JP2557070B2 - 新規生理活性物質プロベスチン、プロスタチン及びその製造法 - Google Patents
新規生理活性物質プロベスチン、プロスタチン及びその製造法Info
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- A61P37/02—Immunomodulators
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗アミノペプチタダーゼＭ作用及び免疫増強
作用を有する新規な生理活性物質プロベスチン及びプロ
スタチン、並びにこれら化合物の製造法に関する。
作用を有する新規な生理活性物質プロベスチン及びプロ
スタチン、並びにこれら化合物の製造法に関する。
微生物の生産する生理活性物質の中で、これまでにア
クチノチン（Actinonin）がアミノペプチダーゼＭを阻
害する活性と免疫増強作用をもつことが梅沢らにより報
告されている〔「The Journal of Antibiotics」第38
巻、1629〜1630頁（1985）〕。しかしアクチノニンの抗
アミノペプチダーゼＭ活性（IC50値:0.40μg/ml）はあ
まり強くない。従ってアミノペプチダーゼＭに特異的で
アクチノニンより強い阻害活性を示す阻害物質が望まれ
ている。
クチノチン（Actinonin）がアミノペプチダーゼＭを阻
害する活性と免疫増強作用をもつことが梅沢らにより報
告されている〔「The Journal of Antibiotics」第38
巻、1629〜1630頁（1985）〕。しかしアクチノニンの抗
アミノペプチダーゼＭ活性（IC50値:0.40μg/ml）はあ
まり強くない。従ってアミノペプチダーゼＭに特異的で
アクチノニンより強い阻害活性を示す阻害物質が望まれ
ている。
本発明者らは、上述の期待に答えるべくアミノペプチ
ダーゼＭに対し高い阻害作用を有する物質の探索を続け
たところ、ストレプトミセス（Streptomyces）属に属す
る或る菌株の培養液中にアミノペプチダーゼＭを強く阻
害する２つの物質が生産されていることを見いだした。
それらの有効物質を単離精製することに成功し、それら
を夫々にプロベスチン（Probestin）及びプロスタチン
（Prostatin）と命名した。さらにプロベスチン及びプ
ロスタチンの理化学的及び生物学的性状を調べた。これ
らの知見により本発明を完成した。
ダーゼＭに対し高い阻害作用を有する物質の探索を続け
たところ、ストレプトミセス（Streptomyces）属に属す
る或る菌株の培養液中にアミノペプチダーゼＭを強く阻
害する２つの物質が生産されていることを見いだした。
それらの有効物質を単離精製することに成功し、それら
を夫々にプロベスチン（Probestin）及びプロスタチン
（Prostatin）と命名した。さらにプロベスチン及びプ
ロスタチンの理化学的及び生物学的性状を調べた。これ
らの知見により本発明を完成した。
また、プロベスチンは次の構造式をもつことを確認し
た。
た。
プロスタチンは次の構造式をもつことを確認した。
従って、第一の本発明は、次の一般式 （式中、Ｒはフェニル基又は２−メチル−ブチル基を示
す）で表わされる新規生理活性物質プロベスチン及びプ
ロスタチン、あるいはこれらの塩を提供するものであ
る。
す）で表わされる新規生理活性物質プロベスチン及びプ
ロスタチン、あるいはこれらの塩を提供するものであ
る。
プロベスチン及びプロスタチンの理化学的性質は下記
の通りである。
の通りである。
（Ａ）プロベスチンの理化学的性状 （１）色及び形状：白色粉末 （２）分子式:C26H38N4O6 （３）分子量:502、SI−MS、m/z （４）融点:168〜170℃ （５）比旋光度：▲〔α〕25 D▼−116.8゜（c1、メタノ
ール） （６）紫外線吸収スペクトル:1mg/mlメタノール 溶液中で210nm〜360nmに特異的な吸収を示さない。
ール） （６）紫外線吸収スペクトル:1mg/mlメタノール 溶液中で210nm〜360nmに特異的な吸収を示さない。
（７）赤外線吸収スペクトル：添付図面の第１図に示
す。
す。
（８）水素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の第２図
に示す。
に示す。
（９）炭素核核磁気共鳴スペクトルのケミカルシフト：
後記の第１表に示す。
後記の第１表に示す。
（10）呈色反応：シリカゲル薄層上でニンヒドリン試
薬、モリブデン硫酸試薬に陽性。
薬、モリブデン硫酸試薬に陽性。
（11）溶解性：水、メタノール、ジメチルスルホキシド
に易溶であり、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、
ヘキサンに不溶である。
に易溶であり、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、
ヘキサンに不溶である。
（12）薄層クロマトグラフィーのRf値シリカゲル〔メル
ク社製シリカゲルArt.5715、展開溶媒:n−ブタノール−
酢酸−水（4:1:1）〕 Rf＝0.39 ODS逆相シリカゲル〔メルク社製シリカゲル、Art.153
89）、展開溶媒：アセトニトリル−緩衝液Ａ＊（3:
5）〕 Rf＝0.57 ＊５％酢酸カリウム、１％クエン酸・１水和物を含む水
溶液である。
ク社製シリカゲルArt.5715、展開溶媒:n−ブタノール−
酢酸−水（4:1:1）〕 Rf＝0.39 ODS逆相シリカゲル〔メルク社製シリカゲル、Art.153
89）、展開溶媒：アセトニトリル−緩衝液Ａ＊（3:
5）〕 Rf＝0.57 ＊５％酢酸カリウム、１％クエン酸・１水和物を含む水
溶液である。
（13）塩基性、酸性、中性の区分：中性 （Ｂ）プロスタチンの理化学的性状 （１）色及び形状：白色粉末 （２）分子式:C25H44N4O6 （３）分子量:496、SI−MS、m/z （４）融点:147〜150℃ （５）比旋光度：▲〔α〕25 D▼−105.4゜（c1、メタノ
ール） （６）紫外線吸収スペクトル:1mg/mlメタノール 溶液中で210nm〜360nmに特異的な吸収を示さない。
ール） （６）紫外線吸収スペクトル:1mg/mlメタノール 溶液中で210nm〜360nmに特異的な吸収を示さない。
（７）赤外線吸収スペクトル：添付図面の第３図に示
す。
す。
（８）水素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の第４図
に示す。
に示す。
（９）炭素核核磁気共鳴スペクトルのケミカルシフト：
後記の第１表に示す。
後記の第１表に示す。
（10）呈色反応：シリカゲル薄層上でニンヒドリン試
薬、モリブデン硫酸試薬に陽性。
薬、モリブデン硫酸試薬に陽性。
（11）溶解性：水、メタノール、ジメチルスルホキシド
に易溶であり、アセトン、クロロホルムに不溶であり、
酢酸エチル、ヘキサンに不溶である。
に易溶であり、アセトン、クロロホルムに不溶であり、
酢酸エチル、ヘキサンに不溶である。
（12）薄層クロマトグラフィーのRf値シリカゲル〔メル
ク社製シリカゲルArt.5715、展開溶媒:n−ブタノール−
酢酸−水（4:1:1）〕 Rf＝0.41 ODS逆相シリカゲル〔メルク社製シリカゲル、Art.153
89、展開溶媒：アセトニトリル−緩衝液Ａ＊（3:5）〕 Rf＝0.45 ＊５％酢酸カリウム、１％クエン酸・１水和物を含む水
溶液である。
ク社製シリカゲルArt.5715、展開溶媒:n−ブタノール−
酢酸−水（4:1:1）〕 Rf＝0.41 ODS逆相シリカゲル〔メルク社製シリカゲル、Art.153
89、展開溶媒：アセトニトリル−緩衝液Ａ＊（3:5）〕 Rf＝0.45 ＊５％酢酸カリウム、１％クエン酸・１水和物を含む水
溶液である。
（13）塩基性、酸性、中性の区分：中性。
次の第１表はプロベスチン及びプロスタチンの重メタ
ノール中で測定した100MHz炭素核磁気共鳴スペクトルの
ケミカルシフトを示す。
ノール中で測定した100MHz炭素核磁気共鳴スペクトルの
ケミカルシフトを示す。
本発明のプロベスチン、プロスタチン及びアクチノニ
ンの夫々の抗アミノペプチダーゼＭ活性は次の第２表に
示すとおりである。また、アミノペプチダーゼＭ（略
号:AP−Ｍ）のみならず、ロイシン・アミノペプチダー
ゼ（略号:Leu−AP）、アミノペプチダーゼＡ（略号:AP
−Ａ）及びアミノペプチダーゼＢ（略号:AP−Ｂ）に関
しても、これら酵素の活性を50％阻害するプロベスチ
ン、プロスタチン及びアクチノニンの各々の濃度（I
C50,μg/ml）を測定したので、その結果を第２表に示
す。
ンの夫々の抗アミノペプチダーゼＭ活性は次の第２表に
示すとおりである。また、アミノペプチダーゼＭ（略
号:AP−Ｍ）のみならず、ロイシン・アミノペプチダー
ゼ（略号:Leu−AP）、アミノペプチダーゼＡ（略号:AP
−Ａ）及びアミノペプチダーゼＢ（略号:AP−Ｂ）に関
しても、これら酵素の活性を50％阻害するプロベスチ
ン、プロスタチン及びアクチノニンの各々の濃度（I
C50,μg/ml）を測定したので、その結果を第２表に示
す。
アクチノニンと比較すると、プロベスチン及びプロス
タチンは、いずれもアミノペプチダーゼＭに対して強い
阻害活性を示した。さらに本発明のプロベスチン及びプ
ロスタチンはマウスにおける細胞性免疫増強作用を示
し、免疫能を増強する物質であると認められた。従っ
て、本発明により得られたプロベスチン及びプロスタチ
ンは、免疫増強剤として有用である。また抗腫よう免疫
増強剤としての用途も期待される。
タチンは、いずれもアミノペプチダーゼＭに対して強い
阻害活性を示した。さらに本発明のプロベスチン及びプ
ロスタチンはマウスにおける細胞性免疫増強作用を示
し、免疫能を増強する物質であると認められた。従っ
て、本発明により得られたプロベスチン及びプロスタチ
ンは、免疫増強剤として有用である。また抗腫よう免疫
増強剤としての用途も期待される。
プロベスチン及びプロスタチンはマウスに静脈注射し
た場合の急性毒性が夫々に、LD50で250mg/Kg以上である
ことが認められた。
た場合の急性毒性が夫々に、LD50で250mg/Kg以上である
ことが認められた。
さらに、第二の本発明によると、ストレプトミセス属
に属するプロベスチン生産菌を培養し、その培養液から
プロベスチンを採取することを特徴とする、生理活性物
質プロベスチンの製造法を提供するものである。
に属するプロベスチン生産菌を培養し、その培養液から
プロベスチンを採取することを特徴とする、生理活性物
質プロベスチンの製造法を提供するものである。
また、第三の本発明によると、ストレプトミセス属に
属するプロスタチン生産菌を培養し、その培養物からプ
ロスタチンを採取することを特徴とする、生理活性物質
プロスタチンの製造法が提供される。本発明の方法に使
用されるプロベスチン生産菌及びプロスタチン生産菌の
一例としては、本発明者らにより東京都品川区の土壌よ
り新たに分離されたMH663−2F6株がある。MH663−2F6株
の菌学的性状は次のとおりである。
属するプロスタチン生産菌を培養し、その培養物からプ
ロスタチンを採取することを特徴とする、生理活性物質
プロスタチンの製造法が提供される。本発明の方法に使
用されるプロベスチン生産菌及びプロスタチン生産菌の
一例としては、本発明者らにより東京都品川区の土壌よ
り新たに分離されたMH663−2F6株がある。MH663−2F6株
の菌学的性状は次のとおりである。
1.形態 MH663−2F6株は、顕微鏡下で分枝した基底菌糸よりら
せん状の気菌糸を形成し、輪生枝は、みとめられない。
成熟した胞子鎖は、20個以上の胞子の連鎖をみとめ、胞
子の大きさは、0.7〜0.8×0.7〜0.9ミクロン位で、胞子
の表面は、平滑である。
せん状の気菌糸を形成し、輪生枝は、みとめられない。
成熟した胞子鎖は、20個以上の胞子の連鎖をみとめ、胞
子の大きさは、0.7〜0.8×0.7〜0.9ミクロン位で、胞子
の表面は、平滑である。
2.各種培地における生育状態 色の記載について〔 〕内に示す標準は、コンティナ
ー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハー
モニー・マニュアル（Container Corporation of Ameri
caのColor Harmony Manual）を用いた。
ー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハー
モニー・マニュアル（Container Corporation of Ameri
caのColor Harmony Manual）を用いた。
（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培養） うす黄〔2ea,Lt.Wheat〜3ca,Pearl Pink〕の発育上に
白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素はみとめら
れない。
白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素はみとめら
れない。
（２）グリセリン・硝酸塩寒天培地（27℃培養） うす黄〔2ea,Lt.Ivory〜2ea,Lt.Wheat〕の発育上に黄
味灰〔2be,Pearl〜2cb,Ivory Tint〕の気菌糸を着生し
溶解性色素はみとめられない。
味灰〔2be,Pearl〜2cb,Ivory Tint〕の気菌糸を着生し
溶解性色素はみとめられない。
（３）グルコース・アスパラギン寒天培地（27℃培養） うす黄（1 1/2gc,Dusty yellow〕の発育上に、白の気
菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素はみとめられな
い。
菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素はみとめられな
い。
（４）イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地2,27℃培
養） うす黄〔2ea,Lt.Wheat〕の発育上に、明るい青味灰
〔17ec,Lt.Aqua Blue〜19ec,Lt.Aqua Green〕の気菌糸
を着生し、溶解性色素はみとめられない。
養） うす黄〔2ea,Lt.Wheat〕の発育上に、明るい青味灰
〔17ec,Lt.Aqua Blue〜19ec,Lt.Aqua Green〕の気菌糸
を着生し、溶解性色素はみとめられない。
（５）オートミール寒天培地（ISP−培地3,27℃培養） うす黄〔2ba,Pearl〕の発育上に、明るい青味灰〔17e
c,Lt.Aqua Blue〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はみと
められない。
c,Lt.Aqua Blue〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はみと
められない。
（６） スターチ・無機塩寒天培地（ISP−培地4,27℃
培養） うす黄〔2ba,Pearl〕の発育上に、明るい青味灰〔17e
c,Lt.Aqua Blue〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はみと
められない。
培養） うす黄〔2ba,Pearl〕の発育上に、明るい青味灰〔17e
c,Lt.Aqua Blue〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はみと
められない。
（７）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP−培地
5,27℃培養） うす黄〔2ea,Lt.Wheat〕の発育上に、白の気菌糸をう
っすらと着生し、溶解性色素はみとめられない。
5,27℃培養） うす黄〔2ea,Lt.Wheat〕の発育上に、白の気菌糸をう
っすらと着生し、溶解性色素はみとめられない。
（８）チロシン寒天培地（ISP−培地7,27℃培養） うすオリーブ〔24ng,Leaf Green〜24 1/2ng、Brite O
live Green〕の発育上に青味白〔17ca,Pale Aqua blu
e〕の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味をおびる。
live Green〕の発育上に青味白〔17ca,Pale Aqua blu
e〕の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味をおびる。
（９）リンゴ酸石灰寒天培地（27℃培養） うす黄〔2ba,Pearl〕の発育上に明るい青味灰〔17ge,
Dusty Aqua Blue〜19ge,Dusty Aqua Green〕の気菌糸を
着生し、溶解性色素はみとめられない。
Dusty Aqua Blue〜19ge,Dusty Aqua Green〕の気菌糸を
着生し、溶解性色素はみとめられない。
（10）栄養寒天培地（27℃培養） うす黄茶〔2gc,Bamboo〕の発育上に、白〜黄味灰〔2b
a,Pearl〕の気菌糸を着生し、溶解性色素は、茶色味を
おびる。
a,Pearl〕の気菌糸を着生し、溶解性色素は、茶色味を
おびる。
（11）スターチ寒天培地（27℃培養） うす黄〔2ba,Pearl〕の発育上に、明るい青味灰〔17e
c,Lt.Aqua Blue〜19ec,Lt.Aqua Green〕の気菌糸を着生
し、溶解性色素はみとめられない。
c,Lt.Aqua Blue〜19ec,Lt.Aqua Green〕の気菌糸を着生
し、溶解性色素はみとめられない。
（12）脱脂牛乳（37℃培養） 発育はうす茶〔3gc,Lt.Tan〕、気菌糸は着生せず、溶
解性色素は茶色味をおびる。
解性色素は茶色味をおびる。
（13）ゼラチン穿刺培養 単純ゼラチン培地（20℃培養）では、うす黄〔3ca,Pe
arl Pink〕の発育上にうっすらと白の気菌糸を着生し、
溶解性色素はみとめられない。
arl Pink〕の発育上にうっすらと白の気菌糸を着生し、
溶解性色素はみとめられない。
グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（27℃培養）で
は、うす茶〔3gc,Lt.Tan〕の発育上にうっすらと白の気
菌糸を着生し、溶解性色素は暗い茶色を呈する。
は、うす茶〔3gc,Lt.Tan〕の発育上にうっすらと白の気
菌糸を着生し、溶解性色素は暗い茶色を呈する。
（14）セルロース（27℃培養） 無色の発育上に白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解
性色素は、みとめられない。
性色素は、みとめられない。
3.生理的性質 （１）生育温度範囲 イースト・スターチ寒天（イーストエキス（大五栄養
化学製）0.2％、可溶性デンプン（小宗化学製）1.0％、
ひも寒天3.0％、pH7.0）を用い、20℃、24℃、27℃、30
℃、37℃、50℃の各温度で試験の結果、50℃を除いて、
いずれの温度でも発育したが、最適生育温度は、24℃〜
30℃付近であると思われる。
化学製）0.2％、可溶性デンプン（小宗化学製）1.0％、
ひも寒天3.0％、pH7.0）を用い、20℃、24℃、27℃、30
℃、37℃、50℃の各温度で試験の結果、50℃を除いて、
いずれの温度でも発育したが、最適生育温度は、24℃〜
30℃付近であると思われる。
（２）ゼラチンの液化（15％単純ゼラチン、20℃培養；
グルコース・ペプトン・ゼラチン、27℃培養） 単純ゼラチン培地では、液化はみとめられない。グル
コース・ペプトン・ゼラチン培地の場合は、培養後15日
目頃から液化が始まりその作用は弱い方である。
グルコース・ペプトン・ゼラチン、27℃培養） 単純ゼラチン培地では、液化はみとめられない。グル
コース・ペプトン・ゼラチン培地の場合は、培養後15日
目頃から液化が始まりその作用は弱い方である。
（３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地
およびスターチ寒天培地、いずれも27℃培養） いずれの培地も５日目頃から水解性がみとめられ、そ
の作用は強い方である。
およびスターチ寒天培地、いずれも27℃培養） いずれの培地も５日目頃から水解性がみとめられ、そ
の作用は強い方である。
（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（10％スキムミルク
（Difco）、37℃培養） 凝固なしに培養後15日目からペプトン化が始まる。
（Difco）、37℃培養） 凝固なしに培養後15日目からペプトン化が始まる。
ペプトン化は21日間培養後も完了せず、その作用は弱
い方である。
い方である。
（５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・
ブロス、ISP−培地1;ペプトン・イースト・鉄寒天、ISP
−培地6;チロシン寒天、ISP−培地7;いずれも27℃培
養） トリプトン・イースト・ブロスとペプトン・イースト
・鉄寒天では、メラニン様色素の生成が認められたが、
チロシン寒天ではほとんどみとめられなかった。その作
用はトリプトン・イースト・ブロス、ペプトン・イース
ト・鉄寒天ともに強い方である。
ブロス、ISP−培地1;ペプトン・イースト・鉄寒天、ISP
−培地6;チロシン寒天、ISP−培地7;いずれも27℃培
養） トリプトン・イースト・ブロスとペプトン・イースト
・鉄寒天では、メラニン様色素の生成が認められたが、
チロシン寒天ではほとんどみとめられなかった。その作
用はトリプトン・イースト・ブロス、ペプトン・イース
ト・鉄寒天ともに強い方である。
（６）炭素源の利用性（プリドハム・コドリーブ寒天培
地、ISP−培地9,27℃培養） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−フラクトース、シュクロース、イノシトール、
Ｌ−ラムノース、ラフィノース、Ｄ−マンニトールを利
用して発育する。
地、ISP−培地9,27℃培養） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−フラクトース、シュクロース、イノシトール、
Ｌ−ラムノース、ラフィノース、Ｄ−マンニトールを利
用して発育する。
（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天、27℃培
養） リンゴ酸石灰の溶解がみとめられ、その作用は中程度
〜強い方である。
養） リンゴ酸石灰の溶解がみとめられ、その作用は中程度
〜強い方である。
（８）硝酸塩の還元反応（0.1％硝酸カリ含有ペプトン
水、ISP−培地8,27℃培養） 陽性である。
水、ISP−培地8,27℃培養） 陽性である。
（９）セルロースの分解（瀘紙片添加合成液、27℃培
養） 陽性である。
養） 陽性である。
以上の性状を要約すると、MH663−2F6株は、ストレプ
トミセス（Streptomyces）属に属し、細胞壁に含まれる
2,6−ジアミノピメリン酸は、LL−型である。又、胞子
のうをみとめず、気菌糸はらせん形成を有し、輪生枝は
みとめられない。胞子の表面は平滑である。種々の培地
でうす黄の発育上に、白〜明るい青味灰の黄菌糸を着生
し、溶解性色素は有機培地で茶色味を呈するが、その他
の培地ではみとめられない。メラニン様色素は、陽性、
蛋白分解力は弱い方、スターチの水解性は強い方であ
る。
トミセス（Streptomyces）属に属し、細胞壁に含まれる
2,6−ジアミノピメリン酸は、LL−型である。又、胞子
のうをみとめず、気菌糸はらせん形成を有し、輪生枝は
みとめられない。胞子の表面は平滑である。種々の培地
でうす黄の発育上に、白〜明るい青味灰の黄菌糸を着生
し、溶解性色素は有機培地で茶色味を呈するが、その他
の培地ではみとめられない。メラニン様色素は、陽性、
蛋白分解力は弱い方、スターチの水解性は強い方であ
る。
これらの性状より、MH663−2F6株の近液の既知菌種を
検索すると、次の種があげられる。
検索すると、次の種があげられる。
すなわち、ストレプトミセス・カエレスティス（Stre
ptomyces caelestis、文献１）「International Journa
l of Systematic Bacteriology」18巻、90頁、1968;文
献２）S.A.Walsman著、「The Actinomycetes」第２巻、
184頁、1961;3）R.Htter著「Systematik der Strepto
myceten」89頁、1967）、ストレプトミセス・アズレウ
ス（Streptomyces azureus、文献１）「International
Journal of Systematic Bacterillogy」18巻、87頁、19
68;文献２）R.Htter著「Systematik der Streptomyce
ten」88頁、1967）である。本出願人研究所で保存中の
前記２菌株と、MH663−2F6株を実際に比較検討した結果
を第３表に示した。
ptomyces caelestis、文献１）「International Journa
l of Systematic Bacteriology」18巻、90頁、1968;文
献２）S.A.Walsman著、「The Actinomycetes」第２巻、
184頁、1961;3）R.Htter著「Systematik der Strepto
myceten」89頁、1967）、ストレプトミセス・アズレウ
ス（Streptomyces azureus、文献１）「International
Journal of Systematic Bacterillogy」18巻、87頁、19
68;文献２）R.Htter著「Systematik der Streptomyce
ten」88頁、1967）である。本出願人研究所で保存中の
前記２菌株と、MH663−2F6株を実際に比較検討した結果
を第３表に示した。
第３表に示されるように、本発明で用いうるMH663−2
F6株はストレプトミセス・カエレステイス及びストレプ
トミセス・アズレウスの両種に極めて類似した性状を示
した。
F6株はストレプトミセス・カエレステイス及びストレプ
トミセス・アズレウスの両種に極めて類似した性状を示
した。
MH663−2F6株がストレプトミセス・カエレステイスと
相異する点は、Ｄ−マンニトールの利用のみであり、ス
トレプトミセス・アズレウスとは、気菌糸の色調の相異
が認められ、すなわちストレプトミセス・アズレウスの
方がMH663−2F6株に比較して青緑色がやや濃い目であ
る。一方、MH663−2F6株の形態上の特徴である気菌糸の
らせん形成は、前記のIJSB及びR.Htterのそれぞれの
文献上に示された記載及び実地の比較試験でまさしくス
トレプトミセス・アズレウスと同様な結果を得た。すな
わち、一見、らせんを持った輪生枝形成のように観察さ
れる点である。なお、ストレプトミセス・カエレステイ
スの方は、らせん形成もとぼしく、１〜２回のらせんの
回転であり、短かい胞子鎖である。
相異する点は、Ｄ−マンニトールの利用のみであり、ス
トレプトミセス・アズレウスとは、気菌糸の色調の相異
が認められ、すなわちストレプトミセス・アズレウスの
方がMH663−2F6株に比較して青緑色がやや濃い目であ
る。一方、MH663−2F6株の形態上の特徴である気菌糸の
らせん形成は、前記のIJSB及びR.Htterのそれぞれの
文献上に示された記載及び実地の比較試験でまさしくス
トレプトミセス・アズレウスと同様な結果を得た。すな
わち、一見、らせんを持った輪生枝形成のように観察さ
れる点である。なお、ストレプトミセス・カエレステイ
スの方は、らせん形成もとぼしく、１〜２回のらせんの
回転であり、短かい胞子鎖である。
これらの点からMH663−2F6株をストレプトミセス・ア
ズレウス（Streptomyces azureus）MH663−2F6と同定し
た。なお、MH663−2F6株を工業技術院微生物工業技術研
究所に、昭和62年８月27日、保管委託申請し、その受託
番号は微工研菌寄第9541号である。なお、本菌株はブダ
ペスト条約の規約の下に国際寄託に1988年７月18日移管
されて微工研条寄第1963号として寄託されてある。
ズレウス（Streptomyces azureus）MH663−2F6と同定し
た。なお、MH663−2F6株を工業技術院微生物工業技術研
究所に、昭和62年８月27日、保管委託申請し、その受託
番号は微工研菌寄第9541号である。なお、本菌株はブダ
ペスト条約の規約の下に国際寄託に1988年７月18日移管
されて微工研条寄第1963号として寄託されてある。
MH663−2F6株はほかの放射菌の場合にみられるように
その性状が変化しやすい。たとえばMH663−2F6株の、ま
たはこの株に由来する突然変異株（自然発生または誘発
性）、形質融合体または遺伝子組換え体であっても、プ
ロベスチン及びプロスタチンの生産能を有するストレプ
トミセス属の菌はすべて本発明の方法に使用することが
出来る。
その性状が変化しやすい。たとえばMH663−2F6株の、ま
たはこの株に由来する突然変異株（自然発生または誘発
性）、形質融合体または遺伝子組換え体であっても、プ
ロベスチン及びプロスタチンの生産能を有するストレプ
トミセス属の菌はすべて本発明の方法に使用することが
出来る。
第二及び第三の本発明の方法では、前記のプロベスチ
ン生産菌又はプロスタチン生産菌を通常の微生物が利用
しうる栄養物を含有する培地で培養する。栄養源として
は、グルコース、水あめ、デキストリン、シュクロー
ス、でんぷん、糖蜜、動物、植物油等を使用できる。ま
た窒素源として、大豆粉、小麦はい芽、コーンスティー
プ・リカー、綿実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキ
ス、硫酸アンモニウム、硫酸ソーダ、尿素等を利用でき
る。その他、必要に応じ、ナトリウム、コバルト、塩
素、燐酸、硫酸、及びその他のイオンを生成することの
出来る無機塩類を添加することは有効である。また菌の
生育を助け、生理活性物質プロベスチン又は（及び）プ
ロスタチンの生産を促進するような有機及び無機物を適
当に添加することができる。
ン生産菌又はプロスタチン生産菌を通常の微生物が利用
しうる栄養物を含有する培地で培養する。栄養源として
は、グルコース、水あめ、デキストリン、シュクロー
ス、でんぷん、糖蜜、動物、植物油等を使用できる。ま
た窒素源として、大豆粉、小麦はい芽、コーンスティー
プ・リカー、綿実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキ
ス、硫酸アンモニウム、硫酸ソーダ、尿素等を利用でき
る。その他、必要に応じ、ナトリウム、コバルト、塩
素、燐酸、硫酸、及びその他のイオンを生成することの
出来る無機塩類を添加することは有効である。また菌の
生育を助け、生理活性物質プロベスチン又は（及び）プ
ロスタチンの生産を促進するような有機及び無機物を適
当に添加することができる。
培養法としては、好気的条件での培養法、特に深部培
養法が適している。培養に適当な温度は15〜37℃である
が、多くの場合、26〜30℃付近で培養する。生理活性物
質プロベスチン又はプロスタチンの生産は培地や培養条
件により異なるが、振とう培養、タンク培養とも通常１
〜10日の間でその蓄積が最高に達する。培養物中の生理
活性物質プロベスチン又はプロスタチンの蓄積量が最高
になったときに培養を停止し、培養液から目的物質を単
離精製する。
養法が適している。培養に適当な温度は15〜37℃である
が、多くの場合、26〜30℃付近で培養する。生理活性物
質プロベスチン又はプロスタチンの生産は培地や培養条
件により異なるが、振とう培養、タンク培養とも通常１
〜10日の間でその蓄積が最高に達する。培養物中の生理
活性物質プロベスチン又はプロスタチンの蓄積量が最高
になったときに培養を停止し、培養液から目的物質を単
離精製する。
本発明によって得られるプロベスチン及びプロスタチ
ンの培養液からの採取にあたっては、その性状を利用し
た通常の分離手段を適宜組み合わせて抽出して精製する
ことができる。即ち培養濾液を吸着樹脂アンバーライト
XAD−４（オルガノ社製）のカラムに通し、水で洗浄
し、メタノールなどの有機溶媒で溶離する。溶離液から
有機溶媒を留去したのち、pH2でブタノールなどの水と
自由に混和しない有機溶媒で有効成分を抽出する。抽出
液を減圧下に濃縮し乾固することにより粗粉末を得るこ
とができる。
ンの培養液からの採取にあたっては、その性状を利用し
た通常の分離手段を適宜組み合わせて抽出して精製する
ことができる。即ち培養濾液を吸着樹脂アンバーライト
XAD−４（オルガノ社製）のカラムに通し、水で洗浄
し、メタノールなどの有機溶媒で溶離する。溶離液から
有機溶媒を留去したのち、pH2でブタノールなどの水と
自由に混和しない有機溶媒で有効成分を抽出する。抽出
液を減圧下に濃縮し乾固することにより粗粉末を得るこ
とができる。
上述の方法に加えて、吸着クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせあるいは
繰り返すことによって、プロベスチン及びプロスタチン
を各々、単離する。
濾過クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせあるいは
繰り返すことによって、プロベスチン及びプロスタチン
を各々、単離する。
プロベスチン及びプロスタチンの培養工程、並びに精
製工程中での追跡は次の方法による。抗アミノペプチダ
ーゼＭ活性の測定に基ずいて行った。抗アミノペプチダ
ーゼＭ活性の測定は、梅沢らの方法〔「Journal of Ant
ibiotics」第38巻、1629〜1630頁（1985）〕で行った。
製工程中での追跡は次の方法による。抗アミノペプチダ
ーゼＭ活性の測定に基ずいて行った。抗アミノペプチダ
ーゼＭ活性の測定は、梅沢らの方法〔「Journal of Ant
ibiotics」第38巻、1629〜1630頁（1985）〕で行った。
即ち、試験管に2mMのＬ−ロイシン−β−ナフチルア
ミド0.25ml、0.1Mのトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）0.5m
l、検体を含む水溶液0.2mlを加えた混合溶液を37℃、３
分間加温した後、4U/mgのアミノペプチダーゼＭ（ベー
リンガー・マンハイム社製）の溶液の0.05mlを加え、37
℃で30分間反応したのち、ツイーン（Tween 20）を10
％、ファーストガーネットGBC塩を0.1％含む1M酢酸ナト
リウム緩衝液（pH4.2）1mlを加え、室温に15分放置後に
525nmにおける吸光度（ａ）を測定した。同時にプロベ
スチン及びプロスタチンを含まない緩衝液のみを用いた
盲検の吸光度（ｂ）を測定し、アミノペプチダーゼＭ阻
害率を〔（ｂ−ａ）/b〕×100の式により計算した。
ミド0.25ml、0.1Mのトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）0.5m
l、検体を含む水溶液0.2mlを加えた混合溶液を37℃、３
分間加温した後、4U/mgのアミノペプチダーゼＭ（ベー
リンガー・マンハイム社製）の溶液の0.05mlを加え、37
℃で30分間反応したのち、ツイーン（Tween 20）を10
％、ファーストガーネットGBC塩を0.1％含む1M酢酸ナト
リウム緩衝液（pH4.2）1mlを加え、室温に15分放置後に
525nmにおける吸光度（ａ）を測定した。同時にプロベ
スチン及びプロスタチンを含まない緩衝液のみを用いた
盲検の吸光度（ｂ）を測定し、アミノペプチダーゼＭ阻
害率を〔（ｂ−ａ）/b〕×100の式により計算した。
（実施例） 次に実施例によって本発明のプロベスチン及びプロス
タチンの製造例を示す。
タチンの製造例を示す。
実施例１ （イ）種培地及び生産培地として、ポテトスターチ2.0
％、グルコース2.0％、ソーヤミール2.0％、酵母エキス
0.5％、塩化ナトリウム0.25％、炭酸カルシウム0.32
％、硫酸銅・５水塩0.0005％、塩化マンガン・４水塩0.
005％、塩化亜塩・７水塩0.005％を含む培地を用いた。
なお殺菌前のpHはすべてpH7.4に調整して使用した。
％、グルコース2.0％、ソーヤミール2.0％、酵母エキス
0.5％、塩化ナトリウム0.25％、炭酸カルシウム0.32
％、硫酸銅・５水塩0.0005％、塩化マンガン・４水塩0.
005％、塩化亜塩・７水塩0.005％を含む培地を用いた。
なお殺菌前のpHはすべてpH7.4に調整して使用した。
500ml容の三角フラスコに110mlずつ分注した前記種培
地を120℃で20分間殺菌し、これにストレプトミセス・
アズレウスMH663−2F6（FERM P−9541）の斜面培養の１
〜２白金耳を摂取し、28℃で２日間振とう培養し第１種
培養とした。ついで500ml容の三角フラスコ５本に110ml
ずつ前記種培地を分注し120℃で20分間殺菌し、前記第
１種培養液3mlずつ接触し、28℃で２日間振とう培養
し、これを２種培養とした。予め120℃で20分間殺菌し
た12の生産培地を含む30容ジャーファーメンターに
前記の第２種培養を500mlずつ接種し、28℃で48時間通
気（12／分）下に撹はん（150rpm）培養した。培養終
了後、濾過助剤として珪藻土を加え濾過し、菌体を含む
固形物および培養濾液を得た。
地を120℃で20分間殺菌し、これにストレプトミセス・
アズレウスMH663−2F6（FERM P−9541）の斜面培養の１
〜２白金耳を摂取し、28℃で２日間振とう培養し第１種
培養とした。ついで500ml容の三角フラスコ５本に110ml
ずつ前記種培地を分注し120℃で20分間殺菌し、前記第
１種培養液3mlずつ接触し、28℃で２日間振とう培養
し、これを２種培養とした。予め120℃で20分間殺菌し
た12の生産培地を含む30容ジャーファーメンターに
前記の第２種培養を500mlずつ接種し、28℃で48時間通
気（12／分）下に撹はん（150rpm）培養した。培養終
了後、濾過助剤として珪藻土を加え濾過し、菌体を含む
固形物および培養濾液を得た。
（ロ）前項（イ）で得られた培養濾液10を吸着樹脂ア
ンバーライトXAD−４の１のカラムにかけ、水で洗浄
し、80％メタノール（４）で溶離した。活性画分を含
む溶離液を減圧濃縮して容積を300mlとし、塩酸を用い
てpHを2.0に調節した。これにブタノール300mlを加えよ
く撹はんして有効成分を抽出し、これを濃縮して褐色の
粗物質3.6gを得た。
ンバーライトXAD−４の１のカラムにかけ、水で洗浄
し、80％メタノール（４）で溶離した。活性画分を含
む溶離液を減圧濃縮して容積を300mlとし、塩酸を用い
てpHを2.0に調節した。これにブタノール300mlを加えよ
く撹はんして有効成分を抽出し、これを濃縮して褐色の
粗物質3.6gを得た。
（ハ）前項（ロ）で得られた粗物質を少量の酢酸ブチル
−ブタノール−酢酸−水（2:4:1:1）に懸濁し、予め同
溶媒で充填したシリカゲル（ワコーゲルＣ−200、和光
純薬工業社製）300mlのカラムにかけ、同溶媒で溶離し
た。この溶離液を濃縮してうすい褐色の粉末320mgを得
た。
−ブタノール−酢酸−水（2:4:1:1）に懸濁し、予め同
溶媒で充填したシリカゲル（ワコーゲルＣ−200、和光
純薬工業社製）300mlのカラムにかけ、同溶媒で溶離し
た。この溶離液を濃縮してうすい褐色の粉末320mgを得
た。
（ニ）前項（ハ）で得られた粉末を水に溶解し、予め水
で充填した逆相シリカゲル（シラナイズドシリカゲル6
0、メルク社製）70mlのカラムにかけ、０〜50％メタノ
ールのグラジエント溶離を行い、溶離液を7gずつ分画し
た。No.51−70にプロベスチンを含む活性画分が、またN
o.81−96にプロスタチンを主に含む活性画分が分離して
得られた。
で充填した逆相シリカゲル（シラナイズドシリカゲル6
0、メルク社製）70mlのカラムにかけ、０〜50％メタノ
ールのグラジエント溶離を行い、溶離液を7gずつ分画し
た。No.51−70にプロベスチンを含む活性画分が、またN
o.81−96にプロスタチンを主に含む活性画分が分離して
得られた。
（ホ）前項（ニ）で得られたプロベスチンを主に含む画
分を濃縮乾固すると、黄色の粉末55.9mgが得られた。こ
の粉末を少量のメタノールに溶解し、メタノールで充填
したトヨパールHW−40（東洋曹達工業社製）500mlのカ
ラムにかけ、メタノールを展開溶媒とするクロマトグラ
フィーを行い、3gずつ分画した。活性分画No.67〜No.70
を減圧濃縮するとプロベスチンの白色粉末30.5mgが得ら
れた。このプロベスチンは0.023μg/mlの濃度でアミノ
ペプチダーゼＭを50％阻害した。
分を濃縮乾固すると、黄色の粉末55.9mgが得られた。こ
の粉末を少量のメタノールに溶解し、メタノールで充填
したトヨパールHW−40（東洋曹達工業社製）500mlのカ
ラムにかけ、メタノールを展開溶媒とするクロマトグラ
フィーを行い、3gずつ分画した。活性分画No.67〜No.70
を減圧濃縮するとプロベスチンの白色粉末30.5mgが得ら
れた。このプロベスチンは0.023μg/mlの濃度でアミノ
ペプチダーゼＭを50％阻害した。
（ヘ）前項（ニ）で得られたプロスタチンを主に含む画
分を濃縮乾固すると、黄色の粉末14.0mgが得られた。こ
の粉末を少量のメタノール−水（1:1）に溶解し、メタ
ノール−水（1:1）で充填したセファデックスLH−20
（ファルマシア・ファインケミカル社製）700mlのカラ
ムにかけ、メタノール−水（1:1）を展開溶媒とするク
ロマトグラフィーを行い、5gずつ分画した。活性分画N
o.29〜No.34を減圧濃縮すると、プロスタチンの白色粉
末6.8mgが得られた。このプロスタチンは0.028μg/mlの
濃度でアミノペプチダーゼＭを50％阻害した。
分を濃縮乾固すると、黄色の粉末14.0mgが得られた。こ
の粉末を少量のメタノール−水（1:1）に溶解し、メタ
ノール−水（1:1）で充填したセファデックスLH−20
（ファルマシア・ファインケミカル社製）700mlのカラ
ムにかけ、メタノール−水（1:1）を展開溶媒とするク
ロマトグラフィーを行い、5gずつ分画した。活性分画N
o.29〜No.34を減圧濃縮すると、プロスタチンの白色粉
末6.8mgが得られた。このプロスタチンは0.028μg/mlの
濃度でアミノペプチダーゼＭを50％阻害した。
第１図はプロベスチン（臭化カリウム錠内）の赤外線吸
収スペクトルを示し、第２図はプロベスチンの重メタノ
ール中で測定した水素核核磁気共鳴スペクトル（400MH
z）を示し、第３図はプロスタチン（臭化カリウム錠
内）の赤外線吸収スペクトルを示し、第４図はプロベス
チンの重メタノール中で測定した水素核核磁気共鳴スペ
クトル（400MHz）を示す。
収スペクトルを示し、第２図はプロベスチンの重メタノ
ール中で測定した水素核核磁気共鳴スペクトル（400MH
z）を示し、第３図はプロスタチン（臭化カリウム錠
内）の赤外線吸収スペクトルを示し、第４図はプロベス
チンの重メタノール中で測定した水素核核磁気共鳴スペ
クトル（400MHz）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (5)
- 【請求項１】下記の一般式 （式中、Ｒはフェニル基又は２−メチル−ブチル基を示
す）で表わされる生理活性物質プロベスチン及びプロス
タチン、またはこれらの塩。 - 【請求項２】次式 で表わされるプロベスチンである特許請求の範囲第１項
記載の化合物。 - 【請求項３】次式 で表わされるプロスタチンである特許請求の範囲第１項
記載の化合物。 - 【請求項４】ストレプトミセス属に属するプロベスチン
生産菌を培養し、その培養物からプロベスチンを採取す
ることを特徴とする、生理活性物質プロベスチンの製造
法。 - 【請求項５】ストレプトミセス属に属するプロスタチン
生産菌を培養し、その培養物からプロスタチンを採取す
ることを特徴とする、生理活性物質プロスタチンの製造
法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62240600A JP2557070B2 (ja) | 1987-09-28 | 1987-09-28 | 新規生理活性物質プロベスチン、プロスタチン及びその製造法 |
| US07/232,852 US5021549A (en) | 1987-09-28 | 1988-08-16 | Physiologically active substances, probestin and prostatin and production thereof |
| DE88307798T DE3881812T2 (de) | 1987-09-28 | 1988-08-23 | Physiologisch aktive Substanzen, Probestin und Prostatin und deren Herstellung. |
| EP19880307798 EP0310238B1 (en) | 1987-09-28 | 1988-08-23 | New physiologically active substances, probestin and prostatin and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62240600A JP2557070B2 (ja) | 1987-09-28 | 1987-09-28 | 新規生理活性物質プロベスチン、プロスタチン及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6485995A JPS6485995A (en) | 1989-03-30 |
| JP2557070B2 true JP2557070B2 (ja) | 1996-11-27 |
Family
ID=17061903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62240600A Expired - Fee Related JP2557070B2 (ja) | 1987-09-28 | 1987-09-28 | 新規生理活性物質プロベスチン、プロスタチン及びその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5021549A (ja) |
| EP (1) | EP0310238B1 (ja) |
| JP (1) | JP2557070B2 (ja) |
| DE (1) | DE3881812T2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0454302A3 (en) * | 1990-03-30 | 1992-10-14 | Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. | Tuftsin derivatives |
| AU2015314979A1 (en) | 2014-09-10 | 2017-03-02 | The Regents Of The University Of California | Targeting K-Ras-mediated signaling pathways and malignancy by prostratin |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0655758B2 (ja) * | 1984-08-24 | 1994-07-27 | 味の素株式会社 | アミノ酸誘導体 |
-
1987
- 1987-09-28 JP JP62240600A patent/JP2557070B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-08-16 US US07/232,852 patent/US5021549A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-23 DE DE88307798T patent/DE3881812T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-08-23 EP EP19880307798 patent/EP0310238B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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