallot
eichus）菌株L585−６によるその生産、該抗生物質を含
む医薬組成物及び該抗生物質による腫瘍の成長を阻止す
る方法に関する。本発明はまたケダルシジンを生産し得
るストレプトアロテイクス菌株L585−６、ATCC53650に
関する。
本発明は、 （ａ） 外観：淡黄褐色の固体； （ｂ） 分子量:SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により12,400ダルトン；ゲル過/HPLC法により17,00
0 （ｃ） 紫外線スペクトル：第１図に実質的に示される
もの （ｄ） 等電点:3.65;並に （ｅ） 下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドより
なる （ただしＸはＨ−ala−ser,H−ser及びＨよりなる群か
ら選択される） 特徴を有する抗腫瘍抗生物質ケダルシジンを提供する。
法により12,400ダルトン；ゲル過/HPLC法により17,00
0 （ｃ） 紫外線スペクトル：第１図に実質的に示される
もの （ｄ） 等電点:3.65;並に （ｅ） 下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドより
なる （ただしＸはＨ−ala−ser,H−ser及びＨよりなる群か
ら選択される） 特徴を有する抗腫瘍抗生物質ケダルシジンを提供する。
前述の物理化学的特徴が、本発明の抗生物質を抗腫瘍
活性を有する他の周知のペプチド抗生物質例えばネオカ
ルジノスタチン、マクロモマイシン、ラルゴマイシン、
アクチノキサンチン及びAN−7Dから区別する。
活性を有する他の周知のペプチド抗生物質例えばネオカ
ルジノスタチン、マクロモマイシン、ラルゴマイシン、
アクチノキサンチン及びAN−7Dから区別する。
本発明は、さらに液内培養好気性条件下同化可能な炭
素及び窒素源を含む培地中でストレプトアロテイクス
（Streptoalloteichus）属に属し抗生物質ケダルシジン
を生産し得る菌株を培養し、そして培養したブロスから
該抗生物質を回収することよりなる抗生物質ケダルシジ
ンを製造する方法を提供する。
素及び窒素源を含む培地中でストレプトアロテイクス
（Streptoalloteichus）属に属し抗生物質ケダルシジン
を生産し得る菌株を培養し、そして培養したブロスから
該抗生物質を回収することよりなる抗生物質ケダルシジ
ンを製造する方法を提供する。
本発明の他の態様はストレプトアロテイクス菌株L585
−６、ATCC53650の抗生物質ケダルシジンを生産し得る
菌株を提供する。
−６、ATCC53650の抗生物質ケダルシジンを生産し得る
菌株を提供する。
本発明のさらに他の態様は、腫瘍阻止量の抗生物質ケ
ダルシジン及び製薬上許容しうる担体を含む製薬組成物
を提供する。
ダルシジン及び製薬上許容しうる担体を含む製薬組成物
を提供する。
本発明の他の態様は、腫瘍を含む宿主に腫瘍阻止量の
抗生物質ケダルシジンを投与することよりなる哺乳動物
の宿主における腫瘍を阻止する方法を提供する。
抗生物質ケダルシジンを投与することよりなる哺乳動物
の宿主における腫瘍を阻止する方法を提供する。
第１図は、抗生物質ケダルシジンの紫外線スペクトル
を示す。
を示す。
本明細書で用いられるとき、下記の略称がアミノ酸を
表すのに用いられる。
表すのに用いられる。
asx:アスパラギン酸＋アスパラギン thr:スレオニン ser:セリン glx:グルタミン酸＋グルタミン asp:アスパラギン酸 asn:アスパラギン glu:グルタミン酸 gln:グルタミン pro:プロリン gly:グリシン ala:アラニン val:バリン met:メチオニン ile:イソロイシン leu:ロイシン tyr:チロシン phe:フエニルアラニン his:ヒスチジン lys:リジン arg:アルギニン cys:システイン trp:トリプトフアン 〔生産微生物〕 菌株L585−６はインド、マハラストラ州で採集された
土壌のサンプルから単離された。菌株L585−６の特徴
は、下記に詳しく記述される。
土壌のサンプルから単離された。菌株L585−６の特徴
は、下記に詳しく記述される。
形態学 菌株L585−６は、グラム陽性の線状菌であつて、基質
及び気菌糸を形成する。基質菌糸は、アガーに浸透しそ
して分裂しない。合体した栄養菌糸とともに、直径５〜
25μｍの菌糸の球状の密な集りが観察される。気菌糸
は、十分に分岐しそして真直な、ねじれた又はらせん状
の長い菌糸となり、胞子が連続又は不連続の鎖で形成す
る。分岐した短い胞子の鎖の密なふさ状分岐は、ISP培
地No.5で主として形成する。胞子の両方のタイプは、だ
円から短い円筒状（0.4〜0.6×1.0〜2.0μｍ）で非運動
性でありそして平滑な表面を有する。
及び気菌糸を形成する。基質菌糸は、アガーに浸透しそ
して分裂しない。合体した栄養菌糸とともに、直径５〜
25μｍの菌糸の球状の密な集りが観察される。気菌糸
は、十分に分岐しそして真直な、ねじれた又はらせん状
の長い菌糸となり、胞子が連続又は不連続の鎖で形成す
る。分岐した短い胞子の鎖の密なふさ状分岐は、ISP培
地No.5で主として形成する。胞子の両方のタイプは、だ
円から短い円筒状（0.4〜0.6×1.0〜2.0μｍ）で非運動
性でありそして平滑な表面を有する。
無色のバルーン様の物体（直径５〜20μｍ）が、５〜
10日間のインキユベーシヨン後気菌糸上に単一で又は塊
状で観察される。３週間以上のインキユベーシヨン後、
これらのバルーン様物体は、さらに伸長した気菌糸によ
り覆われた黄色がかつた褐色の菌核性の顆粒（直径40〜
100μｍ）を発育させる。
10日間のインキユベーシヨン後気菌糸上に単一で又は塊
状で観察される。３週間以上のインキユベーシヨン後、
これらのバルーン様物体は、さらに伸長した気菌糸によ
り覆われた黄色がかつた褐色の菌核性の顆粒（直径40〜
100μｍ）を発育させる。
培養上の特徴 生長は一般的に中程度であるが、ツアペツクの砂糖・
硝酸塩アガー、オートミール・アガー及びでん粉・鉱物
塩アガーでは非常に貧弱である。気菌糸は、チロシン・
アガー及びグリセロール・アスパラギン・アガーで形成
するが、ISP培地No.2、３、４及び６並にベネツトのア
ガーでは形成しない。気菌糸の色は、黄色がかつた白色
である。黒味がかつたメラノイド顔料は、ISP培地No.6
及び７に形成する。他の明確な顔料は形成しない。菌株
L585−６の培養上の特徴は、第Ｉ表に示される。
硝酸塩アガー、オートミール・アガー及びでん粉・鉱物
塩アガーでは非常に貧弱である。気菌糸は、チロシン・
アガー及びグリセロール・アスパラギン・アガーで形成
するが、ISP培地No.2、３、４及び６並にベネツトのア
ガーでは形成しない。気菌糸の色は、黄色がかつた白色
である。黒味がかつたメラノイド顔料は、ISP培地No.6
及び７に形成する。他の明確な顔料は形成しない。菌株
L585−６の培養上の特徴は、第Ｉ表に示される。
生理学上の特徴 最適な生長は、30〜35℃で観察される。生長に関する
温度範囲は、18℃〜39℃である。生長は15℃及び41℃で
生じない。生長は、５％より多いNaClを補給された培地
で生じない。ゼラチンは液化されるが、でん粉は加水分
解されない。テストされた25種の糖の中、Ｄ−リボース
及びＤ−グルコースのみが生長に利用される。生理学上
の特徴及び炭水化物の利用は、第II及びIII表に示され
る。
温度範囲は、18℃〜39℃である。生長は15℃及び41℃で
生じない。生長は、５％より多いNaClを補給された培地
で生じない。ゼラチンは液化されるが、でん粉は加水分
解されない。テストされた25種の糖の中、Ｄ−リボース
及びＤ−グルコースのみが生長に利用される。生理学上
の特徴及び炭水化物の利用は、第II及びIII表に示され
る。
細胞壁化学 菌株L585−６の細胞壁含量は、Beckerら、Appl.Micro
biol.13:236〜243（1965）、ヤマグチ、J.Bacteriol.8
9:444〜453（1965）並にLechevalier及びLechevalier,B
iology of the Actinomycetes and Related Organisms,
11:78〜92（1976）により記載された方法に従つて調べ
られた。細胞壁のペプチドグリカンは、メソ−ジアミノ
ピメリン酸を含む。全細胞・糖は、ガラクトース、グル
コース及びリボースを含む。従つて細胞壁のタイプはタ
イプIII eに属する。ホスホリピドは、ホスフアチジル
エタノールアミン、ホスフアチジルグリセロール及びホ
スフアチジルイノシトールを含むタイプＰ−IIである。
主なメナキノンはMK−９（H4）及びMK−９（H6）であ
る。グリコレートテストは陰性である。
biol.13:236〜243（1965）、ヤマグチ、J.Bacteriol.8
9:444〜453（1965）並にLechevalier及びLechevalier,B
iology of the Actinomycetes and Related Organisms,
11:78〜92（1976）により記載された方法に従つて調べ
られた。細胞壁のペプチドグリカンは、メソ−ジアミノ
ピメリン酸を含む。全細胞・糖は、ガラクトース、グル
コース及びリボースを含む。従つて細胞壁のタイプはタ
イプIII eに属する。ホスホリピドは、ホスフアチジル
エタノールアミン、ホスフアチジルグリセロール及びホ
スフアチジルイノシトールを含むタイプＰ−IIである。
主なメナキノンはMK−９（H4）及びMK−９（H6）であ
る。グリコレートテストは陰性である。
分 類 学 長鎖の胞子を有するアクチノミセタレス（Actinomyce
tales）の属の中で、シュードノカルジア（Pseudonocar
dia）、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）、ア
クチノポリスポラ（Actinopolyspora）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）、アクチノマズラ（Actinomadur
a）、グリコミセス（Glycomyces）、ノカルジオプシス
（Nocardiopsis）及びアミコレート（Amycolate）は細
胞壁型、細胞糖のパターン、リン脂質及びメナキノンを
含む細胞化学において菌株L585−６から明らかに区別さ
れる。キブデロスポランギウム（Kibdelosporangium）
（Shearer他、Int.J.Syst.Bacteriol.36:47〜54、198
6）、キタサトスポリア（Kitasatosporia）（高橋他、
J.Gen.Appl.Microbiol.30:377〜387、1984）及びアミコ
レートプシス（Amycolatepsis）（Lechevalier他、Int.
J.Syst.Bacteriol.36:29〜37、1986）はリン脂質及びメ
ナキノンの組成において菌株L585−６と関連があるが、
キブデロスポランギウム及びアミコレートプシスは、細
胞壁糖のアラビノースの存在に関して該菌株と異り、そ
してキタサトスポリアは細胞壁中のLL−及びメソ−ジア
ミノピメリン酸の存在に関して異なる。さらに、キブデ
ロスポランギウム（Kibdelosporangium）は真性膜をも
つ、菌糸を含む胞子嚢様組織体をもち、そしてキタサト
スポリアは液内培養胞子を形成する。これらの独特な構
造は菌株L585−６では観察されない。化学分類学上、ス
トレプトアロテイクス（富田他、Int.J.Syst.Bacterio
l.37:211〜213、1987）、アクチノシンネマ（Actinosyn
nema）（長谷川他、Int.J.Syst.Bacteriol.28:304〜31
0、1987）及びサッカロスリックス（Saccharothrix）
（Labeda他、Int.J.Syst.Bacteriol.34:426〜431、198
4）は菌株L585−６に最も関連がある。アクチノシンネ
マは分生子柄束の先端から空中胞子鎖を形成する。サッ
カロスリックスは発育及び空中菌糸の両者の断片の球菌
様の成分の鎖を形成し、且つ分岐した短い胞子鎖又は菌
核の顆粒の群れを形成しない。サッカロスリックス ア
ンストラリエンシス（Saccharothrix anstraliensis）
及びエス・アエロコロニゲンズ（S.aerocolonigenes）
における球菌様の成分の鎖の形態学（Labeda、Int.J.Sy
st.Bacteriol.36:109〜110、1986）はノカルジオプシス
（Nocardiopsis）のそれらに関連があるが、ストレプト
ミセスのすべての種に無関係である。従って、菌株L585
−６はアクチノシンネマ（Actinosynnema）及びサッカ
ロスリックス（Saccharothrix）の何れとも関係がな
い。
tales）の属の中で、シュードノカルジア（Pseudonocar
dia）、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）、ア
クチノポリスポラ（Actinopolyspora）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）、アクチノマズラ（Actinomadur
a）、グリコミセス（Glycomyces）、ノカルジオプシス
（Nocardiopsis）及びアミコレート（Amycolate）は細
胞壁型、細胞糖のパターン、リン脂質及びメナキノンを
含む細胞化学において菌株L585−６から明らかに区別さ
れる。キブデロスポランギウム（Kibdelosporangium）
（Shearer他、Int.J.Syst.Bacteriol.36:47〜54、198
6）、キタサトスポリア（Kitasatosporia）（高橋他、
J.Gen.Appl.Microbiol.30:377〜387、1984）及びアミコ
レートプシス（Amycolatepsis）（Lechevalier他、Int.
J.Syst.Bacteriol.36:29〜37、1986）はリン脂質及びメ
ナキノンの組成において菌株L585−６と関連があるが、
キブデロスポランギウム及びアミコレートプシスは、細
胞壁糖のアラビノースの存在に関して該菌株と異り、そ
してキタサトスポリアは細胞壁中のLL−及びメソ−ジア
ミノピメリン酸の存在に関して異なる。さらに、キブデ
ロスポランギウム（Kibdelosporangium）は真性膜をも
つ、菌糸を含む胞子嚢様組織体をもち、そしてキタサト
スポリアは液内培養胞子を形成する。これらの独特な構
造は菌株L585−６では観察されない。化学分類学上、ス
トレプトアロテイクス（富田他、Int.J.Syst.Bacterio
l.37:211〜213、1987）、アクチノシンネマ（Actinosyn
nema）（長谷川他、Int.J.Syst.Bacteriol.28:304〜31
0、1987）及びサッカロスリックス（Saccharothrix）
（Labeda他、Int.J.Syst.Bacteriol.34:426〜431、198
4）は菌株L585−６に最も関連がある。アクチノシンネ
マは分生子柄束の先端から空中胞子鎖を形成する。サッ
カロスリックスは発育及び空中菌糸の両者の断片の球菌
様の成分の鎖を形成し、且つ分岐した短い胞子鎖又は菌
核の顆粒の群れを形成しない。サッカロスリックス ア
ンストラリエンシス（Saccharothrix anstraliensis）
及びエス・アエロコロニゲンズ（S.aerocolonigenes）
における球菌様の成分の鎖の形態学（Labeda、Int.J.Sy
st.Bacteriol.36:109〜110、1986）はノカルジオプシス
（Nocardiopsis）のそれらに関連があるが、ストレプト
ミセスのすべての種に無関係である。従って、菌株L585
−６はアクチノシンネマ（Actinosynnema）及びサッカ
ロスリックス（Saccharothrix）の何れとも関係がな
い。
ストレプトアロテイクス ヒンダスタヌス（Streptoa
lloteichus hindustanus）は、分節胞子の長い螺旋状
の胞子の鎖、分岐した短い胞子の鎖そして空中菌糸の菌
核の顆粒をもち、さらに発育菌糸における鞭毛をもつ１
〜４個の胞子を含む小さな胞子嚢様組織体並びに菌糸の
密な球状体をもつ。菌株L585−６はすべての小さな胞子
嚢様頂嚢を形成する。ストレプトアロテイクスと同様
に、菌株L585−６は菌核顆粒に成長するバルーン様組織
体を形成する。この構造はストレプトミセスの多くの種
例えばエス・カナミセチクス（S.kanamyceticus）（Shi
rling他、Int.J.Syst.Bacteriol.22:265〜394、1972）
及びエス・ローズイスクレロチカス（S.roseisclerotic
us）（Chainia rubra）（Shieling他、Int.J.Syst.Bac
teriol.22:265〜394、1972）において観察される。
lloteichus hindustanus）は、分節胞子の長い螺旋状
の胞子の鎖、分岐した短い胞子の鎖そして空中菌糸の菌
核の顆粒をもち、さらに発育菌糸における鞭毛をもつ１
〜４個の胞子を含む小さな胞子嚢様組織体並びに菌糸の
密な球状体をもつ。菌株L585−６はすべての小さな胞子
嚢様頂嚢を形成する。ストレプトアロテイクスと同様
に、菌株L585−６は菌核顆粒に成長するバルーン様組織
体を形成する。この構造はストレプトミセスの多くの種
例えばエス・カナミセチクス（S.kanamyceticus）（Shi
rling他、Int.J.Syst.Bacteriol.22:265〜394、1972）
及びエス・ローズイスクレロチカス（S.roseisclerotic
us）（Chainia rubra）（Shieling他、Int.J.Syst.Bac
teriol.22:265〜394、1972）において観察される。
上述の比較考察に基づいて、菌株L585−６はストレプ
トアロテイクス属に分類される。菌株L585−６はISP培
地No.2、３及び４並びにベネットのアガーで空中菌糸を
形成する能力の欠如、メラニンの形成、でん粉加水分解
の欠如、41℃における成長の欠如，及びテストされた25
種の糖の中でＤ−リボース及びローグルコースのみを利
用する能力等の点で、ストレプトアロテイクス ヒンダ
スタヌス（Streptoalloteichus hindustanus）とは異
なる。それ故に菌株L585−６はストレプトアロテイクス
属の新規な種である。
トアロテイクス属に分類される。菌株L585−６はISP培
地No.2、３及び４並びにベネットのアガーで空中菌糸を
形成する能力の欠如、メラニンの形成、でん粉加水分解
の欠如、41℃における成長の欠如，及びテストされた25
種の糖の中でＤ−リボース及びローグルコースのみを利
用する能力等の点で、ストレプトアロテイクス ヒンダ
スタヌス（Streptoalloteichus hindustanus）とは異
なる。それ故に菌株L585−６はストレプトアロテイクス
属の新規な種である。
ストレプトアロテイクス属の新しい種と決定された菌
株L585−６の生物学上純粋な培養物は特許手続上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づい
て国際寄託機関、ザ アメリカン タイプ カルチャー
コレクション（ATCC）に寄託されそして受託番号ATCC
53650を付与された。
株L585−６の生物学上純粋な培養物は特許手続上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づい
て国際寄託機関、ザ アメリカン タイプ カルチャー
コレクション（ATCC）に寄託されそして受託番号ATCC
53650を付与された。
本発明の抗腫瘍抗生物質は、菌株L585−６又はその変
種を水性の栄養培地中で液内培養の条件下で培養するこ
とにより生産される。生産微生物は、同化可能な炭素源
例えば同化可能な炭水化物を含む栄養培地中で生長す
る。好適な炭素源の例は、セレロース及びグリセロール
を含む。栄養培地は、又同化可能な窒素源例えばフイシ
ユ・ミール、イースト・エキス又はアンモニウム塩を含
まねばならない。無機塩例えば塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、りん酸塩
などが、必要ならば加えられる。微量元素例えば銅、マ
ンガン、鉄、亜鉛などは、所望ならば培地に加えられる
か、又はそれらは培地の他の成分の不純物として存在し
ている。インキユベーシヨン温度は、生産菌株が生長す
ることのできる任意の温度例えば18℃〜39℃であるが、
25℃〜35℃最も好ましくは27℃〜32℃で発酵を行うのが
好ましい。中性のpHが好ましくは培地で用いられ、抗生
物質の生産は一般に約４〜８日の期間行われる。通常、
最適の生産は約５〜６日で達成される。比較的少量の抗
生物質の製造のために、振盪フラスコ及び表面培養が用
いられるが、多量での製造では液内培養の好気性培養
（滅菌タンク内の）が好ましい。タンク発酵が行われる
とき、微生物からの胞子をブロス培養に接種することに
より栄養ブロス中に増殖接種物を生成し、そして若い活
性な増殖接種物が得られたとき接種物を発酵タンクの培
地に滅菌的に移すことが望ましい。撹拌はさらに機械的
な撹拌器によりもたらされる。発泡防止剤例えばラード
油又はシリコーン油も又必要ならば加えられる。
種を水性の栄養培地中で液内培養の条件下で培養するこ
とにより生産される。生産微生物は、同化可能な炭素源
例えば同化可能な炭水化物を含む栄養培地中で生長す
る。好適な炭素源の例は、セレロース及びグリセロール
を含む。栄養培地は、又同化可能な窒素源例えばフイシ
ユ・ミール、イースト・エキス又はアンモニウム塩を含
まねばならない。無機塩例えば塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、りん酸塩
などが、必要ならば加えられる。微量元素例えば銅、マ
ンガン、鉄、亜鉛などは、所望ならば培地に加えられる
か、又はそれらは培地の他の成分の不純物として存在し
ている。インキユベーシヨン温度は、生産菌株が生長す
ることのできる任意の温度例えば18℃〜39℃であるが、
25℃〜35℃最も好ましくは27℃〜32℃で発酵を行うのが
好ましい。中性のpHが好ましくは培地で用いられ、抗生
物質の生産は一般に約４〜８日の期間行われる。通常、
最適の生産は約５〜６日で達成される。比較的少量の抗
生物質の製造のために、振盪フラスコ及び表面培養が用
いられるが、多量での製造では液内培養の好気性培養
（滅菌タンク内の）が好ましい。タンク発酵が行われる
とき、微生物からの胞子をブロス培養に接種することに
より栄養ブロス中に増殖接種物を生成し、そして若い活
性な増殖接種物が得られたとき接種物を発酵タンクの培
地に滅菌的に移すことが望ましい。撹拌はさらに機械的
な撹拌器によりもたらされる。発泡防止剤例えばラード
油又はシリコーン油も又必要ならば加えられる。
発酵培地中の抗生物質ケダルシジンの生産は、テスト
微生物として枯草菌（バチルス スブチリス）を用いる
抗菌性アツセイにより、又はネズミ（B16−F10）又はヒ
ト（例えばHCT−116、KB）腫瘍細胞系を用いる細胞毒性
アツセイにより、発酵の途中で容易に追跡できる。
微生物として枯草菌（バチルス スブチリス）を用いる
抗菌性アツセイにより、又はネズミ（B16−F10）又はヒ
ト（例えばHCT−116、KB）腫瘍細胞系を用いる細胞毒性
アツセイにより、発酵の途中で容易に追跡できる。
本発明は、前述の特に好ましい菌株L585−６又は前述
の記述に十分に適合する微生物の使用に限定されないこ
とは理解されるべきである。従来の手段例えばＸ線照
射、紫外線照射、ナイトロジエンマスタードによる処
理、フアージ露出などにより生成できる他のケダルシジ
ン生産菌株又は該微生物の変種を含むことを特に目的と
している。
の記述に十分に適合する微生物の使用に限定されないこ
とは理解されるべきである。従来の手段例えばＸ線照
射、紫外線照射、ナイトロジエンマスタードによる処
理、フアージ露出などにより生成できる他のケダルシジ
ン生産菌株又は該微生物の変種を含むことを特に目的と
している。
本発明の抗腫瘍蛋白は、従来の蛋白分離法例えば透
析、限外過、ゲル過、等電点沈澱、塩析、電気透
析、イオン交換クロマトグラフイ及びアフイニテイクロ
マトグラフイを用いて、発酵ブロスから単離できる。一
連のこれらの技術の組合わせは、見掛け上の均一性にま
で蛋白を精製するのに一般に用いられる。単離及び精製
の工程は、微生物学的なアツセイ例えば枯草菌（バチル
ス スブチリス）、生体外細胞毒性アツセイ（ネズミ又
はヒトの癌細胞系に対する）、生体内の抗腫瘍アツセイ
により、又は物理的方法例えばUV又はHPLC技術により、
モニターされそして導かれる。スケームＩは、代表的な
単離精製の順序を示す。この特別な順序は、説明の目的
のみのためであり、他の方法を用いる異る順序も又蛋白
が高純度で得られそしてその生物学的活性を保持する限
り用いられうることは当業者により理解されるだろう。
析、限外過、ゲル過、等電点沈澱、塩析、電気透
析、イオン交換クロマトグラフイ及びアフイニテイクロ
マトグラフイを用いて、発酵ブロスから単離できる。一
連のこれらの技術の組合わせは、見掛け上の均一性にま
で蛋白を精製するのに一般に用いられる。単離及び精製
の工程は、微生物学的なアツセイ例えば枯草菌（バチル
ス スブチリス）、生体外細胞毒性アツセイ（ネズミ又
はヒトの癌細胞系に対する）、生体内の抗腫瘍アツセイ
により、又は物理的方法例えばUV又はHPLC技術により、
モニターされそして導かれる。スケームＩは、代表的な
単離精製の順序を示す。この特別な順序は、説明の目的
のみのためであり、他の方法を用いる異る順序も又蛋白
が高純度で得られそしてその生物学的活性を保持する限
り用いられうることは当業者により理解されるだろう。
スケームI.蛋白の単離及び精製 スケームＩを行うのに、全発酵ブロスの不溶性の塊
は、従来の方法例えば遠心分離又は過を用いて除去さ
れる。もしブロスが過されるならば、過助剤例えば
Dicaliteが有利に用いられる。液を次に７〜８のpH範
囲で溶離液として陽イオン性バツフアーを用いる陰イオ
ン交換クロマトグラフイにかけ、次に塩化ナトリウムを
含む同一のバツフアーを用いる。このpH範囲の好適な陽
イオン性バツフアーは例えばトリスHClである。NaCl含
有バツフアーにより溶離した画分を集め、濃縮しそして
さらに同一の陽イオン性バツフアーを用いるゲル過ク
ロマトグラフイにより精製する。画文を集めそして活性
成分の存在についてアツセイする。溶離液をモニターす
る好都合な最初のシステムは、枯草菌（バチルス スブ
チリス）に対してアツセイすることである。阻止帯を示
すこれらの画文は、集められ、濃縮しそしてさらに最初
の溶離液として７〜８の範囲のpHを有する陽イオン性バ
ツフアーを用いる陰イオン交換クロマトグラフイにより
精製され、そしてイオン力を増大する直線状の勾配によ
り続ける。活性画分は、ナトリウムドデシルサルフエー
ト−ポリアクリルアミドゲル電気透析（SDS−PAGE）、
等電点フオーカシング及びHPLC技術により、均一性につ
いてチエツクされる。均一と判断される画分を集め凍結
乾燥して活性蛋白を得る。
は、従来の方法例えば遠心分離又は過を用いて除去さ
れる。もしブロスが過されるならば、過助剤例えば
Dicaliteが有利に用いられる。液を次に７〜８のpH範
囲で溶離液として陽イオン性バツフアーを用いる陰イオ
ン交換クロマトグラフイにかけ、次に塩化ナトリウムを
含む同一のバツフアーを用いる。このpH範囲の好適な陽
イオン性バツフアーは例えばトリスHClである。NaCl含
有バツフアーにより溶離した画分を集め、濃縮しそして
さらに同一の陽イオン性バツフアーを用いるゲル過ク
ロマトグラフイにより精製する。画文を集めそして活性
成分の存在についてアツセイする。溶離液をモニターす
る好都合な最初のシステムは、枯草菌（バチルス スブ
チリス）に対してアツセイすることである。阻止帯を示
すこれらの画文は、集められ、濃縮しそしてさらに最初
の溶離液として７〜８の範囲のpHを有する陽イオン性バ
ツフアーを用いる陰イオン交換クロマトグラフイにより
精製され、そしてイオン力を増大する直線状の勾配によ
り続ける。活性画分は、ナトリウムドデシルサルフエー
ト−ポリアクリルアミドゲル電気透析（SDS−PAGE）、
等電点フオーカシング及びHPLC技術により、均一性につ
いてチエツクされる。均一と判断される画分を集め凍結
乾燥して活性蛋白を得る。
ケダルシジンは、一本鎖ポリペプチド及び非蛋白発色
団よりなる有力な蛋白抗腫瘍抗生物質である。物理化学
的特徴及び生理学的テストにかけられた抗生物質のサン
プルは、配列の実験中SDS−PAGE、等電点フオーカシン
グ及びHPLCにより均一と判断されたが、抗生物質が一つ
の主な異型及び一つ又は二つの少ない異型よりなること
が分つた。異型は、下記に記載されるようにポリペプチ
ドの最初のＮ末端アミノ酸配列において異る。個々の異
型の分離又は単離は、抗腫瘍活性について要求されな
い。
団よりなる有力な蛋白抗腫瘍抗生物質である。物理化学
的特徴及び生理学的テストにかけられた抗生物質のサン
プルは、配列の実験中SDS−PAGE、等電点フオーカシン
グ及びHPLCにより均一と判断されたが、抗生物質が一つ
の主な異型及び一つ又は二つの少ない異型よりなること
が分つた。異型は、下記に記載されるようにポリペプチ
ドの最初のＮ末端アミノ酸配列において異る。個々の異
型の分離又は単離は、抗腫瘍活性について要求されな
い。
本発明は、又ケダルシジンの異型を包含し、抗生物質
のペプチド部分は、本明細書に記載されたような抗生物
質の抗腫瘍活性を実質的に変更することなく、例えばペ
プチドの一次構造に沿つて或るアミノ酸の欠損、付加又
は置換により、周知の技術によつて変更されて、そのフ
ラグメント及び誘導体を生成することができる。
のペプチド部分は、本明細書に記載されたような抗生物
質の抗腫瘍活性を実質的に変更することなく、例えばペ
プチドの一次構造に沿つて或るアミノ酸の欠損、付加又
は置換により、周知の技術によつて変更されて、そのフ
ラグメント及び誘導体を生成することができる。
アミノ酸組成 周知の標準的な方法を用いて、精製された蛋白のアミ
ノ酸組成が決定されそして第IV表に示される。
ノ酸組成が決定されそして第IV表に示される。
アミノ酸配列 アミノ末端配列分析では、ケダルシジンは、２−メル
カプトエタノールにより還元されそしてさらにSDS−PAG
E（15％アクリルアミド）により精製されそして電気溶
離又は電気ブロツテイングによりゲルから回収された。
カプトエタノールにより還元されそしてさらにSDS−PAG
E（15％アクリルアミド）により精製されそして電気溶
離又は電気ブロツテイングによりゲルから回収された。
多くの酵素的開裂では、ケダルシジンはさらに精製す
ることなく用いられた。ケダルシジンは、50℃で２時間
6MグアニジンHCl、0.1％Na2EDTAを含む0.4Mトリス−HCl
バツフアー（pH8.5）100μ中の20mMジチオスレイトー
ルにより還元され、次に室温で１晩100mM4−ビニルピリ
ジンによりＳ−ピリジルエチル化された、反応を50℃で
１時間10μの２−メルカプトエタノールを加えること
により停止した。試薬を24時間５％（v/v）酢酸に対す
る透析により除去し、そして修飾したケダルシジンを次
にSpeedvac遠心分離濃縮器（Savant Instruments）中で
乾燥した。
ることなく用いられた。ケダルシジンは、50℃で２時間
6MグアニジンHCl、0.1％Na2EDTAを含む0.4Mトリス−HCl
バツフアー（pH8.5）100μ中の20mMジチオスレイトー
ルにより還元され、次に室温で１晩100mM4−ビニルピリ
ジンによりＳ−ピリジルエチル化された、反応を50℃で
１時間10μの２−メルカプトエタノールを加えること
により停止した。試薬を24時間５％（v/v）酢酸に対す
る透析により除去し、そして修飾したケダルシジンを次
にSpeedvac遠心分離濃縮器（Savant Instruments）中で
乾燥した。
ASP−Ｎ酵素又はS.aureus V8プロテアーゼによるＳ−
ピリジルエチル化ケダルシジンの酵素的開裂は、1:100
（ASP−Ｎ）又は1:10（V8プロテアーゼ）の酵素／基質
比を用いて、１晩37℃で0.7M尿素を含む0.1Mトリス酢酸
バツフアー（pH8.0）40μ中で行われた。トリプシン
消化は、１対20の酵素／基質の比で１晩37℃で0.1Mトリ
ス酢酸バツフアー（pH8.0）40μ中で行われた。酵素
の消化物は、トリフルオロ酢酸（TFA）によりpH2.0と酸
性化され、そして逆相HPLCにより分離された。
ピリジルエチル化ケダルシジンの酵素的開裂は、1:100
（ASP−Ｎ）又は1:10（V8プロテアーゼ）の酵素／基質
比を用いて、１晩37℃で0.7M尿素を含む0.1Mトリス酢酸
バツフアー（pH8.0）40μ中で行われた。トリプシン
消化は、１対20の酵素／基質の比で１晩37℃で0.1Mトリ
ス酢酸バツフアー（pH8.0）40μ中で行われた。酵素
の消化物は、トリフルオロ酢酸（TFA）によりpH2.0と酸
性化され、そして逆相HPLCにより分離された。
rpHPLCによるペプチド精製は、モデル130A分離システ
ム（Applied Biosystems,Inc.）により行われ、そしてR
P−300カラム（2.1×100mm;applied Biosystems,Inc.）
で40℃で行われた。出発バツフアーとして水中0.1％TFA
よりなりそして制限バツフアーとして0.085％TFAを含む
60％アセトニトリルよりなる線状アセトニトリル勾配
を、溶離に用いた。ペプチドは手で集めた。アミノ酸配
列の決定は、標準の技術を用いて自動アミノ酸シーケン
サー（モデル475A、Applied Biosystems,Inc.）で行わ
れた。
ム（Applied Biosystems,Inc.）により行われ、そしてR
P−300カラム（2.1×100mm;applied Biosystems,Inc.）
で40℃で行われた。出発バツフアーとして水中0.1％TFA
よりなりそして制限バツフアーとして0.085％TFAを含む
60％アセトニトリルよりなる線状アセトニトリル勾配
を、溶離に用いた。ペプチドは手で集めた。アミノ酸配
列の決定は、標準の技術を用いて自動アミノ酸シーケン
サー（モデル475A、Applied Biosystems,Inc.）で行わ
れた。
主な異型ポリペプチドは114個のアミノ酸残基よりな
る。アミノ酸の配列は、次の通りと決定されている。
る。アミノ酸の配列は、次の通りと決定されている。
Ｎ−末端 Ｃ−末端 ２種の少い異型が同定され、一つは多い異型の初めの
アラニンを欠き、そして他は多い異型の初めの２個のア
ミノ酸即ちアラニンとセリンを欠く。
アラニンを欠き、そして他は多い異型の初めの２個のア
ミノ酸即ちアラニンとセリンを欠く。
分子量の決定 （ａ） ゲル過/HPLC法 TSK−G2000SWカラム（7.5×300mm）（LKB Produkter
AB,スウエーデン）を用い、ゲル過を行い、0.5ml/分
の流速で0.5M Naclを含む30mMトリスHClバツフアー（pH
7.4）を用いる。一方、Waters Associates Protein Ana
lysis Columm I−125が、1ml/分の流速で溶離液として
0.2Mトリスアセテートとともに用いられる。分子量は、
標準の分子量マーカーから得られる参考曲線から17,000
ダルトンであると測定される（Bio Rad Laboratorie
s）。
AB,スウエーデン）を用い、ゲル過を行い、0.5ml/分
の流速で0.5M Naclを含む30mMトリスHClバツフアー（pH
7.4）を用いる。一方、Waters Associates Protein Ana
lysis Columm I−125が、1ml/分の流速で溶離液として
0.2Mトリスアセテートとともに用いられる。分子量は、
標準の分子量マーカーから得られる参考曲線から17,000
ダルトンであると測定される（Bio Rad Laboratorie
s）。
（ｂ） ナトリウムドデシルサルフエート・ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法 蛋白のサンプル及び分子量マーカー（Diversified Bi
otech,メインより購入）を、等容量のSeprasol（砂糖及
び追跡用染料を含む直に用いられる蛋白溶解液）と混合
し、次に電気泳動直前に90℃で３分間加熱する。電気泳
動は、追跡用染料がゲルの底に達するまでSeprabuff
（トリス−グリシン−SDS、pH8.3）中で300Vで行う。ゲ
ルを次に少くとも10時間染色溶液（含水メタノール908m
l中の1.25gのComassie BBR−250、92mlの氷酢酸）に浸
漬し、次いでゲルのバツクグラウンドが透明になるまで
脱色溶液（水875ml中の75mlの酢酸及び50mlのメタノー
ル）に浸漬する。Seprasol及びSeprebuffは、Integrate
d Separation System,マサチユーセツツから購入した。
分子量は、この方法により12,400ダルトンであると測定
される。
ルアミドゲル電気泳動法 蛋白のサンプル及び分子量マーカー（Diversified Bi
otech,メインより購入）を、等容量のSeprasol（砂糖及
び追跡用染料を含む直に用いられる蛋白溶解液）と混合
し、次に電気泳動直前に90℃で３分間加熱する。電気泳
動は、追跡用染料がゲルの底に達するまでSeprabuff
（トリス−グリシン−SDS、pH8.3）中で300Vで行う。ゲ
ルを次に少くとも10時間染色溶液（含水メタノール908m
l中の1.25gのComassie BBR−250、92mlの氷酢酸）に浸
漬し、次いでゲルのバツクグラウンドが透明になるまで
脱色溶液（水875ml中の75mlの酢酸及び50mlのメタノー
ル）に浸漬する。Seprasol及びSeprebuffは、Integrate
d Separation System,マサチユーセツツから購入した。
分子量は、この方法により12,400ダルトンであると測定
される。
等電点フオーカシング フオーカシングに用いられるゲルは、以下のものを混
合することにより製造される。
合することにより製造される。
29.1％アクリルアミド（水中） 10ml 0.9％N,N′-メチレン-ビス-アクリルアミド(水中) 10ml グリセリン 7ml 1802Ampholine pH2.5〜４ 3ml 水を加えて 60ml 得られた溶液を10分間脱気しそして水中１％過硫酸ア
ンモニウム1.5ml及びN,N,N′,N′−テトラメチルエチレ
ンジアミン10μをそれに加える。混合物を注型用の型
に注ぎそして放置して重合させる。用いる電極溶液は陰
極で1M燐酸であり陽極で２％1809Ampholine（pH6〜８）
である。フオーカシングの実験は、２時間25ワツトの一
定電力で行われる。％は容量中の重量の％である。等電
点は、3.65と測定されそして陽極からの泳動距離は6.25
cmである。
ンモニウム1.5ml及びN,N,N′,N′−テトラメチルエチレ
ンジアミン10μをそれに加える。混合物を注型用の型
に注ぎそして放置して重合させる。用いる電極溶液は陰
極で1M燐酸であり陽極で２％1809Ampholine（pH6〜８）
である。フオーカシングの実験は、２時間25ワツトの一
定電力で行われる。％は容量中の重量の％である。等電
点は、3.65と測定されそして陽極からの泳動距離は6.25
cmである。
蛋白の抗腫瘍活性は、移植可能なネズミP388白血病に
ついて評価された。CDFマウスに、この移植可能なネズ
ミ白血病を有するDBA/2ドナーマウスから得た106P388白
血病細胞を腹腔内（ip）又は静脈内（iv）に移植した。
ip移植されたP388白血病に対して、マウスは、腫瘍移植
後の１日から始まる５日間連続して毎日１回ケダルシジ
ンの投与又は塩水（コントロール・マウス）の何れかに
よりip処理された。iv移植されたP388白血病に対して、
マウスは移植後１、３及び５日にケダルシジンをivで受
けた。これらの動物は、毎日観察されそしてそれらの死
亡を記録した。平均の体重の変化（白血病移植の日から
最後の処理の日まで）を、薬剤の毒性を反映する手段と
してすべての群について求めた。腫瘍移植後５日目の各
群において生存したマウスの発生を、薬剤の毒性を評価
する追加の手段として記録した。もし処理群当り１匹よ
り多いマウスが５日までに死亡したならば、治療結果は
有意とは考えなかつた。処理群は４匹又は６匹の何れか
のマウスよりなり；コントロール群は10匹のマウスを含
んだ。もしあるならば30日（実験の最後の日）まで生存
するマウスの数も又記録された。実験の終りでは、各群
に関する平均の生存時間（MST）が求められそして％T/C
（100倍された処理群のMST及びコントロール群のMSTの
比である）を計算するのに用いられた。125より大きい
％T/C値は、有意な抗腫瘍活性を示す。生体内のデータ
を第Ｖ及びVI表に示す。
ついて評価された。CDFマウスに、この移植可能なネズ
ミ白血病を有するDBA/2ドナーマウスから得た106P388白
血病細胞を腹腔内（ip）又は静脈内（iv）に移植した。
ip移植されたP388白血病に対して、マウスは、腫瘍移植
後の１日から始まる５日間連続して毎日１回ケダルシジ
ンの投与又は塩水（コントロール・マウス）の何れかに
よりip処理された。iv移植されたP388白血病に対して、
マウスは移植後１、３及び５日にケダルシジンをivで受
けた。これらの動物は、毎日観察されそしてそれらの死
亡を記録した。平均の体重の変化（白血病移植の日から
最後の処理の日まで）を、薬剤の毒性を反映する手段と
してすべての群について求めた。腫瘍移植後５日目の各
群において生存したマウスの発生を、薬剤の毒性を評価
する追加の手段として記録した。もし処理群当り１匹よ
り多いマウスが５日までに死亡したならば、治療結果は
有意とは考えなかつた。処理群は４匹又は６匹の何れか
のマウスよりなり；コントロール群は10匹のマウスを含
んだ。もしあるならば30日（実験の最後の日）まで生存
するマウスの数も又記録された。実験の終りでは、各群
に関する平均の生存時間（MST）が求められそして％T/C
（100倍された処理群のMST及びコントロール群のMSTの
比である）を計算するのに用いられた。125より大きい
％T/C値は、有意な抗腫瘍活性を示す。生体内のデータ
を第Ｖ及びVI表に示す。
第Ｖ、VI及びVII表に示されているテストの結果は、
抗生物質ケダルシジンがネズミ白血病P388及びB16黒色
腫に対して再現可能な生体内抗腫瘍活性を示す有力な物
質であることを証明している。観察された活性は、ip移
植されたB16黒色腫並にip及びivの両方の移植されたP38
8に対して生存日を増大することにより明らかにされ、
後者はその転移する性質のため有効に治療することがさ
らに困難な形の疾患を示す。ケダルシジンは、又皮下に
移植されたB16黒色腫、M5076ネズミ肺腫瘍及び頭内に移
植されたP388白血病に対して評価されたが、これらの動
物のモデルにおいて有意な活性を示さなかつた。
抗生物質ケダルシジンがネズミ白血病P388及びB16黒色
腫に対して再現可能な生体内抗腫瘍活性を示す有力な物
質であることを証明している。観察された活性は、ip移
植されたB16黒色腫並にip及びivの両方の移植されたP38
8に対して生存日を増大することにより明らかにされ、
後者はその転移する性質のため有効に治療することがさ
らに困難な形の疾患を示す。ケダルシジンは、又皮下に
移植されたB16黒色腫、M5076ネズミ肺腫瘍及び頭内に移
植されたP388白血病に対して評価されたが、これらの動
物のモデルにおいて有意な活性を示さなかつた。
本発明は、その範囲内に、不活性な製薬上許容しうる
担体又は希釈剤とともに有効な腫瘍阻止量の本発明の抗
生物質を含む製薬組成物を含む。このような組成物は、
又他の活性抗腫瘍剤を含みそして所望の投与経路に適切
な任意の製薬上の形に作られる。このような組成物の例
は、経口投与用の固体組成物例えば錠剤、カプセル、ピ
ル、粉末及び顆粒、経口投与用の液体組成物例えば溶
液、懸濁液、シロツプ又はエリキシル並に非経口投与用
の製剤例えば滅菌溶液、懸濁液又はエマルシヨンを含
む。それらは、又使用直前に滅菌水、生理学的塩水又は
或る他の滅菌した注射可能な媒体に溶解できる滅菌固体
組成物の形で製造できる。
担体又は希釈剤とともに有効な腫瘍阻止量の本発明の抗
生物質を含む製薬組成物を含む。このような組成物は、
又他の活性抗腫瘍剤を含みそして所望の投与経路に適切
な任意の製薬上の形に作られる。このような組成物の例
は、経口投与用の固体組成物例えば錠剤、カプセル、ピ
ル、粉末及び顆粒、経口投与用の液体組成物例えば溶
液、懸濁液、シロツプ又はエリキシル並に非経口投与用
の製剤例えば滅菌溶液、懸濁液又はエマルシヨンを含
む。それらは、又使用直前に滅菌水、生理学的塩水又は
或る他の滅菌した注射可能な媒体に溶解できる滅菌固体
組成物の形で製造できる。
抗腫瘍剤として使用するために、或る哺乳動物の宿主
に対する最適の投与量及び用法は、当業者により容易に
確められる。もち論、用いられる実験の投与量は、処理
される特定の組成物、投与経路及び特定の部位、治療さ
れる宿主及び疾患に応じて変化することは理解されよ
う。薬剤の作用を修飾する多くのフアクターは、考慮に
入られれ、年令、体重、性別、食事、投与の時間、投与
の経路、排出の速度、患者の状態、薬剤の組合せ、反応
の感受性及び疾患の程度を含む。
に対する最適の投与量及び用法は、当業者により容易に
確められる。もち論、用いられる実験の投与量は、処理
される特定の組成物、投与経路及び特定の部位、治療さ
れる宿主及び疾患に応じて変化することは理解されよ
う。薬剤の作用を修飾する多くのフアクターは、考慮に
入られれ、年令、体重、性別、食事、投与の時間、投与
の経路、排出の速度、患者の状態、薬剤の組合せ、反応
の感受性及び疾患の程度を含む。
本発明は下記の実施例により説明され、それらは本発
明の範囲を制限するものとは考えてはならない。
明の範囲を制限するものとは考えてはならない。
実施例 1. ストレプトアロテイクス属菌株L585−６の栄養培養物の
製造 ストレプトアロテイクス属菌株L585−６（ATCC 5365
0）を、試験管内の デキストロース 4.0g イースト・エキス 4.0g 麦芽エキス 10.0g CaCO3 1.5g アガー 15g 蒸留水を加えて １ よりなるイースト−麦芽エキスアガーのスラントに維持
且移した。それぞれの移植にはアガー・スラントを２週
間28℃でインキユベートした。栄養培養物を、 セレロース（Corn Products） 30g Pharmamedia（Traders Oil Mill Co.） 10g Nutriszy（Archer Daniels Midland Co.） 10g CaCO3 3g 蒸留水を加えて １ よりなる滅菌培地100mlを含む500ml容エルレンマイヤー
・フラスコに、スラント培養物からの表面培養物を移す
ことにより製造した。この栄養培養物を250回転／分に
セツトされた回転振盪機で72時間28℃でインキユベート
した。
製造 ストレプトアロテイクス属菌株L585−６（ATCC 5365
0）を、試験管内の デキストロース 4.0g イースト・エキス 4.0g 麦芽エキス 10.0g CaCO3 1.5g アガー 15g 蒸留水を加えて １ よりなるイースト−麦芽エキスアガーのスラントに維持
且移した。それぞれの移植にはアガー・スラントを２週
間28℃でインキユベートした。栄養培養物を、 セレロース（Corn Products） 30g Pharmamedia（Traders Oil Mill Co.） 10g Nutriszy（Archer Daniels Midland Co.） 10g CaCO3 3g 蒸留水を加えて １ よりなる滅菌培地100mlを含む500ml容エルレンマイヤー
・フラスコに、スラント培養物からの表面培養物を移す
ことにより製造した。この栄養培養物を250回転／分に
セツトされた回転振盪機で72時間28℃でインキユベート
した。
実施例 2. 振盪フラスコにおける発酵 実施例１の栄養培養物5mlを、 グリセロール 30g Pharmamedia 10g Distillerの可溶物（Nutrition Product Co）15g フイシユ・ミール（Menhaden） 10g CaCO3 6g 蒸留水を加えて １ よりなる生産培地100mlをそれぞれ含む500ml容エルレン
マイヤー・フラスコに接種した。生産培養を250回転／
分にセツトした回転振盪機で28℃でインキユベートし
た。蛋白抗生物質の生産を枯草菌（バチルス スブチリ
ス）を用いる微生物アツセイ並にネズミ黒色腫細胞系B1
6−F10及びヒト腫瘍細胞系を用いる生体外の細胞毒性ア
ツセイによりモニターした。最適の生産は一般に144〜1
68時間で達した。
マイヤー・フラスコに接種した。生産培養を250回転／
分にセツトした回転振盪機で28℃でインキユベートし
た。蛋白抗生物質の生産を枯草菌（バチルス スブチリ
ス）を用いる微生物アツセイ並にネズミ黒色腫細胞系B1
6−F10及びヒト腫瘍細胞系を用いる生体外の細胞毒性ア
ツセイによりモニターした。最適の生産は一般に144〜1
68時間で達した。
実施例 3. タンク中の発酵 実施例１の栄養培養物25mlを、同一の栄養培地500ml
を含む２容Vitro瓶に接種した。第二次の段階の種培
養物を、250回転／分にセツトした撹拌速度で回転振盪
機で72時間28℃でさらにインキユベートした。第二次の
段階の種培養500mlを、実施例２に示された組成を有す
る生産培地10を含むNew Brunswick Microgen発酵槽
（公称容量16）に接種した。発酵を、250回転／分に
セツトした撹拌、毎分１容量の通気量及び28℃で行つ
た。抗生物質ケダルシジンの生産は、適切な生体外バイ
オアツセイによりモニターされた。
を含む２容Vitro瓶に接種した。第二次の段階の種培
養物を、250回転／分にセツトした撹拌速度で回転振盪
機で72時間28℃でさらにインキユベートした。第二次の
段階の種培養500mlを、実施例２に示された組成を有す
る生産培地10を含むNew Brunswick Microgen発酵槽
（公称容量16）に接種した。発酵を、250回転／分に
セツトした撹拌、毎分１容量の通気量及び28℃で行つ
た。抗生物質ケダルシジンの生産は、適切な生体外バイ
オアツセイによりモニターされた。
実施例 4. ケダルシジンの単離及び精製 原料発酵ブロス10をDicalite 6と混合しそして得
られた薄いスラリーをDicaliteパツドで過した。不溶
物を捨てそして液を30ml/分の速度でZeta Prep 250 Q
AEイオン交換カートリツジ（LKB−Produkter AB,スウエ
ーデン）に圧入した。カートリツジは予め２の50mMト
リス−HClバツフアー（pH7.4）により平衡にされてい
た。溶離液を集めた。カートリツジを１の50mMトリス
−HClバツフアー（pH7.4）により洗い次にNaCl0.5モル
を含む50mMトリス−HClバツフアー（pH7.4）500mlによ
り溶離した。溶離液を集めそしてAmicon YM5膜を付けた
Amicon標準限外過セルを用いて500mlから100mlに濃縮
した。濃縮した溶液を、等容量の50mMトリス−HClバツ
フアー中の1400mlのUltrogel AcA54（LKB−Produkter A
B,スウエーデン）を充填したゲル過カラム（５×100c
m）に浸透させた。Ultrogelベツドは既に５の50mMト
リス−HClバツフアー（pH7.4）により平衡されていた。
装入したカラムを、60ml/分で２の50mMトリス−HClバ
ツフアー（pH7.4）により溶離した。450mlの最初の部分
の次に、10mlの画分を集めそしてそれぞれの画分をB.su
btilisについてアツセイした。阻止帯を示す画分（画分
83−133）を集め、次に限外過により100mlに濃縮し
た。濃縮した溶液を、等容量の50mMトリス−HClバツフ
アー中のDEAE Trisacryl（LKB−Produkter AB,スウエー
デン）70mlのスラリーを充填したイオン交換カラム（2.
5×15cm）に浸透した。Trisacrylベツトを既に10倍のカ
ラム容量の50mMトリス−HClバツフアーにより平衡にし
ておいた。装入したカラムを最初に10倍のカラム容量の
50mM−トリス−HClバツフアーにより溶離し、次に60ml/
時の流速で100％50mMトリス−HClバツフアーから0.5M N
aClを含む50mMトリス−HClバツフアーの100％までの300
mlの線状勾配（スローブ＝0.1M/時）により溶離した。
合計47個の5ml画分を集めそしてB.subtilisについてア
ツセイした。活性画分25〜37を集めそしてWaters Prote
in AnalysisカラムＩ−125、溶離液として1ml/分の流速
で0.2Mトリスアセテート（pH7.0）並に260nmのUV検出器
を用いて分析用ゲル過/HPLCにかけた。これらの条件
下、クロマトグラムは8.3分間の保持時間で単一のピー
クを示す。集められた画分を、又前述の条件を用いる等
電点フオーカシング及びSDS−PAGEにより均一であると
判断した。活性成分の濃度は、10mlの部分の凍結乾燥及
びバツフアー重量について補正することにより、4.25mg
/mlであると測定された。
られた薄いスラリーをDicaliteパツドで過した。不溶
物を捨てそして液を30ml/分の速度でZeta Prep 250 Q
AEイオン交換カートリツジ（LKB−Produkter AB,スウエ
ーデン）に圧入した。カートリツジは予め２の50mMト
リス−HClバツフアー（pH7.4）により平衡にされてい
た。溶離液を集めた。カートリツジを１の50mMトリス
−HClバツフアー（pH7.4）により洗い次にNaCl0.5モル
を含む50mMトリス−HClバツフアー（pH7.4）500mlによ
り溶離した。溶離液を集めそしてAmicon YM5膜を付けた
Amicon標準限外過セルを用いて500mlから100mlに濃縮
した。濃縮した溶液を、等容量の50mMトリス−HClバツ
フアー中の1400mlのUltrogel AcA54（LKB−Produkter A
B,スウエーデン）を充填したゲル過カラム（５×100c
m）に浸透させた。Ultrogelベツドは既に５の50mMト
リス−HClバツフアー（pH7.4）により平衡されていた。
装入したカラムを、60ml/分で２の50mMトリス−HClバ
ツフアー（pH7.4）により溶離した。450mlの最初の部分
の次に、10mlの画分を集めそしてそれぞれの画分をB.su
btilisについてアツセイした。阻止帯を示す画分（画分
83−133）を集め、次に限外過により100mlに濃縮し
た。濃縮した溶液を、等容量の50mMトリス−HClバツフ
アー中のDEAE Trisacryl（LKB−Produkter AB,スウエー
デン）70mlのスラリーを充填したイオン交換カラム（2.
5×15cm）に浸透した。Trisacrylベツトを既に10倍のカ
ラム容量の50mMトリス−HClバツフアーにより平衡にし
ておいた。装入したカラムを最初に10倍のカラム容量の
50mM−トリス−HClバツフアーにより溶離し、次に60ml/
時の流速で100％50mMトリス−HClバツフアーから0.5M N
aClを含む50mMトリス−HClバツフアーの100％までの300
mlの線状勾配（スローブ＝0.1M/時）により溶離した。
合計47個の5ml画分を集めそしてB.subtilisについてア
ツセイした。活性画分25〜37を集めそしてWaters Prote
in AnalysisカラムＩ−125、溶離液として1ml/分の流速
で0.2Mトリスアセテート（pH7.0）並に260nmのUV検出器
を用いて分析用ゲル過/HPLCにかけた。これらの条件
下、クロマトグラムは8.3分間の保持時間で単一のピー
クを示す。集められた画分を、又前述の条件を用いる等
電点フオーカシング及びSDS−PAGEにより均一であると
判断した。活性成分の濃度は、10mlの部分の凍結乾燥及
びバツフアー重量について補正することにより、4.25mg
/mlであると測定された。
第１図は、抗生物質ケダルシジンの紫外線スペクトルを
示す。
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 キン シング ラム アメリカ合衆国コネチカツト州 06410 チエシヤー カールトン ドライブ 264 (72)発明者 サルバトーレ フオーレンザ アメリカ合衆国コネチカツト州 06410 チエシヤー ウツドヒル ロード 481 (72)発明者 ジエームス エー ブツシユ アメリカ合衆国コネチカツト州 06410 チエシヤー ブロークフイールド コ ート ８ (72)発明者 富田 康二 東京都世田谷区上用賀５‐２‐３ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/195 C12P 21/02 C12N 1/20 A61K 38/16 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】（ａ） 外観：淡黄褐色の固体； （ｂ） 分子量:SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により12,400ダルトン；ゲル濾過/HPLC法により17,00
0 （ｃ） 紫外線スペクトル：第１図に実質的に示される
もの （ｄ） 等電点:3.65;並びに （ｅ） 下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドより
なる （ただしＸはＨ−ala−ser,H−ser及びＨよりなる群か
ら選択される） 抗生物質ケダルシジン（kedarcidin）。 - 【請求項２】液内培養好気性条件下同化可能な炭素及び
窒素源を含む培地中でストレプトアロティクス（Strept
oalloteichus）属に属し請求項１記載のケダルシジンを
生産し得る菌株を培養し、そして培養したブロスから該
抗生物質を回収することよりなる請求項１記載の抗生物
質ケダルシジンを製造する方法。 - 【請求項３】該生産菌株が菌株L585−６、ATCC53650で
ある請求項２記載の方法。 - 【請求項４】請求項１記載の抗生物質ケダルシジンを生
産し得るストレプトアロティクスL585−６。 - 【請求項５】有効成分として請求項１記載の抗生物質ケ
ダルシジンを含む抗腫瘍剤。 - 【請求項６】（ａ） 液内培養好気性条件下同化可能な
炭素及び窒素源を含む培地中でストレプトアロティクス
属に属し請求項１記載の抗生物質ケダルシジンを生産し
得る菌株を培養する工程：そして （ｂ） 培養したブロスから該抗生物質を回収する工程
よりなる方法により製造される請求項１記載の抗生物質
ケダルシジン。 - 【請求項７】該生産菌株が菌株L585−６である請求項６
記載の方法により製造される請求項１記載の抗生物質ケ
ダルシジン。
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|---|---|---|---|
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| US180519 | 1988-04-12 | ||
| US07/323,001 US5001112A (en) | 1988-04-12 | 1989-03-17 | Antitumor antibiotic kedarcidin |
| US323001 | 1989-03-17 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP2850132B2 true JP2850132B2 (ja) | 1999-01-27 |
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1995
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1996
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