JP2625129B2 - 酵素活性阻害剤及びその製造法 - Google Patents

酵素活性阻害剤及びその製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 ｛産業上の利用分野｝ 本発明は、キタサトスポリア（Kitasatosporia）属に
属してペプシン、レニン等のアスパルティックプロティ
ナーゼに対して酵素機能阻害活性を示す新規生理活性化
合物、該生産能を有する新規な微生物及びその微生物に
よる該化合物のの製造方法に関するものである。
｛従来の技術および問題点｝ 生体内に於て存在が知られているアスパルティックプ
ロティナーゼのうち代表的なものとして胃のペプシンや
腎臓のレニン等が挙げられる。これらのアスパルティッ
クプロティナーゼに対する低分子量ペプチド性阻害剤と
しては、従来ペプスタチン（梅沢ら、J.Antibiotics,23
巻、259頁（1970）、または特開昭47−29582）、あるい
はペプスタノン（宮野ら、J.Antibiotics,25巻、489
頁、（1972）、または特開昭48−88281）がよく知られ
ている。これらペプスタチンの類緑化合物としては、ア
ラニン残基がセリン残基に置き換わったヒドロキシペプ
スタチン（梅沢ら、J.Antibiotics,27巻、615頁、（197
3））や、Ｎ末端アシル基が炭素鎖２の酢酸から炭素鎖2
0のアルギン酸までの直鎖、あるいは分岐の脂肪酸（青
柳ら、J.Antibiotics,26巻、539頁（1973））であるも
のも分離されている。SP−１（村尾ら、Agric.Biol.Che
m.34巻、1265頁、（1970））、ペプシノストレプチン
（垣沼ら、J.Takeda Res.Lab.,35巻、123頁、（197
6））等もこれらペプスタチンの中に含まれているのと
同一物質である。これら化学物質の特徴はすべてペンタ
ペプチドでＮ末端から３残基目及びＣ末端に異常アミノ
酸であるスタチン（（3S,4S）−４−アミノ−３−ヒド
ロキシ−６−メチルヘプタン酸）を含み（ヘプスタノン
の場合はＣ端にスタノン（（3S）−３−アミノ−５−メ
チル−ヘキサン−２−オン））、またＮ端に直鎖あるい
は分岐の脂肪酸がアシル結合している。しかしながら、
従来知られているアスパルティックプロティナーゼに対
する低分子量ペプチド性阻害剤の多くは微生物により産
生されているが、その構造上溶媒に溶けにくいため、精
製は容易ではなく、また生体系に対する透過性もあまり
良くないと考えられる。このような観点から、アスパル
ティックプロティナーゼ阻害活性を有し、より親溶媒性
の新規な生理活性物質が望まれている。
｛問題点を解決するための手段｝ そこで本発明者らは、自然界より、新規な構造を有
し、アスパルティックプロティナーゼに対して酵素機能
阻害活性を示す生理活性物質を産生する新規微生物を見
出すべく鋭意探索した結果、京都府京都市の土壌より分
離した放線菌に属するキタサトスポリア・キョウトエン
シス（Kitasatosporia kyotoensi）SAM−0107の培養液
中から、数種類のアスパルティックプロナーゼに対して
酵素機能阻害活性を示す生理活性物質が産生されること
を見いだした。さらに該生理活性物質を純粋に分離・精
製することに成功して本発明を完成した。これら本発明
に於ける新規な生理活性物質は、従来知られているペプ
スタチン類とそのアミノ酸残基数、配列、およびＮ末端
アシル基が大きく異なっている。
本発明におけるアスパルティックプロティナーゼに対
して酵素機能阻害活性を示す化合物の構造式は次式Ｉで
表される。
式I: （式中Ａは−OH、または−Ｏ−CH3であり、Ｂは である。） また、該生理活性物質を産生する新規微生物キタサト
スポリア・キョウトエンシスSAM−0107は次の菌学的特
徴を有する。
１） 形態的所見 SAM−0107株はあまり長くない気中菌糸の先端に直鎖
状の、さらにその先端が螺旋状になった胞子連鎖を形成
する。成熟した胞子連鎖は20〜50個、あるいはそれ以上
の胞子からなる。胞子の大きさは（0.4〜0.8）μｍ×
（0.8〜1.2）μｍで、胞子表面は平滑である。基底菌糸
の分断は認められない。
２） 培養所見（28℃、14日間培養） ▲ショ糖・硫酸塩寒天培地：気中菌糸、なし；裏面の色
調、白から薄黄色；可溶性色素、無し。
▲グルコース・アスパラギン寒天培地：気中菌糸、うっ
すら、白〜灰色；裏面の色調、黄色；可溶性色素、無
し。
▲グリセリン・アスパラギン寒天培地：気中菌糸、うっ
すら、白〜灰色；裏面の色調、黄褐色；可溶性色素、褐
色。
▲スターチ・無機塩寒天培地：気中菌糸、豊富、白色；
裏面の色調、濃黄褐色；可溶性色素、無し。
▲チロシン・寒天培地：気中菌糸、かすか、白〜灰色；
裏面の色調、褐色；可溶性色素、濃褐色。
▲栄養寒天培地：気中菌糸、なし；裏面の色調、薄黄
色；可溶性色素、無し。
▲イースト・麦芽寒天培地：気中菌糸、豊富、白〜灰
色；裏面の色調、黄褐色；可溶性色素、無し。
▲オートミール・寒天培地：気中菌糸、うっすら、白〜
灰色；裏面の色調黄褐色；可溶性色素、無し。
▲ペプトン・イースト・鉄寒天培地：気中菌糸、なし；
裏面の色調、薄黄色；可溶性色素、無し。
３） 生理学的所見 生育温度範囲（CYC液体培地、３日間培養） 生育可能温度 18〜31 ℃ 生育至適温度 21〜24.5℃ ゼラチンの液化 陰性 スターチの加水分解 陽性 脱脂乳の凝固 陰性 脱脂乳のペプトン化 陰性 メラニン様色素の生成 ペプトン・イースト・鉄寒天培地 陰性 チロシン・寒天培地（0.2％グルコース、1.0％イースト
エキストラクト（ディフコ）、0.05％Ｌ−チロシン、0.
5％NaCl、2.0％寒天、pH7.0） 陰性 トリプトン・イースト寒天培地 陰性 硝酸塩の還元 陽性 炭酸源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培
地、28℃、14日間培養） Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｌ−ラムノース − Ｄ−フラクトース ± Ｄ−ガラクトース ＋ ラフィノース − Ｄ−マンニトール − イノシトール − サリシン ± シュクロース ＋ （但し、＋；利用する、±；利用するかどうか疑わし
い、−；利用しない。） ４） 化学的性質 細胞壁 a.アミノ酸 全体菌、及び細胞壁の加水分解物を、Stanek,J.L.お
よびRoberts,G.D.の方法（Applied Microbiology,28
巻、226頁（1974））に準拠して調べた結果、メソー2,6
−ジアミノピメリン酸とL,L−2,6−ジアミノピメリン酸
の２種の異性体及びグリシンの存在が認められた。
b.糖 全菌体の加水分解物中に、リボース、マンノース、グ
ルコース、およびガラクトースの存在が認められた。
キノン系 MK−９（H6）およびMK−９（H8）を主成分として有す
る。
以上、本菌株の菌学的性質を要約すると以下の通りで
ある。
SAM0107株の気中菌糸は比較的短く、胞子連鎖は直鎖
状でその先端が螺旋状を呈している。胞子連鎖は20〜50
個、あるいはそれ以上からなり、その表面は平滑であ
る。種々の培地で薄黄色〜褐色の基中菌糸上に白色〜黄
灰色の基中菌糸を着生し、可溶性色素は、チロシン・寒
天培地上で濃褐色の色素を産生する。メラニン様色素は
産生しない。
全菌体の加水分解物中には、メソ−2,6−ジアミノピ
メリン酸、、L,L−2,6−ジアミノピメリン酸、グリシ
ン、およびリボース、マンノース、グルコース、ガラク
トースが認められた。キノン系は（MK−９（H6）,MK−
９（H8）を主成分として有する。
以上の点、特に全菌体の加水分解物中に、2,6−ジア
ミノピメリン酸の２種の異性体が存在することから、SA
M−0107株は1982年に大村らの設定したキタサトスポリ
ア（Kitasatosporia）属（J.Antibiotics,35巻、1013
頁、（1982）；日本放線菌研究会報,No45、Dec.,1984
年）に属する菌株と判断できる。
キタサトスポリア属に属する放線菌としては、OMURA
ら（J.Antibiotics,35巻、1013頁,1982年）のキタサト
スポリア・セタルバ（Kitasatosporia setalba）KM−60
54、TAKAHASHIら（J.Gen.Appl.Microbiol.,30巻、377
頁、1984年）のキタサトスポリア・フォサラシネア（Ki
tasatosporia phosalacinea）KA−338、キタサトスポリ
ア・グリセオラKitasatosporia griseola）AM−9660、
島津ら（日本放線菌研究会、昭和59年度大会、要旨P9、
大坂、1984年のキタサトスポリア・メラノゲナ（Kitasa
tosporia melanogena）K55−Ｇ−32、稲岡ら（特開昭61
−088884）のキタサトスポリア・エスピー（Kitasatosp
oria sp.）SANK60684）、磯野ら（特開昭61−146188）
のキタサトスポリア・エスピー（Kitasatosporia sp.）
RK−419、梅沢ら（特開昭61−285992）のキタサトスポ
リア・セタエ（Kitasatosporia setae）MF730−N6、IWA
MIら（J.Antibiotics,40巻、612頁、1987年）のキタサ
トスポリア・キフネンス（Kitasatosporia Kifnense）9
482、 （Acta Microbiologica Sinica 26巻、87頁、1986年）
のキタサトスポリア・クラウサ（Kitasatosporia claus
a）33・35−１が報告されている。
SAM0107株とこれらの菌株を比較すると、胞子連鎖の
先端の形状において、SAM0107株は螺旋状を呈するのに
対し、キタサトスポリア・セタルバKM−6054、キタサト
スポリア・フォサラシネアKA−338、キタサトスポリア
・グリセオラKM−9660、キタサトスポリア・メラノゲナ
K55−Ｇ−32、キタサトスポリア・セタエMF−730−N6は
レクタス−フレキシビリス（Rectus−Flexibilis）状
を、キタサトスポリア・エスピーSANK60684は直ないし
曲状を呈するという点で、これらの菌株と本発明の菌株
SAM0107株は明らかに異なっている。
キタサトスポリア・キフネンス9482は、胞子連鎖の先
端が鍵状（hooked）あるいは螺旋状を呈するが、グリセ
リン・アスパラギン寒天培地上での可溶性色素の生成、
硝酸塩の還元、及びＤ−キシロース、Ｄ−マンニトール
の利用性において、本発明の菌株SAM0107とは明瞭に区
別される。
キタサトスポリア・エスピーRK−419は、胞子連鎖の
先端がオープンスパイラル状を呈するが、ショ糖・硝酸
塩寒天培地上での気中菌糸の着生、グリセリン・アスパ
ラギン寒天培地上での可溶性色素の生成、チロシン寒天
培地上での可溶性色素の生成、栄養寒天培地上での気中
菌糸の着生、ペプトン・イースト・鉄寒天培地上での生
育、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、ラフィノース
の利用性、ミルクの凝固、ミルクのペプトン化、全菌体
の加水分解物の糖組成において、本発明における菌株SA
M0107株とは明瞭に区別される。
キタサトスポリア・クラウサ33・35−１は基底菌糸が
分断するという点でSAM0107株とは明瞭に区別される。
以上のことから、本発明者らはSAM0107株をキタサトス
ポリア属の一新種であると判断し、キタサトスポリア・
キョウトエンシス（Kitasatosporia kyotoensis）と命
名した。
本菌株は微生物工業技術研究所に微工研菌寄第9580号
（FERM P−9580）として寄託されている。
本発明における生理活性物質の製造は、公知のペプチ
ド合成法によっても当業者にとっては容易になし得ると
考えられ、該合成法で得られたものも本発明に含まれる
が、さらに効率的な工業的製造方法はキタサトスポリア
に属する前記式Ｉで表される生理活性物質の生産能を有
する放線菌を適当な培地で培養し、その培養物から分離
精製する方法である。
本発明において該生理活性物質を製造する際に使用さ
れる培地は、液状でも固状でもよいが、通常は液体培地
による振盪培養または通気撹拌培養が便利である。培地
は本発明物質生産菌が生育して培地中に本発明物質を蓄
積するものであればどのようなものでもよい。即ち、炭
素源としては、例えばグルコースラクトース、グリセリ
ン、デンプン、シュークロース、デキストリン、糖蜜、
有機酸類などが、また窒素源としては、例えばペプト
ン、カザミノ酸などの蛋白質加水分解物、肉エキス、酵
母エキス、大豆粕、コーンスティープリカー、アミノ酸
類、アンモニウム塩、硝酸塩その他の各種有機あるいは
無機窒素化合物が用いられる。無機塩としては各種燐酸
塩、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムを添加してもよ
く、また菌の生育を促進する目的でビタミン類、核酸関
連化合物などを添加してもよい。なお、シリコン、ポリ
プロピレングリコール誘導体、大豆油などの消泡剤を培
地に添加することが本発明物質の蓄積量を増大させるの
に効果的な場合もある。
培養にあたっては、いきなり本培養をするよりは予め
小規模な前培養を行なって得られる培養物を培地に接種
するのが望ましい。培養温度、培養期間、培養の液性な
どの条件は、本発明物質の蓄積量が最大となるよう適当
に選択、調節されるが、多くの場合、好気的条件下に25
℃〜35℃、１〜３日の培養でよく、また培地の液性はpH
4.0〜9.5に保つのがよい。
このように培養することにより、培養物中に本発明物
質が生成蓄積される。液体培地を用いて培養した場合
は、主としてその液状部分に目的物が蓄積されるので、
培養物を一旦過あるいは遠心分離して菌体を除去した
後の液あるいは上清液からこれを分離するのが好まし
いが、必要に応じて菌体を除去することなく培養液から
直接目的物を分離することもできる。培養物からの目的
物の分離、精製には、本発明物質の化学的特性に基づく
種々の手段が採用される。すなわち、例えば硫酸アンモ
ニウム等の沈澱剤の添加による沈澱、ｎ−ブタノールな
どの水とは任意に混合せず、しかも本発明物質を溶解し
うる有機溶媒による抽出、メタノール、エタノールなど
の極性の大きい溶媒への溶解、ヘキサンなどで処理する
ことによる不純物の除去、セファデックス類によるゲル
過、イオン交換樹脂、イオン交換セルロース、イオン
交換セファデックスなど各種イオン交換体によるイオン
交換クロマトグラフィー、活性炭、アルミナ、シリカゲ
ル、アンバーライト−XAD−1,2などの吸着剤を用いる吸
着クロマトグラフィーなどが有効に用いられ、これら手
段を適当に組み合わせて使用することにより、本発明物
質は白色の無定形結晶状に単離される。但し、これら以
外の方法であっても本発明物質の特性を有効に利用する
ものであれば適宜使用できる。特に好ましい吸着剤とし
ては、ダイヤイオンHP−20、セファデックスLH−20、TS
KG−3000S、コスモシル10C18、およびDEAE−セルロース
の組合せが挙げられる。
本発明によりつくられた生理活性物質はペプシン等の
アスパルティックプロテイナーゼに対して阻害活性を示
し、例えば実施例に示すとおりペプシンによるヘモグロ
ビンの分解を阻止することが確認された。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発
明はこれらに限定されるものでばない。
実施例１ A.キタサトスポリア・キョウトエンシスの培養による生
理活性物質（SUAM物質）の製造 ブドウ糖、ペプトン、とうもろこしでんぷん、酵母エ
キス、乾燥酵母菌体、および燐酸二カリウムカラナル合
成培地（pH7.0）にキタサトスポリア・キョウトエン
シス株の純粋培養物を接種し、小型培養機で28℃、通気
量３/min、300回転/minで24時間通気撹拌培養した、
この前培養物（小型培養機２機分）を同上の合成培地に
300に接種し、タンク中で28℃、通気量210/min、10
0回転/minで17時間通気撹拌培養した。
培養物を遠心分離し、上清250をダイヤイオンHP−2
0（三菱化成工業製）のカラム（25）に吸着させた。
このカラムを水100で洗浄した後メタノール150で溶
離して、坑ペプシン活性画分を溶出させた。溶出物を減
圧下で濃縮し、濃縮液（15）を同上のカラム（４）
に再び吸着させた。このカラムを水20で洗浄した後、
40％、60％及、及び80％メタノール各々８で溶出させ
た。
60％メタノール溶出画分を減圧濃縮し、乾固物を50％
メタノールmlに溶解して、セファデックスLH−20（ファ
ルマシア社製）のカラム（55mm×2100mm）に負荷し、15
mlずつ分画すると、酵素阻害活性は画分番号119〜176に
溶出した。このうち画分番号119から139はSUAM物質I.II
IおよびIVを、画分番号140〜176はSUAM物質ＶおよびVI
を含む画分である。このLH−20前半（119から139）を減
圧濃縮し、乾固物を20％メタノール100mlに溶解してあ
らかじめ20％メタノールで平衡化したHP−20カラムに負
荷した。このカラムを20％メタノール600ml、その後20
〜80％メタノールの直線濃度勾配（計1200ml）で溶出
し、10mlずつ分画すると酵素阻害活性は20％メタノール
素通り画分（SUAM物質IIIおよびIVを含む）と、画分番
号81ら100（SUAM物質Ｉを含む）に得られた。SUAM物質I
II及びIVを含む画分をセファデックスLH−20カラム（30
mm×1710mm、50％メタノール）で再び分離し、15mlずつ
分画しつ得られた酵素阻害活性画分番号80から92を集め
て減圧濃縮した。乾固物を50％メタノールに溶解して高
速液体クロマトグラフ溶充填カラム（コスモシル10C18
パックドカラム、20mm×250mm）に負荷した。溶出は、
流速で2ml/min、各画分0.25minで採取し、235nmの吸収
で検知した。溶媒は最初0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）
で４分間、その後20分間かけて0.1％TFA−60％アセトニ
トリルに直線的に移行し、さらに10分間溶出する。この
結果、画分番号34〜36および画分番号56〜59にそれぞれ
純粋なSUAM物質III（mg）およびSUAM物質IV（3mg）を回
収することができた。（第１図） 次に上述SUAM物質Ｉを含む画分番号80〜100を減圧濃
縮し、乾固物を30％エタノール90mlに溶解して予め30％
エタノールで平衡化したTSKG3000SS（東洋曹達製）カラ
ム（15mm×258mm）に負荷した。30％エタノールル900ml
で洗浄後50％エタノールで溶出し、10mlずつ分画すると
SUAM物質Ｉを含む画分は画分番号106から123に得られ
た。この画分を集めて上記SUAM物質IIIおよびIVと同様
にコスモシル10C18パックドカラムに負荷し、画分番号2
1から25に純粋なSUAM物質Ｉ（4mg）を回収した。（第２
図） 次にSUAM物質Ｖ及びVIを含む画分（前述画分番号146
〜176）を減圧濃縮し、乾固物を20％エタノール100mlに
溶解してあらかじめ20％メタノールで平衡化したHP−20
カラム（30mm×300mm）に吸着させた。このカラムを20
％メタノール600mlで洗浄した後、20〜80％メタノール
の直線濃度勾配（計1200ml）で溶解し、10mlずつ分画す
ると酵素阻害活性画分は画分番号71〜111に得られた。
（第３図） この活性画分を集めて前述と同様にコスモシル10C18
パックドカラムに負荷し、画分番号28〜31および画分番
号36〜44にそれぞれ純粋なSUAM物質VI（10mg）およびSU
AM物質Ｖ（40mg）を回収した。（第４図） 最初のダイヤイオンHP−20カラムにおける80％メタノ
ール溶出画分を減圧濃縮し、乾固物を50％メタノール50
mlに溶解してセファデックスLH−20のカラム（55mm×21
00mm）に深し、15mlずつ分画すると酵素阻害活性画分は
画分番号110〜140に溶出した。この画分を減圧濃縮し、
乾固物を50％メタノール100mlに溶解してアンモニアでp
Hに調整した後、50％メタノール、50mM酢酸アンモニウ
ム緩衝液（pH5.6）であらかじめ平衡化したDEAEセルロ
ース（ワットマンDE23）カラム（26mm×110mm）に負荷
し、同溶液で溶出し10mlずつ分画すると、酵素阻害活性
画分は画分番号16〜18に得られた。（第５図） 活性画分を集めて減圧濃縮し、乾固物を50％メタノー
ルに溶解して前述の高速液体クロマトグラフ用充填カラ
ムに負荷した。この結果画分番号６〜10及び12〜18に純
粋なSUAM物質II（22mg）を回収した。（第６図） 以上のようにキタサトポリア・キョウトエンシスの培
養物より、純粋に分離・精製したSUAM物質Ｉ〜VIを各々
SUAM−20007、20008、20009、20010、20011、20012と命
名した。
B.SUAM物質群の物理化学的性質 （１） SUAM−20007 性状：白色粉末 溶解性：メタノール、エタノール、ジメチルスルフォキ
シドに易溶、ブタノールに可溶、水、ベンゼン、エーテ
ル、石油エーテル、クロロホルム、四塩化炭素、ヘキサ
ン、酢酸エチルに難溶。
分子式:C44H79N7O14 分子量:930.1 マススペクトル:930［Ｍ＋Ｈ］＋ プロトンNMRスペクトル:TMS基準 0.80−1.10（30H,m）,1.20−1.40（9H,m）,1.50−1.80
（9H,m）,2.00−2.10（2H,m）,2.30−2.50（6H,m）,4.0
0（6H,m）,3.65（1H,q,J＝5.0）,4.05−4.20（2H,m）,
4.30−4.50（2H,m） 呈色反応：ニンヒドリン反応に陰性、リドン−スミス反
応、塩酸−ニンヒドリン反応に陽性。
（２） SUAM−20008 性状：白色粉末 溶解性：メタノール、エタノール、ジメチルスルフォキ
シドに易溶、ブタノールに可溶、水、ベンゼン、エーテ
ル、石油エーテル、クロロホルム、四塩化炭素、ヘキサ
ン、酢酸エチルに難溶。
分子式:C43H77N7O12 分子量:884.1 マススペクトル:884［Ｍ＋Ｈ］＋ プロトンNMRスペクトル:TMS基準 0.80−1.10（30H,m）,1.20−1.24（9H,m）,1.50−1.58
（9H,m）,2.10（3H,s）,2.00−2.10（2H,m）,2.30−2.5
0（4H,m）,4.00−4.40（9H,m） 呈色反応：ニンヒドリン反応に陰性、リドン−スミス反
応、塩酸−ニンヒドリン反応に陽性。
（３） SUAM−20009 性状：白色粉末 溶解性：メタノール、エタノール、ジメチルスルフォキ
シドに易溶、ブタノールに可溶、水、ベンゼン、エーテ
ル、石油エーテル、クロロホルム、四塩化炭素、ヘキサ
ン、酢酸エチルに難溶。
分子式:C34H61N5O11 分子量:715.9 マススペクトル:716［Ｍ＋Ｈ］＋ プロトンNMRスペクトル:TMS基準 0.80−0.95（12H,m）,0.98（6H,d,J＝5.2）,1.02（6H,
d,J＝5.2）,1.37（2H,m）,1.38（3H,d,J＝5.0）,1.40
（3H,d,J＝5.0）,1.50−1.70（4H,m）,2.20（2H,m）,2.
30−2.50（4H,m）,3.62（3H,s）,3.63（1H,q,J＝5.0）,
4.00（4H,m）,4.10（1H,d,J＝5.2）,4.18（1H,d,J＝5.
2）,4.30（1H,d,J＝5.0） 呈色反応：ニンヒドリン反応に陰性、リドン−スミス反
応、塩酸−ニンヒドリン反応に陽性。
（４） SUAM−20010 性状：白色粉末 溶解性：メタノール、エタノール、ジメチルスルフォキ
シドに易溶、ブタノールに可溶、水、ベンゼン、エーテ
ル、石油エーテル、クロロホルム、四塩化炭素、ヘキサ
ン、酢酸エチルに難溶。
分子式:C33H59N5O11 分子量:701.9 マススペクトル:702［Ｍ＋Ｈ］＋ プロトンNMRスペクトル:TMS基準 0.80−0.95（12H,m）,0.98（6H,d,J＝5.2）,1.02（6H,
d,J＝5.2）,1.35（2H,m）,1.38（6H,m）,1.50−1.70（4
H,m）,2.10−2.25（2H,m）,2.30−2.50（4H,m）,3.63
（1H,q,J＝5.0）,4.00（4H,m）,4.10（1H,d,J＝5.0）,
4.18（1H,d,J＝5.0）,4.30（1H,d,J＝5.0） 呈色反応：ニンヒドリン反応に陰性、リドン−スミス反
応、塩酸−ニンヒドリン反応に陽性。
（５） SUAM−20011 性状：白色粉末 溶解性：メタノール、エタノール、ジメチルスルフォキ
シドに易溶、ブタノールに可溶、水、ベンゼン、エーテ
ル、石油エーテル、クロロホルム、四塩化炭素、ヘキサ
ン、酢酸エチルに難溶。
分子式:C33H59N6O9 分子量:669.9 マススペクトル:670［Ｍ＋Ｈ］＋ プロトンNMRスペクトル:TMS基準 0.80−1.10（24H,m）,1.20−1.24（6H,m）,1.50−1.70
（6H,m）,2.15（3H,S）2.00−2.10（2H,m）,2.30−2.45
（2H,m）,3.63（3H,s）,3.70（1H,m）,4.00（3H,m）,4.
10−4.25（2H,m）,4.25−4.30（2H,m） 呈色反応：ニンヒドリン反応に陰性、リドン−スミス反
応、塩酸−ニンヒドリン反応に陽性。
（６）SUAM−20012 性状：白色粉末 溶解性：メタノール、エタノール、ジメチルスルフォキ
シドに易溶、ブタノールに可溶、水、ベンゼン、エーテ
ル、石油エーテル、クロロホルム、四塩化炭素、ヘキサ
ン、酢酸エチルに難溶。
分子式:C32H57N5O9 分子量:655.8 マススペクトル:655［Ｍ＋Ｈ］＋ プロトンNMRスペクトル:TMS基準 0.80−1.10（24H,m）,1.20−1.24（6H,m）,1.50−1.70
（6H,m）,2.00−2.10（2H,m）,2.30−2.45（2H,m）,3.6
3（3H,s）,3.70（1H,m）,4.00（3H,m）,4.10−4.25（2
H,m）,4.25−4.30（2H,m） 呈色反応：ニンヒドリン反応に陰性、リドンースミス反
応、塩酸−ニンヒドリン反応に陽性。またいずれのSUAM
物質もメタノールに対する溶解性において、従来の物質
（例えば、ペプスタチン）よりも10倍も高かった。
C.SUAM物質群のアミノ酸分析 SUAM−20007、20008、20009、20010、20011、および2
0012をそれぞれ２〜３μずつ別々に６規定塩酸0.1mlに
溶解し、真空封管した後、105℃で48時間加水分解し
た。加水分解後、真空下で乾燥し、それぞれに0.02規定
塩酸を0.3ml加えて溶解し、その0.225mlをアミノ酸分析
に供した結果、上記６種のSUAM化合物全てからアラニ
ン、およびバリンが検出された。各化合物の分子量およ
びその構成アミノ酸のモル比等を考え合わせた結果下記
のような値を得た。
以上の分析結果より本発明におけるSUAM物質（SUAM−
20007〜20012）の構造は、下記のごとく決定された。
（１）SUAM−20007 （２）SUAM−20008 （３）SUAM−20009 （４）SUAM−20010 （５）SUAM−20011 （６）SUAM−20012 実施例２ SUAM物質群の酵素阻害活性 以下の測定方法により本発明物質SUAM−20007、2000
8、20009、20010、20011、および20012の酵素阻害活性
を検討した。
（ａ） 牛膵臓由来のペプシンに対する阻害活性 各種濃度に設定した本発明物質の水溶液（０〜50μ
;aμ）とペプシン水溶液（５μg/5μ）とを混合
し、0.06規定塩酸（（150−ａ）μ）を加えてpH3〜５
であることを確認する。この溶液と基質溶液とを混合し
て反応を開始させる。基質として2.0％ヘモグロビンの
0.06規定塩酸溶液（800μ）を用いて（反応液総量1m
l）35℃で10分間反応させる。ついで反応液に５％トリ
クロロ酢酸（3ml）を加えて反応を停止させ、沈澱をろ
過する。ペプシンにより加水分解されたヘモグロビンの
トリクロロ酢酸可溶画分中の蛋白質量を280nmの紫外吸
収強度により測定し、対照液との比較から阻害能（50％
阻害濃度:IC50）を求めた結果下記のような値を得た。
｛発明の効果｝ 本発明における生理活性物質は、そのＮ末端側に特徴
のある構造を有し、溶媒（特にメタノール）に溶け易い
ために精製が容易である。さらにペプシン等のアルパル
ティックプロテイナーゼに対して酵素機能阻害活性を有
することから、アスパルティックプテイナーゼがその原
因と考えられる胃潰瘍発生の阻止、あるいはその治癒期
間の短縮、肉芽腫増殖抑制、腎性高血圧の抑制、ウィル
ス病巣形成阻止等の効果が期待できる。また本発明化合
物をリガンドとしたアフィニティーカラムの作成によ
り、アスパルティックプロテイナーゼの精製、酵素反応
機構研究の試薬等としての用途にも有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例のSUAM−20009及び20010の製造における
最終の高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示
すグラフである。 第２図は同じくSUAM−20007の製造における最終の高速
液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示すグラフで
ある。 第３図はSUAM−20011および20012の製造におけるダイヤ
イオンHP−20カラムの溶出パターンを示すグラフであ
る。 第４図は同じくSUAM−20011および20012の製造における
最終の高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示
すグラフである。 第５図はSUAM−20008の製造におけるDEAEセルロースカ
ラムの溶出パターンを示すグラフである。 第６図は同じくSUAM−20008の製造における最終高速液
体クロマトグラフィーの溶出パターンを示すグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/20 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/00 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 樋口 直樹 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社基礎研究所内 (72)発明者 天野 典英 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社基礎研究所内

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の式I: （式中Ａは−OH、または−Ｏ−CH3であり、Ｂは である）で表される化合物。
  2. 【請求項２】キタサトスポリア属に属する放線菌の菌株
    であって、下記式Ｉの化合物の産生能を有する菌株を培
    養し、該培養液中に式I: （式中Ａは−OH、または−Ｏ−CH3であり、Ｂは である）で表される化合物を産生、蓄積させ、該培養液
    を精製することを特徴とする該化合物の製造方法。
  3. 【請求項３】キタサトスポリア属に属する放線菌が、キ
    タサトスポリア・キョウトエンシスSAM0107（微工研菌
    寄第9580号（FERM P−9580））である特許請求の範囲第
    ２項記載の製造方法。
  4. 【請求項４】式I: （式中Ａは−OH、または−Ｏ−CH3であり、Ｂは である）で表される化合物を含有するアスパルティック
    プロティナーゼ活性阻害剤。
  5. 【請求項５】以下の菌学的特徴を有するキタサトスポリ
    ア・キョウトエンシス（Kitasatosporia kyotoensis）
    種に属する微生物； １） 形態的所見 あまり長くない気中菌糸の先端に直鎖状の、さらにその
    先端が螺旋状になった胞子連鎖を形成する；成熟した胞
    子連鎖は20〜50個、あるいはそれ以上の胞子からなる；
    胞子の大きさは（0.4〜0.8）μｍ×（0.8〜1.2）μｍで
    胞子表面は平滑である；基底菌糸の分断は認められな
    い； ２） 培養所見（28℃、14日間培養） ▲ショ糖・硝酸塩寒天培地：気中菌糸、なし：裏面の色
    調、白から薄黄色；可溶性色素、無し； ▲グルコース・アスパラギン寒天培地：気中菌糸、うっ
    すら、白〜灰色；裏面の色調、黄色；可溶性色素、無
    し； ▲グリセリン・アスパラギン寒天培地：気中菌糸、うっ
    すら、白〜灰色；裏面の色調、黄褐色；可溶性色素、褐
    色； ▲スターチ・無機塩寒天培地：気中菌糸、豊富、白色；
    裏面の色調、濃黄褐色；可溶性色素、無し； ▲チロシン・寒天培地：気中菌糸、かすか、白〜灰色；
    裏面の色調、褐色；可溶性色素、濃褐色； ▲栄養寒天培地：気中菌糸、なし；裏面の色調、薄黄
    色；可溶性色素、無し； ▲イースト・麦芽寒天培地：気中菌糸、豊富、白〜灰
    色；裏面の色調、黄褐色；可溶性色素、無し； ▲オートミール・寒天培地：気中菌糸、うっすら、白〜
    灰色；裏面の色調、黄褐色；可溶性色素、無し； ▲ペプトン・イースト・鉄寒天培地：気中菌糸、なし；
    裏面の色調、薄黄色；可溶性色素、無し； ３） 生理学的所見 生育温度範囲（CYC液体培地、３日間培養） 生育可能温度 18〜31 ℃ 生育至適温度 21〜24.5℃ ゼラチンの液化 陰 性 スターチの加水分解 陽 性 脱脂乳の凝固 陰 性 脱脂乳のペプトン化 陰 性 メラニン様色素の生成 ペプトン・イースト・鉄寒天培地 陰 性 チロシン・寒天培地（0.2％グルコース、1.0％イースト
    エキストラクト（ディフコ）、0.05％Ｌ−チロシン、0.
    5％NaCl、2.0％寒天、pH7.0） 陰 性 トリプトン・イースト寒天培地 陰 性 硝酸塩の還元 陽 性 炭酸源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培
    地、28℃、14日間培養） Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｌ−ラムノース − Ｄ−フラクトース ± Ｄ−ガラクトース ＋ ラフィノース − Ｄ−マンニトール − イノシトール − サリシン ± シュクロース ＋ （但し、＋；利用する、±；利用するかどうか疑わし
    い、−；利用しない。 ４） 化学的性質 細胞壁 a.アミノ酸 全菌体、及び細胞壁の加水分解物を、ステナック,J.L.
    およびロバーツ,G.D.の方法（Applied Microbiology,28
    巻、226頁（1974））に準拠して調べたとき、メソー2,6
    −ジアミノピメリン酸とL,L−2,6−ジアミノピペリンの
    ２種類の異性体及びグリシンの存在が認められる； b.糖 全菌体の加水分解物中に、リボース、マンノース、グル
    コース、およびガラクトースの存在が認められる； キノン系 MK−９（H6）およびMK−９（H8）を主成分として有す
    る。
  6. 【請求項６】前記の微生物、キタサトスポリア・キョウ
    トエンシスが微工研菌寄第9580号（FERM P−9580）とし
    て寄託されている特許請求の範囲第５項記載のキタサト
    スポリア・キョウトエンシス。
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