PT86364B

PT86364B - Processo para a producao do complexo antibiotico a10255 e seus factores

Info

Publication number: PT86364B
Application number: PT86364A
Authority: PT
Inventors: Laverne Dwaine Boeck; Otis Webster Godfrey; Karl Heinz Michel; Herbert Andrew Kirst; Marvin Martin Hoehn; Eugene Thomas Seno
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1986-12-15
Filing date: 1987-12-15
Publication date: 1990-11-07
Also published as: GR3006408T3; PT86364A; CN1023758C; EP0274873A2; JPS63258585A; IL84819A; EP0274873B1; ES2052584T3; MX170925B; DK654987D0; DE3781878D1; KR880007553A; NZ222895A; DE3781878T2; HU199559B; AU604806B2; EP0274873A3; AU8249387A; HUT49376A; DK654987A

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DO COMPLEXO ANTIBIÓTICO A10255 E

SEUS FACTORES

Este invento está relacionado com substâncias antibióticas recentemente descobertas que aqui são arbitrária e genéricamente designadas como antibiótico A10255. O antibiótico A 10255 é composto por uma mistura de 6 compostos separados ou factores (factores B, C, E, F, G e Η). A mistura dos factores é coproduzida pela cultura das novas estirpes de Streptomyces gardneri, NRRL 15537, NRRL 18260, NRRL 15922 ou um seu mutante produtor de A10255, em condições de fermentação aeróbica submersa até ser produzido um nível substancial de Antibiótico A 10255. Os factores coproduzidos B, C, E, F, Ge H são extraídos do caldo de fermentação (em quantidades diminutas) e a partir de micélios (em grandes quantidades) com solventes. Os factores coproduzidos são separados como uma mistura por concentração dos extractos e extracção do concentrado com um solvente imiscível em água, concentração do extracto, colheita e secagem do precipitado resultante contendo o complexo. Deve-se notar que o termo complexo antibiótico e complexo A 10255 conforme usados nos trabalhos de fermentação e nesta especificação não se refere a um complexo químico ligado covalentemente, mas a uma mistura de factores antibióticos individuais coproduzidos. Conforme será reconhecido pelos familiarizados com a fermentação de antibióticos, a proporção de factores individuais produzidos num complexo antibiótico podem variar dependendo das condições de fermentação usadas. O complexo A 10255 foi ainda purificado e separado nos factores individuais B, C, E, F, G e H através de uma série de processos cromatográficos.

O complexo antibiótico A 10255 e os factores individuais B, C, E, F, G e H inibem o crescimento de microorganismos patogénicos para o homem e animais. O complexo A 10255 e os factores individuais também aumentam a eficácia de utilização de alimentos em galinhas e gado e promovem o crescimento e aumentam a eficácia de utilização de alimentos em porcos recém desmamados.

ι

Outros aspectos do presente invento incluem as culturas biologicamente puras dos microorganismos Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces gardneris NRRL 18260 e Streptomyces gardneri NRRL 15922 ou um seu mutante produtor de A 10255 e os métodos para produção do complexo A 10255. O invento também proporciona composições alimentares compreendendo o complexo A 10255 ou factores individuais de A 10255 combinados com o alimento adequado para galinhas, porcos recém desmamados e gado. O invento engloba igualmente várias composições farmacêuticas compreendendo um veículo adequado e uma quantidade terapêuticamente eficaz do complexo A 10255, factor B de A 10252, factor C 10255, factor E de A 10255, factor F de A 10255, factor G de A 10255 ou factor H de A 10255. O complexo A 10255 deste invento pode ser usado para seleccionar células de Streptomyces que tenham o gene de resistência à tiostreptona como sendo ainda um outro aspecto do invento.

Descrição dos Desenhos

Os espectros de absorção de infravermelhos dos factores B, C, E, F, G e H individuais do A-10255 corridos em discos de KBr estão apresentados nos desenhos como se segue:

Fig.	1 —	Factor	B	de	A10255
Fig.	2 —	Factor	C	de	A10255
Fig.	3 —	Factor	E	de	A10255
Fig.	4 —	Factor	F	de	A10255
Fig.	5 —	Factor	G	de	A10255
Fig.	6 —	Factor	H	de	A10255

Descrição detalhada do invento complexo A10255, compreendendo essêncialmente os factores B, C, E, F, GeHé, produzido através da cultura num meio de cultura aquoso contendo fontes assimiláveis de açúcares, azoto e sais inorgânicos, das estirpes, até aqui não descritas, de Streptomyces gardneri, estirpe NRRL 15537 ou NRRL 18260 ou um seu mutante produtor de A10255 até ser produzido o complexo A10255.

Tal como acontece com muitas culturas produtoras de antibióticos, a fermentação de uma estirpe produtora de A10255 de í5. gardneri NRRL 15537, NRRL 18260 ouNRRL 15922 resulta na coprodução de uma série de substâncias antibióticas. O factor antibiótico B de A10255 é o principal factor produzido pela cultura de NRRL 15537 e os factores C, E, F, G e H são produzidos em quantidades menores ainda que isoláveis. Outros factores estão presentes em quantidades muito pequenas que torna o seu isolamento não compensador ou são relativamente instáveis. Os factores G e H foram isolados a partir de fermentação da cultura de NRRL 18260, sendo o factor G o principal factor. As quantidades de factores individuais coproduzidos podem variar de fermentação para fermentação de qualquer um dos microorganismos acima descritos.

Os factores antibióticos B, C, E, F, G e H coproduzidos durante a fermentação e obtidos como uma mistura foram designados complexo A10255. Os factores individuais foram separados uns dos outros e isolados como entidades distintas com as seguintes características físicas e biológicas que se seguem.

O termo sais farmacêuticamente aceitáveis inclui sais de metais alcalinos e de metais alcalinos terrosos dos compostos do presente invento, por exemplo,

lítio, sódio, potássio e cálcio, assim como sais de adição ácida tais como os que se formam entre os compostos do presente invento e ácidos tais como os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico.

Características físicas dos factores antibióticos

Factor B de A10255

O factor B de A10255 é um pó não cristalino, branco a amarelo claro que é solúvel em dimetilsulfóxido, dimetilformamida, piridina, misturas de clorofórmio/ /metanol e de tetra-hidrofurano:água (4:1, v/v).

A análise elementar do factor B indica a composição percentual aproximada que se segue (média): carbono 49,25%, hidrogénio 3,94%; azoto 15,65%; oxigénio 21,36%; e enxofre 6,73%.

peso molecular aparente do factor B de A10255 foi determinado por espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos como sendo aproximadamenI te 1244 daltons.

A titulação electrométrica de factor B de A10255 em dimetilformamida aquosa a 66% indica a presença de três grupos tituláveis com valores de pKa de 4,9, 11,2 | e 12,8.

A análise de aminoácidos do factor B (após hidrólise com ácido clorídrico 6N) indica a presença de amónia (5,268 mmoles/mg) e termina (629 mmoles/mg). A análise também evidenciou um pico grande não identificado surgindo antes da posição do pico da histidina.

espectro de absorção de ultravioleta para o factor B obtido em metanol neutro, ácido e básico demonstrou L, de 245 nm (^ = 66.000).

s-' max ^e espectro de absorção de infravermelhos (disco KBr) está descrito na Fig. 1 dos desenhos juntos. Os máximos de absorção mais significativos observados no espectro são em 3373, 2969, 2932, 2875, 1661, 1598, 1520, 1494, 1395, 1250, 1114, 1084, 946, 932 e 900 cm^-1.

O espectro de ressonância magnética nuclear de protões para o factor B foi obtido em dimetilsulfóxido perdeuterado a 500 MHz e tinha os seguintes sinais:

Ressonância N°.

	V/L/⁷
Desvio	Multiplicidade
10,53	S
9,95	S
9,86	S
9,79	S
9,61	S
9,58	S
9,09	S
8,90	T
8,84	D
8,67	S
8,60	S
8,51	S
8,48	D
8,39	S
8,25	D
8,24	S
8,04	D
6,53*	S
6,39	T
6,11	S
5,95	S
5,84	S
5,82	S
5,79	S
4* 5,76	S
5,68	S
5,64	S
5,44	DQ
5,16	D
4,80	DD
4,67	DD
4,63	DD
4,24	BS
2,21	DQ

Continuação Ressonância N2.	Desvio	Multiplicidade
35	1.62	DQ
36	1,11	D
37	i,oi	T

* duplamente intenso ⁺ triplamente intenso espectro de ressonância nuclear de _z

C do factor B foi obtido em dimetilsulfóxido predeuterado a 125 MHz e tinha os seguintes sinais:

Ressonância N°.	Desvio	Multiplicidade
1	172,88	S
2	169,17	S
3	168,87	S
4	164,90	S
5	163,67	S
6	163,07	S
7	162,84	S
8	162,68	S
9	162,61	S
10	161,57	S
11	160,32	S
12	160,17	S
13	160,01	S
14	159,46	S
15	158,96	S
16	158,10	S
17	149,39	S
18	149,37	S

Ressonância NQ.	Desvio	Multiplicidade
19	148,79	S
20	142,05	S
21	146,88	S
22	142,05	D
23	141,32	D
24	140,68	D
25	139,23	S
26	136,33	S
27	136,29	S
28	136,14	S
29	135,26	D
3C	134,23	S
31	133,82	S
32	133,28	S
33	130,21	S
34	129,07	S
35	127,22	D
36	125,94	D
37	124,98	D
38	122,36	S
39	121,47	D
40	110,92	T
41	110,49	T
42	109,98	T
43	109,46	T
44	106,23	T
45	104,73	T
46	67,37	D
47	57,94	D
48	46,33	D
49	40,24	T
50	20,74	T
51	20,67	Q
52	12,93	Q
53	12,93	Q
S= singeleto; D =	dubleto; T= tripleto;	Q = quarteto

Factor C de A10255

O factor C de A10255 é um pó não cristalino, branco a amarelo claro que é solúvel em dimetilsul' fóxido, dimetilformamida, piridina, cloreto de metileno/metanol 1:1 (v:v) e tetra-hidrofurano:água 4:1 (v:v).

A análise elementar do factor C indica a composição percentual aproximada que se segue (média): carbono 49,18%; hidrogénio 3,86%; azoto 17,89%; oxigénio 18,28% e enxofre 6,46%.

peso molecular aparente do factor C de A10255 foi determinada por espectrometria de massa de bombardeamento com átomos rápidos como sendo de aproximadamente 1174 daltons. Usando Csl como padrão de referência determinou-se a massa exacta como sendo 1175,36 (M+H).

A titulação electrométrica do factor C de A10255 em dimetilformamida aquosa a 66% (pH inicial 7,29) indicou a presença de dois grupos tituláveis com valores de pKa de 2,9 (incerto) e 12,0. A análise de aminoácidos do factor C (após hidrólise com ácido clorídrico 6N) indicou a presença de amónia (7,429 mmoles/mg) e treonina (758 mmoles/ /mg). A análise também evidênciou um pico grande não identificado surgindo antes da posição do pico da histidina.

O espectro de absorção de ultra-violetas para o factor C obtido em metanol neutro, ácido e básico demonstrou X de 245 nm ( ê. = 63.000).

max

O espectro de absorção de infravermelhos (disco Kbr) está produzido na Fig. 2 dos desenhos juntos. Os máximos de absorção mais significativos observados no espectro ocorrem a 3375, 2973, 2932, 2876, 1661, 1597, 1494, 1427, 1345, 1305, 1249, 1111, 1083, 984, 933 e 89 4^^-1.

-11G espectro de ressonância magnética nuclear de protões do factor C foi obtido em dimetilsulfóxido perdeuterado a 360 MHz e tinha os seguintes sinais: 10,51,

10,08, 9,84, 9,57, 9,10, 8,88, 8,03, 7,94, 7,53, 5,15 (todos os precedentes são trocáveis com D₂O), θ,67, 8,59, 8,51, 8,49, 8,38, 8,25, 8,24, 6,57, 6,52, 6,38, 6,11, 5,91, 5,78, 5,74, 5,70, 5,65, 5,63, 5,44, 5,15, 4,79, 4,67, 4,63, 4,23, 2,21, 1,62, 1,11 e 1,01.

Factor E de A10255

O factor E de A10255 é um pó não cristalino, branco a amarelo claro que é solúvel em dimetilsulfóxido, dimetilformamida, piridina, misturas de clorofórmio/ /metanol e 4:1 (v:v) de tetra-hidrofurano:água.

A análise elementar do factor E indica a composição percentual aproximada que se segue (média): carbono 48,03%; hidrogénio 3,91%; azoto 15,76%; oxigénio 17,09%; e enxofre 5,63%.

O peso molecular aparente do factor E de A10255 foi determinado por espectrometria de massa com bombardeamento por átomos rápidos como sendo aproximadamente 1258 daltons. A massa exacta do factor E foi determinada como sendo 1259,55 (M+H) usando Csl como referência padrão.

A titulação electrométrica do factor E de A10255 em dimetilformamida aquosa a 66% indica a presença de três grupos tituláveis com valores de pKa de 4,85, 11,1 e 13,2. A análise de aminoácidos do factor E (após hidrólise com ácido clorídrico 6N) indica a presença de amónia (8,580 mmoles/mg) e treonina (716 mmoles/mg). A análise também evidenciou um grande pico não identificado surgindo antes da posição do pico da histidina.

-120 espectro de absorção de ultravioletas para o factor E obtido em metanol neutro, ácido e básico demonstrou um t de 245 nm ( è = 77.000).

' max

O espectro de absorção de infravermelhos (disco KBr) está reproduzido na Fig.3 dos desenhos juntos. Os máximos de absorção mais significativos observados no espectro ocorrem a 3367, 3361, 2966, 1664, 1501, 1389, 1254, 1102 e 889 cm^-1.

O espectro de ressonância magnética nuclear de protões do factor E foi obtido em dimetilsulfóxido perdeuterado a 270 MHz e tinha os seguintes sinais: O 10,54, 10,00, 9,94, 9,81, 9,60, 9,56, 9,45, 8,89, 8,84, 8,66, 8,59, 8,50, 8,47, 8,39, 8,25, 8,22, 8,10, 6,53, 6,50, 6,24, 5,95, 5,86,, 5,84, 5,77, 5,64, 5,65, 5,52, 5,44, 5,10, 4,80, 4,66, 4,64, 4,22, 2,78, 1,60, 1,11 e 1,00.

Factor F de A10255

O factor F de A10255 é um pó não cristalino branco a amarelo claro que é solúvel em dimetilsulfóxido, dimetilformamida, piridina, 1:1 (v:v) de cloreto de metileno/metanol e 4:(v:v) de tetra-hidrofurano:água.

A análise elementar do factor F indica a composição percentual aproximada que se segue (média): carbono, 49,65%; hidrogénio; 4,23%; azoto 17,11%; oxigénio 22,08%; e enxofre 7,78%.

peso molecular aparente do factor F de A10255 foi determinado por espectrometria de massa de desabsorção de campo como sendo aproximadamente 1188 daltons.

A titulação electromérica do factor F

de A10255 em dimetilformamida aquosa, a 66% (começando em pH 7,08) indica a presença de um grupo titulável com um pKa de 12,5.

A análise de aminoácidos do factor F (após hidrólise com ácido clorídrico 6N) indica a presença de amónia (7,226 mmoles/mg) e treonina (735 mmoles/mg). A análise também evidenciou um pico grande não identificado surgindo antes da posição do pico da histidina.

espectro de absorção de ultravioletas para o factor F obtido em metanol neutro, ácido e básico demonstrou um ,L de 245 nm ( Q = 71.500).

max

O espectro de absorção de infravermelhos (disco KBr) está reproduzido na Fig. 4 dos desenhos juntos. Os máximos de absorção mais significativos observados no espectro ocorrem a 3369, 2943, 2907, 2846, 1663, 1588, 1519, 1493, 1425, 1337, 1288, 1251, 1151, 1110, 1083, 995, 927, 890, 807, 776 e 751 cm^-1.

O espectro de ressonância magnética nu clear de protões do factor F foi obtido em dimetilsulfóxido perdeuterado a 360 MHz e tinh

10,17	, 9,88	, 9,77	, 9,54	, 9,10
8,49,	8,38,	8,25,	8,24,	8,06,
6,23,	6,12,	6,12,	5,96,	5,77,
5,47,	5,14,	4 77	4,65,	4,62,
1,08,	0,98	e 0,98	•

os seguintes sinais: 10,51,

8,90, 8,88, 8,66, 8,59, 8,51,

7,94,	7,53,	6,56, 6,51,	6,27,
5,76,	5,71,	5,71, 5,64,	5,62,
4,20,	2,77,	2,48, 2,48,	1,58,

Factor G do A10255

Factor G do A10255 é um pó branco a amarelo, não cristalino que é solúvel em dimetilsulfóxido, dimetilformamida, piridina, misturas de clorofórmio/metanol e 4:1 (v:v) de tetra-hidrofurano:água.

A análise elementar do factor G indica a composição percentual aproximada que se segue:

Analise elementar:

Encontrado (%)

C

H

N

O

S

51,46

3,82

17,62

19,38

7,03

99,31%

O espectro de absorção de ultravioletas para o factor G em etanol neutro demonstrou um À = 247 nm ^c max ( € =72.200): solução ácida, = 247 nm ( £= 73.400), e solução básica / = 211 nm ( p = 27.200).

^v max ^c

O espectro de infravermelhos (disco KBr) para o factor G de A10255 está descrito na Fig. 5 dos desenhos juntos.

espectro de ressonância magnética nuclear do factor G foi obtida em dimetilsulfóxido perdeuterado a 500 MHz e tinha os seguintes sinais:

Ressonância NQ.	Desvio	Multiplicidade
1	10,53	S
2	9,95	S
3	9,83	S
4	9,79	S
5	9,59*	BS
6	9,09	S
7	8,89	T
8	8,84	D
9	8,68	S
10	8,60	S
11	8,51	S
12	8,48	D
13	8,39	S
14	8,24	S
15	8,24	D
16	8,04	D
17	6,53*	S
18	6,47	Q
19	6,10	S
20	5,95	S
21	5,84	S
22	5,81	S
23	5,80	S
24	5,78	S
25	5,76*	S
26	5,68	S
27	5,64	S
28	5,44	DQ
29	5,16	D
30	4,75	DD
31	4,67	DD
32	4,63	DD
33	4,24	BS

(Continuação ) Ressonância NQ.

Desvio

1,77

1,62

1,11

Multiplicidade

Q

Q *Duplamente intenso

BS=singeleto largo

DD=dubleto de dubletos

DQ=dubleto de quartetos

Espectro de Ressonância Magnética z

Nuclear C do factor G foi obtido em dimetilsulfóxido perdeuterado a 125 MHz;

Ressonância N2.	Desvio	Multiplicidade
1	172,80	S
2	168,89	S
3	168,71	S
4	164,80	s
5	163,59	s
6	163,00	s
7	162,79	s
8	162,61	s
9	162,53	s
10	161,52	s
11	160,24	s
12	160,12	s
13	159,94	s
14	159,42	s
15	158,91	s
16	158,01	s
17	149,41	s

Continuação

Ressonância N°.	Desvio	Multiplicidade
18	148,73	S
19	148,04	S
20	146,83	S
21	141,94	D
22	141,26	D
23	140,62	D
24	139,20	S
25	136,25	S
26	136,20	S
27	136,04	S
28	134,20	S
29	133,81	S
30	133,22	S
31	130,14	S
32	128,99	D
33	128,70	S
34	127,08	D
35	125,83	D
36	124,92	D
37	123,66	S
38	121,40	D
39	110,77	T
40	110,22	T
41	109,85	T
42	109,35	T
43	106,12	tp
44	104,65	T
45	67,26	D
46	57,94	D
47	46,49	D
48	40,12	Q
49	20,60	Q
51	20,22	Q
52	13,41	Q

Factor H de A10255 factor H é um pó não cristalino, branco a amarelo claro que é solúvel em dimetilsulfóxido, dimetilformamida, piridina, 1:1 (v:v) cloreto de metileno/metanol e 4:1 (v:v) de tetra-hidrofurano:água.

A análise elementar do factor H indica a composição percentual aproximada que se segue:

Análise Elementar:

Encontrado%

C50,36

H3,72

N18,61

018,54

S8,20

99,43%

O espectro de absorção de ultravioletas para o factor H em etanol neutro demonstrou um X max de 244 nm ( C = 74.000); solução ácido A = 245 nm (é = max = 74.500); e solução básica Λ = 211 nm ( 8 = 23.800). ' ^v max

O espectro de ressonância magnética nuclear de do factor H de A10255 a 125 MHz em dimetilsulfóxido perdeuterado tem os sinais que se seguem:

Ressonância	N° .	Desvio	Multiplicidade
1		172,92	S
2		168,92	S
3		168,86	S
4		165,14	S
5		163,63	S
6		163,03	S
7		162,65	S
8		162,33	S
9		161,52	S
10		160,30	S
11		160,14	S
12		159,99	S
13		159,45	S
14		158,94	S
15		158,09	S
16		149,43*	S
17		148,78	S
18		148,03	S
19		146,90	S
20		142,07	D
21		141,30	D
22		140,68	D
23		139,21	S
24		136,96	S
25		136,10	S
26		134,67	S
27		134,07	S
28		133,80	S
29		130,27	S
30		129,03	S
*Duplamente	intenso
31		128,78	D
32		127,24	D
33		125,94	D
34		124,99	D

-20Continuação

Ressonância	N°. Desvio	Multiplicidade
35	123,71	S
36	121,50	D
37	111,76	T
38	110,45	T
39	106,11	T
40	104,67	T
41	104,44	T
42	67,39	D
43	57,95	D
44	46,54	D
45	40,22	T
46	20,66	Q
47	20,34	Q
48	13,52	Q
	O espectro de ressonância magnética nu
clear de ¹H	a 500 MHz em dimetilsulfóxido	perdeuterado tin-
ha os seguintes sinais:
Ressonância	NS. Desvio	Multiplicidade
1	10,51	S
2	10,08	S
3	9,81	S
4	9,79	S
5	9,57	S
6	9,10	S
7	8,86	T
8	8,83	D
9	8,68	S
10	8,60	D
11	8,51	S

8.50

D

Continuação Ressonância N°.	Desvio	Multiplicidade
13	8,39	S
14	8,25	D
15	8,24	S
16	8,03	D
17	7,94	S
18	7,53	S
19	6,56	S
20	6,53	S
21	6,48	Q
22	6,12	S
23	5,96	S
24	5,80	S
25	5,78	S
26	5,74	S
27	5,72	S
28	5,65	S
29	5,64	S
30	5,44	DQ
31	5,15	D
32	4,80	DD
33	4,68	DD
34	4,63	DD
35	4,24	BS
36	1,78	D
37	1,62	D
38	1,10	D

espectro de infravermelhos (disco KBr) para o factor H de A10255 está descrito na Fig. 6 dos desenhos juntos.

peso molecular do factor H de A10255 foi determinado por espectrometria de massa de bombardeamento com átomos rápidos como sendo de aproximadamente 1160; a massa exacta foi determinada como sendo 1161,32 (M+H) usando Csl como padrão referência.

A estirpe parental produtora de A10255, _S. gardneri NRRL 15537, também identificada como A10255.1, foi classificado como tal por estudos taxonómicos efectuados como descrito pelos parágrafos que se segue.

Taxonomia da estirpe Ã10255.1

Os estudos taxonómicos da estirpe A10255. foram efectuados por Mr. Frederick P. Mertz da Lilly Research Laboratories. Com base nestes estudos o organismo é classificado como uma nova estirpe de Streptomyces gardneri (Waksman 1942) Waksman 1961 ATCC 23911. Esta classificação é baseada num exame de descrições publicadas desta espécie /^-R. E. Buchanan, e N.E. Gibbons (eds), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8a Edição, The Williams and Wilkins Cs., Baltimore, 1974; E.B. Shirling e D. Gottlieb, Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces Int. J. Syst. Bacteriol. 18 (4): 279-392 (1968); e S.A. Waksman, The Actinomycetes Vol. II, The Williams e Wilkins Co., Baltimore, 1961 7 e comparações simultâneas entre laboratórios.

Os métodos recomendados pelo International Streptomyces Project (ISP) para a caracterização de espécies de Streptomyces /~^Ε·^Β· Shirling e D. Gottlieb,

Mzthods for Characterization of Streptomyces Species, Int.

J. Syst. Bacteriol 16 (3), 313-340 (1966) 7 foram seguidos juntamente com certos testes suplementares / D. J. Blazevic e G.M. Ederer. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology, Jonh Wiley and Sons, Inc., New York, 19757.

A utilização do carbono foi determinada em meio base ISP N2 9 a que foram adicionados fontes de carbono esterifiçadas pro filtração de modo a igualar uma concentração final de 1,0 por cento. Placas foram incubadas a 30°C e analisadas após 14 dias.

A produção de pigmento melanóide (cromogemicidade) foi determinada com ISP N2 1 (caldo de triptona-extracto de levedura), ISP N2 6 (agar com peptona-extracto de levedura e ferro), ISP N2 7 (agar com tirosina) e ISP N2 7 modificado a que foi removida a tirosina.

A hidrólise do amido foi determinada testando a presença do amido com iodo em placas de ISP N2 4 (agar com sais inorgânicos-amido) (ver Blazevic e Ederer, supra).

A morfologia foi estudada usando um microscópio óptico. Para estudar a ornamentação da superfície do esporo usou-se um microscópio electrónico de scanning (SEM).

A tolerância ao cloreto de sódio foi medida pela adição de cloreto de sódio ao agar de ISP N2 2 de modo a igualar a concentração pretendida.

Para dar nomes de cores usaram-se Centroid Color Charts ICSS-NBS, amostra padrão N2 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U. S. Department of Washington, D.C.) e o Color Harmony Manual (4^ Ed., Color Standards

Department, Container Corporation of América, Chicago, Illinois , 1958 ) .

Os açúcares da parede celular foram determinados com o processo de M.P. Lechevalier, Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinicai Importance, | J. Lab. Clin. Med., 71, 934-944 (1968). Os isómeros do ácido diaminopimélico (DAP) foram estabelecidos por métodos cromatográficos descritos em B. Becker, M.P. Lechevalier. R.E. Gordon e H.A. Lechevalier, Rapid Differentiations between Nocardia e Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolyates , Ãppl. Microbiol 11, 421-423 (1964).

I

Características das culturas

A10255.1 é caracterizado por um vegetativo limitado e micélios aéreos fracamente desenvolvidos. O micélio aéreo tem uma cor de massa de esporos na série de cores entre o branco (W) e o cinzento (GY). A côr mais próxima da tabela no sistema de Tresner e Backus /~Color Harmony Manual, supra; e E.J. Backus e H.D. Tresner, System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy, Appl. Microbiol., 11, 335-338 (1926)_7 para a série de côr branca é branco ostra b e na série de côr cinzento é cinzento claro d. Esta característica da cultura é melhor observada em agar com asparagina e glicerol (ISP NQ. 5). 0 micélio aéreo desenvolve-se tão pouco na maior parte dos meios que a determinação de umacôr é muito díficil.

lado reverso desta cultura não tem pigmentos distintos. A côr do lado reverso vai de amarelo alaranjado a castanho amarelado e a côr não é afectada pelo pH. 0 único pigmento solúvel produzido é um pigmento castanho claro em agar com tirosina (ISP N° 7) e em agar de farinha de aveia e pasta de tomate (TPO) e um pigmento laranja

claro produzido em agar com Gl.icerol-Glicina. Quando semeada para observar a variabilidade esta cultura mostrou-se estável e homogénea.

As características de cultura da estirpe A10255.1 e de í>. gardneri ATCC 23911 estão descritas abaixo na Tabela 1.

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Característica de cultura de A10255.1 e de S. gardneri ATCC 23911

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-27Tabela 1 Continuação

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Tabela 1 Continuação

Característica de cultura de A10255.1 e de S. gardneri ATCC 23911 Agar

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Características morfológicas

A cultura de A10255.1 produz um micélio aéreo, não fragmentável, fracamente desenvolvido que é ramificado monopódicamente. Os esporóforos estão arranjados em ramos lineares e flexíveis. Não se observaram espirais, I escleróticos, esporângios ou esporos móveis. A 10255.1, está colocada na secção de Rectus-flexibilus (RF) de Pridlsam et al /^-T. G. Pridham et al., A Guide for the Classification of Streptomyces Acoording to Selected Groups, Appl. Microbiol., 6, 52-79 (1957)7.

I Observou-se a mesma morfologia em todos os meios onde se verificou crescimento de micélio aéreo. As cadeias de esporos maduros contêm geralmente entre 10 e 50 esporos por cadeia.

A forma do esporo é cilíndrica. 0 tamanho do esporo varia entre 0,9-1,0 juM de comprimento e 0,5-0,6 yuM de largura. O tamanho médio é de 1,6 x 0,6 yiiM. A ornamentação da superfície do esporo é lisa.

Características fisiológicas

Os hidrolisados de células totais contêm o ácido LL-diaminopimélico sem que o isómero meso esteja presente. Os açúcares presentes nos hidrolisados de células totais eram glucose, manose e ribose. Estas características representam uma parede celular Tipo I e um padrão de açúcares NC, ou não característico /~M.P. Lechevalier, supra 7. Esta combinação dos principais constituintes da parede celular é indicativo do género Streptomyces /M.P. Lechevalier, supra, e R.E. Buchaman e N.E. Gibbons (eds.)., supra 7.

O padrão de utilização de carbono para A10255.1 é como se segue: L-arabinose, D-fructose, D-galac-

tose, D-glucose, i-inositol, rafinose e D-xilose são utilizados no crescimento. D-manitol, L-ramnose, salicina e sucrose não suportam o crescimento. A Tabela 2 abaixo compara os padrões de utilização do carbono observados para A10255.1 e £5. gardneri ATCC 23911.

Tabela 2

Utilização dos Compostos de Carbono por

A10255 .1 e S^. gardneri ATCC 23911

Fonte de Carbono	A10255 .1	S. gardneri
Sem carbono	a	-
L-arabinose	₊ ^b	+
D-fructose	+	+
D-galactose	+	+
D-glucose	+	+
i-inositol	+	-
D-manitol	-	-
rafinose	+	+
L-ramnose	-	+
salicina	-	-
sucrose	—	+

D-xilose +

-^a = não utilização b . ., .

+ = utilização

A cultura A10255.1 hidroliza o am.ido e hidroliza parcialmente o leite desnatado, produz catalase, liquefaz a gelatina e reduz nitratos em nitritos.

A10255.1 tolerará até 6 por cento de cloreto de sódio e crescerá a temperaturas que variam entre 4^o e 40°C.

Produzem-se pigmentos melanóides quando A10255.1 é crescido em caldo de triptona-extracto de levedura (ISP NP. 1) e em agar inclinado de peptona e extracto de levedura (ISP N° 6). Não se produziram pigmentos melanóides em agar inclinado com tirosina (ISP NP 7).

Determinação da Éspecie

Usando as características de cultura, morfológica e fisiológicas de A10255.1, fez-se uma comparação com as descrições publicadas para espécies semelhantes. Seleccionaram-se quatro espécies de Streptomyces para examinar comparativamente em simultâneo no laboratório:

a

Streptomyces aureofasciculus a

Streptomyces aureomonopodioles Streptomyces flavochromogenes c

Streptomyces gardneri £

E.B. Shirling e D. Gottlieb, Cooperativo Description of Type Cultures of Streptomyces Int. J. Syst. Bacteriol. 19 (4), 375-390 (1969).

E.B. Shirling e D. Gottlieb, Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces, Int. J. Syst. Bacteriol. 22 (4), 265-394 (1972).

^c E.B. Shirling e D. Gottlieb, Cooperative Description

of Type Cultures of Streptomyces, Int. J. Syst. Bacteriol. 18 (4), 279-392 (1968).

As comparações feitas no laboratório indicaram diferenças significativas relativamente a Í5. aureofasciculus e a S. flavochromogene e uma boa concordância com _S. aureomonopodiales e í5. gardneri. No entanto, como SI. aureomonopodiales não está na lista Aprovada dos Nomes Bacterianos, deixou de ser considerada.

A10255.1 é muito semelhante a S^. gardneri nas características de cultura, morfológicas e fisiológicas. A característica de cultura perdominante que distingue ambas as estirpes é a formação muito fraca de hifas aéreas na maior parte dos meios. S>. gardneri está descrita na literatura como pertencendo à série Gray (Cinzento) (GY). No entanto, na descriação original por Waksman /~S.A. Waksman, supra 7 e nas comparações de laboratório com A10255.1, ela produziu hifas aéreas brancas (W) -e cinzentas (GY). A côr do lado reverso de ambas as culturas é quase idêntica. Ambas as culturas possuem uma morfologia Rectus-flexibilus (RF), ornamentação lisa da superfície dos esporos, forma dos esporos cilíndrica e cadeias de 10-50 esporos.

A produção de catalase, liquefação de gelatina, produção de pigmentos melanóides, redução de nitratos e hidrólise do leite e amido foram as mesmas para ambas as estirpes.

As diferenças entre A10255.1 e Í3. gardneri são mínimas. S. gardneri tem menos tolerância ao cloreto de sódio e uma gama de temperaturas mais baixas do que A10255.1. A utilização de L-ramnose, sucrose e incapacidade para utilizar i-inositol destingue £. gardneri de A10255.1. Estas semelhanças e diferenças estão resumidas em baixo.

Comparação entre A10255.1 e Streptomyces gardneri

Semelhanças

Cor da massa de esporos aérea (W) Catalase positiva

Hidrolisados de parede celular (LL-DAP) Ausência de pigmentos distintos

Liquefação da gelatina

Morfologia (RF)

Redução de nitratos

Hidrólise parcial do leite

Pigmentação reversa

Ausência de pigmentos solúveis

Comprimento da cadeia de esporos

Forma do esporo

Ornamentação da superfície do esporo (Sm)

Hidrólise do amido

Diferenças

Utilização de carbono

Tolerância ao cloreto de sódio

Gama de temperaturas

As semelhanças e diferenças entre as duas culturas estão descritas abaixo detalhadamente na Tabela 3:

Tabela 3

Comparação de A10255 .1 e S.	gardneri	(ATCC 23911)
Características	A10255.1	S. gardneri
Cor da massa de esporos aérea	(W)	(w)
Padrão de utilização de carbono
i-inositol	+	-
L-ramnose	-	+
sucrose	-	l·
Catalase
Tipo de parede celular	I	I
Pigmentos diferênciadores	-	-
Liquefação da gelatina	+	+

Produção de pigmentos melaróides

ISP No. 1	+	+
ISP No. 6	+	+
ISP No. 7	-	-
Morfologia	(RF)	(RF)
Tolerância ao NaCl - %	6	4
Redução de nitratos	+	+
Côr reversa	YBr	YBr
Hidrólise do leite desnatado	parcial	parcial
Pigmentos solúveis	-	-
Comprimento da cadeia de esporos	10-50	10-50
Forma dos esporos	cilíndrica	cilíndrica
Superfície dos esporos	lisa	lisa
Hidrólise de amido	+	+
Gama de temperaturas - °C	4-40	4-37

Os resultados das comparações descritas acima indicam que A10255.1 é muito semelhante a S,. gardneri. Assim, a cultura de A10255.1 é classificada como uma estirpe de Streptomyces gardneri (Waksman, 1942) Waksman 1961, ATCC 23911. Í5. gardneri é reconhecida na Lista Aprovada de Nomes Bacterianos / U.B.D. Skerman et al., Approved Lists ! | of Bacteriol Names, Int. J. Syst. Bacteriol. 30 (1), 225-420 (1980) 7 e consequentemente é uma espécie válidamente I publicada.

Deverá ser referido que Kurylowicz et al. /W. Kurilowicz, A. Paszkiewicz, W. Woznicka e W. KurzaI tkowski, Numerical Taxonomy of Streptomyces Polish Medicai

Publishers, 1975J, quando da classificação de Streptomyces, tanto pelo método de dendrites de semelhança de Wsoclaw como pelo método numérico do Método de Semelhança Global, colocaram S^. aureomonopodiales e SI. gardneri no mesmo grupo. Um dendograma baseado neste estudo relaciona/estas duas estirpes numa semelhança percentual de 94. Esta semelhança sugere que a distinção em espécies não é justificada.

A cultura de Streptomyces gardneri descrita acima foi depositada e incluída na colecção de cultu| ras stock do Northern Regional Research Division, U. S.

Departament of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, IL, 61604. Quando da publicação da presente especificação, a cultura ficará disponível ao público neste ramo do Departamento de Agricultura com o número NRRL 15537.

Descrição da estirpe A10255.10 (NRRL 18260)

A estirpe A10255.10 NRRL 18260 derivou da estirpe parental A10255.1, NRRL 15537, por uma série de tratamentos sequênciados com NTG-(N-nitrosoguanidina).

Taxonomia da estirpe A10255.2

A estirpe A10255.2 (referida atrás como Streptomyces gardneri estirpe NRRL 15 a 22) é um mutante da A10255.1 obtido com NTG (N-nitrosoguanidina). Esta última estirpe é Streptomyces gardneri NRRL 15537.

Existem muitas semelhanças nas taxonomias das estirpes A10255.1 e A10255.2. A comparação taxonómica entre as estirpes A10255.1 e A10255.2 está descrita abaixo sob a forma de tabela

-38I

Tabela 4

Características de cultura de A10255.1 e A10255.

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-39Tabela 4 continuação

Características de cultura de A10255.1 e A10255.2

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-41Tabela 4 continuação

Caracteristicas de cultura de A10255.1 e A10255.2

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Comparação das estirpes A10255.1 e A10255.2

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-43A cultura AIΟ255.2 de Streptomyces gardneri atrás descrita foi depositada e incluida na colecção de cultura stock da Northern Regional Research Division, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peria, IL, 61604, sob o número NRRL 15922.

Produção dos Factores Antibióticos e sua Actividade Biológica i

O complexo antibiótico A10255 pode ser produzido pela cultura do microorganismo não descrito pré- I viamente Streptomyces gardneri, NRRL 15537, estirpe NRRL 18260|

............ I ou estirpe NRRL 15922 ou um seu mutante produtor de A10255, num meio de cultura contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos, em condições de fermentação aeróbica submersa até ser produzido o complexo antibiótico A10255 ' e preferêncialmente até ser produzido um nível substancial de actividade antibiótica. A maior parte da actividade antibiótica está geralmente associada ao micélio, enquanto que quantidades pequenas de actividade antibiótica se encontram no caldo. O complexo A10255 é fácilmente separado da mistura de fermentação por remoção do micélio (a biomassa) por filtração. Normalmente rejeita-se o caldo. O complexo antibiótico é então isolado a partir do micélio.

A estirpe parental NRRL 15537 produz o factor B como o factor mais abundante. A estirpe mutante NRRL 18260 produz B e G como os factores mais abundantes. Os restantes factores C, E, F e H foram até agora produzidos apenas em pequenas quantidades com qualquer uma destas estirpes .

Os micélios são extraídos com solventes polares (como seja 4:1 de acetona:água), concentrados, acidificados, extraídos de novo com um solvente orgânico (ace-44-

tato de etilo, por exemplo) e as soluções resultantes são j concentradas para precipitar o complexo A10255.

complexo A10255 pode ser usado sem j posterior purificação e misturado directamente em alimentos ι para animais ou premisturas de ração para animais. Como alternativa, o complexo antibiótico A10255 pode ser ainda pu- j rificado e separado nos seus factores individuais por técni- i cas cromatográficas bem conhecidas tais como cromatografia com camada fina, cromatografia em coluna e especialmente vários processos de cromatografia líquida de alta resolução.

Na Secção experimental são discutidos alguns processos específicos para o isolamento de factores individuais.

Podem ser usados vários meios diferentes com NRRL 15537, NRRL 18260 ou NRRL 15922 para produzir o complexo A10255. No entanto para economia ha produção,rendimento óptimo e facilidade de isolamento do produto são pre- | feridos determinados meios de cultura. Estes meios devem con- | ter fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos, j Fontes de carbono adequadas incluem glucose, amido, maltose, j fructose e glicerol. Os níveis óptimos das fontes de carbo- ! no vão de cerca de 2 a cerca de 5 por cento por peso.

As fontes de azoto preferidas incluem produtos da digestão ácida da soja, produtos da digestão ácida ou enzimática da cadeina, sais de amónio, sais de nitrato, glicina, alanina, serina, asparagina e glutamina.

Os micronutrientes essenciais necessários para o crescimento e desenvolvimento do organismo podem ocorrer como impurezas noutros constituintes do meio em quantidades suficientes para satisfazer as necessidades de crescimento e biossintéticas do organismo. No entanto, pode ser benéfico incorporar no meio de cultura sais inorgânicos adicionais capazes de fornecerem iões de sódio, potássio, magnésio, cálcio, amónio, iões ferroso, cloreto, carbonato, fosfato, sulfato, nitrato e iões similares.

Se bem que pequenas quantidades do antibiótico A10255 possam ser obtidas por cultura em balões com agitação, a fermentação aérobica submersa em tanques é um método preferido para a produção de quantidades substânciais do antibiótico A10255. Para a fermentação em tanques é preferível usar um inoculo vegetativo. 0 inoculo vegetativo é preparado por inoculação de um pequeno volume de meio de cultura com a forma de esporo, ou fragmentos, para se obter uma cultura fresca de crescimento activo do organismo. 0 inoculo vegetativo é então transferido para um tanque maior onde, após um tempo de incubação adequado, o antibiótico A10255 é produzido com um bom rendimento.

Os organismos produtores de A10255 produzem o complexo A10255 numa gama de temperaturas que vai desde cerca de 23° até cerca de 37°C. A produção óptima do complexo antibiótico A10255 parece dar-se a uma temperatura contra cerca de 32°C.

Como é hábito em processos de cultura aeróbica submersa, o ar estéril é disperso pelo meio de cultura. Para crescimento eficaz do organismo, ovolume de ar usado na produção em tanque é na gama de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 volumes de ar por volume de meio de cultura por minuto (v:v:m), com aproximadamente 100 a aproximadamente 300 RPM de agitação. Uma velocidade óptima num vaso de 165 litros contendo 100 litros de meio de fermentação é cerca de 0,125 v/v/m com agitação fornecida por uma hélice rodando a cerca de 200 RPM.

A fermentação produz de um modo geral actividade antibiótica após cerca de 40 horas. O pico de produção do antibiótico ocorre entre cerca de 110 horas e cerca

de 140 horas de tempo de fermentação.

A produção do antibiótico A10255 pode ser controlada durante a fermentação por difusão em agar usan do Bacillus subtilis ATCC 6633 ou por métodos de turbidimetria usando Staphylococus aureus ATCC 9114.

O complexo A10255 e factores individuais são agentes antimicrobianos e são especialmente activos contra microorganismos gram-positivos, conforme ilustrado pelos dados de teste in vitro e in vivo que se seguem. Na Tabela 6 que se segue é apresentada a concentração mínima inibidora, (MIC, em microgramas/mililitro) para os factores contra uma amostragem de bactérias patogénicas gram-positivas e gram-negativas. Os valores de MIC foram obtidos pelo método do teste convencional de diluição em agar.

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Os compostos A10255 também demonstraram excelente actividade antimicrobiana contra uma série de estirpes de Clostridium difficile. Em particular, em testes convencionais de diluição em agar o complexo A10255- e factores B, C, E e F apresentam MICs menores ou iguais a 0,03 microgramas/mililitro. Por comparação, nos mesmos testes para o complexo e factores B e C, o antibiótico vancomicina apresentou um MIC de 2 a 4 microgramas/mililitro.

O complexo A10255 e o factor C foram testados contra várias espécies de Bacteróides e demonstraram excelentes actividades microbianas. Os resultados deste teste de diluição em agar está descrito na Tabela 7 abaixo.

Tabela 7

Actividade dos Compostos A10255 vs.

Estirpes seleccionadas de espécies de Bacteroides

Organismo teste		MIC (mcg/ml)
Estirpes de B. fragilis	Complexo	A10255 Factor C
1877	0,5	0,5
103	0,5	0,5
104	0,06	0,06
106	0,06	0,06
107	1,0	1,0
108	1,0	1,0
110	0,5	°,5
111	1,0	1,0
112	1,0	1,0
113	1,0	1,0
1451	0,25	0,25
1470	1,0	1,0
2	0,5	0,5
9	1,0	1,0
9032	1,0	1,0
B. corrodens 1874	0,5	0,5
B. vulgatis 1563	0,25	0,25
B. thetaiotaomicron 1438	0,5	0,5
B. thetaiotaomicron 1900A	0,5	0,5

50O complexo Α10255 e os factores individuais demonstraram actividade antimicrobiana contra uma vasta variedade de microorganismos anaeróbicos. A actividade antimicrobiana está descrita abaixo na Tabela 8. Os resultados apresentados na Tabela são valores de MIC de um teste convencional de diluição em agar.

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Tabela 8

Actividade los Compostos A10255 vs. Bactérias Anaeróbicas

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Tabela 8 continuação

Actividade dos Compostos A10255 vs. Bactérias Anaeróbicas

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-530 complexo A10255 e o factor B demonstraram um LDj-q superior a 300 mg/kg XI e superior a 75 mg/ /Kg XI, respectivamente. Os resultados foram obtidos por in jecção intraperitoneal em ratinhos.

Os antibióticos A10255 são agentes pro motores do crescimento de animais de sangue quente economicamente importantes como seja criação, porcos e vacas. Em galinhas o complexo AIO255 melhorou os ganhos de peso e a eficácia dos alimentos. A Tabela 9 resume os resultados de dois testes em que o complexo foi dado ad libitum a pintos com 7 dias de idade, durante 14 dias numa bateria de testes (dez gaiolas de sete pintos por tratamento). Os resultados da velocidade de crescimento dos pintos tratados com o complexo foram comparados com os de um número igual de elementos de um tratamento testemunha simultâneo.

O efeito promotor do crescimento em aves de capoira está ilustrado pelos dados dos testes que se seguem obtidos com galinhas.

o 4-1 c Φ ε fO

Tabela 9

Actividade Promotora do Crescimento do Complexo A10255 em galinhas

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-55Para promover o crescimento de galinhas, o complexo A10255 ou os seus factores individuais devem ser administrados com a ração para galinhas em proporções de cerca de 0,5 até cerca de 50 gramas do compelxo A10255 ou factores individuais pro tonelada de alimento para galinhas. Os resultados mais benéficos foram observados quando o complexo A10255 ou factores individuais são administrados em proporções de cerca de 5 a cerca de 20 gramas do complexo A10255 ou factor pro tonelada de alimento para galinhas .

Um outro aspecto deste invento é uma composição alimentar para aumento da eficácia de utilização de alimentos e promoção do crescimento em aves de capoeira. A composição da ração compreende alimento para galinhas e uma quantidade eficaz do complexo A10255, factor B de A10255, factor C de A10255, factor E de A10255, factor F de A10255, factor G de A10255 ou factor H de A10255. Uma quantidade eficaz do complexo ou dos factores individuais vai de aproximadamente 0,5 a 50 gramas por tonelada e de preferência de cerca de 5 a cerca de 20 gramas por tonelada de alimento para galinhas. A ração para galinhas usada na composição alimentar pode ser qualquer ração convencional para galinhas .

A formulação das composições alimentares é conseguida por processos de mistura bem conhecidos em farmacêutica veterinária.

Uma composição alimentar preferida compreende uma quantidade eficaz do complexo A10255 e ração para galinhas.

O complexo A10255 apresenta actividade promotora do crescimento e potenciadora da eficácia da alimentação em porcos recém desmamados. A evidência de tal ac-

tividade está descrita em baixo na Tabela 10 que resume os resultados de nove ensaios empregando o complexo. Nestes ensaios os porcos tinham um peso médio inicial de 24 libras e acabaram o estado com um peso médio de 53 libras. Os porcos foram engaiolados 4 por gaiola numa maternidade com ambiente controlado e foram alimentados ad libitum com uma dieta de milho-soja com 18% de proteína. Todos os estudos duraram 35 dias, usou-se duas a três unidades experimentais por tratamento e uma média de quatorze animais por tratamento.

Na Tabela 10 as figuras entre parêntesis indicam a alteração percentual relativamente ao grupo testemunha. Uma alteração percentual negativa na coluna Alimento/Ganho indica uma melhoria no Alimento/Ganho (eficácia do alimento) dos porcos alimentados com o complexo A10255.

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Tabela 10

Efeito do complexo A10255 em porcos recém-desmamados

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Um outro aspecto do invento é uma composição alimentar para aumento da eficácia de utilização de alimentos e promoção do crescimento em porcos recém-desmamados. A composição alimentar compreende ração para porcos e uma quantidade eficaz de complexo A10255, factor B de A10255, factor C de A10255, factor E de A10255, factor F de A10255, factor G de A10255 ou factor H de A10255.

termo quantidade eficaz na composição alimentar para porcos recém-desmamados significa aproximadamente 20 a 40 partes por milhão do complexo A10255 ou factores individuais por unidade de alimento total. O alimento usado para a composição destinado a porcos recém-desmamados é qualquer uma das rações normais usadas com porcosrecém-desmamados. A composição alimentar pode ser formulada por qualquer um dos métodos bem conhecidos em farmacêutica veterinária.

Uma composição alimentar preferida para porcos recém desmamados compreende ração para porcos e uma quantidade eficaz do complexo A10255.

O complexo A10255 também melhora a efiI cácia de utilização de alimentos em ruminantes que tenham uma ruminante desenvolvida. O aumento na eficácia provocado pelos antibióticos A10255 pode ser controlado através da observação da produção e concentração dos compostos de propionato no rumen usando o método descrito por James R. Beck.

) e Joseph A. Yahner, Patente U.S. NQ 4.333.923, publicada em de Junho de 1982, aqui incluido como referência. A Tabela 11 mostra a proporção da produção de ácidos gordos voláteis (VFA) em frascos tratados com o complexo A10255 relativamente à produção em frascos testemunha neste teste obtido a partir do método de Beck e Yahner.

-59Tabela 11

Efeito do complexo A10255 na Eficácia de

Utilização de alimentos por

Ruminantes

Dosagem mcg/mL	Propionato	Acetato	Butirato	VFA Total mM/L
5	1,623	0,903	0,538	1,03
1	1,406	0,965	0,604	1,02

Razão entre as velocidades de produção/moles/d) em frascos tratados e as velocidades de produção em frascos testemunha

Os compostos A10255 são tipicamente eficazes para aumentar o propionato e portanto, a eficácia de utilização de alimentos quando administrados oralmente a ruminantes.

A Tabela 12 que se segue resume os dados demonstrando os efeitos do complexo A10255 no crescimento e utilização de alimentos por gado vacunm. 0 estudo foi conduzido durante um período de 79 dias nos três grupos de animais.

Tabela 12

Efeito do complexo A10255 no crescimento de
	gado produtor de carne
Dose de Grupo A10255^a	Ganho de b peso	Resposta	Conversão de alimentos	Resposta
l^c 2^d	0 275	2,76 2,88	(+4%)	6.94 5.94	14%
3®	550	2,74	(-1%)	5,79	17%
	a mg/cabeça/dia b λ- por dia	c_n 9 animais ^10 animais	e_n 9 animais

Um outro aspecto deste invento é um mé- j todo para aumentar a eficácia de utilização de alimentos do j gado, o qual se caracteriza pela administração a gado de uma quantidade eficaz do complexo A10255 ou uma quantidade eficaz de um factor de A10255. Um método preferido compreende a administração a gado de uma quantidade eficaz do complexo A10255 .

De acordo com o método aqui fornecido para promoção do crescimento em gado, aos animais é dado oralmente uma quantidade eficaz do complexo A10255 ou de um seu factor. 0 termo quantidade eficaz refere-se a aproximadamente 0,05 mg/Kg/dia até cerca de 5,0 mg/kg/dia. As dosagens preferidas para administração oral vão de cerca de 0,1 mg/Kg/dia até cerca de 3,0 mg/kg/dia. O complexo ou factor antibiótico pode ser administrado oralmente com a ração para gado; no entanto ele pode ser administrado por outras vias, por exemplo poções, bolus ou cápsulas. A mistura do composto A10255 com o alimento para gado é a via de administração preferida. A formulação destas várias formas de dosagem é conseguida por métodos bem conhecidos da farmacêutica

veterinária .

Um outro aspecto do invento consiste numa composição alimentar para aumentar a utilização de alimentos do gado. A composição alimentar compreende ração para gado e uma quantidade eficaz do complexo A10255 ou um factor de A10255. Uma composição alimentar preferida para gado compreende ração para gado e uma quantidade eficaz do complexo A10255. A composição alimentar mais preferida para gado compreende a ração para gado e uma quantidade eficaz do factor B de A10255 ou do factor G de A10255. Os factores individuais B, C, E, F, GeHde A10255 parecem ser de grosso modo bioequivalentes.

Nas composições alimentares acima para gado, o termo quantidade eficaz é como definido acima para o método de estimulação da utilização de alimentos em gado. A ração para gado usada conjuntamente com a composição alimentar pode ser qualquer ração alimentar convencional para gado.

Num outro aspecto deste invento, ocomplexo A10255 e seus factores e especialmente o factor B de A10255, são úteis na identificação de espécies de Streptomyces possuidoras de um gene portador da resistência à tiostreptona. Tais espécies podem ter um gene de resistência natural à tiostreptona ou podem ter um após transformação com um plasmídeo ou outro vector de clonagem contendo um gene de resistência à tiostreptona. Assim, A10255B e o complexo A10255 são permutáveis com o antibiótico tiostreptona para detectar a marca de resistência à tiostreptona em experiências de DNA recombinante com estirpes de Streptomyces.

Específicamente, os protoplastos da espécie S. fradiar, S. lividans ou S. griseofuscus são transformados com um plasmídeo (por exemplo, pIJ702 ou pHJL401) contendo o gene que confere resistência à tiostreptona (C.J.

-62Thompson et al., Nature, 286, p. 525-527 (1980)). Os protoplastos foram inoculados num meio sólido adequado à regeneração da parede celular e incubados durante a noite (aproximadamente 16 horas) a 29°C A10255 é adicionado a uma camada de agar mole para cobertura que é depois vertida sobre a superfície da placa contendo os protoplastos em regeneração. A quantidade do(s) antibiótico(s) usado(s) na camada de cobertura deve ser suficiente para dar uma concentração de aproximadamente 50 jig/ml após aplicação ao meio de regeneração. As placas foram então incubadas durante sete a quatorze dias a 29°C para permitir o crescimento para fora da subpopulação de células contendo o plasmídeo portador do gene que confere resistência à tiostreptona. Nestas condições, as células que não receberam o plasmídeo não crescem. Os transformantes resistentes a A10255 são então transferidos para meio contendo 50 jig/ml de A10255 que assegura a manutenção do plasmídeo portador do gene que confere resistência à tiostreptona.

Os compsotos antimicrobianos (i.e. complexo A10255 e factores individuais) deste invento são úteis para o tratamento terapêutico ou profilático de infecções em animais de sangue quente causadas por bactérias patogénicas. Os compostos antimicrobianos podem ser administrados oralmente, parenteralmente (por exemplo, intravenosamente, intramuscularmente ou subcutâneamente) ou como uma pomada ou solução para o tratamento de infecções bacterianas em animais de sangue quente.

Um outro aspecto do presente invento respeita a compsoições farmacêuticas do complexo A10255 ou dos factores individuais. Estas composições são compostas por uma quantidade terapêuticamente activa dos presentes compostos antibióticos (i.e. o complexo A10255 ou factor B, factor C, factor E, factor F, factor G ou factor H, separadamente) e um veículo adequado. Relativamente às composições para administração oral (por exemplo comprimidos e cápsulas), o

-63termo veículo adequado significa excipientes comuns tais como agentes ligantes, por exemplo xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinilpirrolidona (Povidona), metilcelulose, etilcelulose, carboximetilcelulose sódica, hidroxipropilmetilcelulose, sucrose e amido; agentes de enchimento e veículos, por exemplo amido de milho, gelatina,lactose, sucrose, celulose microcristalina, caulino, manitol, fosfato dicálcico, cloreto de sódio e ácido algínico, desintegrante tais como croscarmelose sódica, celulose microcristalina, amido de milho, glicolato sódico de amido, ácido algínico e agentes molhantes mudáveis tais como laurilsulfato de sódio, e lubrificantes tais como estearato de magnésio e outros estearatos metálicos, ácido esteárico, fluidos de silicone, talco, ceras, óleos e sílica coloidal. Também podem ser usados agentes cromatizantes tais como hortelã-pimenta, óleo de pírola, aroma de cereja ou similares. Pode ser desejável adicionar um corante para fazer a forma de dosagem mais atraente visualmente ou para ajudar a identificar o produto. Os comprimidos também podem ser revestidos por métodos bem conhecidos.

As composições farmacêuticas do presente invento também podem ser na forma de preparações orais líquidas, que podem ser a) suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões ou xaropes; ou b) um pó seco para ser reconstituído com água ou um outro veículo adequado antes de ser usado. Quando usado conjuntamente com tais preparações orais líquidas, o termo veículo adequado significa aditivos convencionais tais como agentes suspensores, por exemplo, sorbitol, xarope, metilcelulose, xarope de glucose/açúcar, gelatina, hidroetilcelulose, carboximetilcelulose ou gel de estearato de alumínio; ou óleos comestíveis, por exemplo óleo de amêndoas, óleo de coco fraccionado, ésteres oleosos,propilenoglicol ou álcool etílico, e preservativos tais como p-hidroxibenzoatos de metilo ou propilo ou ácido sórbico.

A composição farmacêutica também pode

ser para uso intravenoso (IV). Específicamente, uma forma solúvel em água do composto antibiótico pode ser dissolvida num dos fluídos intravenosos vulgarmente usados e administrados por infusão. Quando usada conjuntamente com composições para uso IV, o termo veículo adequado significa fluídos tais como soro fisiológico, solução de Ringer ou solução de dextrose a 5%.

Para preparações intramusculares uma formulação estéril de um sal adequado do composto antibiótico (por exemplo, o sal hidrocloreto ou o sal sódico) pode ser formulada com um veículo adequado. São exemplos de tais formulações estéreis uma forma de sal adequado dissolvido num diluente farmacêutico (por exemplo, Água-para-Injecção, soro fisiológico, glucose a 5%) ou suspenso numa base aquosa ou numa base oleosa farmacêuticamente aceitável (por exemplo, um éster de um ácido gordo de cadeia longa como seja oleato de etilo).

As composições tóxicas podem ser formuladas comveículos adequados como sejam bases hidrofóbicas ou hidrófilas. Tais bases incluem pomadas, cremes ou loções .

As composições farmacêuticas veterinárias dos compostos antibióticos podem ser administrados na ração ou na água de beber dos animais da quinta. Como alternativa, os compostos podem ser formulados como preparações intramamárias com veículos adequados como sejam bases de libertação longa ou rápida.

Os compostos antibióticos do presente invento também podem ser formulados na forma de dosagem unitária em frascos estéreis, bolsas de plástico estéreis contendo uma parte com um septo ou ampolas estéreis herméticamente seladas. 0 composto antibiótico (ou o correspondente sal farmacêuticamente aceitável) pode estar na forma de pó

-65seco ou na forma cristalina ou liofilizada. A quantidade do composto antibiótico por unidade de dosagem, pode variar entre cerca de 250 miligramas e cerca de 10 gramas.

Uma quantidade terapêuticamente eficaz dos compostos antibióticos do presente invento vai de aproximadamente 3,5 mg até cerca de 5 mg de composto por Kg de peso de corpo. Esta quantidade geralmente totaliza entre cerca de 1 grama e cerca de 27 gramas pro dia para um adulto humano.

Um outro aspecto deste invento é um método para tratamento ou controle de doenças infecciosas causadas por organismos gram-positivos ou gram-negativos em animais de sangue quente. Este método compreende administração ao animal de uma quantidade terapêuticamente eficaz dos presentes compostos antibióticos. Uma dose diária típica para um adulto humano neste método vai de cerca de 10 gramas a cerca de 12 gramas.

Ao efectuar-se este método, o composto antibiótico pode ser administrado numa única dose diária ou em múltiplas doses por dia. O regime de tratamento pode requerer administração durante períodos de tempo prolongados, por exemplo, durante vários dias ou durante cerca de duas a três semanas. A quantidade administrada por dose ou a quantidade total administrada dependerá de factores tais como a natureza e gravidade da infecção, a idade e saúde geral do paciente e a tolerância ao composto antibiótico tanto do paciente como do microorganismo ou microorganismos envolvidos na infecção.

Ainda como outro aspecto do presente invento, é proporcionado uma prémistura para animais compreendendo um ingrediente activo, complexo A10255 ou factor B, C, E, F, G ou H em qualquer combinação ou num seu sal farmacêu-66-

ticamente aceitável, associado a um veículo adequado. Alguém familiarizado com a matéria apreciará certamente quais os veículos que devem ser seleccionados.

Ainda como outro aspecto do presente invento é proporcionado um processo para a produção do complexo A10255 que se caracteriza por

a) cultura de Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces gardneri NRRL 18260, Streptomyces gardneri 15922 ou num seu mutante produtor de A10255 num meio de cultura contendo factores assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos em condições de fermentação submersa até ser produzido o complexo antibiótico A10255;

b) separação facultativa do complexo A10255 a partir do meio de cultura; e

c) isolamento facultativo de um ou mais dos factores antibióticos A10255 B, C, E, F, GeHa partir do complexo A10255 separado.

Os Exemplos que se seguem são proporcionados para ilustrarem ainda o invento seja limitado no seu âmbito por qualquer um dos Exemplos que se seguem.

	Secção Experimental Exemplo 1 0 meio que se segue foi preparado para
usar na cultura de A10255:	em agar inclinado do microorganismo produtor

-67Produção do Complexo AI0255

Ingrediente

Farinha de aveia pré-cozinhada

Levedura ^K2^HPO4

KC1

MgSO₄.7H₂O

FeSO₄.7H₂O

Água desionizada q. s. para

Quantidade (g/1)

60,0

2,5

1,0

0,5

0,1 litro

O pH do meio resultante foi ajustado a pH 7,3 com hidróxido de sódio aquoso. O meio foi então autoclavado, dando um meio esterilizado com um pH de 6,7.

Os esporos de íS. gardneri, NRRL 15537 foram inoculados num agar inclinado nutritivo composto pelo meio esterilizado referido atrás. O agar com o inoculo foi incubado durante 7-10 dias a uma temperatura de 30°C. A cultura de agar inclinada madura foi então coberta com soro de vitela e raspada com uma ansa estéril para perder os esporos e micélios. A suspensão resultante foi transferida para pequenos tubos e liofilizada para preservação. Um sedimento liofilizado foi usado para inocular meio de cultura vegetativa estéril ( 50 ml, contido num Frasco Erlenmeyer de 250 m lcom boca larga) tendo a seguinte composição:

Ingrediente

Glucose

Dextrina

Farelo de soja

Xarope de milho

Extrato de levedura

CaCO^

Água da torneira q. s. para

Quantidade

15,0

20,0

10,0

1,0

2,0 litro

O pH do meio foi ajustado a 6,7 com hidróxido de sódio aquoso. O meio foi autoclavado, o que levantou o pH do meio para cerca de 6,8 a 7,0.

O meio vegetativo inoculado foi incubado durante 48 horas a 30°C num agitador rodando num arco de duas polegadas de diâmetro a 250 RPM. A cultura resultante do meio vegetativo foi usada para inocular fermentadores pequenos (sendo o inoculo aproximadamente 1% por volume do meio do fermentador) ou para inocular frascos de segunda fase para a preparação de um volume de inoculo maior.

Meio vegetativo industrial

Em dois frascos Erlenmeyer de boca larga (2 litros de capacidade) foi introduzido meio (400 ml cada) tendo a seguinte composição:

Ingrediente Quantidade

Glucose15,0

Dextrina20,0

Farelo de soja15,0

Xarope de milho10,0

Extracto de levedura1,0

CaCO₃5,0

Água da torneira q. s. para 1 litro

meio em cada frasco Erlenmeyer foi inoculado com a cultura vegetativa atrás referida. O volume de inoculo totalizou 2,5% do volume do meio no frasco Erlenmeyer. 0 meio inoculado foi incubado a 30°C durante 24 horas num agitador rotativo a 250 RPM numa inclinação do fundo de 10° para dar uma cultura de vegetativo industrial.

Fermentação em larga escala

Uma porção da cultura de vegetativo in dustrial (bump) (800 ml) que se segue (100 litros).

Ingrediente

A

Anti-espumante

Propilenoglicol (PM 2000) Glucose

Glicerol

Bacto-Peptona**

Caseína

NaH₂PO₄.H₂O

Melaços

CaCO₃

Água da torneira q.s. para foi usada para inocular o meio

Quantidade (g/L) ^{* *}

0,200

2,000 ml

10,000

40,000

10,000

0,100

40,000

2,500

100 litros *Anti-espumante Dow-Corning

Hidrolisado de carne (Laboratórios Difco, Detroit, MI).

O meio foi introduzido num fermentador de 165 litros. O pH do meio foi ajustado a 6,9 com hidróxido de sódio aquoso 5N. Esterilizou-se a mistura durante 45 min. a 17-19 psi e 121°C. Após o processo de esterificação o meio ficou com pH 7,0. O meio esterilizado foi arejado com ar estéril a uma velocidade de 2,125 v/v/m, agitado com um agitai

-ΊΟ-

dor convencional a 200 RPM e deixado fermentar durante cerca de 6 dias a uma temperatura de 30°C.

Exemplo 2

Isolamento do Complexo Antibiótico A10255

Todo o caldo de fermentação (3780 L) foi filtrado usando um auxiliar de filtração (Hyflo Super-Cel, Johns-Manville Products Corp.). A prensa contendo os micélios foi lavada com 300 L de água, em seguida o micélio foi extraído duas vezes com acetona:água (4:1). O primeiro extracto foi de 900 L, o segundo de 800 L. Os extractos foram combinados e concentrados sob pressão reduzida para dar 450 L de uma solução aquosa. O pH da solução foi ajustado a 3,0 com -ácido clorídrico, depois a solução foi extraída três vezes com acetato de etilo (os volumes dos extractos foram de 165 L, 280 L e 225 L respectivamente). Os extractos e a fase aquosa foram analisados relativamente à actividade biológica por um ensaio em discos de papel sobre placas de agar semeadas com B. subtilis ATCC 6633. Os extractos foram combinados e concentrados para um volume de 23 L, sob pressão reduzida. Os sólidos que precipitaram durante a concentração foram colhidos por filtração e secos sob vácuo para dar 216 g do complexo antibiótico A10255 (ensaio: 90,7 g de actividade). O filtrado foi ainda concentrado para 900 ml e depois filtrado novamente. O segundo precipitado foi seco sob vácuo para dar 16,2 g do complexo antibiótico A10255 (ensaio:9,l g de actividade ) .

-71Exemplo 3

Separação dos factores a partir do complexo antibiótico A10255 | i

complexo A10255 (20 g) foi dissolvido em clorofórmio:metanol (9:1, 400 ml total) e filtrado. O ' filtrado foi aplicado numa coluna de aço inoxidável (8x100 cm) cheia com silica-gel LPS-1 13-24 micron (4 L, Whatman Chemical Separation Inc. , Clifton, New Jersey). A coluna era parte de uma unidade Chromatospac Prep-100 (Jobin Υνοη,ΐβ-18 Rue du Canal 91160, Longumeau, France). Colheram-se frac- ;

i ções de 240 ml da coluna que foi eluída a um fluxo de 60 ml/ j min primeiro com uma mistura 9:1 de clorofórmio:metanol (7 L)J depois com uma mistura 3:1 de clorofórmio:metanol (15 L). Durante a cromatografia o detector de HPLC foi regulado para 280 nm. Todas as fracções foram aplicadas em placas de agar semeadas com Micrococcus luteus ATCC -9341 para detectar ac- i tividade biológica. Reuniram-se as fracções que se seguem I

Fracções	Factores	Rendimento (g)
11-23	C,F	0,68
30-63	B ,E	6,50

conjunto de fracções contendo os factores B e E foi concentrado para 400 ml. 0 precipitado resultante foi colhido por filtração seco in vacuo para dar 5,68 g de material consistindo essêncialmente no factor B com uma pequena quantidade do factor E (ensaio:3,6 g de actividade) . O sobrenadante da precipitação foi por sua vez concentrado. 0 concentrado foi adicionado a éter dietílico para dar 0,64 g de um precipitado contendo uma mistura semelhante dos factores B e E (ensaio:0,3 g de actividade).

Exemplo 4

Isolamento do Factor Antibiótico A10255B

Uma porção de 1,5 g do material das Fracções 30-63 do Exemplo 3 foi dissolvida numa mistura de tetra-hidrofurano:água (35:65, 150 ml). A amostra foi aplicada numa coluna de aço inoxidável (8x100 cm) cheia com sílica gel de fase reversa LP1-C18 (4 L). (A sílica gel foi preparada por um processo descrito nos exemplos 6 e 7 de B. J. Abbott et al., Patente U.S. No. 4.299.763, publicado em 10 de Novembro de 1981). A coluna foi eluida com um fluxo de 60 ml/min. colhendo-se fracções de 240 ml com uma mistura de tetra-hidrofurano:água:hidrogenofosfato dissódico (3:7:0,5M, 12 L, pH 7,8 (ácido fosfórico). O detector de HPLC foi regulado para 280 nm durante a cromatografia. Examinaram-se as fracções individuais por HPLC analítica.

(A HPLC analítica foi efectuada numa coluna de aço inoxidável de 4,6 x 250 nm num material de fase reversa constituído por ultraesferas ODS 5 micron (altex Scientific Inc., Berkeley, CA). A coluna foi eluida a um fluxo de 1 ml/min com uma mistura de tetra-hidrofurano:água: :hidrogenofosfato de sódio (1:2:0,05M, a pH 7,8 devido à solução de ácido fosfórico). O detector foi regulado para 254 nm durante a cromatografia).

As fracções foram reunidas como se se-

Fracções	Factores	Rendimento(g)
17-23	B( impuro)	150 ml
24-35	B(puro)	200 ml
38-45	E	100 ml

tendo as fracções

O conjunto de fracções concentrado con24-35 foi diluido para 300 ml com água de sionizada e o pH da mistura resultante foi ajustado a pH 3,0 com ácido fosfórico. A solução foi extraída com uma mistura 7:3 de clorofórmio:metanol. 0 extracto foi concentrado até secagem e cromatografado por HPLC. HPLC foi efectuado numa coluna de vidro para cromatografia líquida de baixa pressão e alta resolução (HPLPLC) Michel-Miller (como descrito em

K. Michel et al., Patente U.S. N°. 4.131.547, publicada em 26 de Dezembro de 1978) contendo um suporte de sílica gel (100-200 micron, Woelm Pharma). A coluna foi eluida com uma mistura de clorofórmio:metanol (7:3). 0 monitor de HPLC foi regulado para 254 nm durante a cromatografia. As fracções contendo o principal cromóforo de UV foram combinadas, concentradas in vacuo e liofilizadas para dar 659 mg do Factor B.

Exemplo 5

Purificação do Factor Antibiótico A10255E

O conjunto de fracções 38-45 do Exemplo 4 foi combinado com?os conjuntos de fracções de composição semelhante de outras cinco cromatografias efectuadas como a realizada no suporte LPl-C-^θ do Exemplo 4. O pH dos conjuntos de fracções combinadas (800 ml) foi ajustado a pH 3,0 com ácido fosfórico. Os conjuntos de fracções combinados foram extraídos com uma mistura 7:3 de clorofórmio:metanol (2x, 800 ml), depois com mais uma pequena quantidade (400 ml) da mistura solvente. Os extractos foram combinados, concentrados até secagem e dissolvidos em 50 ml de uma mistura CHCl^MeOH (7:3, 500 ml). A solução foi aplicada a uma coluna de vidro de HPLPLC Michel-Miller de 5,1x42 cm contendo um suporte de gel de sílica (500 ml, 100-200 micron, Woelm). A coluna foi eluida com uma mistura de 7:3 (v:v) de clorofórmio:metanol e o principal cromóforo de UV (250 nm) foi colhido e lavado até à secagem para dar 349 mg de factor E puro.

Exemplo 6 ΐ ί

i

Purificação dos Factores Antibióticos C e F j

A preparação seca (0,68 g) obtida a partir do conjunto de fracções 11-23 no Exemplo 3 foi combinada com preparações obtidas de modo semelhante para totalizar 3,03 g de sólido. Este material foi dissolvido numa mistura de tetra-hidrofurano:água (6:4) e a solução cromatografada num gel de sílica de fase reversa (4 L) numa coluna de aço inoxidável (8x100 cm) eluida a um fluxo de 60 ml/min. com uma mistura de 3:7 de tetra-hidrofurano:água (39 L) controlada a 280 nm. As fracções de 480 ml colhidas foram espalhadas sobre placas de agar semeadas com Micrococcus luteus ATCC 9341 para detectar actividade biológica. As fracções biologicamente activas foram ainda analisadas pelo sistema de HPLC à escala analítica descrito no Exemplo 4. As fracções foram reunidas como se segue::

Fracções

28-37

Factores Rendimento(mg)

40-50

51-55

56-62

66-75

desconhecidos	186
C	(impuro)	373
C	(puro)	302
C	(impuro)	70
F	(puro)	56

Cada um dos conjuntos foi concentrado e o precipitado resultante colhido num filtro e secosob vá cuo .

Exemplo 7

Usou-se o meio de agar inclinado do

Exemplo 1 para cultivar o microorganismo produtor de A10255 NRRL 18260.

Assim, um sedimento liofilizado obtido
pelo processo acima foi usado para	inocular meio de cultu-
ra vegetativo estéril (50 ml, introduzido num frasco Erlen-
meyer de 250 ml de boca larga) com	a seguinte composição:
Ingrediente	Quantidade(g/1)
Caldo de tripticase de soja	30,0
Caseína hidrolizada com enzimas
(Universal Foods, Juneau, WI)	5,0
Glucose	5,0
Glicerol	10,0
Dextrina	10,0
CaCO₃	10,0
Xgua da torneira q.s. para	1 litro

Ο ρΗ do meio foi ajustado a 7,0 com hidróxido de sódio aquoso antes da autoclavagem.

O meio vegetativo inoculado foi incubado durante 72 h a 30°C num agitador rodando através de um arco de duas polegadas de diâmetro a 250 RPM. O meio de cultura vegetativo resultante foi usado para inocular fermentadores pequenos (sendo o inoculo aproximadamente 1% por volume de meio do fermentador) ou para inocular frascos de segunda fase para a produção de um volume maior de inoculo.

Meio vegetativo industrial (Bump Médium)

Dois frascos Erlenmeyer de boca larga (2 litros de capacidade) foram cheios com um meio (400 ml cada) idêntico ao meio vegetativo descrito atrás.

O meio de cada frasco Erlenmeyer foi inoculado com a cultura vegetativa acima. 0 volume do inoculo totalizou 2,5% do volume do meio no frasco Erlenmeyer. O meio inoculado foi incubado a 30°C durante 48 horas num agi-76-

tador rotativo a 250 RPM comum angulo de inclinação del0° para dar uma cultura bump.

Fermentação em Larga Escala

Uma porção da cultura bump (800 ml) acima foi usado para inocular o seguinte meio (100 litros):

Ingrediente

Sag 471

P-2000

Glucose nh₄ci

Na₂SO₄

ZnCl₂

MgCl₂.6H₂O

FeGl₃

MnCl₂.4H₂O

CaCl₂

CuCl₂,2H₂O kh₂po₄*

Água da torneira q.s. para *Esterilizado separadamente do pH a 6,0 com KOH

Quantidade(g/1)

0,2

0,1 ml

1,0

2,0

0,019

0,304

0,062

0,035

0,06

0,005

0,67

110 litros em H₂O desionizada após ajuste

O meio tinha sido introduzido num fermentador de 165 litros. A mistura foi esterilizada com vapor através da aplicação de 20 unidades de aquecimento F_q(onde 1 F_q equivale exactamente a um minuto a 121°C). Depois do processo de esterilização o pH do meio ficou a 8,3. Após a adição de KH₂PO₄ o pH ficou a 7,0. O meio esterilizado foi arejado com ar estéril e agitado com um agitador convencional para manter o nível de oxigénio dissolvido a 45% da saturação do ar a 5 psi acima da pressão atmosférica e deixado fermentar durante cerca de 7 dias a uma temperatura de 30°C.

-ΊΊDurante a fermentação em larga escala conforme descrito atrás verificou-se ser eficaz alimentar a mistura de fermentação com glucose à velocidade de 5,7 g/1/ dia.

Exemplo 8

Isolamento do Factor Antibiótico A10255G

Uma porção de 1,0 g do complexo antibiótico do Exemplo 2 foi dissolvido em 2 L de F^OrCH^CN (4:1) a pH 6,0. Esta solução foi aplicada a um sistema Waters Perp 500 usando uma coluna de cassetes C18. A coluna foi eluida usando um gradiente linear de 4 L de (A) f^C^CH^CN: :THF:HOAc (70:30:5:0,5) até 4 L de (B) H₂O:CH^CN:THF:HOAc (65:35:5:0,5) a um fluxo de 250 ml por minuto, colhendo uma fracção por minuto. Isto foi seguido de 2 L de solvente (B). O eluato da coluna foi seguido a 280 nm. Fizeram-se mais seis corridas usando condições idênticas. Os conjuntos de fracções contendo uma mistura de factores C e G foram combinados, o pH ajustado a 6,0 usando NaOH 5N diluído com um volume igual de água (para um volume total de 26 L) e cromatografado em duas corridas separadas usando 13 L de cada vez. Estas corridas foram também feitas numa coluna de cassetes C18 num Waters Prep 500. Usou-se para a cromatografia um gradiente linear de 4 L de solvente (A) 0,05N NH^OAc (pH 5,5): CHgCN (75:25) até 4 L de solvente (B) 60:40 seguido do solvente (B). O fluxo usado foi de 250 ml por minuto e colheu-se uma fracção em cada minuto. As fracções contendo essêncialmente o factor G foram combinadas, diluídas usando um volume igual de água e cromatografadas de novo numa coluna de cassetes C18 usando um Prep 500. Usou-se o gradiente linear que se segue: (A) 4 L de F^CHCH^CN: THF: HOAc (70:30:5:0,5) puro (B) 4 L de (65:35:5:0,5) no mesmo fluxo descrito atrás. As fracções contendo o factor G apenas foram combinadas e concentradas in vacuo para dar uma soluçãoaquo sa. 0 factor G precipitado foi eitão separado por centrifugação, lavado com água, suspenso em água e liofilizado para dar 686 mg de factor G.

Exemplo 9

Isolamento do Factor Antibiótico A10255H

Uma porção de 1,0 g do compelxo antibiótico do Exemplo 2 foi dissolvida em 2 L de E^CCCH^CN (4:1) a pH 5,0 e filtrado através de lã de vidro num funil com filtro. A solução foi aplicada numa coluna de cassetes C18 num sistema Waters Prep 500. A coluna foi eluida usando um gradiente linear de 4 L de (A) í^OzCHgCNzTHFzHOAc (70:30:5:0,5) até 4 L de (B) 65:35:5:0,5 num fluxo de 250 ml por minuto, colhendo uma fracção de minuto a minuto. Isto foi seguido de 2 L de solvente (B).

O eluato da coluna foi controlado a

280 nm. Fizeram-se mais três cromatografias usando idênticas condições. Todos os conjuntos de fracções contendo o factor H foram combinados (17 L), concentrados e secos in vacuo para dar 690 mg do factor H bruto. Este material foi combinado com 329 mg de uma preparação semelhante dissolvida em 3 L de E^C^CHgCb^THF (75:20:5 ) a pH 6,0 e aplicado numa coluna de cassetes C18 como descrito acima. Usou-se na cromatograf ia um gradiente linear de 4 L de solvente (A) 0,05 M NH₄OH:CH₃CN (75:25) para 4 L de solvente (B) 0,05 M NH₄OH:CH₃CN (60:40). Isto foi seguido de 2 L do solvente (B). O fluxo e volume das fracções foram os mesmos descritos atrás. As fracções contendo factor H foram combinadas (750 ml) adicionadas a igual volume de água e aplicado de novo numa coluna de cassetes C18 como descrito atrás. A coluna foi dissolvida usando um gradiente linear de 4 L de (A) E^O:CH^CN:THF :HOA (75:25:5:0,5) para 4 L de (B) H₂q_;CH3 cN:THF:HOAc (60:40:5:0,5), colhen-79-

do uma fracção de 250 ml minuto a minuto. As fracçÕes 23-29 contendo o factor H foram combinadas e concentradas in vácuo para um volume de 450 ml. O factor H precipitado foi recuperado por filtração, lavado com água e seco in vacuo para dar 285 mg de factor H.

Exemplo 10

Composição alimentar para promover o crescimento de gado

O complexo A10255 ou os seus factores individuais podem ser administrados oralmente a gado através da mistura de uma quantidade eficaz do complexo ou factor com a ração. Por exemplo, um aspecto do invento é uma ração alimentar convencional tendo a composição:

Ingrediente Quantidade

Silagem de milho (planta completa, maçarocas intactas) 50%

Milho com alto teor de humidade 44%

Suplemento (total) 6% em que o Suplemento é composto por:

Ingrediente Quantidade

Farinha de alfafa (Desidratada,

17%) 12,00%

Farinha de óleo de soja (Extraída com solventes) 45,40%

Ureia, Grau Alimentar 5,00%

Fosfato dicálcico 8,00%

Sal 10,00%

Carbonato de cálcio 11,00%

Pré-mistura de Micronutrientes 0,80%

Pré-mistura de Vitaminas A+D^ 1,40%

Pré-mistura de Vitamina E 1,40%

Cloreto de Potássio 5,00%

-80Antes da administração a ração convencional foi misturada com uma pré-mistura contendo o complexo A10255. A pré-mistura era composta pelos seguintes ingredientes :

Ingrediente Quantidade

Milho amarelo 48,00%

Farelo de tarolo de milho 20/40 50,00% óleo Mineral 2,00%

A pré-mistura foi primeiro misturada com o complexo A10255 numa taxa de administração de por exemplo 275 mg/cabeça/dia ou 550 mg/cabeça/dia (que para esta experiência particular traduz-se em 28,6 e 61,7 g/tonelada respectivamente). A pré-mistura contendo o complexo A10255 é então junta (e subsequentemente misturada) com a ração alimentar convencional referida atrás numa aplicação de 0,351b/ /cabeça/dia.

Exemplo 11

O meio que se segue foi preparado para usar em culturas de agar inclinado do microorganismo produtor de A10255.2:

Produção do complexo A10255

Ingrediente

Farinha de aveia pré-cozinhada Levedura ^K2^HPO4

KC1

MgSO₄.7H₂O

FeSO₄.7H₂O

Agua desionizada q.s. para

Quantidade (g/1)

60,0

2,5

1,0

0,5

0,1 litro

O pH do meio resultante foi ajustado a pH 7,3 com hidróxido de sódio aquoso. O meio foi então autoclavado, dando um meio esterilizado com úm pH de 6,7.

Esporos de S_. gardneri, NRRL 15922, foram inoculados num agar inclinado nutritivo composto pelo meio acima esterilizado. O agar inclinado inoculado foi incubado durante 7-10 dias a uma temperatura de 30°C. A cultura madu ra em agar inclinado foi então coberta com soro de vitela e raspada com uma ansa esterilizada para destacar osesporos e micélios. A suspensão resultante foi transferida para tubos pequenos e liofilizada para preservação. Um sedimento liofilizado foi usado para inocular meio de cultura vegetativo estéril (50 ml, contido num frasco Erlenmeyer de 250 ml com boca larga) tendo a seguinte composição:

Ingrediente	Quantidade
Glucose	15,0
Dextrina	20,0
Farelo de soja	10,0
Xarope de milho	10,0
Extracto de levedura	1,0
CaCO^ Água da torneira q.s. para	2,0 1 litro

pH do meio foi ajustado a 6,7 com hidróxido de sódio aquoso. Autoclavou-se o meio, o que fez subir o pH do meio para 6,8 a 7,0.

O meio vegetativo inoculado foi incubado durante 48 horas a 30°C num agitador rodando através de um arco de duas polegadas de diâmetro a 250 RPM. A cultura de meio vegetativo resultante foi usada para inocular fermentadores pequenos (o inoculo sendo aproximadamente 1% por volume do meio de fermentador) ou para inocular os frascos da segunda fase para a produção de um volume maior de inoculo .

Meio Bump

Dois frascos Erlenmeyer de boca larga (2 litros de capacidade) foram carregados com um meio (400 ml cada) tendo a seguinte composição:

Ingrediente	Quantidade (g/1)
Glucose	15,0
Dextrina	20,0
Farelo de soja	15,0
Xarope de milho	10,0
Extracto de lèvedura	1,0
CaCl₃ Agua da torneira q.s para	5,0 1 litro

meio de cada frasco Erlenmeyer foi inoculado com 2,5% do seu volume do meio vegetativo de cultura atrás referido. O meio inoculado foi incubado a 30°C du rante 23 horas num agitador rotativo a 250 RPM para dar uma cultura bump (vegetativo industrial).

Fermentação em Larga Escala

Uma porção da cultura bump acima (800 ml) foi usada para inocular o seguinte meio (115 litros):

Ingrediente

Anti-espumante

Propilenoglicol (PM 2000)

Glucose

Caseína

NaH₂PO₄.H₂O

Melaço

CaCOg

Água da torneira q.s. para

Quantidade (g/1)

0,200

2,000 ml

1,000

16,000

0,100

40,000

5,000

110 litros *

Sag 471, Agente Anti-espumante de Silicone, Dow Corning Co.

O meio foi introduzido num fermentador de 165 litros. 0 pH do meio foi ajustado a 6,9 com hidróxido de sódio aquoso 5N. A mistura foi esterilizada durante 45 min. a 17-19 psi a 121°C. Depois do processo de esterilização o meio com pH 6,8. O meio esterilizado foi arejado com ar estéril a uma velocidade de 0,5 v/v/m, agitado com agitadores convencionais numa velocidade inicial de 300 RPM e deixado fermentar durante cerca de 7 dias a uma temperatura de 30°C. Durante o período de fermentação o pH foi mantido a 7,0, o nível de oxigénio dissolvido foi mantido a 45% da saturação do ar e adicionou-se glucose ao meio a uma velocidade de constante de 3,5-4,0 g/l/dia. Após 24 horas, Hy Case Amino (hidrolisado ácido da caseína), Humko Sheffield Chemical Co., Lyndhurst, NJ foi igualmente adicionado ao meio a uma velocidade constante de 3 g/l/dia.

O complexo A10255 bruto foi isolado num processo semelhante ao do Exemplo 13 abaixo.

Exemplo 12

Fermentação em grandes volumes da estirpe A10255.2

Inoculo vegetativo

Como ponto de partida para fermentações em grandes volumes da estirpe A10255.2 (i.e. volumes maiores do que o Exemplo 1 acima), preparou-se inoculo vegetativo em duas fases. Ambas as fases usaram o seguinte meio:

Ingredientes

Glucose

Farelo de soja

Dextrina de batata

Xarope de milho

Extracto de levedura

Carbonato de cálcio Água da torneira

Quantidade

1,5%

2,0%

1,0%

0,1%

0,2% para perfazer o volume

A primeira fase de incubação foi efectuada num frasco de 250 ml contendo 80 ml de meio esterilizado. O frasco foi inoculado com um sedimento liofilizado da cultura A10255.2. O meio foi incubado a 30°C durante 48 horas num agitador rotativo a 250 rpm.

Uma porção (10 ml) do inoculo da primeira fase foi usado para inocular um meio de incubação de segunda fase esterilizado, composto por 400 ml do meio acima dentro de um frasco Erlenmeyer de dois litros com boca larga. Este meio de segunda fase foi incubado a 30°C durante 24 horas num agitador rotativo a 250 rpm. O meio incubado foi usado abaixo no tanque de fermentação.

Tanque de Fermentação

O meio do Inoculo Vegetativo de Segunda

Fase atrás referido foi usado para inocular o tanque de meio

que se segue num fermentador cie 150 litros:

Ingredientes

Cerelose

Dextrina de batata

Xarope de milho

Farelo de soja

Carbonato de cálcio

SAG 471*

Água da torneira

Quantidade

1,5%

2,0%

1,0%

1,5%

0,5%

0,01% até 120 litros *Agente anti-espumante de silicone, Dow Corning Co.

Este meio foi primeiro esterilizado por autoclavagem. Após esterilização, o pH do meio foi ajustado a 6,5 pela adição de solução de hidróxido de sódio 5N. O meio foi então inoculado e fermentado a 30°C durante cerca de 24 horas. Durante a fermentação o meio foi arejado com ar estéril a uma velocidade inicial de pé cúbico por minuto (cfm) e agitado com um agitador convencional numa velocidade inicial de 350 rpm.

Fermentação em Larga Escala

Uma porção do meio de tanque atrás referido (40 litros) foi usado para inocular o meio de larga escala que se segue:

Ingredientes

Anti-espumante

Propilenoglicol (pm 2000) Melaço

Carbonato de cálcio z z **

Hidrolisado acido de caseína

NaH„PO. .H„0

4 2

Glucose

Agua da torneira * SAG 471 agente **Hy Case, Humko anti-espumante

Quantidade

0,02%

4,00%

0,50%

1,60%

0,01%

0,01% até 1200 galões de silicone

Sheffield Chemical Co., Lyndhurst, NJ

O meio foi colocado num fermentador de

1600 galões. Ajustou-se o pH do meio a 7,0 pela adição de solução de hidróxido de sódio 5N. O meio foi esterilizado durante trinta minutos a 121°C a 17 psi. O meio esterilizado foi arejado com ar estéril a uma velocidade inicial de 20 pés cúbicos por minuto, agitado com um agitador convencional a uma velocidade inicial de 100 rpm e deixado fermentar durante cerca de 6 dias a 30°C. Durante o período de fermentação, o pH do meio foi mantido a cerca de 7,0, o teor em oxigénio dissolvido do meio foi mantido a cerca de 45% de saturação do ar e adicionou-se glucose a uma velocidade constante de 4 g/l/dia. Após 24 horas adicionou-se também Hy Case ao meio a uma velocidade de 3 g/l/dia.

Exemplo 13

Isolamento do Complexo Antibiótico A10255

O caldo de fermentação do organismo

A10255.2 foi colhido na sua totalidade (5000 L) e filtrado usando um auxiliar de filtração (Hyflo Super-Cel, Jonhs Manville Products Corp.). 0 filtrado e a lavagem com água (1200 L de água) da biomassa foram rejeitados.

A biomassa foi então extraída de uma só vez com uma mistura de 1:4 de água:acetona (2000 L) .A extracção foi repetida e os extractos foram combinados (total: 4000 litros). Os extractos combinados continham o grosso do complexo A10255.

Os extractos combinados foram concentrados sob vácuo para se obter uma suspensão aquosa. Deixando em repouso formou-se um precipitado sólido fino a partir da suspensão. O sólido era constituído pelo complexo A10255 bruto. Os extractos concentrados foram então centrifugados e o sobrenadante rejeitado.

Os sólidos obtidos da centrifugação foram secos sob vácuo para dar 1,5 kg de um pó castanho contendo 423 microgramas/miligrama de actividade antibiótica A10255.

Claims

REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a produção do complexo A10255 ou factor B, C, E, F, G ou H, ou qualquer combinação sua, caracterizado por compreender:

a) a cultura de Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces gardneri NRRL 18260, Streptomyces gardneri NRRL 15922 ou de um seu mutante produtor de A10255, num meio de cultura contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos em condições de fermentação aeróbica submersa até se produzir o antibiótico A10255;

b) facultativamente, a separação do complexo' A10255 do meio de cultura; e

c) facultativamente, o isolamento de um ou mais factores antibióticos A10255, B, C, E, F, G e H a partir do complexo A10255 separado.
2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar a cultura de Streptomyces gardneri NRRL 15537 ou um seu mutante produtor de A10255.
3^. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar a cultura de Streptomyces gardneri NRR1 15922 ou um seu mutante produtor de A10255 .
4ê. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar a cultura de Streptomyces gardneri NRRL 18260 ou um seu mutante produtor de A10255.
5§. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se isolar o factor B de A10255.

65. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se isolar o factor G de A10255.

75. - Processo para a preparação de uma composição alimentar para aumentar a eficiência de utilização de alimentos, caracterizado por se incluir na referida composição o alimento para animais e o complexo A10255, um factor de A10255 seleccionado do grupo de factores B, C, E, F, G e H de A10255 ou uma composição de um ou mais dos referidos factores.

85. - Método para aumentar a eficiência de utilização de alimentos de um animal doméstico, caracterizado por se administrar a um animal doméstico o complexo A10255, o factor de A10255, seleccionado do grupo constituído pelo factor B de A10255, factor C de A10255, factor E de A10255, factor F de A10255, factor G de A10255 e factor H de A10255 ou uma combinação de um ou mais dos referidos factores.

95. - Método para a determinação da resistência à tiostreptona em espécies de Streptomyces ca-90racterizado por se apl..car o complexo A10255, factor B de A10255, factor C de A10255, factor E de A10255, factor F de A10255, factor G de A10255 ou factor H de A10255 ao meio de cultura de uma espécie de Streptomyces.