CZ279196B6 - Protinádorové antibiotikum kedarcidin - Google Patents
Protinádorové antibiotikum kedarcidin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ279196B6 CZ279196B6 CS892256A CS225689A CZ279196B6 CZ 279196 B6 CZ279196 B6 CZ 279196B6 CS 892256 A CS892256 A CS 892256A CS 225689 A CS225689 A CS 225689A CZ 279196 B6 CZ279196 B6 CZ 279196B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ala
- gly
- val
- ser
- thr
- Prior art date
Links
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 3
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 title description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 title description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- RSXFZXJOBQZOOM-WXIIGEIKSA-N kedarcidin Chemical compound O([C@@H]\1COC(=O)C[C@H](C2=CC=C(C(=N2)Cl)O[C@@H]2[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@](C)(O)C3)[C@]34O[C@H]3C#C/C=C/1C#CC4=C2)NC(=O)C=1C(O)=CC2=CC(OC(C)C)=C(C(=C2C=1)OC)OC)[C@H]1C[C@H](O)[C@H](N(C)C)[C@H](C)O1 RSXFZXJOBQZOOM-WXIIGEIKSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000178647 Streptoalloteichus sp. Species 0.000 claims description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 14
- 241000203615 Streptoalloteichus Species 0.000 abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 3
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical group C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 abstract 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 17
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 17
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 13
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 8
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 7
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 4
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000123663 Actinosynnema Species 0.000 description 3
- 241000203790 Kibdelosporangium Species 0.000 description 3
- 241000204057 Kitasatospora Species 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000204098 Saccharothrix Species 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000007613 bennett's agar Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- CDVZCUKHEYPEQS-KPXKHRLBSA-N (2s,3r,4r)-2,3,4,5-tetrahydroxypentanal;(2r,3s,4s)-2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O CDVZCUKHEYPEQS-KPXKHRLBSA-N 0.000 description 2
- 241000187643 Amycolatopsis Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 2
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 2
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 208000008342 Leukemia P388 Diseases 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710204212 Neocarzinostatin Proteins 0.000 description 2
- 241000203622 Nocardiopsis Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000187603 Pseudonocardia Species 0.000 description 2
- 241000203644 Streptoalloteichus hindustanus Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 and mucos Chemical class 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 108700030388 macromomycin Proteins 0.000 description 2
- HXKWEZFTHHFQMB-UHFFFAOYSA-N macromomycin b Chemical compound O1C(=C)C(=O)NC2=C1C=C(OC)C=C2C(=O)OC HXKWEZFTHHFQMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000695 menaquinone group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002816 microbial assay Methods 0.000 description 2
- QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N neocarzinostatin chromophore Chemical compound O1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC)[C@H]1O[C@@H]1C/2=C/C#C[C@H]3O[C@@]3([C@@H]3OC(=O)OC3)C#CC\2=C[C@H]1OC(=O)C1=C(O)C=CC2=C(C)C=C(OC)C=C12 QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 229950009268 zinostatin Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BBBFYZOJHSYQMW-LGDQNDJISA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O BBBFYZOJHSYQMW-LGDQNDJISA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JULNFDXVRPENAR-VFQQELCFSA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2R,3R,4R,5S)-hexane-1,2,3,4,5,6-hexol Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO JULNFDXVRPENAR-VFQQELCFSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHYNEQNPKGIOQF-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydro-2h-phosphole Chemical class C1CC=PC1 JHYNEQNPKGIOQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 241000203809 Actinomycetales Species 0.000 description 1
- 241000187619 Actinopolyspora Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N D-melezitose Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 241001440720 Elanoides Species 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000592889 Glycomyces Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000970318 Lechevalieria aerocolonigenes Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000544912 Melanoides Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- DMINJUFEBITUAM-UHFFFAOYSA-N N1C(=O)NC=2N=CNC2C1=O.NC(=O)N Chemical compound N1C(=O)NC=2N=CNC2C1=O.NC(=O)N DMINJUFEBITUAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- QMYDHJSXOZCPFF-WGGIRBBPSA-N OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O QMYDHJSXOZCPFF-WGGIRBBPSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000187560 Saccharopolyspora Species 0.000 description 1
- 241000204094 Saccharothrix australiensis Species 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187309 Streptomyces roseiscleroticus Species 0.000 description 1
- 241001646644 Streptomyces ruber Species 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 1
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 1
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N melezitose Chemical compound O([C@@]1(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)CO)CO)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000006877 oatmeal agar Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Protinádorové účinné nové antibiotikum kedarcidin, produkované novým mikroorganismem Streptoalloteichus sp. nov., kmen L585-6, ATCC 53650.ŕ
Description
Vynález se týká protinádorového antibiotika kedarcidin, způsobu jeho přípravy a farmaceutického prostředku pro inhibici růstu nádorů, který ho obsahuje. Vynález se také týká biologicky čisté kultury mikroorganismu Streptoalloteichus sp. nov., kmen L585-6, ATCC 53650, který toto antibiotikum produkuje.
Dosavadní stav techniky
Pro stále velkou četnost výskytu nádorových onemocnění se zkoumají stále nové a nové účinné látky k předcházení a k omezování bujení nádorů. Kromě chemoterapeutik se věnuje velká pozornost i antibiotikům, přičemž jsou protinádorově účinnými příkladně antibiotika neocarzinostatin, macromomycin, largomycin, actinoxanthin a AN-7D. Vynález se právě týká nového antibiotika účinného k potírání nádorového onemocnění.
Podstata vynálezu
Podstatou tohoto vynálezu je antibiotikum kedarcidin, které je polypeptidem s následujícím aminokyselinovým řetězcem
X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyr-gly-asn-ala-aka-ile-ser-phe-gly-OH, kde X znamená H-ala-ser, H-ser nebo H, vzhledu špinavě zbarvené pevné látky, o molekulové hmotnosti 12 400 při stanovení elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu, 17 000 při stanovení filtrací na gelu a vysokotlakou kapalinovou chromatografií, se spektrem v ultrafialovém světle podle obr. 1, mající isoelektrický bod 3,65 a připravitelného pěstováním kultury mikroorganismu Streptoalloteichus sp. nov., kmen L585-6, ATCC 53650, produkujícího kedarcidin v prostředí, obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku v submerzní kultuře za aerobních podmínek a následnou izolací antibiotika ze živného prostředí.
Shora uvedené fyzikálně-chemické vlastnosti odlišují nové antibiotikum podle vynálezu od jiných známých peptidových antibiotik s protinádorovou účinností, jako jsou neocarzinostatin, macromomycin, largomycin, actinoxanthin a AN-7D.
-1CZ 279196 B6
Způsob přípravy nového antibiotika kedarcidin spočívá podle vynálezu v tom, že se pěstuje kmen Streptoalloteichus produkující kedarcidin v prostředí, obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku v submerzní kultuře za aerobních podmínek s následnou izolací antibiotika ze živného prostředí, tedy s následným oddělení bílkovin od fermentačního prostředí.
Podstatou vynálezu je také biologicky čistá kultura mikroorganismu Streptoalloteichus sp. nov., kmen L585-6, ATCC 53650, produkující kedarcidin.
Podstatou vynálezu je také farmaceutický prostředek s obsahem protinádorově účinného množství antibiotika kedarcidin a farmaceuticky vhodný nosič.
Při použiti antibiotika podle vynálezu je možno potlačit růst nádorů u hostitele, náležejícího k savcům tak, že se tomuto hostiteli podá množství kedarcidinu, které je dostatečné k dosažení inhibice nádoru.
Spektrum antibiotika kedarcidinu v ultrafialovém světle je znázorněno na obr. 1.
V následujícím popisu budou užity pro jednotlivé aminokyseliny následující zkratky:
as : kyselina asparagová + asparagin thr : threonin ser : serin glx : kyselina glutamová + glutamin asp : kyselina asparagová asn : asparagin glu : kyselina glutamová gin : glutamin pro : prolin gly : glycin ala : alanin val : valin met : methionin ile : isoleucin leu : leucin tyr : tyrosin phe : fenylalanin his : histidin lys : lysin arg : arginin cys : cystein trp : tryptofan
Produkční mikroorganismus, kmen L585-6 byl izolován ve vzorku půdy, odebraném ve státě Maharastra v Indii. Dále budou podrobněji popsány vlastnosti tohoto nového kmene.
Morfologie
Kmen L585-6 je grampositivní, vláknitý organismus, který vytváří vzdušné mycelium. Mycelium v živném prostředí proniká agarem a není fragmentováno. Je možno pozorovat kulovité shluky
-2CZ 279196 B6 hyf s průměrem 5 až 25 pm a vegetativní hyfy. Vzdušné mycelium je dobře rozvětvené a vyvíjí přímé nebo spirální dlouhé hyfy, v nichž se tvoří spory v kontinuálním nebo diskontinuálním řetězci. Shluky krátkých rozvětvených řetězců spor se tvoří převážně na prostředí ISP č. 5. Oba typy spor jsou oválné až krátce válcovité, hladké, nepohyblivé a mají rozměry 0,4 až 0,6 x 1,0 až 2,0 pm.
Po inkubaci 5 až 10 dnů je možno pozorovat na vzdušném myceliu jednotlivé nebo hromadně bezbarvá kulovitá tělíska s průměrem 5 až 20 μιη. Po inkubaci, trvající 3 týdny nebo déle se tato tělíska vyvinou na žlutohnědá sklerotická granula s průměrem 40 až 100 μιη, která jsou pokryta dalšími prodlouženými vzdušnými hyfami.
Růstové vlastnosti
Růst je obvykle mírný, kultura se sacharózou a dusičnany, na agaru s ovesnou se škrobem a minerálními solemi, agaru s tyrosinem a na nikoliv na prostředcích ISP č. 2, 3, 4a Barva vzdušného mycelia je žlutavěbílá. menty se vytvářejí na prostředích IPS č. ttově agaru. Barva vzdušného mycelia melanoidní pigmenty se vytvářejí na prostředích ISP Jiné odlišitelné pigmenty se nevytvářejí.
málo roste na Czapkově agaru moukou a na agaru Vzdušné mycelium se tvoří na agaru s glycerolem a asparaginem, avšak 6 a na Bennettově agaru. Černavé, elanoidní pig2, 3, 4 a 6 a na Benneje žlutavěbílá. Černavé č. 6 a 7.
V následující tabulce I jsou shrnuty vlastnosti nového kmene L585-6 při jeho pěstování na různých živných prostředích.
Tabulka I
Vlastnosti kmene L585-6 v kultuře
Prostředí agar se sacharózou a dusičnanem (Czapek-Dox) bujón s tryptonem a extraktem z kvasnic (IPS č. 1) agar s extraktem z kvasnic se sledem (IPS č. 2) agar s ovesnou moukou (IPS č. 3) vlastnost1 'G : zadný nebo nepatrný
A : žádné
S : bezbarvé
D : žádný
G : mírný, vločkující
A : žádné
S : bezbarvé
D : hluboce žlutohnědý (75)3'
G : mírný
A : žádné
S : tmavěžlutohnědá (78)
D : hluboce žlutohnědý (75)
G : nepatrný
A : žádné nebo nepatrné, bílé
S : bezbarvé
D : žádný
-3CZ 279196 B6
Prostředí vlastnost1)
Tabulka I - pokračování agar s anorganickými solemi a škrobem (IPS č. 4) agar s glycerolem a asparaginem (IPS č. 5) agar s peptonem, extraktem z kvasnic a železem (IPS č. 6) agar s tyrosinem (IPS č. 7) agar s glukózou a asparaginem
Bennettův agar
G : nepatrný
A : žádné nebo nepatrné, bílé
S : bezbarvé
D : žádný
G : mírný
A : mírné, žlutobílé (92)
S : bezbarvé
D : žádný
G : mírný
A : žádné
S : světlešedavěžlutavěhnědé (79)
D : hnědočerný (65)
G : mírný
A : bohaté, žlutavěbílé (92)
S : černé
D : černý
G : špatný
A : žádné
S : tmavěoranžověžluté (72)
D : žádný
G : mírný
A : žádné nebo nepatrné, bílé
S : tmavěšedavěžlutavěhnědé (81)
G : mírně žlutavěhnědý (77).
Vysvětlivky :
růst byl pozorován po inkubaci tři týdny při 28 °C 2) G = růst, A = vzdušné mycelium, S = mycelium v substrátu, D =pigment, schopný difúze.
3) barva a číslo v závorkách odpovídají označení podle ISCC-NBS.
Fyziologické vlastnosti
Optimální růst je v rozmezí 30 až 35 °C, schopnost růstu v rozmezí 18 až 39 °C. K růstu nedochází při 15 a 41 °C, ani v prostředí s více než 5 % chloridu sodného. Želatina je zkapalňována, škrob není hydrolyzován. Z 25 cukrů se využívá pouze D-ribosa a D-glukosa. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách II a III.
-4CZ 279196 B6
Tabulka II
Fyziologické vlastnosti kmene L585-6
Hydrolýza: Využití:*2
| želatina škrob : rozpustný škrob bramborový škrob | + | L-rhamnosa D-glukosa D-galaktosa D-fruktosa | + |
| koagulace mléka | + | D-mannosa | — |
| peptonisace | + | L-sorbosa | - |
| Produkce : | sacharosa | ||
| reduktázy nitrátu | - nebo | laktosa | - |
| + (w)*1 | cellobiosa | - | |
| tyrosinásy | + | melibiosa | - |
| tolerance vůči : | trehalosa | — | |
| lysozymu 0,01 g/100 ml | + | rafinosa | - |
| NaCl, 1 až 4 g/100 ml | + | D-melezitosa | - |
| 5 g/100 ml | - | rozpustný škrob | - |
| pH 5 až 11,0 | + | celulosa | - |
| 4,5a 12 | - | dulcitol | - |
| inositol | — | ||
| D-mannitol | - | ||
| růstová oblast 18 až 39 °C | D-sorbitol | - | |
| žádný růst 15 a 41 °C | salicin | - | |
| optimální růst 30 až 35 °C | glycerol | - |
D-arabinosa L-arabinosa D-xylosa
D-ribosa + y· Ί * * x Produkce reduktazy nitrátu je negativní na Czapkově bujónu se sacharosou a nitrátem, je však positivní v bujónu s peptonem a nitrátem
Y O X o XX
Zkoušky na využiti cukru byly prováděny v základním prostředí, kterým je pro toto použití Pridhem-Gottliebovo prostředí (IPS č. 9)
V následující tabulce jsou popsány další fyziologické vlastnosti kmene L585-6. Tyto zkoušky byly prováděny způsobem podle publikace Gordon a další, J. Gen. Microb., 1978, 109, 69-78.
-5CZ 279196 B6
Tabulka III
Další fyziologické vlastnosti kmene L585-6
Hydrolýza : produkce kyseliny z :
| adeninu kaseinu esculinu kyseliny hippurové hypoxanthinu tyrosinu močoviny xantinu | + + + + | glyceronu D-arabinosy L-arabinosy D-xylosy L-rhamnosy D-glukosy D-mannosy laktosy cellobiosy | + | |
| Přežití | při 50 °C, | |||
| 8 hod. | - | melibiosy | - | |
| trehalosy | — | |||
| Využití | rafinosy | - | ||
| benzoátu | - | D-melezitosy | - | |
| citrátu | - | inositolu | - | |
| mukánu | - | D-mannitolu | - | |
| sukcinátu | + | D-sorbitolu | - | |
| tartrátu | - | erythritolu | - | |
| adonitolu | - | |||
| methyl a-glukosidu | - |
Chemie buněčné stěny
Buněčná stěna kmene L 585-6 byla zkoumána způsobem podle publikací Becker a další, Appl. Microbiol. 13, 236 až 243 (1965), Yamaguchi, J. Bacteriol. 89, 444 až 453 (1965) a Lechevalier a Lechevalier, Biology of the Actinomycetes and Related Organismus 11, 78 až 92, (1976). Peptidoglykan buněčné stěny obsahuje kyselinu meso-diaminopimelovou. Z cukrů jsou obsaženy galaktosa, glukosa a ribosa. Jde tedy o buněčnou stěnu typu IIIq. Fosfolipidy jsou typu Ρ-ΙΙ a obsahují fosfatidylethanolamin, fosfatidylglycerol a fosftatidylinositol. Hlavními menachinony jsou MK-9(H4) a MK-9(Hg). Test na glykolát je negativní.
Taxonomie
Z rodů Actinomycetales s dlouhými řetězci spor je možno Pseudonocardia, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Streptomyces, Actinomadura, Glycomyces, Nocardiopsis a Amycolata jasně odlišit od kmene L585-6 pokud jde o buněčnou chemii, zejména typ buněčné stěny, buněčné cukry, fosfolipidy a menachinony. Kibdelosporangium, popsané v publikaci Shearer a další, Int. J. Syst. Bacteriol. 36, 47 až 54 (1986), Kitasatosporia, popsaná v publikaci Takahashi a další, J. Gen. Appl. Microbiol. 30, 377 až 387
-6CZ 279196 B6 (1984), a Amycolatopsis podle publikace Lechevalier a další, Int. J. Syst. Bacteriol., 36, 29 až 37 (1986) jsou příbuzné kmeni L585-6, pokud jde o složení fosfolipidů a menachinonů, avšak Kibdelosporangium a Amycolatopsis se liší přítomností arabinosy v cukrech buněčné stěny a Kitasatosporia přítomností kyseliny LL-diaminopimelové a mezodiaminopimelové v buněčné stěně. Mimoto Kibdelosporangium nese tělíska, obalující hyfy a opatřená pravou membránou a Kitasatosporia vytváří submersní spory. Tyto unikátní struktury nejsou u kmene L585-6 pozorovány. Chemotaxonomicky jsou Streptoalloteichus podle publikace Tomita a další, Int. J. Syst. Bacteriol., 37, 211 až 213 (1987), Actinosynnema podle publikace Hasegawa a další, Int. J. Syst. Bacteriol., 28, 304 až 310 (1978) a Saccharothrix podle publikace Labeda a další, Int. J. Syst. Bacteriol., 34, 426 až 431, (1984), nejpříbuznější kmeni L585-6. Actinosynnema vytváří vzdušné řetězce spor na vrcholu synnematu. Saccharothrix vytváří řetězce fragmentovaných tělísek ve vegetativním i vzdušném myceliu a nevytváří shluky krátkých řetězců spor nebo sklerotická granula. Morfologie řetězců fragmentovaných prvků u Saccharothrix australiensis a S. aerocolonigenes podle publikace Labeda, Int. J.Syst. Bacteriol., 36, 109 až 110 (1986) jsou příbuzné řetězcům u Nocardiopsis, avšak není příbuzná žádné čeledi Streptomyces. To znamená, že kmen L585-6 není možno přiřadit ani k Actinosynnema ani k Saccharothrix.
Streptoalloteichus hindustanus nese dlouhé spirální řetězce arthrospor, rozvětvené krátké řetězce spor, sklerotická granula ve vzdušném myceliu a kulovité shluky hyf a mimo to malá, sporangiím podobná tělíska, z nichž se vytváří ve vegetativním myceliu 1 až 4 spory s bičíky. Kmen L585-6 vytváří malé inkluse, podobné sporangiím. Stejně jako Streptoalloteichus vytváří kmen L585-6 kulovitá tělíska, která se vyvíjí na sklerotická granula. Tuto strukturu je možno pozorovat u celé řady čeledí Streptomyces, například u S, kanamyceticus podle publikace Shirling a další, Int. J. Syst. Bacteriol., 22, 265 až 394 (1972) a S. roseiscleroticus (Chainia rubra) podle téže publikace.
Na základě svrchu uvedených srovnávacích studiích byl kmen L585-6 zařazen do rodu Streptoalloteichus. Kmen L585-6 se liší od Streptoalloteichus hindustanus v nepřítomnosti vzdušného mycelia na IPS prostředích 2,3 a 4 a na Bennettově agaru, tvorbou melaninu, neschopností hydrolyzovat škrob, neschopností růst při teplotě 41 °C a také tím, že z 25 zkoumaných cukrů využívá pouze D-ribosu a D-glukosu. Z uvedeného důvodu je kmen považován za novou čeleď rodu Streptoalloteichus.
Biologicky čistá kultura kmene L585-6, náležející do rodu Streptoalloteichus byla uložena ve veřejné sbírce kultur Američan Type Culture Collection (Rockville, MD) a zařazena pod číslem ATCC 53650.
Produkce antibiotika
Protinádorové antibiotikum podle vynálezu je možno získat tak, že se pěstuje kmen L585-6 nebo jeho mutanta v submerzní kultuře ve vodném živném prostředí. Organismus se pěstuje v živném prostředí, které obsahuje využitelný zdroj uhlíku, například využitelný uhlohydrát. Příkladem vhodného zdroje uhlíku
-7CZ 279196 B6 může být cerelosa a glycerol. Živné prostředí by mělo obsahovat také využitelný zdroj dusíku, například rybí moučku, extrakt z kvasnic nebo amonné soli. V případě potřeby je možno přidat také anorganické soli, například chlorid sodný, chlorid draselný, síran hořečnatý, uhličitan vápenatý, fosfáty a podobně. Mimoto je možno přidávat také stopové prvky jako měd’, mangan, železo, zinek a podobně, tyto prvky však mohou být přítomny také jako nečistoty v jiných i jakékoliv například a zvláště neutrálním biotika se malého lahvích nebo kulturu na pevném prostředí, avšak při výrobě většího množství je výhodnější mikroorganismus kultuře za aerobních podmínek ve sterilním fermentace je žádoucí nejprve připravit materiál v živném bujónu jeho naočkováním mladé vegetativní kultury se tento očkovací materiál asepticky přenese do prostředí ve fermentačním tanku. Mimoto je možno živné prostředí míchat mechanickým způsobem. Je také možno přidávat protipěnivá činidla, například silikonový nebo jiný olej.
složkách teplotě, 18 27 až až živného prostředí, při °C, °C.
se provádí při schopen růst, je však 25 až 35 °C výhodou se fermentace provádí při 4 až 8 dnů. Optimální produkce antipo 5 až 6 dnech. Pro výrobu poměrně je možno užít kulturu v třepacích
Inkubace níž je produkční kmen výhodné rozmezí S pH a obvykle trvá obvykle dosahuje množství antibiotika pěstovat v submersní tanku. V případě této vegetativní očkovací sporami a po dosažení
Produkci antibiotika kedarcidinu ve fermentačním prostředí je možno v průběhu fermentace snadno sledovat mikrobiální zkouškou při použití Bacillus subtilis jako zkušebního organismu nebo je možno provádět pokusy na buněčnou cytotoxicitu při použití nádorových buněčných linií, a to myšího původu (B16-F10) nebo lidského původu (například HCT-116, KB).
Je zřejmé, že vynález není možno omezit na použití zvláště výhodného kmene L585-6 tak, jak byl svrchu popsán nebo na použití organismů, které plně odpovídají svrchu uvedenému popisu. Je zřejmě nutné zahrnout i jiné kmeny nebo mutanty uvedeného organismu, produkující kedarcidin, získané běžným způsobem, například ozářením rtg-paprsky, ulrafialovým světlem, působením vystavení působení fágu a podobně.
Izolace a čištění antibiotika
Protinádorové antibiotikum podle vynálezu je bílkovina a je tedy možno jej izolovat z fermentačního prostředí při použití běžných způsobů pro izolaci bílkovin, jako jsou diolýza, ultrafiltrace, filtrace na gelu, srážení v isoelektrickém bodu, srážení působením solí, elektoforézou, chromatografii na iontoměniči nebo afinitní chromatografií. Obvykle se užívá několika těchto postupů po sobě k vyčištění antibiotika do vysokého stupně. Izolaci a čištění je možno sledovat mikrobiologicky, například při použití B. subtilis, sledováním cytotoxicity in vitro proti nádorovým buněčným liniím myšího nebo lidského původu, zkouškami na protinádorovou účinnost in vivo nebo fyzikálními postupy, například v ultrafialovém světle nebo vysokotlakou kapalinovou chromatograf ií. V následujícím schématu I je uveden typický čisticí postup. Tento postup je uveden pouze pro ilustraci a každý odborník jej může pozměnit nebo užít jiný postup, pokud má získaná bílkovina vysokou čistotu a uchová si svou biologickou účinnost.
-8CZ 279196 B6
Schéma I
Izolace a čištění bílkoviny fermentační prostředí mycelium filtrát
| aniontoměnič | ||
| pufr | pufr + 1 M NaCl |
eluát eluát eluát filtrace na gelu eluát preparativní aniontoměnič čištěný roztok bílkoviny lyofilizace čištěná bílkovina
Při postupu podle schématu I se celé fermentační prostředí odstředí nebo zfiltruje. Při filtraci je možno užít pomocný prostředek, například Dicalite. Potom se filtrát podrobí chromátografii na aniontoměniči, přičemž jako eluční činidlo se užije kationtový pufr s pH 7 až 8, potom se užije téhož pufru s obsahem chloridu sodného. Vhodný kationtový pufr pro tuto oblast pH je například tris-pufr s kyselinou chlorovodíkovou. Frakce, získaná při použití pufru s obsahem chloridu sodného se odebere, zahustí a dále čistí filtrací na gelu při použití téhož kationtového pufru. Frakce se shromažďují a zkouší se na přítomnost účinné složky. Vhodným počátečním systémem pro sledování eluátu je zkouška proti Bacillus subtilis. Ty frakce, které vytvářejí inihibiční zónu se slijí, zahustí se a potom se dále čistí chromatografií na aniontoměniči, přičemž jako eluční činidlo se nejprve užije kationtový pufr o pH 7 až 8 a potom se pokračuje se zvyšující se iontovou silou. Účinné frakce se zkouší na homogenitu elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným (SDS-PAGE), sledováním isoelektrického bodu a vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Frakce, které jsou homogenní se slijí a potom se lyofilizují, čímž je možno získat vysoce čistou bílkovinu.
Antibiotikum
Kedarcidin je vysoce účinné bílkovinné protinádorové antibiotikum, které sestává z polypeptidu s jediným řetězcem
-9CZ 279196 B6 a z nebílkovinného chromoforu. Přestože vzorky antibiotika, které byly podrobeny fyzikálně-chemickým zkouškám a biologickým pokusům, byly považovány za homogenní při sledování pomocí SDS-PAGE, zjišťováním isoelektrického bodu a vysokotlakou kapalinovou chromatografii, v průběhu dalších pokusů při analýze řetězce bylo prokázáno, že se antibiotikum skládá z hlavní složky a dvou menších složek. Tyto složky se od sebe liší počátečním N-terminálním řetězcem aminokyselin z polypeptidu, jak bude dále popsáno. K dosažení protinádorového účinku není zapotřebí oddělovat nebo izolovat jednotlivé složky.
Vynález zahrnuje také ty varianty kedarcidinu, v nichž je peptidová část pozměněna známým způsobem za vzniku fragmentů a derivátů, a to vypuštěním, přidáním nebo náhradou některých aminokyselin v průběhu primární řetězce peptidu, aniž by přitom došlo ke změně protinádorové účinnosti.
Složení aminokyselin
Při použití standardních známých postupů bylo stanoveno složení aminokyselin v čištěné bílkovině a toto složení je shrnuto v následující tabulce IV.
Tabulka IV
Obsah aminokyselin v kedarcicinu výtěžek zbytky
| nmol | mol % | (a) | (b) | ||
| asp | 2,765 | 8,1 | 10,1 | 9,3 | (6) |
| asn | (3) | ||||
| thr | 3,18 | 9,3 | 11,6 | 10,6 | (11) |
| ser | 3,163 | 9,3 | 11,5 | 10,6 | (12) |
| glu | (4) | ||||
| 1,928 | 5,7 | 7,0 | 6,5 | ||
| gin | (2) | ||||
| pro | 1,615 | 4,7 | 5,9 | 5,4 | (4) |
| giy | 5,529 | 16,2 | 20,1 | 18,5 | (18) |
| ala | 5,566 | 16,3 | 20,3 | 18,6 | (18) |
| val | 3,731 | 11 | 13,6 | 12,5 | (13) |
| met | 0,2873 | 0,8 | 1,1 | 1,0 | (1) |
| ile | 0,8531 | 2,5 | 3,1 | 2,9 | (3) |
| leu | 1,298 | 3,8 | 4,7 | 4,3 | (4) |
| tyr | 0,6274 | 1,8 | 2,3 | 2,1 | (2) |
| phe | 1,565 | 4,6 | 5,7 | 5,2 | (5) |
| his | 0,6235 | 1,8 | 2,3 | 2,1 | (1) |
| lys | 0,3196 | 0,9 | 1,2 | 1,1 | (0) |
| arg | 1,001 | 2,9 | 3,7 | 3,3 | (3) |
| cys | 0 | 0 | 0 | 0 | (4) |
| trp | 0 | 0 | 0 | 0 | (0) |
(a) Počet zbytků v peptidu za předpokladu, že molekulová hmotnost peptidu je 12 000.
-10CZ 279196 B6 (b) Počet zbytků v peptidu při celkovém počtu 114 zbytků. Hodnoty v závorkách jsou počty zbytků v peptidu, stanovené analýzou řetězce aminokyselin.
Řetězec aminokyselin
Pro analýzu aminoterminálního zakončení byl kedarcidin redukován 2-merkaptoethanolem a potom dále čištěn na 15 % SDS-PAGE a izolován z gelu elektroelucí nebo elektroblokovou reakcí.
Pro většinu enzymatických štěpení byl kedarcidin použit bez dalšího čištění. Kedarcidin byl potom redukován 20 mM dithiothreitolu ve 100 μΐ 0,4 M tris-HCl o pH 8,5 s obsahem 6 M guanidinhydrochloridu, 0,1 % sodnou solí EDTA 2 hodiny při teplotě 50 °C, potom byl S-pyridylethylován působením 100 mM 4-vinylpyridinu přes noc při teplotě místnosti. Reakce byla zastavena přidáním 10 μΐ 2-merkaptoethanolu na 1 hodinu při teplotě 50 °C. Reakční složky byly odstraněny dialýzou proti kyselině octové o koncentraci 5 % objemových na 24 hodin a modifikovaný kedarcidin byl sušen v rotačním odpařovači (Savant Instruments).
Enzymatické štěpení S-pyridylethylovaného kedarcidinu enzymem ASP-N nebo proteázou V8 ze S. aureus bylo prováděno ve 40 μΐ 0,1 M tris-pufru s kyselinou octovou o pH 8,0 s obsahem 0,7 M močoviny při teplotě 37 °C přes noc při použití poměru enzymu k substrátu 1 : 100 v případě ASP-N nebo 1 : 10 v případě proteázy V8. Štěpení trypsinem bylo prováděno ve 40 μΐ 0,1 M tris-pufru s kyselinou octovou o pH 8,0 při teplotě 37 “C přes noc při poměru enzymu k substrátu 1 : 20. Materiál potom byl okyselen kyselinou trifluoroctovou (TFA) na pH 2,0 a oddělen vysokotlakou kapalinovou chromatografií v reversní fázi.
Čištění peptidu vysokotlakou kapalinovou chromatografií v reverzní fázi bylo prováděno na dělicím systému 130 A (Applied Biosystems, lne.) při teplotě 40 °C při použití sloupce RP-300 s rozměrem 2,1 x 100 mm (Applied Biosystems, lne.). K eluci byl použit lineární gradient z acetonitrilu od 0,1 % TFA ve vodě na počátku eluce až do 60 % acetonitrilu s 0,080 % TFA. Peptidy byly odebírány ručně. Stanovení řetězce aminokyselin bylo prováděno na automatickém zařízení pro analýzu aminokyselin při použití standardního postupu (Model 475 A, Applied Biosystems, lne.).
Hlavní složka polypeptidu sestává ze 114 zbytků aminokyselin. Tyto zbytky po sobě následují v následujícím pořadí :
-11CZ 279196 B6
N-terminální zakončení
H-ala-ser-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cis-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH
C terminální zakončení
Bylo možno identifikovat dvě menší složky, z nichž v jedné chybí první zbytek alaninu, který se nachází v hlavní složce a ve druhé chybí první dva zbytky, tj. zbytek alaninu a šeřinu.
Stanovení molekulové hmotnosti
a) Filtrací na gelu a vysokotlakou kapalinovou chromatografií
Při použití sloupce TSK-G2000 SW s rozměrem 7,5 x 300 mm (LKB Produkter AB, Švédsko) byla prováděna filtrace na gelu při použiti 50 mM tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou s obsahem 0,5M NaCl o pH 7,4 při rychlosti průtoku 0,5 ml/za minutu. Je také možno užít sloupec 1-125 (Waters Associates Protein) při použití 0,2M tris-pufru s kyselinou octovou při rychlosti průtoku 1 ml/min. Molekulová hmotnost byla stanovena z referenční křivky, získané při použití standardních značících látek (Bio Rad Laboratories) a stanovená hodnota je 17 000.
b) Postup s použitím elektroforézy na polyakrylaminovém gelu s dodecylsíranem sodným
Vzorek bílkoviny a látek pro označení molekulové hmotnosti (Diversified Biotech., Maine) se smísí se stejným objemem Seprasolu (kapalina pro rozpouštění bílkovin, obsahující sacharózu a barvivo) a směs se zahřívá těsně před prováděním elektroforézy tři minuty na 90 °C. Elektroforéza se provádí při 300 v v prostředku Seprabuff (tris-glycin-SDS, o pH 8,3) tak dlouho, až barvivo dosáhne dna gelu. Potom se gel ponoří do barvicího roztoku (1,25 g Comassie BB R-250, 92 ml ledové kyseliny octové v 908 ml vodného methanolu) na alespoň 20 hodin, potom se ponoří do odbarvovacího roztoku (75 ml kyseliny octové a 50 ml methanolu v 875 ml vody) na tak dlouhou dobu, až se gel stane průsvitným. Seprasol a Seprabuff vyrábí Integrated Separation Systém, Massachusetts. Takto stanovená molekulová hmotnost je 12 400.
Stanovení isoelektrického bodu
Gel pro použití byl připraven smísením následujících složek:
29,1 % akrylamidu ve vodě 10 ml
0,9 % N,N'-methylen-bis-akrylamid ve vodě 10 ml
-12CZ 279196 B6 glycerol
1802 Ampholin o pH 2,5 - 4 voda ml ml do 60 ml
Výsledný roztok se 10 minut zbavuje plynů a potom se k němu přidá 1,5 ml 1% persiranu amonného ve vodě a 10 μΐ Ν,Ν,Ν'Ν'tetramethylethylendiaminu. Směs se vlije do formy a nechá se polymerovat. Roztokem pro elektrody je 1M kyselina fosforečná pro anodu a 2% 1809 Ampholine o pH 6 až 8 pro katody. Pokus se provádí při 25 W celkem 2 hodiny. Získaná hodnota odpovídá hmotnosti v gramech/100 ml. Isoelektrický bod byl 3,65, vzdálenost od katody 6,25 cm.
Biologická účinnost
Protinádorová účinnost bílkoviny byla vyhodnocena proti transplantovatelné myší leukémii P388. Myším kmene CDFg bylo transplantováno intraperitoneálně (ip) nebo nitrožilně (iv) vždy 106 buněk leukémie P388, získaných od myší DBA/2 s transplantovatelnou leukémií. V případě intraperitoneálně implantované leukémie se myším stejnou cestou podá bud’ fyziologický roztok kuchyňské soli v případě kontrolní skupiny, nebo kedarcidin jednou denně 5 dní po sobě od prvního dne po naočkování nádoru. V případě leukémie, naočkované nitrožilně se myším podá stejnou cestou kedarcidin prvního, třetího a pátého dne po implantaci. Všechna zvířata se denně pozorují a uhynutí se zaznamenává. Pro všechny skupiny od dne implantace do dne posledního ošetření se také zaznamenává změna hmotnosti, změny se připisují toxicitě antibiotika. Zaznamenává se také přežití v každé skupině pátého dne po naočkování jako další možná známka toxicity. V případě, že alespoň jedna myš uhynula do pátého dne, nebyla léčba považována za účinnou. Ve skupině bylo 4 nebo 6 myší, v kontrolní skupině 10 myší. Počet myší přežívající 30 dne byl také zaznamenán. Na konci celého pokusu byla pro každou skupinu stanovena průměrná doba přežití (MST) a tato hodnota byla použita k výpočtu % T/C, což je poměr MST v pokusné skupině k MST kontrolní skupiny, násobený stem. Hodnota % T/C vyšší než 125 nebo alespoň 125 je důkazem vysoké protinádorové účinnosti. Údaje, získané při pokusech in vivo jsou uvedeny v následujících tabulkách IV a V.
-13CZ 279196 B6
Tabulka IV
Protinádorová účinnost proti leukémii P388, implantované ip
| skupina | dávky3 ředění nebo mg/kg/inj | střední doba přežití (dny) |
| D16F411 | 1 : 40 | 7,0 |
| 1 : 80 | 10,0 | |
| 1 : 160 | 12,5 | |
| 1 : 320 | 18,5 | |
| kontrola | 9,5 | |
| D18F413 | 0,27 | 7,0 |
| 0,09 | 15,0 | |
| 0,03 | 17,0 | |
| 0,01 | 15,0 | |
| D18G414b) | 0,09 | 9,5 |
| 0,03 | 15,5 | |
| 0,01 | 14,5 | |
| 0,0033 | 14,0 | |
| kontrola | 10,0 |
| % T/C | průměrná změna hmotnosti (g) | počet živých myší 5. dne |
| 74 | -1,9 | 4/4 |
| 105 | -1,2 | 4/4 |
| 132 | -i,o | 4/4 |
| 195 | -1,9 | 4/4 |
| — | 0,2 | 10/10 |
| 70 | -1,9 | 4/6 |
| 150 | -0,8 | 6/6 |
| 170 | -1,7 | 6/6 |
| 150 | -0,3 | 6/6 |
| 95 | -1,3 | 6/6 |
| 155 | -1,2 | 6/6 |
| 145 | -0,5 | 6/6 |
| 140 | -0,2 | 6/6 |
| — | 0 | 10/10 |
a) účinná látka byla podána ip jednou denně pět po sobě jdoucích dní od prvního dne po naočkování.
b) Lyofilizovaný a rekonstituovaný prostředek z téhož vzorku jako pro skupinu D17F413.
Tabulka V
Protinádorová účinnost proti leukémii P388, implantované iv skupina dávky3střední % T/C průměrná počet živých ředění doba pře- změna myší 5. dne nebo žití (dny) hmotnosti mg/kg/inj (g)
| D18F413 | 0,32 | 6,0 | 75 | -3,1 | 6/6 |
| 0,16 | 7,5 | 94 | -3,2 | 6/6 | |
| 0,08 | 11,0 | 138 | -1,4 | 6/6 | |
| 0,04 | 12,5 | 156 | -0,6 | 6/6 | |
| 0,02 | 10,0 | 125 | 0,1 | 6/6 | |
| 0,01 | 8,0 | 100 | 1,2 | 6/6 |
-14CZ 279196 B6
Tabulka V - pokračování
| skupina | dávkya ) ředění nebo mg/kg/inj | střední doba přežití (dny) | % T/C | průměrná změna hmotnosti (g) | počet živých myší 5. dne |
| D16F411 | 1 : 25 | 7,0 | 88 | -2,9 | 6/6 |
| 1 : 50 | 10,5 | 131 | -1,6 | 6/6 | |
| 1 : 100 | 13,0 | 163 | 1,2 | 6/6 | |
| 1 : 200 | 9,5 | 119 | -0,2 | 6/6 | |
| 1 : 400 | 9,0 | 113 | 0,5 | 6/6 | |
| 1 : 800 | 8,0 | 100 | 0,8 | 6/6 | |
| kontrola | 8,0 | - | - | 10/10 |
a) účinná látka byla podána nitrožilně prvního, třetího a pátého dne po naočkování nádoru.
Kedarcidin byl také vyhodnocen proti myšímu melanomu B16, který byl implantován intraperitoneálně při použití 0,5 ml 10% suspenze nádoru. Pro každou dávku bylo použito 10 myší. Účinná látka byla podávána intraperitoneálně jednou denně celkem devět po sobě následujících dnů od prvního dne po naočkování nádoru. Byl zaznamenán počet myší, které byly na živu 10. dne a na konci pokusu 60. dne. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce VI. Hodnoty % T/C 125 nebo vyšší znamenají vysokou protinádorovou účinnost.
Tabulka VI
Protinádorová účinnost kedarcidinu proti melanomu B16, implantovanému ip
| dávka (mg/kg) | MST (d) | % T/C | průměrná změna hmotnosti (g) | počet živých myší 5. (60. ) dnex |
| 0,256 | 16,0 | 97 | “2,7 | 9/10 |
| 0,128 | 24,5 | 148 | -1,3 | 10/10 |
| 0,064 | 26,5 | 161 | 0,3 | 10/10 |
| 0,032 | 31,5 | 191 | 1,0 | 10/10 |
| 0,016 | 32,5 | 197 | 0,6 | 10/10 |
| 0,008 | 34,0 | 206 | 0,6 | 9/10 |
| 0,004 | 27,0 | 164 | 0,3 | 10/10 (1) |
| 0,002 | 21,5 | 130 | 0 | 10/10 |
| kontrola | 16,5 | - | 1,3 | |
| x číslo v | závorce | znamená počet | myší, které | byly na živu 60. dne |
po naočkování nádoru.
-15CZ 279196 B6
Výsledky, uvedené v tabulkách IV, V a VI ukazují, že antibiotikum kedarcidin je účinná látka s vysokou protinádorovou účinností in vivo proti leukémii P388 a melanomu B16 u myší. Antibiotikem prodloužilo přežití v případě intraperitoneální implantace melanomu B16 a v případě intraperitoneální a nitrožilní transplantace leukémie P388, nitrožilní forma se obtížněji léčí, protože je rozesetá po organismu. Kedarcidin byl potom vyhodnocen také proti podkožně naočkovanému melanomu B16, myšímu plicnímu nádoru M5076 a intrakraniálně implantované leukémii P388, na těchto pokusných modelech však nebylo možno prokázat významnou účinnost.
Antibiotikum kedarcidin je možno zpracovat na běžné lékové formy, které obsahují účinné množství antibiotika s inertním, z farmaceutického hlediska přijatelným nosičem nebo ředidlem. Tyto prostředky mohou obsahovat ještě další látky s protinádorovým účinkem a mohou mít jakoukoliv formu, vhodnou pro zvolený způsob podání. Příkladem těchto prostředků mohou být pevné prostředky pro perorální podání jako tablety, kapsle, pilulky, prášky a granula, kapalné prostředky pro perorální podání, například roztoky, suspenze, sirupy nebo elixíry a prostředky pro parenterální podání, jako sterilní roztoky, suspenze nebo emulze. Je možno je zpracovat také na sterilní pevné prostředky, které je možno rozpustit ve sterilní vodě, fyziologickém roztoku chloridu sodného nebo jiném sterilním prostředí pro injekční podání těsně před použitím.
Pro použití jako protinádorové látky je možno snadno stanovit optimální dávkování a způsob podávání pro jakéhokoliv savce. Velikost dávky závisí na typu použitého prostředku, na způsobu podávání, na stavu ošetřovaného a na závažnosti onemocnění. Je nutno brát zřetel na četné faktory, které mohou modifikovat působení účinné látky, například věk, hmotnost, pohlaví, typ stravy, doba podání, způsob podání, způsob a rychlost vyměšování, stav nemocného, kombinace účinných látek na přecitlivělost a závažnost onemocnění.
Vynález objasňují následující příklady, které vynález nijak neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava vegetativní kultury kmene Streptoalloteichus L585-6
Kmen Streptoalloteichus L585-6 (ATCC 53650) byl udržován a přenesen do zkumavek na šikmý agar s extraktem z kvasnic a sladu, který sestává z následujících složek:
destrosa extrakt z kvasnic extrakt ze sladu CaCO3 agar destilovaná voda
4,0 g
4,0 g
10,0 g
1,5 g g
do 1 litru
-16CZ 279196 B6
Při každém přenosu byl šikmý agar inkubován dva týdny při teplotě 28 °C. Vegetativní kultura byla připravena přenesením materiálu z povrchu šikmého agaru do Erlenmayerovy baňky o objemu 500 ml s obsahem 100 ml sterilního živného prostředí následujícího složení :
| cerelosa (Corn Products) | 30 g |
| Pharmamedia (Traders Oil Milí Co. | ) 10 g |
| Nutrisoy (Archer Daniels | |
| Midland CO.) | 10 g |
| CaCO3 | 3 g |
| destilovaná voda | do 1 litru |
Tato vegetativní kultura byla inkubována při teplotě 28 °C celkem 72 hodin na rotační třepačce při 250 výkyvech za minutu.
Příklad 2
Fermentace v třepacích lahvích ml vegetativní kultury z příkladu 1 se užije k naočkování 500 ml Erlenmeyerových baněk, z nichž každá obsahuje 100 ml produkčního živného prostředí následujícího složení:
glycerol 30 g Pharmamedia 10 g lihovarské výpalky (Nutrition
Product Co.) 15 g rybí moučka (Manhaden) 10 g CaCO3 6 g destilovaná voda do 1 litru
Produkční kultura se inkubuje při teplotě 28 °C na rotační třepačce při 250 výkyvech za minutu. Produkce antibiotika se sleduje mikrobiální zkouškou použití B. subtilis a zkouškou na cytotoxicitu in vitro při použití buněčné linie myšího melanomu B16-F10 a lidských nádorových buněčných linií. Optimální produkce bylo obvykle dosaženo v rozmezí 144 až 168 hodin.
Příklad 3
Fermentace v tancích ml vegetativní kultury z příkladu 1 se naočkuje do baněk s objemem 2 litry a s obsahem 500 ml téhož vegetativního prostředí. Očkovací kultura z tohoto druhého stupně se dále inkubuje 72 hodin při teplotě 28 °C na rotační třepačce při 250 výkyvech za minutu. 500 ml této kultury se potom užije k naočkování fermentoru o objemu 16 litrů (New Brunswick Microgen) s obsahem 10 litrů produkčního prostředí se složením, uvedeným v příkladu 2. Fermentace se provádí při teplotě 28 °C při provzdušnění jedním objemem za minutu a při míchání 250 výkyvy za minutu. Produkce antibiotika kedarcidinu se sleduje příslušnými biologickými pokusy in vitro.
-17CZ 279196 B6
Příklad 4
Izolace a čištění kedarcidinu litrů surového fermentačního prostředí se smísí s 6 litry Dicalitu a výsledná řídká emulze se zfiltruje přes vrstvu Dicalitu. Nerozpustný podíl se odloží a filtrát se čerpadlem prohání iontoměničovou pryskyřicí Zeta Prep 250 QAE v obchodně dodávaném sloupci (LKB-Produkter AB, Švédsko) rychlostí 30 ml za minutu. Sloupec se předem uvede do rovnovážného stavu použitím 2 litrů 50 mM tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,4. Eluát se shromažďuje. Sloupec se potom promyje shora uvedeným pufrem,a to nejprve 1 litrem téhož pufru a potom 500 ml téhož pufru s obsahem 0,5 M chloridu sodného. Eluát se odebírá a zahustí z 500 ml na 100 ml při použití standardní ultrafiltrační komůrky (Amicon), opatřené membránou (Amicon YM5). Koncentrovaný roztok se potom nechá projít sloupcem o rozměru 5 x 10 cm s náplni 14 000 ml gelu Ultrogel AcA54 (LKB-Produkter AB, Švédsko) ve stejném objemu 50 mM tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou. Ultrogel se uvede do rovnovážného stavu před průchodem zkoumaného materiálu použitím 5 litrů 50 mM tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,4. Sloupec se vymývá 2 litry téhož pufru rychlostí 60 ml/min. Nejprve se nechá projít 450 ml eluátu, potom se odebírají frakce s objemem 10 ml a každá z nich se zkouší proti B. subtilis. Ty frakce, které poskytují inhibiční zóny, tj. 83 až 133 se lijí a potom zahustí ulrafiltrací na objem 100 ml. Koncentrovaný roztok se nechá projít sloupcem s rozměrem 2,5 x 15 cm s náplní suspenze 70 ml iontoměniče DEAE Trisacryl (LKB-Produkter AB, Švédsko) ve stejném objemu 50 mM tris-HCl-pufru. Vrstva Trisakrylu se uvede do rovnovážného stavu desetinásobným objemem téhož pufru. Naplněný sloupec se nejprve promyje 10 objemy téhož pufru, potom se užije 300 ml lineárního gradientu (stoupání = 0,1 M/h. ) od 100% svrchu uvedeného pufru téhož složení s 0,5 M chloridu sodného při rychlosti průtoku 60 ml/h. Odebere se celkem 47 frakcí po 5 ml, frakce se zkouší proti B. subtilis. Účinné frakce 25 až 37 se slijí a podrobí analytické filtraci na gelu a vysokotlaké kapalinové chromatografii při použití sloupce Waters Protein Analysis column 1-125 při použití 0,2 M tris-pufru s acetátem o pH 7,0 při rychlosti průtoku 1 ml/min a použití detektoru v ultafialovém světle při 260 nm. Za těchto podmínek má chromátogram jediný vrchol při době retence 8,3 minuty. Slité frakce jsou také homogenní při stanovení isoelektrického bodu a při použití SDS-PAGE za shora uvedených podmínek. Koncentrace účinné složky byla stanovena 4,25 mg/ml lyofilizací podílu s objemem 10 ml s opravou na hmotnost pufru.
Průmyslová využitelnost
Protinádorové antibiotikum potlačující růst nádorů u savců a získatelné kultivací biologicky čisté kultury nového mikroorganismu Streptoalloteichus sp. nov., kmen L585-6, ATCC 5350.
Claims (4)
1. Antibiotikum kedarcidin, které je polypeptidem s následujícím aminokyselinovým řetězcem
X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH, kde X znamená H-ala-ser, H ser nebo H, vzhledu špinavě zbarvené pevné látky, o molekulové hmotnosti 12 400 při stanovení elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu, 17 000 při stanovení filtrací na gelu a vysokotlakou kapalinovou chromatografií, se spektrem v ultrafialovém světle podle obr. 1, mající isoelektrický bod 3,65 a připravitelné pěstováním kultury mikroorganismu Streptoalfoteichus sp. nov. , kmen L585-6, ATCC 53650, produkujícího kedarcidin v prostředí, obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku v submerzní kultuře za aerobních podmínek s následnou izolací antibiotika ze živného prostředí.
2. Způsob přípravy antibiotika kedarcidin podle nároku 1, vyznačující se tím, že se pěstuje biologicky čistá kultura mikroorganismu Streptoalloteichus sp. nov., kmen L585-6, ATCC 53650, produkující kedarcidin v prostředí, obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku v submerzní kultuře za aerobních podmínek s následnou izolací antibiotika ze živného prostředí.
3. Farmaceutický prostředek pro inhibici růstu nádorů, citlivých na kedarcidin u savců, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje kedarcidin v množství dostatečném k inhibici nádoru, a farmaceuticky vhodný nosič.
4. Biologicky čistá kultura mikroorganismu Streptoalloteichus sp. nov., kmen L585-6, ATCC 53650.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/323,001 US5001112A (en) | 1988-04-12 | 1989-03-17 | Antitumor antibiotic kedarcidin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ225689A3 CZ225689A3 (en) | 1994-04-13 |
| CZ279196B6 true CZ279196B6 (cs) | 1995-01-18 |
Family
ID=23257367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS892256A CZ279196B6 (cs) | 1989-03-17 | 1989-04-12 | Protinádorové antibiotikum kedarcidin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ279196B6 (cs) |
-
1989
- 1989-04-12 CZ CS892256A patent/CZ279196B6/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ225689A3 (en) | 1994-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO164111B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et antibiotisk virksomta 40926-kompleks og dets rene faktorer pa, pb, a, b og bomikron. | |
| PL122756B1 (en) | Process for preparing novel a-21978 antibiotic | |
| EP0132118B1 (en) | Antibiotics produced by kibdelosporangium aridum shearer gen. nov., sp. nov. atcc 39323 | |
| AU623641B2 (en) | Antitumor antibiotic kedaricin | |
| US6482412B1 (en) | Polypeptide having human HIV inhibitory activity, a gene encoding the polypeptide, a method to produce the polypeptide | |
| CZ279196B6 (cs) | Protinádorové antibiotikum kedarcidin | |
| FI87469B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av antibiotikum a 42867 och dess additionssalter. | |
| EP0213320B1 (en) | Physiologically active formamides | |
| JP2593495B2 (ja) | 化合物ｔａｎ−９９９、その製造法および用途 | |
| US4672036A (en) | Pure cultures of Kibdelsporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 and mutants thereof | |
| KR860001291B1 (ko) | A 53868인자 a의 제조방법 | |
| JP2625129B2 (ja) | 酵素活性阻害剤及びその製造法 | |
| CS251077B2 (en) | Method of new polypeptide antibiotic production with antitumor effect | |
| US4482488A (en) | Antibiotic A53868 and process for production thereof | |
| DD280553A5 (de) | Verfahren zur herstellung des antibiotikums kedarcidin | |
| CA2110827A1 (en) | Antiviral antibiotic bu-4724v and preparation thereof | |
| US4797280A (en) | Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 | |
| CA2110854A1 (en) | Antiviral antibiotic bu-4628v and preparation thereof |