HU199559B - Process for producing antibioticum a 10255 complex and factors and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Process for producing antibioticum a 10255 complex and factors and pharmaceutical compositions containing them Download PDF

Info

Publication number
HU199559B
HU199559B HU875637A HU563787A HU199559B HU 199559 B HU199559 B HU 199559B HU 875637 A HU875637 A HU 875637A HU 563787 A HU563787 A HU 563787A HU 199559 B HU199559 B HU 199559B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
factor
complex
factors
medium
nrrl
Prior art date
Application number
HU875637A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT49376A (en
Inventor
Laverne D Boeck
Herbert A Krist
Eugene Th Seno
Marvin M Hoehn
Karl H Michel
Otis W Jun Godfrey
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUT49376A publication Critical patent/HUT49376A/hu
Publication of HU199559B publication Critical patent/HU199559B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K11/00—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Description

A találmány tárgya eljárás egy új, önkényesen A10255 generikus jelöléssel ellátott antibiotikum előállítására. Az A10255 antibiotikum 6 különálló vegyület vagy faktor — B, C, E, F, G és H faktor — keveréke. A faktorok keverékét egyidejűleg állítjuk elő a Streptomyces gardneri NRRL 15537, NRRL 18260, NRRL 15922 új törzsekkel vagy ezek A10255 antibiotikumot termelő mutánsaival. A mikroorganizmusokat süllyesztett, aerob körülmények között tenyésztjük, amíg kellő mennyiségű A10255 antibiotikum termelődik. A B, C, E, F, G és H faktorokat kisebb menynyiségben a tápközegből, nagyobb mennyiségben a micéliumból extraháljuk oldószerekkel. Az együtt termelődő faktorokat keverékként nyerjük ki: az extraktumokat betöményítve, a betöményített oldatot vízzel nem elegyedő oldószerrel extrahálva, az extraktumot bekoncentrálva és a komplexet tartalmazó csapadékot összegyűjtjve és megszárítva. Megjegyezzük, hogy az „antibiotikum-komplex és az „A10255 komplex kifejezéseken nem kovalens kötésekkel kötött kémiai komplexeket értünk, hanem, ahogyan ezt a kifejezést az antibiotikumokkal kapcsolatban használják, az együtt termelődő, különálló antibiotikumfaktorok keverékét. Amint az az antibiotikumtermeléssel foglalkozó szakemberek előtt nyilvánvaló, az egyes termelődött faktorok aránya az antibiotikum-komplexben változó a fermentációs körülményektől függően. Az A10255 komplexet tovább tisztíthatjuk, és a B, C, E, F, G és H faktorokat elválasztjuk egymástól különféle kromatográfiás eljárásokkal.
Az A10255 komplex és az egyes B, C, E, F, G és H faktorok gátolják az emberi és az állati kórokozó mikroorganizmusok növekedését. Az A10255 komplex és az egyes faktorai ezenkívül fokozzák a csirkéknél és a szarvasmarháknál a tápanyaghasznosítást, gyorsítják a választási malacok növekedését és fokozzák a tápanyaghasznosításukat.
Foglalkozik a találmány a biológiailag egységes Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces gardneri NRRL 18260 és Streptomyces gardneri NRRL 15922 törzsekkel vagy a nevezett törzsek A10255 antibiotikumot termelő mutánsaival. A találmány további tárgya az A10255 komplexet vagy az egyes A10255 faktorokat tartalmazó tápkészítmény csirkék, választási malacok és szarvasmarhák részére. A találmány további tárgyát képezik az alkalmas hordozóanyag mellett hatékony mennyiségben A10255 komplexet, A10255B faktort, A10255C faktort, A10255E faktort, A10255F faktort, A10255G faktort vagy Á10255H faktort tartalmazó különféle gyógyszerkészítmények. A találmány további tárgya az A10255 komplexet felhasználó eljárás tiosztrepton rezisztenciagénnel rendelkező Streptomyces-ek szelektál ására.
Az 1—6. ábrákon az egyes A10255 faktorok kálium-bromid pasztillában felvett infravörös elnyelési spektrumait mutatjuk be: 2
1. ábra — A10255B faktor,
2. ábra — A10255C faktor,
3. ábra — A10255E faktor,
4. ábra — A10255F faktor,
5. ábra — A10255G faktor,
6. ábra — A10255H faktor.
A főként B, C, E, F, G és H faktorokból álló A10255 komplexet a későbbiekben jellemzett Streptomyces gardneri NRRL 15537, vagy NRRL 18260 törzzsel vagy ezek A10255 komplexet termelő mutánsaival állítjuk elő, oly módon, hogy az említett mikroorganizmusokat asszimilálható szénhidrogénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó vizes tápközegben tenyésztjük, amíg A10255 komplex termelődik.
Amint az több antibiotikumot termelő törzsnél ismereres, az A10255 antibiotikumot termelő S. gardneri NRRL 15537, NRRL 18260 vagy NRRL 15922 törzsek fermentálásakor többféle antibiotikum termelődik egyidejűleg. Az NRRL 15537 tenyészet elsősorban az A10255B faktort termeli, és a C, E, F, G és H faktorok melléktermékként jelennek meg még kinyerhető mennyiségben. A többi jelenlévő faktor vagy olyan kis menynyiségben található, hogy nem érdemes kinyerni, vagy viszonylag nem stabil. A G és H faktorokat az NRRL 18260 tenyészetből izoláltuk, melyben a G faktor a főtermék. Az együtt termelődő faktorok mennyisége bármelyik fent említett mikroorganizmusoknál fermentációról fermentációra változhat.
A B, C, E, F, G és H faktorok együtt termelődnek a fermentáció folyamán, és mint keveréket kapjuk meg őket A10255 komplexként. Az egyes faktorokat elválasztjuk egymástól, és az alábbiakban ismertetett fizikai és biológiai tulajdonságaik alapján azonosítjuk őket.
A „gyógyászati szempontból elfogadható sók kifejezés alatt a találmány szerinti vegyületek alkáli és alkáliföldfémsóit, valamint a savaddíciós sóit értjük. Ilyen sók ezek szerint a lítium-, nátrium-, kálium- és kálciumsók, illetve a vegyületek sósavval, hidrogén-bromiddal, kénsavval vagy foszforsavval alkotott addiciós sói.
Az alábbiakban ismertetjük az egyes antibiotikum-faktorok fizikai tulajdonságait: A10255B faktor:
Nem kristályos, fehér, sárgás-fehér por, ami oldódik dimetií-szulfoxidban, dimetil-formamidban, piridinben, kloroform/metanől elegyében és tetrahidrofurán/víz 4:1 térfoga tarányú elegyében.
. Az elemanalízis a következő százalékos összetételt adja (átlag):
C: 49,25, H: 3,94, N: 15,65,O:21,36és S:6,73%.
A gyors atom bombázású tömegspektrometriával meghatározott látszólagos molekulatömeg: 1244 dalton.
A 66%-os vizes dimetil-formamid oldatban végzett elektrometrikus titráció szerint három titrálható csoportot tartalmaz pKa — = 4,9, 11,2 és 12,8 értékekkel.
-2HU 199559 Β
6n sósavban történő hidrolízis után az aminosavanalizis 5,268 mmól/mg ammóniáról és 629 mmól/mg treoninról tanúskodik. Nagy, nem azonosított csúcs jelenik meg a hisztidincsúcs előtt a kromatogrammon.
Savas, semleges és lúgos metanolban az ultraibolya fény elnyelési spektrumában ληαχ = 245 mm (e = 66000).
Az infravörös elnyelési spektrumot (KBr pasztillában) lásd az 1. ábrán. A spektrum legjellemzőbb csúcsai: 3373, 2969, 2932, 2875, 1661, 1598, 1520, 1494, 1395,1250,1114,1084, 996, 932 és 900 cm'1.
A B faktor proton magmágneses rezonanciaspektrumát perdeuterált dimetil-szulfoxidban vettük fel 500 MHz-en és az alábbi csúcsokat kaptuk:
A C13 magmágneses rezonanciaspektrumát perdeutrált dimetil-szulfoxidban, 125 MHz-en felvéve, az alábbi csúcsokat kaptuk:
jel eltolódás jeltípus
1. 10,53 S
2. 9,95 S
3. 9,86 S
4. 9,79 S
5. 9,61 S
6. 9,58 S
7. 9,09 S
8. 8,90 T
9. 8,84 D
10. 8,67 S
11. 8,60 S
12. 8,51 S
13. 8,48 D
14. 8,39 s
15. 8,25 D
16. 8,24 S
17. 8,04 D
18. 6,53x S
19. 6,39 T
20. 6,11 S
21. 5,95 S
22. 5,84 S
23. 5,82 S
24. 5,79 s
25. 5,76+ s
26. 5,68 s
27. 5,64 s
28. 5,44 DQ
29. 5,16 D
30. 4,80 DD
31. 4,67 DD
32. 4,63 DD
33. 4,24 BS
34. 2,21 DQ
35. 1,62 D
36. 1,11 D
37. 1,01 T
x= kétszeres erősség +=háromszoros erősség. S= szinglett D= dublett T= triplett Q= kvartett B= széles jel eltolódás jeltipus
1. 17?,88 S
2. 169,17 S
3. 168,87 S
4. 164,90 S
5. 163,67 S
6. 163,07 S
7. 162,84 S
8. 162,68 S
9. 162,61 S
10. 161,57 S
11. 160,32 S
12. 160,17 S
13. 160,01 S
14. 159,46 S
15. 158,96 S
16. 158,10 S
17. 149,39 S
18. 149,37 S
19. 148,79 S
20. 142,05 S
21. 146,88 S
22. 142,05 D
23. 141,32 D
24. 140,68 D
25. 139,23 S
26. 136,33 S
27. 136,29 S
28. 136,14 S
29. 135,26 D
30. 134,23 S
31. 133,82 S
32. 133,28 S
33. 130,21 S
34. 129,07 S
35. 127,22 D
36. 125,94 D
37. 124,98 D
38. 122,36 S
39. 121,47 D
40. 110,92 T
41. 110,49 T
42. 109,98 T
43. 109,46 T
44. 106,23 T
45. 104,73 T
46. 67,37 D
47. 57,94 D
48. 46,33 D
49. 40,24 T
50. 20,74 T
51. 20,67 Q
52. 12,93 Q
53. 12,93 Q
S= szinglett D= dublett
Q= kvartett
-3HU 199559 Β
A10255C faktor:
Nem kristályos, fehér, sárgás-fehér por, ami dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, piridinben, metilén-klorid/metanol, 1:1 térfogatarányú elegyében és tetrahidrofurán/ /víz, 4:1 térfogatarányú elegyében oldódik.
I ElemanalízisC: 49,18, H: 3,86, N: 17,89,0:18,28 és S:6,46% (átlag).
A gyors atom bombázás ú (FAB) tömegspektrometriával meghatározott látszólagos molekulatömeg: 1174 dalton.
, Viszonyító anyagként cézium-jodidot hasz| nálva, a pontos tömeg: 1175,35 (M+H).
A 66%-os vizes dimetil-formamid oldatban végzett elektrometrikus titrálás szerint (kezdő pH= 7,29) a C faktor két titráIható, csoporttal rendelkezik, melyek pKa értéke
2,9 (bizonytalan), illetve 12,0.
A 6n sósavban végzett hidrolízis után az aminosavanalízis 7,429 mmól/mg ammóniá; ról és 758 mmól/mg treoninról tanúskodik.
' A kromatogrammon egy nagy, nem azono» sított csúcs jelenik meg a hisztidin csúcs előtt.
. Semleges, savas és lúgos metanolban fel' vett ultraibolya elnyelési spektrumban az λ/πβχ 245 nm (e = 63000).
Az infravörös-spektrumát (KBr) a 2. ábrán mutatjuk be. A spektrum legjellemzőbb elnyelési maximumai: 3375, 2973, 2932, 2876,
S 1661,1597, 1494, 1427, 1345, 1305, 1249, 1111, j 1083 , 984,933 és 894 cnf‘.
í A perdeuterált dimetil-szulfoxidban 360 * MHz-en felvett proton magmágneses rezo! nanciaspektrum csúcsai: delta 10,51, 10,08, • 9,84, 9,57, 9,10, 8,88, 8,03, 7,94, 7,53, 5,15 (az eddigiek D2O-val mind cserélhetők), 8.67, ' 8,59, 8,51, 8,49, 8,38, 8,25, 8,24, 6,57, 6,52
6,38, 6Ί1, 5,91, 5,78, 5,74, 5,70, 5,65, 5,63,
5,44, 5,15, 4,79, 4,67, 4,63, 4,23. 2,21, 1,62, j 1,11 és 1,01.
, A10255E faktor:
Nem kristályos, fehér, sárgás-fehér por, ami oldható dimetil-szulfoxidban, dimetilí -formamidban, piridinben, kloroform/metanol
I elegyében és tetrahidrofurán/víz, 4:1 térfogatarányú elegyében.
! Elemanalízis: C: 48,03, H: 3,91, N: 15,76, ί O: 17,09, S: 5,63% (átlag).
A gyors atom bombázású (FAB) tömegspektrometriával meghatározott látszólagos molekulutömeg: 1258 dalton. Viszonyító anyagként cézium-jodidot használva a pontos tömege: 1259,55 (M+H).
A 66%-os vizes dimetil-formamid oldatban végzett elektrometrikus titrálás alapján az A10255E faktor három titrálható csoporttal rendelkezik, melyek pKa értékei: 4,85, 11,1, j illetve 13,2.
A 6n sósavas hidrolízis után végzett ami[ nosav analízis 8,580 mmól/mg ammóniáról ί és 7,16 mmól/mg, treoninról tanúskodik.
II A kromatogrammon egy nagy, nem azonosí, tott csúcs jelenik meg a hisztidin csúcsa előtt.
H 4
Semleges, savas és lúgos metanolban felvett ultraibolya elnyelési spektrumában λ„,οχ = 245 nm (ε = 77000).
Az infravörös elnyelési spektrumát (KBr) 5 a 3. ábrán mutatjuk be. A spektrum legjellemzőbb elnyelési maximumai: 3367, 3361, 2966,1664, 1501,1389,1254,1102 és 889 cm-*.
A perdeuterált dimetil-szulfoxidban 270 MHz-nél felvett proton magmágneses rezo10 nanciaspektrumának csúcsai: delta 10,54, 10,00, 9,94, 9,81, 9,60, 9,56, 9,45, 8,89, 8,84,
8,66, 8,59, 8,50, 8,47, 8,39, 8,25, 8,22, 8,10,
6,53, 6,50, 6,24, 5,95, 5,86, 5,84 , 5,77, 5,64,
5.55, 5,52, 5,44, 5,10, 4,80, 4,66, 4,64, 4,22,
2,78, 1,60, 1,11 és 1,00.
A10255F faktor:
Nem kristályos, fehér, sárgás-fehér por, ami dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, piridinben, metilén-klorid/metanol, 1:1 20 térfogatarányú elegyében, tetrahidrofurán/ /víz, 4:1 térfogatarányű elegyében oldódik.
Elemanalízis:
C: 49,65, H: 4,23, N: 17,11,0: 22,08, S: 7,78% (átlag).
A térdeszorpciós (FD) tömegspektrometriával meghatározott látszólagos molekulatömeg: 1188 dalton.
66%-os vizes dimetil-formamid oldatban végzett elektrometriásan titrálás szerint (kez30 dő pH = 7,08) az A10255F faktor egy titrálható csoporttal rendelkezik pKa = 12,5 értékkel.
A 6n sósavas hidrolízis után végzett ami35 nosavanalízis 7,226 mmól/mg ammóniáról és 735 mmól/mg treoninról tanúskodik. A kromatogrammon egy nagy, nem azonosított csúcs jelenik meg a hisztidin csúcs előtt.
Semleges, savas és lúgos metanolban 40 felvett ultraibolya elnyelési spektrumban λ,«η.τ~245 nm (e=71.500).
Az infravörös elnyelési spektrumot (KBr) a 4. ábrán mutatjuk be. A legjellemzőbb elnyelési maximumok: 3369, 2943, 2907, 2846,
1663, 1588, 1519, 1493, 1425, 1337, 1288, 1251, 1151, 1110, 1083, 995, 927, 890, 807, 776 és 751 cm’1.
A perdeuterált dimetil-szulfoxidban, 360 50 MHz-nél felvett proton magmágnses rezonanciaspektrum csúcsai: delta 10,51, 10,17, 9,88, 9,77, 9,54 , 9,10, 8,90, 8,88, 8,66, 8,59, 8,51, 8,49, 8,38, 8,25, 8,24 , 8,06, 7,94, 7,53,
6.56, 6,51, 6,27, 6,23, 6,12, 6,12, 5,96, 5,77, „ 5,76, 5,71, 5,71, 5,64, 5,62, 5,47, 5,14, 4,77, 00 4,65, 4,62 , 4,20, 2,77, 2,48, 2,48, 1,58, 1,08,
0,98 és 0,98.
A10255G faktor:
Nem kristályos fehér, sárgás-fehér por, ami dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamid60 bán, piridinben, kloroform/metanol elegyében, tetrahidrofurán/viz, 4:1 arányú elegyében oldódik.
Elemanalízis:
C: 51,46, H: 3,82, N: 17,62, O: 19,38, S:7,03% 65 (összesen: 99,31%).
-4HU 199559 Β
Az ultraibolya elnyelési spektrum maximuma semleges etanolban k™, = 247 nm (ε = 72200), savas etanolban Kmex = 247 nm (ε = 73400), lúgos oldatban λίηβχ — 211 nm (ε = 27200).
Az A10255G faktor infravörös elnyelési spektrumát (KBr) az 5. ábrán mutatjuk be.
A perdeuterált dimetil-szulfoxidban, 500 MHz-en felvett *H magmágneses rezonanciaspektrum csúcsai:
jel eltolódás jeltípus
1. 10,53 S
2. 9,95 S
3. 9,83 S
4. 9,79 S
5.. 9,59 BS
6. 9,09 S
7. 8,89 T
8. 8,84 D
9. 8,68 S
10. 8,60 S
11. 8,51 S
12. 8,48 D
13. 8}39 S
14. 8,24 S
15. 8,24 D
16. 8.04 D
17. 6,53x S
18. 6,47 Q
19. 6,10 s
20. 5,95 s
21. 5,84 s
22. 5,81 s
23. 5,80 s
24. 5,78 s
25. 5,76 s
26. 5,68 s
27. 5,64 s
28. 5,44 DQ
29. 5,16 D
30. 4,75 DD
31. 4,67 DD
32. 4,63 DD
33. 4,24 BS
34. 1,77 Q
35. 1,62 Q
36. 1,11 Q
x= kétszeres erősség BS= széles szinglett DD=dupla dublett DQ=dupla kvartett
A perdeuterált dimetil-szulfoxidban, 125 MHz-en felvett 13C magmágneses rezonanciaspektrumának csúcsai:
jel eltolódás jeltípus
1. 172,80 S
2. 168,89 S
3. 168,71 S
4. 164,80 S
jel_eltolódás_jeltípus
5.
6.
7.
8. 9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20. 21. 22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
163,59
163,00
162,79
162,61
162,53
161,52
160.24
160,12
159.94 159,42
158.91 158,01
149.41 148,73 148,04
146.83
141.94
141.26 140,62
139.20
136.25
136.20 136,04
134.20 133,81
133.22 130,14 128,99 128,70 127,08
125.83
124.92 123,66 121,40 110,77
110.22 109,85 109,35
106,12 104,65
67.26
57.94 46,49
40,12 20,60
20,22
13.41 <O<O-O<O ÖDO-MHHHHOí/)OOOc/lO(/KZ)t/)VllZVlt/)WOCIÖ7lí/)7lWt/)C/5CZHZ)tZ)V)(ZíCnW
A10255H faktor:
Nem kristályos, fehér, sárgás-fehér por, ami dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, piridinben, metilén-klorid/metanol, 1:1 térfogatarányú elegyében, tetrahidrofurán/ 55 /víz, 4:1 térfogatarányú elegyében oldódik.
Elemanalízis:
C: 50,36, H: 3,72, N: 18,61, O: 18,54, S:8,20% (összesen: 99,43%).
Az ultraibolya elnyelési spektrum maxioq muma semleges etanolban XmeI — 244 nm (e = 74000), savas oldatban λ-max — 245 nm (ε = 74500) és lúgos oldatban Xmejt = 211 nm (8 = 23800).
A perdeuterált dimetil-szulfoxidban, 125 MHz-nél felvett 13C magmágneses rezonan65 ciaspektrum csúcsai:
-5HU 199559ί B jel eltolódás jeltípus
1. 172,92 S
2. 168,92 S
3. 168,86 s
4. 165,14 s
5. 163,63 s
6. 163,03 s
7. 162,65 s
8. 162,33 s
9. 161,52 s
10. 160,30 s
11. 160,14 s
12. 159,99 s
13. 159,45 s
14. 158,94 s
15. 158,09 s
16. 149,43* s
17. 148,78 s
18. 148,03 s
19. 146,90 s
20. 142,07 D
21. 141,30 D
22. 140,68 D
23. 139,21 S
24. 136,96 S
25. 136,10 S
26. 134,67 S
27. 134,07 S
28. 133,80 S
29. 130,27 s
30. 129,03 s
31. 128,78 D
32. 127,24 D
33. 125,94 D
34. 124,99 D
35. 123,71 S
36. 121,50 D
37. 111,76 T
38. 110,45 T
39. 106,11 T
40. 104,67 T
41. 104,44 T
42. 67,39 D
43. 57,95 D
44. 46,54 D
45. 40,22 T
46. 20,66 Q
47. 20,34 Q
48. 13,52 Q
x= kétszeres erősség
A perdeuterált dimetil - szulfoxidban 500 MHz-en felvett ’H-magmágneses rezonanciaspektrum csúcsai:
jel eltolódás jeltípus
1. 10,51 S
2. 10,08 S
3. 9,81 S
4. 9,79 S
5. 9,57 S
6. 9,10 S
jel eltolódás jeltípus
7. 8,86 T
8. 8,83 D
9. 8,68 S
10. 8,60 D
11. 8,51 S
12. 8,50 D
13. 8,39 S
14. 8,25 D
15. 8,24 S
16. 8,03 D
17. 7,94 S
18. 7,53 S
19. 6,56 S
20. 6,53 S
21. 6,48 Q
22. 6,12 s
23. 5,96 s
24. 5,80 s
25. 5,78 s
26. 5,74 s
27. 5,72 s
28. 5,65 s
29. 5,64 s
30. 5,44 DQ
31. 5,15 D
32. 4,80 DD
33. 4,68 DD
34. 4,63 DD
35. 4,24 BS
36. 1,78 D
37. 1,62 D
38. 1,10 D
Az A10255H faktor infravörös elnyelési spektrumát (KBr) a 6. ábrán mutatjuk be.
A gyors atom bombázású (FAB) tömegspektrometriával meghatározott látszólagos molekulatömeg: 1160. Viszonyító anyagként cézium-jodidot használva a pontos tömege: 1161,32 (M+H).
Az alábbiakban ismertetjük azokat a taxonómiai vizsgálatokat, melyek segítségével az A10255 antibiotikumot termelő Streptomyces gardneri NRRL 15537 szülőtörzs rendszertani azonosítását végeztük. A törzs eredetileg Al0255.1 törzsként volt azonosítva.
Az Al 0255.1 törzs rendszertani vizsgálatait Frederick P. Mertz végezte a Lilly Research Laboratoriesban. Ezeknek a vizsgálatoknak az alapján a törzset a Streptomyces gardneri (Waksman 1942) Waksman 1961 ATCC 23911 egyik új törzseként írták le. A meghatározás a faj közzétett leírásain [R.E. Buchanan és N.E. Gibbons (szerk.) „Bergey’s manual of determinative bacteortology, 8. kiadás, The Williams ad Wilkins Co., Baltimore, 1974; E.B. Shirling és D. Gottlieb, „Cooperative description of type cultures of Streptómyces, Int. J.Syst. Bacteriol., 18 (4) : 279—392 (1968); S.A. Waksman, „The Actinomycestes II. köt., The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961), és egyide-6HU 199559 Β jű laboratóriumi összehasonlításokon alapszik.
A Streptomyces fajok jellemzésére az International Streptomyces Project (ISP) által ajánlott módszereket (E.B. Shirling és D. Gottlieb, „Methods fór character-ization of Streptomyces species, Int. J.Syst. Bacter»l., 16 (3): 313—340 (966)] bizonyos további vizsgálatokkal (D.J. Balzevic és G.M. Ederer, „Principles of biochemical test in diagnostic microbiology, John Willy and Sons, Inc., New York, 1975] egészítettük ki.
A szénhasznosítást ISP No.9 alaptalajon határoztuk meg, melyhez 1%-os végkoncentrációban adtunk szűréssel sterilizált szénforrást. A lemezeket 30°C hőmérsékleten inkubáltuk, és 14 nap elteltével értékeltük.
A melanoid-pigment termelését (kromogenitás) ISP No.l (tripton/élesztőkivonat), ISP No.6 (pepton/élesztökiv‘onat/vas agar), ISP No.7 (tirozinos agar) és módosított ISP No.7 (tirozin nélkül) táptalajon határoztuk meg.
A keményítőhidrolízist jódos keményítő jelenlétében határoztuk meg ISP No.4 (szervetlen sók/keményítő agar) táptalajon (1. Blazevic és Ederer).
A morfológiai vizsgálatokhoz fénymikroszkópot használtunk. A spórafelszín rajzolatának meghatározásáhozz letapogató elektronmikroszkópot (SEM) alkalmaztunk.
A nátrium-klorid-tűrés megállapításához kívánt koncentrációban nátriüm-kloridot adtunk az ISP No.2 agárhoz.
A színek megnevezése az ICSS-NBS Centroid Color Charts, stadard sample No.2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C.) és a Color Harmony Manual (4. kiadás, Color Standards Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) alapján történt.
A sejtfal cukorjait M.P. Lechevalier („Identification of aerobic Actenomycetes of
I. T Á B clinical importance, J. Láb. Clin. Med., 71: 934—944 (1968)] eljárásával határoztuk meg. A diaminopimelinsav (DAP) izomereket B. Beeker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon és
H.A. Lechevalier („Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromotography of Whole-cell hydrolysates, Appl. Microbiol., 11: 421—423 (1964)] kromatográfiás módszereivel állapítottuk meg.
Az A10255.1 törzs tenyészetének jellemzői:
Korlátozott vegetatív- és nagyon gyengén fejlett légmicéliumok. A légmicélium spóra15 tömegének a színe a fehér (W) — szürke (GY) sorozatba tartozik. A Tresner és Backus rendszerben (Color Harmony Manual, 1. fent és E. J. Backus és H.D. Tresner, „System of color wheels fór Streptomyces taxonomy, Appl.
Microbiol., 11; 335—338 (1956)1 ehhez a színhez a legközelebb álló szín a fehér sorozatban a „b oyster white” (osztrigafehér), a szürke színsorozatában a „<[ light gray (halványszürke). A tenyészetnek fenti leírása leg25 inkább a glicerines/aszparaginos agaron (ISP No.5) figyelhető meg. A légmicélium a legtöbb táptalajon oly gyengén fejlődik ki, hogy a szín meghatározása nagyon nehéz.
A tenyészet fonák oldalának nincsenek megkülönböztető színanyagai. A fonák oldal színe narancssárgától sárgás-barnáig változik, és a színt a pH nem befolyásolja. Az egyetlen oldható halványbarna színanyag a tirozi35 nos agaron (ISP No.7) és a paradicsompasztás, zablisztes agaron (TPO) termelődik, míg glicerines, glicines agaron a termelt színanyag halvány narancsszínű. A variabilitási vizsgálatok alapján megállapítható volt, hogy a tenyészet stabil és homogén.
Az A10255.1 törzs és a Streptomyces gardneri ATCC 23911 törzs tenyészetének jellemző tulajdonságait az 1. táblázatban foglaljuk össze.
LÁZAT
agar A10255.1 S.gardáért
ISP N közepes közepes
No.2 jA 72.d.0Y. 72.d. OY.
Lm2 gyenge: b Mii te (csak α széleken) gyenge: d light Gi (csak a széleken)
°P nincs nincs
ISP N nyomokban-közepos ny om óléban
No. 3 F 7O.1.OY -
Lw nyomokban, b White (csalt α széleken) nincs
Op nincs nincs
-7HU 199559 Β
I. TÁBLA.Z AT (folytatás) agar A10255.1 S.gardneri
káloium- N közepes közepes
malát F 79.l.gy.yBr 93Gray
Lm ni no s - ny om ok ba n nyomokban: b Vhite
Sp nincs nincs
Czapek N közepes erőteljes
F 93 .y Cray 79·l.gy. y Dr
Lm gyenge, b Vhite erőteljes, b Irtiite
Sp nincs nincs
gltilcóz/ N közepes közepes
aszpárágin F 72.d.0Y 90.gy,Y.
I«i gyenge : b líliite ninos
Sp nincs nincs
ISP N jó jó
F 54 brO 77.m.yBr
Lm gyenge, _b White gyenge, b Vhite
Op haÍványbarna nagyon halványbarna
glioerin/ N közopes közepes (redőzött felszín)
glicin F 53.m.O. (nem pH függő) 9O.gy.Y
Lm ninos ninos
Op halvány naranosszinü nincs
-ΓΡΟ N jó jó
F 54 brO (nem pH függő) 72.d.0Y
Lm gyenge (csak a széleken) gyönge (osaka széleken)
3oa pale orange yellov d light Gray
Op halvány narancsos barna ninos
ISP N közepes közepes
F 71.m.0Y 91.d.gy,Y.
Lm gyenge, b Vhite gyenge, d light Gray
Op nincs nincs
-8HU 199559 Β
I, TÁBLÁZAT (folytatás) agnr
A10255.1
S,gardneri
1SP N
No. 5 F
Itn
Sp közepes
70. lJOC.
közepes, b Vhite -dl Gray nincs közepes
9O.gy.Y.
nyomokban ninos
N= növekedés,
F= fonák oldal,
Lm= légmioélium,
Op= oldható-pigment
1-a színek az ICSS-NBS rendszer szerint jelölve 2 - a színek a Color Harmony Manual szerint jelölve.
Az A10255.1 törzs tenyészete gyengén A teljes sejt hidrolizátumában levő LL-difejlett, nem fragmentált légmicéliumokat fejleszt, ami monopodiálisan elágazik. A sporofórák egyenes és csavarodott ágakként elrendezettek. Nem figyelhetők meg spirálok, szkleróciák, sporangiák vagy mozgóspórák. Pridham és munkatársai rendszerében [T.G. Pridham és munkatársa, „A guide fór the classification of Streptomyces according to selected groups, Appl. Microbiol., 6:52—79 (1957)] az A10255.1 törzs a Rectus-flexibilus (RF) csoportba tartozik.
Ugyanaz a morfológia figyelhető meg valamennyi táptalajon, ahol légmicélium megjelenik. Az érett spóraláncok általában 10— 50 spórából állnak.
A spóraalak hengeres. A spóra 0,9-1,0 pm hosszú és 0,5—0,6 pm széles. Az átlagméret: 1,6x0,6 pm. A spórafelszín sima.
Fiziológiailag az alábbiak szerint jellemezhetjük a törzseket:
II. T Á amino-pimelinsav mezo-izomert nem tartalmaz. A teljes sejt hidrolizátumában levő cukrok: glükóz, mannóz és ribóz. Ezek a jellemzők az I. sejtfal típusú és a „nem jellemző (no characteristic, NC.) cukorösszetét’elű cso35 portba sorolják a mikroorganizmust (M.P. Lechevalier., 1. fent). A fő sejtfal-alkotóknak ez a kombinációja a Streptomyces nemre jellemző [M.P. Lechevalier, 1. fent és R.E. Buchanan és N.E. Gibbons (szerk.) 1. fent).
Az Al 0255.1 törzs, szénforrásként hasznosítja az L-arabinózt, D-fruktózt, D-galaktózt, D-glükózt, i-inozitolt, rafinózt és a D-xilózt; nem hasznosítja a D-mannitolt, L-ram45 nőzt, szalicint és szacharózt. A II. táblázatban összefoglaljuk az A10255.1 törzs és a Streptomyces gardneri ATCC 23911 szénhasznosítását.
B L Á Z A T
Az A10255.1 és a S.gardneri ATCC 23911 törzsek szénforráshasznositásai szénforrás A10255.1 S.gardneri nincs szén
L-arabinóz
D-frxiktóz
D-galaktóz
-9HU 199559 Β
II. TÁBLÁZAT
szénforrás. (folytatás) A10255.1 S.gardneri
D-glükóz + +
i-inozitol + -
D-jnannitol - -
raffinóz + +
L-raamóz - +
szállóin - -
szacharóz - +
B-xilóz + +
a (
- s nem hasznosított +b = hasznosított
Az A 10255.1 törzs hidrolizálja a keményítőt, részben hidrolizálja a fölözött tejet, katalózt termel, elfolyósítja a zselatint és nitritté redukálja a nitrátot.
Az A 10255.1 törzs 6%-ig elviseli a nátrium-klorid koncentrációt, és 4 és 40°C hőmérséklettartományban növekszik.
Az A 10255.1 törzs melanoid pigmenteket termel tripton/élesztőkivonatos táptalajon (1SP No.l) és pepton/élesztőkivonat/vasas ferdeagaron (ISP No.6). A tirozinos ferdeagaron (ISP No.7) nem termelődik melanoid pigment.
Az A10255.1 törzs tenyészetének jellemzőit, morfológiai, fiziológiai tulajdonságait összehasonlítottuk a hasonló fajok közzétett leírásaival. Négy Streptomyces fajt választottunk ki az egyidejű laboratóriumi összehasonlításra:
Streptomyces aureofascículus Streptomyces aureomonopodiales —
Streptomyces flavochromonogenes Streptomyces gardneri-2- E.B. Shirling és Gottlieb, „Cooperative description of type cultures of Streptomyces, Int. J. Syst. Bacteriol., 19 (4): 375—390 (1969).
- E.B. Shirling és D. Gottlieb, „Cooperative description of type cultures of Streptomyces, Int. J. Syst. Bacteriology, 22 (4): 265—394 11972).
- E.B. Shirling és D. Gottlieb, „Cooperative description of type cultures of Streptomyces, Int. J. Syst. Bacteriol., 18 (4): 279—392 (1968).
A laboratóriumi összehasonlító vizsgálatok lényeges eltérést mutatnak a S. aureofasciculus-tól és a S.flavochromonegenes-től, de jó egyezést a S.aureomonopodialse-szel és a
S.gardneri-vel. Minthogy azonban a S.aureomonopodiales nem szerepel a „Baktérium-nevek elfogadott jegyzék-én („Approved list of bacterial names), az összehasonlításból elhagytuk.
40
A tenyésztési jellemzőket, morfológiai és fiziológiai tulajdonságokat illetően az A10255.1 törzs teljesen hasonló a S.gardneri-hez. A tenyészet legjellemzőbb tulajdonsága, mely mindkét törzset megkülönbözteti a töb45 bitói, a léghifák nagyon gyenge képződése valamennyi táptalajon. A S.gardneri az irodalmi leírása szerint a „szürke (Gray, GY) sorozathoz tartozik. Ezzel szemben az
5Q A10255.1 törzs Waksman [S.A. Waksman
1. fentebb) eredeti leírása és a laboratóriumi összehasonlításunk alapján fehér (W, white) és szürke (GY) léghifákat fejleszt. Mindkét lenyészet fonák oldalának a színe csaknem 55 azonos. Mindkét tenyészet morfológiailag a rectus-flexibilus (RF) csoportba tartozik, spórafelszínük sima, a spóráik hengeres alakúak, és spóraláncaik 10—50 spórából állnak.
Mindkét törzs megegyezik a kataláztermelést, a zselatinelfolyósítást, melanoid pigment termelését, a nitrátredukciót, valamint a tej- és keményítő hidrolízist illetően.
Az A 10255.1 törzs és a S.gardneri közötti eltérés minimális. A S.gardneri kevésbé nátrium- klorid-türő, és a hőmérséklettartomány, melyben növekedést mutat alacsonyabban
-10HU 199559 Β van, mint az A10255.1 törzsé. Az L-ramnóz és szacharóz hasznosítás, valamint az, hogy nem képes hasznosítani az ί-inozitolt, a S.gard* hasonlóság nerit megkülönbözteti az A 10255.1 törzstől. Ezeket a hasonlóságokat és eltéréseket az alábbiakban összegezzük:
eltérés léghifák spóra tömegének színe (V) kataláz pozitív sojtfalhidrolizátum (LL-DAP) jellemző pigment hiánya zselatinélfolyósitás morfológia (RF) nitrátredukoló részleges tejhidrolizis fonák oldal festékanyaga oldható festékanyag hiánya spóralátíc hossza spóraalak spórák felületének rajzolata (sima, keményitohidrolízis szénforrás-hasznositás nátrium-klorid-tűrés növekedés hőmérséklettartománya
Sm)
A két mikroorganizmus hasonlóságait és különbözőségeit részletesen a III. táblázatban foglaltuk össze.
IXI. TÁBLÁZAT
Az A10255.1 törzs és a S.gardneri ATCC 23911 összehas onlitása
tulajdonságok A10255.1 s.gardneri
léghifák spóratömegének színe (V) (V)
szénf orráshasznositás .*
i-inozitol + -
L-ramnóz - +
szacharóz - +
kataláz + +
sejtfaltípus I I
jellemző pigment - -
II
-11HU 199559 Β tulajdonságok ζ ί
III. TÁBLÁZAT (folytatás)
0255.1
S.gardneri zselatiné lf olyósilfás raelanoid pigment termelés
ISP No.1
ISP No. 6
ISP No. 7 morfológia NaCl-tűrés, % nitrátredukció fonák oldal szine fölözött tej hidrolízise oldható pigmentek spóralánc hossza spóraalak spórafelszin keményitohidrolizis növelícíés hőmérséklettartománya, °C +
+ +
(RF) +
YBr részleges
10-50 hengeres sima +
4-40 +
+ +
(RF) +
QÍBr részleges
10-50 hengeres sima
4*
4-37
A fenti összehasonlítások szerint az Al 0255.1 törzs nagyon hasonló a S.gardneri (Waksman, 1942) Waksman 1961, ATCC 23911 egyik törzseként sorolhatjuk rendszertanilag be. A S.gardneri szerepel a „Baktérium-nevek elfogadott jegyzék-ében [V.B.D. Skerman és munkatársai, „Approved lists of bacterial names”, Int.J. Syst. Bacteriol., 30 (1): 225—420 (1980)], így tehát szabályosan közzétett név.
Megjegyzendő, hogy Kurylowicz és munkatársai (W. Kurylowicz, A.Paszkiewicz, W. Woznicka és W. Kurzatkowski, „Numerical taxonomy of Streptomyces, Polish Media! Publishers, 1975) a „Wroclawdentrite of similarity és az „Owerall similarity method számos módszere alapján a S.gardnerit ugyanabba a csoportba helyezik. A vizsgálatokon alapuló dendogram szerint a két törzs hasonlósági százaléka: 94. Ez az egyezés azt igazolja, hogy a fajokra való elkülönítés nem jogos.
A fentiekben leírt Streptomyces gardneri tenyészetet letétbe helyeztük, és a Northern 12
Régiónál Research Division, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, II. 61604, USA tőrzsgyűjtemé45 riyének részét képezi. A jelen szabadalom kiboocsátása nyomán a törzs a Department of Agriculture (Mezőgazdasági Minisztérium) említett intézményéből az NRRL 15537 szá5Q mon beszerezhető.
Az A10255.10, NRRL 18260 törzs az Al0255.1, NRRL 15537 szűlőtörzsből származik, annak N-nitrozo-guanidinnel tör55 tént sorozatos kezelése nyomán.
Az Al0255.2 törzs (a fentiekben Streptomyces 'gardneri NRRL 15922 törzsként már említett) az A10255.1 törzsből származó mutáns, ami N-nitrozo-guanidinnel való -kezelés nyomán keletkezett. Az A10255.1 törzs azo60 nos a Streptomyces gardneri NRRL 15537 törzssel.
Az A10255.1 és az A10255.2 törzsek között számos rendszertani hasonlóság van, ezeket a IV. táblázatban foglaljuk össze.
-12HU 199559 Β
IV. TÁBLÁZAT
Az A10255.1 és az A10255.2 törzsek tenyészeteinek összehasonlítása
agar A10255.1 A10255.2
ISP N közepes közepes
No. 2. F— 72.Ú.OY 72.Ú.0Y
InA gyenge, b wkite d light Gray (csak széleken) gyenge, b líhite - 2ba Pale Yellow
θρ nincs nincs
ISP N ny omokban-közepes nyomokban-közepes
No. 3 F 70.1.OY 93.y.Gray
Lm nyomokban, ti Vhite (csak a széleken) nyomokban, Ja líhite
Op nincs nincs
kalcituu- malát N közepes (malátot nem hidrolizál) közepes (malátot nem hidrolizál)
F 79.i.gy.yBi* 79.i.gy. yBr
I$n nincs nincs
°P nincs nincs
Czapek N közepes nincs
F 93.y Gray
Lm gyenge, b White
Op nincs
glükóz/ N közepes gyenge
aszparagin F 72.d.0Y 9O.gy.Y
Lm gyenge, b White (csak a széleken) nincs
Op nincs nincs
ISP N jó jó
-13HU 199559 Β
26
IV. TÁBLÁZAT
agar (folytatás) A10255.1 A.10255.2
No.7 F 54. brO, 54.br0
Lm gyenge, b White közepes, b Vhite
op halv ány barna halványbarna
glicerin/ N közepes erőteljes
glicin. P 53.ra.O (nem pH függő) 50. s.O
Lm nincs jó, 5ob gy.yPlc.
θρ halvány narancs halvány narancs
TPO N jó erőteljes
P 54 brO (nem pH függő) 51. deepO
Lm gyenge, 3oa pale orange yellow (csak a széleken) jó, 2 ba Pale yellow
Op t^alvány narancs os barna halvány narancsos barna
ISP N közepes közepes
No.4 F 71.ra. OY 77. m.yBr
Lm gyenge, b White (csak a széleken) közepes, b Hhite-2ba Pale yellow
Op nincs nincs
ISP N közepes jó
No. 5 P 70. 1.0Y 70. 1.0Y
Lm közepes, b líhite-d 1. Gray jó, b Nhite-2ba Pale yellow
Op nincs nincs
N · növekedés , P v fonák oldal szine, Lm = légmicélium,
Op a oldható pigment
1_ - az ICSS-NBS System jelölései
2-a Color Harmony Manual jelölései.
-14HU 199559 Β
V. TÁBLÁZAT
Az A10255.1 éa az A10255.2 törzsek összehasonlítása tulajdonságok
A10255.1 A10255.2 léghifák spóratömegének színe V-Gy szénforrás hasznosítása kataláz + tenyészet jéllemzől:
léghifák a glioerin/glicines agaron növekedés Czapek agaron + jellemző színanyag bizonyos táptalajon +
W-Y azonos zs elatinélf olyós itás melanoid pigment termelés morfológia
NaCl tolerancia, £ nitrátredukció fonák oldal színe fölözött tej hidrolízise oldható festékanyag bizonyos táptalaj on spóraláno hossza spóraalak spóraméret - yum spórafelszin keraényitőhidrolizis növekedés hőmérséklettartománya, +
+
RF +
Ybr részleges +
10-50 hengeres 1,0x0,6 sima +
’c 4-40 +
+ +
RE +
Ybr teljes +
10-50 hengeres 1,3x0,6 sima +
4-37
A fent jellemzett Streptomyces gardneri Al0255.2 törzs tenyészetét letétbe helyeztük a Norhern Régiónál Research Division, US, Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peöria, II. 61604, USA törzsgyűjteményében. A jelen szabadalom kibocsátását követően a Department of Agriculture (Y Mezőgazdasági Minisztérium) nevezett intézményéből beszerezhető az NRRL 15922 számon.
Az A10255 antibiotikum komplexet az előzőekben leírt Streptomyces gardneri NRRL 15537, NRRL 18260, NRRL 15922 törzsek vagy ezek A10255 antibiotikumot termelő 60 mutánsaik tenyészetével állítjuk elő. A tenyétést süllyesztett, aerob fermentációs körülmények között végezzük asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó tápközegben. A fermentálást elő65 nyösen addig végezzük, amíg kellő mennyi15
-15HU 199559 Β ségű antibiotikum termelődik. Az antibiotikus aktivitás nagy része a micéliumban található, míg kisebb része a tápközegben. Az A10255 komplex a legkönnyebben úgy választható el a fermentléből, hogy a micéliumot (biomasszát) kiszűrjük. A tápközeget rendszerint nem használjuk fel az antibiotikum kinyerésére. Az antibiotikum komplexet a micéliumból izoláljuk.
Az NRRL 15537 szülőtörzs főtermékként a B faktort termeli. Az NRRL 18260 mutáns törzs főterméke a B és G faktor. Mindkét törzsnél a C, E, F és H faktorok csak mint melléktermékek keletkeznek.
A micéliumot poláris oldószerrel — például aceton/víz, 4:1 arányú elegyével — extraháljuk, az extraktumot betöményítjük, savanyítjuk és szerves oldószerrel — például etil-acetáttal — ismét extraháljuk. A nyert oldatot betöményítjük, hogy az A10255 komplex kicsapódjon.
Az A10255 komplex további tisztítás nélkül felhasználható, közvetlenül hozzákeverve az állat táplálékába, vagy takarmány premixébe. Ettől eltérő módon, az A10255 antibiotikum-komplexet tovább tisztíthatjuk, és az egyes faktorokat elválaszthatjuk jól ismert kromatográfiás eljárásokkal, például vékonyréteg-kromatográfiával, oszlopkromatográfiával vagy különösen különféle HPLC eljárásokkal. Az egyes faktorok elválasztásának néhány sajátságos eljárását a későbbiekben tárgyaljuk.
Az A10255 komplex termelésénél számos különféle táptalaj használható fel az NRRL 15537, NRRL 18260 vagy az NRRL 15922 törzsek tenyésztésére. Vannak azonban tápközegek, melyek a gazdaságos termelés, az optimális kinyerés, a termék könnyebb kinyerése szempontjából előnyösebbek a többinél. Ezeknek a táptalajoknak asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat kell tartalmazniuk. Alkalmas szénforrás lehet a glükóz, keményítő, maltóz, fruktóz és glicerin. A szénforrás optimális koncentrációja 2—5 súly%.
Előnyös nitrogénforrás az emésztett szója, savval vagy enzimatikusan emésztett kazein, az ammóniumsók, nitrátsók, glicin, alanin, szerin, aszparagin és glutamin.
A mikroorganizmusok növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges eszenciális nyomelemek kellő mennyiségben találhatók, mint szennyezések a táptalaj más alkotórészeiben. Előnyös lehet azonban további oldható szer30 vetlen sókat adni a táptalajhoz, melyek nátrium-, kálium-, magnézium-, kálcium-, ammónium, vas-, klorid-, karbonát-, foszfát-, szulfát-, stb., ionokat szolgáltatnak.
Noha kis mennyiségű A10255 antibiotikumot rázott-lombikos tenyészetekben is előállíthatunk, nagyobb mennyiségű A10255 antibiotikum előállítására előnyös süllyesztett, aerob tankfermentációt végezni. A tankfermentációnál előnyösen vegetatív oltóanyagot használunk. A vegetatív inokulum előállításához kis térfogatú táptalajt spórával vagy micélium fragmensekkel oltunk be, hogy friss, aktivan növekvő tenyészethez jussunk. A vegetatív inokulumot visszük azután át a nagy. tankfermentorba, ahol alkalmas inkubációs idő elteltével, az A10255 antibiotikum optimális hozadékkal termelődik.
Az A10255 antibiotikumot termelő mikroorganizmusok 23—37°C hőmérséklettartományban termelik az A10255 komplexet. Az A10255 komplex optimális termelése 30— 32°C hőmérsékleten történik.
Amint az a süllyesztett, aerob tenyészeteknél történik, steril levegőt diszpergálunk keresztül a tenyészeten- A mikroorganizmus kellő növekedéséhez a tankfermentorban percenként átvezetett levegő térfogatának, percenként 100—300 fordulatszámú kevertetésnél, a tápközeg térfogatának egytizede és fele között kell lennie. Egy 165 literes fermentornál, mely 100 liter fermentációs közeget tartalmaz, melyet lapátkerekes keverővei percenként 200 fordulatszámmal keverünk, a percenként átvezetett levegő optimális térfogata a fermentlé térfogatának 0,125-öd részével egyenlő.
A fermentlében az antibiotikus aktivitás rendszerint a 40. óra után jelenik meg, és az antibiotikumtermelés csúcsa a 110—140. órára várható.
Az A10255 antibiotikum termelését vagy agardiffúziós módszerrel — tesztorganizmusként Bacillus subtilis ATCC 6633 törzset használva —, vagy turbidimetrikus módszerrel — Staphylococcus aureus ATCC 9114 tesztorganizmust használva — követhetjük nyomon.
Az A10255 komplex, valamint annak egyes komponensei antimikrobiális hatóanyagok, különösen Gram-pozitív mikroorganizmusokkal szemben, amint azt a következő in vitro és in vivő vizsgálatok eredményei tanúsítják.
-16HU 199559 Β
32
VI. T Á B L Á Z A T
Az A10255 vegyületek aktivitása patogán mikroorganizmusok ellen
MIC (mog/ml)
B C © F
Staphylooooous aureus XI.1 0,125 0,03 0,25 0,03
Staphyloeocous aureus V41 0,5 0,125 0,25 0,06
S taphylooőooww aureus XltOO 0,5 0,125 0,5 0,06
Staphylooooous aureus S13E 0,5 0,06 0,125 0,03
Staphylooooous epidermidis 270 0,25 0,03 0,25 0,03
Staphylooooous epidermidis 222 0,5 0,125 0,5 0,06
Streptocooous pyogenes C2O3 0,125 0,06 0,125 0,03
Streptooooous pneumoniae Park I 0,125 0,015 0,125 0,015
Streptooooous group D X66 0,25 0,06 0,25 0,06
Streptooooous group D 20^1 0,5 0,125 0,25 0,125
Ilemophilus influenzáé C.L. (szeme) >128 64 >128 >128
Hemophilus influenzáé 76 ( réz, ) >128 16 16 128
A minimális gátlás! koncentrációkat (MIC) a szabványos agar hígításos módszerrel határozzuk meg.
Az A10255 faktorok ugyancsak kiváló antimikrobiális aktivitást mutatnak számos Clostridium difficile törzzsel szemben is. A szabványos agar hígításos vizsgálatban az A10255 komplex és a B, C, E és F faktorok MIC értékei kevesebbek vagy egyenlők a milliliterenként! 0,03 mikrogrammnál. Ugyanabban a vizsgálatban az összehasonlító anyag45 ként szolgáló vankomicin MIC értéke 2—4 pg/ml.
Az A10255 komplexet és a C faktort megvizsgáltuk néhány Bacteroides fajjal szemben is, és kitűnő antimikrobiális aktivitást 50 tapasztaltunk. Az agar hígításos vizsgálatok eredményét a VII. táblázatban foglaltuk össze.
-17HU 199559 Β
Az A10255 vegyűletek aktivitása Bacteroides törzsekkel szemben
VII. TÁBLÁZAT
MIC (mcg/ml)
mikr oorganizmus A10255 C faktor
B. fragilis 1877 °»5 0,5
103 o,5 o,5
104 0,06 0,06
106 0,06 0,06
107 1,0 1,0
108 1,θ 1,0
110 0,5 0,5
111 1,0 1,0
112 1,0 1,0
113 1,0 1,0
1451 0,25 0,25
1470 1,0 1,0
2 0,5 0,5
9 1,0 1,0
9032 1,0 1,0 i
B.corrodens 1874 0,5 0,5
B.vulgatis 1563 0,25 0,25
B. thetaiotaomicron 1438 0,5 0,5
B. thetaiotaomicron 19OOA 0,5 0,5
Az A10255 komplex és az egyes faktorai antimikrobiális aktivitást fejtenek ki az anaerob mikroorganizmusok széles skálájával szemben is. Ezeket az eredményeket foglal- 65 18 tűk össze a Vili. táblázatban. Az adatokat a szabványos agar hígításos vizsgálati módszerrel kaptuk.
-18HU 199559 Β
«η m
οη οη οη οη VO οι m οι
ο ο ο ο Ο τ— ο οι τ- ο ο
·* ·* ·* «* ·. ·* «* ·* «« *»
ο ο ο ο ο ο τ— ο ο V V—
VI VI VI VI en οι cn cn ο ο ο ο ·»·»*·» ο ο ο ο vt VI VI VI m
οι \ρ Ό Ό
Τ- ο ο ο *·»·»·» ο ο ο ο
VI VI VI m
οη οι Ο τ•Η ·*
Ο ο VI m
m οι ιθ
Ο fc
Φ β!
Φ <3
Ρ
Ρ >
Ρ
Ρ
y)
Rt
Ü
Φ
Ρ
Φ
Η
Φ ?>
ιη m
οι ο
οι ·» ο
\Λ *
ο
VI ιη οι οι
Η φ
Η α
I
-ϋ
VI m
οι
ο ο ο ο ο οι οι οι οι οι
VI VI VI νι VI οη Α οη Λ οη Α οη Λ
m
Ό Ό Ό Ό νο οι
Ο Ο Ο ο Ο ο ο τ- Ο
·« β. ·* ·» »> ·* «* »
ο ο ο ο ο 5“ ο V οι
VI VI VI VI VI
φ
Ρ •Η
Ο •Η <Η <Η
Ή fc
Ρ fc ο 00 σ» οι ο
ιη •4·
οη \ο
οι οι Ο\
C0 τ- η- η-
CÍ ΟΙ V- Τ“ η-
Τ“ ο C0 η η V— C0
τ- 2 οη βί ς φ \— Τ“
φ τ- Τ Ρ Ε
Ρ •ΰ ο Ο η
Ο
Ρ
Ρ a
ο
Rt <Ρ
Ο fc ο
Φ
Ο •Η
Ρ •Η
Ρ
Ο
Φ η
ο
Ο οο οι
Ρ
Ρ
Ρ tű
Rt
Ν Ό •ϋ a α φ Ρ a ο η Ρ ο a
Ρ ο ο φ Ρ
Ε 2 β ρ ρ η fc η Ρ •Η 3 0 η
fit 3 Η η 3 Φ φ Φ a χι Φ φ φ
tű Ρ Ρ Ρ Ρ 0 Λ 0 φ 0 0 XJ Ρ
b ρ Ρ Ρ fc 0 ο ο fc fc 0 Ρ Ρ
ο Ρ Ρ Ρ φ ο 0 0 Ρ φ 0 Ε 0
ο fc fc fc Ρ ο φ ο η Φ ο ο fc
Η ρ Ρ Ρ 0 0 ί 0 ο Ε ο Ρ φ
Ja α η η Φ Ρ φ Ρ Ρ Φ Ρ a Ρ
Ρ 0 0 0 & a a a a Ο 0
Β Ρ Ρ Ρ ΰ φ ο φ 0 fc φ
ο Ο ο a a a a a η
Ρ
Ρ
Ρ tű φ
fc
Ρ φ
Ρ
Ρ ο
fc φ
Ρ ο
Rt η
-19HU 199559 Β fa
ιη
»η Ot ιη «η
W τ— « in ο
·% *» V» ·* «·
ο -d· ο ο ο ο
ιη ο ·» ·«
Ο V«η ο
Η «0
Ο
Ε m
·» ο
w cn m
·· ο
in ·« ο
« «η m ό in «Ί w ο
-e -3· « ο cn £h <5
Ν >4
Μ
Η *
Ν
Η d
4?
•μ d
-μ ?>
rl
Ο <Η
r-l & § ιη ♦» in ·» ο m «» m «* ιη ot ·»
ϋ ο ο Τ ο ο ο
ο ί>
Ρ3 οο
Ό ot τ- Γ- τ-
cn C0 \ r- ΟΟ
Ο\ cn νο Ό CM Η
τ- Λ· ιη cn r- 3
ν— οο tv 9 α
α τ- Ot » 0 ο
Ή Ü •Η φ Ή
Γί Ο α α •μ Ό XI
ο h
«τ(
Μ tí
Η
4-( h
ο •Η
Ε ο
d ο
β ο
d
Η >
Β ?» η
ϋθ*θ ÜO*O 9Ο*Ο 9Ο*Ο 90*0 ν*ϊ£09
α α -μ α Ο α ο α α •Η •τί ο
ο φ 0 φ Ö ο d φ φ Jh Ρ έ,
ί3 Ό •Η χ) •Η Ό •rt Ό ’ϋ Φ φ 0.
•γΙ «Η Φ •Η d •rt Ε •rt Ή μ -μ ο
0 0 •μ Ο d 0 ϋ 0 Ο 0 0 h
μ & φ Ρ Η k Η Η Ν d d ο
0 0 Λ Φ Φ Φ Φ Φ Ο Λ fi ο
•μ μ -μ -μ Ε •μ ε •μ •μ Ο ο Ü
0 0 ο 0 0 0 9 α
α) Ö d d d d
¢0 η Μ Θ θ Η fa fa
-20HU 199559 Β
Az A10255 komplexet és a B-faktort intraperitoneálisan egerekbe injektálva, az LDM érték 300 mg/kgxl értéknél, illetve 75 mg/ /kgxl értéknél nagyobbnak adódott.
Gazdaságilag jelentős melegvérű állatoknál, például szárnyasoknál, sertésnél és szarvasmarhánál az A10255 antibiotikumok növekedést serkentő hatásúak. Csirkéknél az A10255 komplex javítja a súlygyarapodást és
IX. T Á B a tápanyaghasznosítást. A IX. táblázatban összefoglaltuk annak a két vizsgálatnak az eredményeit, melyben a komplexet ad libitum adtuk hét napos csirkéknek 14 napon kereszg tül. A komplexszel kezelt csirkék növekedési adatait összehasonlítottuk azonos számú kontrollállat adataival (kezelésenként hét-hét állatot használtunk).
LÁZAT
Az Λ1Ο255 komplex növekedését serkents aktivitása csirkéknél súlygyarapodás t&plálék/sulygyarapodás
táplálék kezelés komplex mennyisége g/t súly (e) javulásÁ (%) arány Javulás (yí)
kukorica kontroll — 331 — 1,724 —
Λ10255 5 358 8,2 1,688 2,1
komplex 20 350 5,7 1,714 0,6
rizs kontroll — 313 — 1,974 —
Λ10255 5 373 19,2 1,718 13,0
komplex 20 358 14,4 1,817 7,9
kezelt átlag
- x 100 = javulás (fó) kontroll átlag
A csirkék növekedésének meggyorsítása céljából az állatok takarmányának egy tonnájához 0,5—50 gramm A10255 komplexet vagy valamelyik faktorát adtuk. A legkedvezőbb eredményeket akkor kaptuk, ha a táplálék egy tonnájához 5—20 gramm A10255 komplexet vagy valamelyik faktorát adtuk.
A találmány további tárgya tápkészítmény baromfiak tápanyaghasznosításának fokozására. A tápkészítfnény csirketápból és az A10255 komplex, A10255B faktor, A10255C faktor, A10255E faktor, A10255F faktor, A10255G faktor vagy A10255H faktor hatásos mennyiségéből áll. A „hatásos mennyi* ség” alatt 0,5—50 g, előnyösen 5—20 g antibiotikum-komplexet vagy faktort értünk a csirketáp tonnájaként. A készítményhez használt csirketápot bármilyen szokásos fejadagban adhatjuk az állatoknak.
A készítményt az állatgyógyszertechnológia jól ismert keverési eljárásaival állíthatjuk elő.
Előnyös az AJ0255 komplex hatásos menynyiségéből és csirketápból álló tápkészítmény.
Az A10255 komplex gyorsítja a választási malacok növekedését és fokozza a táp40 anyaghasznosításukat. Hatásosságát bizonyítják a X. táblázatban összefoglalt eredmények, melyeket kilenc kísérletből nyertünk. A kísérleteket 24 fontos (10,9 kg) kezdősúlyú malacokon végeztük, a vizsgálatokat
4g akkor fejeztük be, amikor az állatok átlagsúlya elérte az 53 fontot (24 kg). A malacokat négyesével tartottuk a szabályozható környezeti tényezőket biztosító nevelőketrecekben, és a 18% proteint tartalmazó kukorica/ /szója táplálékból tetszés szerint fogyasztottak. Valamennyi vizsgálat 35 napon át tartott, kezelésenként átlag 14 állattal dolgoztunk.
A X. táblázatban a zárójelben levő számok a kontrollcsoporthoz viszonyított százalékos eltérést jelentik. A negatív előjelű százalékos eltérés a táplálék/súlygyarapodás oszlopban azt jelzi, hogy az A10255 komplexθθ szel kezelt malacoknál nőtt a tápanyaghasznosítás.
-21HU 199559 Β ni ?>
tó ?>
rl <n ro rl vő rl M aro ro ü -P O 0.
p tí •ri O C.Q
«Ο. χ-κ
CM m CO X—X z*t
et et ·» cn >n
CM cn T~ o et et
1 j I 1 T- en
V^x* K_X V-x*
Ol -d- -4- T— o -d- CO •ít cn CM
σ\ CM m Ol ko CM o •d- r- Ό cn
T“ o T— o O o o o o o a o
et ** — e· et et et •t et et ·»
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM V CM
«4
N '-4 n
'4 d
h jj o
o d
rl d
B •rl, n
+>
N in d
r-l sd >
d π
ró p
d
XS
X ©
rl
QJ ε
o
Ji π -Φ O rl ep'd © rl rl a PSÖ sí p +>
tí o
•ri <ri a<§ n ro in Ό o © t© Jd d © rl í>
P :0 sd tí
5 c a o a M <x •μ ©
rl '•tí ?» ω
© >
P rl -P s d
N rl © rl
Ü'd *o ö ?> N rl © tí Jd n
I
P
Ό Μ P •ri © « rl d -p rl tí -P o SÍ <(-(
x-*
χ—X m x“x Z*~X Z-^t Z—>.
V Tk in CO CM KO
•t ro et ♦ e· •t
Ol 1 »n T“ cn o
'*^x vx *t_X ^x V—*
ro ro ro Ol Ol in T“ cn o ro Oi CM
o o -d· ro Oi t— co n- -d- Pt KO
CM -d· m O CM cn cn ah in T- V“
et •t «. •t et •t •t •t et et et
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
x^x x“x
Ol ro z**x x—x /*—t CM
*t Oi Ol 01 e»
T— cn et et et cn
V t ro CM r- 1
X—* *x«X S-X S-X x»x
v- Ol o J- cn in ro ro 01 ro V
cn in Ol m o r- in co O CM S? ro
o V CM CM o o V“ V“ cM CM o O
τ— τ- Τ— Τ- t— τ- Τ— τ- T- Τ- Τ— Τ-
ο o Ο o Ο o Ο o Ο O Ο o
CM CM CM CM CM CM
H rl r4 rl rl
rl rl rl rl rl rl
O m 0 m O in O m 0 in rl m
h in p in p in h m h m O m
•P CM -P CM P CM Ρ ι ‘•CM P CM h CM
tí O tí o tí o tí o tí o •P O
o τ— 0 T“ 0 0 T“ 0 T— tí T—
Jd 4 Jd -4 Jd c Jd 4 Jd <! 0 Jd <4
in m cm cm n- n- -s· -d· τ-σ»
CM
O o o o o Ο o © O O ο O
ro ro ro ro «fc M co ro Ol ro T- O
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
CM cn « · in ro
-22HU 199559 Β «4 '•=4 ra
Εη
Z\ d
OS +>
?>
rri
O
4ri tí rri to
tí o p ft +» ri •ri o P.<h •4
BIO O rri totí ttS rri tri Ol +> «4 tí +>
4» ri o
ri Qri Pl'—' ri a «® to tí ο Φ ¢0 24 aS © H i>
+» X) tí tí § §.
O pl 24·^ r4 ra ?» tű ffl rri +>
Φ flt z->l n rri ra Φ rri tí Jdtí^ tí ?» aj -P N H rt ri Φ p -P O 24 Wtí <H ««-*
I
Et «® η -p •ri φ W rri
CV τ- Ο z-> o ·» T“ <n cn Ci o cv 1 z“»» CA ·» T“ r- í> o
CV cv σ» «—z tí co 00 00 v-
cri cv ’C- r- cv cv
r- O\ eV ·· o cv «—t On un b· o On On Ό ·» o cv o o Ό cn V cv ·» cv CV 00 r*
CV cv «- cv cv CV
z-s x—·» Z“\
cn !> r-
•s ·*
00 cv cn
«—* «—· *
On cn on r- cn o
en cn cv un V“ un
t— cv o o o o
·» ♦k ·« *» •k
V T- V T“ T-
o o •M O O O o tí
rri rri tri
rri rri rri
O un O un O un
Et un Et un Et un
P cv P CV 43 cv
ri o tí o ri o
O r- o T— o v—
24 <4 24 «4 <4
-s- tí tí cn
o o o
•t ·. •t
cn tí O\
cv eV v-
• * r- co
o o o
«» ·* *k
CA CV CV
T- cv CV
o>
-23HU 199559 Β
A találmány további tárgya tápkészítmény választási malacok növekedésének gyorsítására és tápanyaghasznositásuk fokozására. A tápkészítmény sertés táplálékból és az A10255 komplex, A10255B faktor, A10255C faktor, A10255E faktor, A10255F faktor, A10255G faktor vagy az A10255H faktor hatásos mennyiségéből áll.
A választási malacok tápkészítményében a „hatásos mennyiség kb. 20—40 ppm A10255 komplexet vagy faktort jelent tápegységenként. A tápkészítményben használt táp a választási malacok etetésére szokásosan használt bármilyen eleség lehet. A tápkészítményt az állat-gyógyszertechnológia bármelyik jól ismert módszerével előállíthatjuk.
A választási malacok előnyös tápkészítménye sertés eleségből és hatásos mennyiségű A10255 komplexből áll.
Az A10255 komplex a kifejlett bendőmű5 ködésű kérődzők tápanyaghasznosítását is javítja. Az A10255 antibiotikumokkal kiváltott tápanyaghasznosítás-javulá.st a bendőtartalom propionátjainak termelődésével és a propionátkoncentráció változásával követhet 10 jük nyomon James R. Beek és Joseph A. Yahner módszerével, melyet az 1982. június 8-án kibocsátott 4 333 923 számú USA szabadalomban írnak le. A XI. táblázat adatai az A10255 komplexszel kezelt lombikok illékony zsírsavtermékeihek' arányait mutatják a kont-. roll lombikokhoz viszonyítva. A vizsgálatokat Beek és Yahner (1. fent) módszerével végeztük.
XI. TÁBLÁZAT
Az A10255 komplex hatása a kérődzők ftpanyaghasznositására (a kezelt lombikok termékeinek aránya
- mól/nap - a kontroll lombikok termékeihez viszonyítva') dózis összes illó zsirsav /Ug/ml propionát acetát butirát mmól/l
1,623 0,903 0,538
1,03
1,406 0,965 0,604
1,02
Az A10255 komplex jellemző hatásaként 40 nyilvánul meg a propionát arányainak a növekedése, és ezáltal a tápanyaghasznosulás fokozódása.
A XII. táblázatban azokat az adatokat foglaltuk össze, melyek az A10255 növekedést gyorsító és tápanyaghasznositást javító hatását szemléltetik szarvasmarháknál. A vizsgálatokat 79· napon keresztül végeztük az állatok három csoportján.
XII
TÁBLA
As Α1Ο255 komplex hatása vágómarhák növekedésére csoport A10255 dózis sulygyara- sulygyara- tápanyag- tápanyag(mg/fő/nap) podás podás vál- haszno- haszno(font/nap) tozása sitás sitás változása
(9 állal) 0 2,76 6,94
2
(10 állat) 275 2,88 +4# 5,94 14#
8
(9 állat) 550 2,74 -l£ 5,79 1755
-2447
A találmány további tárgya eljárás szarvasmarhák növekedésének gyorsítására és tápanyaghasznosításuk növelésére azáltal, hogy az állatoknak hatásos mennyiségű A10255 komplexet vagy valamelyik A10255 faktort adiuk be. Előnyös eljárás, ha az állatoknak AÍ0255 komplex hatásos mennyiségét adjuk be.
Az eljárás szerint a szarvasmarhák növekedésének meggyorsítására az állatoknak hatásos mennyiségű A10255 komplexet vagy A10255 faktort adunk be szájon keresztül. A „hatásos mennyiség 0,05—5,0 mg/kg, előnyösen 0,1-3,0 mg/kg napi dózist jelent. Az antibiotikum komplexet vagy faktort az állat eleségével adhatjuk be szájon keresztül, de a beadás más módon is történhet, például folyadék, bólusz vagy kapszula formájában. A bejuttatás előnyös módja, amikor az A10255 vegyületet egyszerűen belekeverjük az állatok eleségébe. A dózisok különféle megformálását az állat-gyógyszertechnológia ismert módszereivel végezhetjük.
A találmány további tárgya tápkészitmény szarvasmarhák tápanyaghasznosításának fokozására. A tápkészítmény szarvasmarha eleségből és az A10255 komplex vagy valamelyik A10255 faktor hatásos mennyiségéből áll. Előnyös az a tápkészítmény, mely a táplálék mellett az A10255 faktor hatásos mennyiségét tartalmazza. Szarvasmarhák számára a legelőnyösebb tápkészítmény a táplálék mellett hatékony mennyiségű A10255B faktor vagy A10255G faktort tartalmaz. Az egyes A10255B, C, E, F, G és H faktorok nagyjából bioekvivalensek egymással.
A fenti szarvasmarha tápkészítményben a „hatásos mennyiség azonos a szarvasmarhák tápanyaghasznosítását javító tápkészítmények előzőekben meghatározott menynyiségével. A tápkészítményben bármilyen, a szarvasmarhák etetésére szolgáló eleséget alkalmazhatunk.
A találmány további hasznosítási területe, hogy az A10255 komplexet és faktorait, különösen az A10255 faktort felhasználhatjuk tiosztrepton rezisztenciagént tartalmazó Streptomyces törzsek azonosítására. Ezek a fajok vagy természetes állapotuknál fogva tartalmazzák a tiosztrepton rezisztenciaként, vagy a tiosztrepton rezisztenciagént tartalmazó plazmiddal vagy más vektorral történő transzformálásuk révén jutnak hozzá. Ezek szerint a . tiosztrepton antibiotikum A10255B faktorral és az A102S5 komplexszel helyettesíthető, amikor a tiosztrepton rezisztenciagéneket akarjuk kimutatni Streptomyces törzsekkel végzett DNS rekombinációs kísérletekben.
Különösen S.fraide, S.lividans vagy S.griseofuscus protoplasztokat transzformálunk tiosztrepton rezisztenciagént hordozó plazmiddal (pl. pIJ702 vagy pHJL401 plazmiddal) [C.J. Thomson és munkatársai, Natúré 286: 525—527 (1980)]. A protoplasztokat a sejtfalregeneráláshoz alkalmas szilárd táptalajra visszük, és egy éjszakán át (kb. 16 órán át) inkubáljuk 29°C hőmérsékleten. Az A10255 antibiotikumot tartalmazó lágy g agart rétegezünk a regenerálódó protoplasztokat hordozó lemez felszínére. A rárétegezett agarnak annyi A10255 antibiotikumot kell tartalmaznia, hogy a regeneráló táptalajra való rárétegezés után kb. 50 pg 'antibioti10 kumot tartalmazzon milliliterenként. Ezután a lemezeket 7—14 napon át 29°C hőmérsékleten inkubáljuk, hogy a tiosztrepton rezisztenciagénnel rendelkező plazmidokat tartalmazó sejtek telepei kinőjenek. A plazmidot 15 nem tartalmazó sejtek ezek között a körülmények között nem nőnek. Az A10255 rezisztens transzformánsokat ezt követően milliliterenként 50 pg A10255 antibiotikumot tartalmazó táptalajra visszük át, mely bizto20 sítja a tiosztrepton rezisztenciagéneket hordozó plazmidok fennmaradását.
A találmány szerinti antimikrobiális vegyületek (azaz az A10255 komplex és az egyes faktorai) alkalmasak melegvérű állatok kór25 okozó baktériumokkal történt fertőzéseinek terápiás kezelésére vagy a fertőzések megelőzésére. Az antimikrobiális vegyületeket beadhatjuk szájon át, parenterálisan — például intravénásán, intramuszkulárisan vagy szubkután — vagy alkalmazhatjuk helyileg kenőcsként vagy oldatként.
A találmány további tárgya az A10255 komplexet vagy egyes faktorait tartalmazó gyógyszerkészítmény. Ezek a készítmények a szóbanforgó antibiotikumok — azaz az A10255 komplex vagy az egyes faktorai: B faktor, C faktor, E faktor, F faktor, G faktor vagy H faktor — gyógyászatilag hatásos
4q mennyiségéből és alkalmas hordozóanyagból állnak. Amennyiben a készítményt szájon át kívánjuk beadni, például tablettaként vagy kapszulában, az „alkalmas hordozóanyag a szokásos adalékanyagokat jelenti, nevezetesen kötőanyagokat, például szirupot, 45 arabmézgát, zselatint, szorbitolt, tragantmézgát, polivinilpirrolidint (Povidone), metil-cellulózt, etil-cellulózt, nátrium-karboxi-metil-cellulózt, hidroxi-propil-metil-cellulózt,
5q szacharózt és keményítőt; töltelékanyagokat és vivőanyagokat, például kukoricakeményítőt, zselatint, laktózt, szacharózt, mikrokristályos cellulózt, kaolint, mannitolt, dikálcium-foszfátot, nátrium-kloridot és alginsa55 vat; dezintegrátorokat, például kroszkarmellóz-nátriumot, mikrokristályos cellulózt, kukoricakeményítőt, nátrium-keményítő-glükonátot, alginsavat, nedvesítőszereket, mint amilyen a nátrium-lauril-szulfát; és sikosítóanyagokat, példuál magnézium-sztearátot és 60 más fémsztearátokat, sztearinsavat, szilikon folyadékot, talkumot, viaszokat, olajokat és kolloidális szilícium-dioxidokat. Ugyancsak használhatunk aromásítóanyagokat, például borsosmentát, hangyaolajat, cseresznye65 aromát, stb. Adhatunk a készítményhez színe25
-25HU 199559 b zőanyagokat, hogy ezzel tetszetősebbé tegyük, vagy hogy megkönnyítsük a termék azonosítását. A tablettákat ezen kivül ismert módon be is vonhatjuk.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmény szájon keresztül bevihető formája lehet folyékony is: a) vizes vagy olajos szuszpenzió, oldat, emulzió vagy szirup; vagy b) száraz por, amit használat előtt vízben vagy más alkalmas vivőanyagban kell elkeverni. Ezekben a készítményekben az „alkalmas vivőanyag a szokásos segédanyagokat jelenti, ilyenek a szuszpendálószerek, például szorbitol, szirup, metil-cellulóz, glükóz/cukorszirup, zselatin, hidroxi-etil-cellulóz, karboxi-metil-cellulóz vagy az alumínium-sztearát gél; a hidrogénezett étolaj, például mandulaolaj, frakcionált kókuszolaj, olajészterek; a propilén-glikol, etilalkohol; és a tartósítószerek, például metil- vagy propil-p-hidroxi-benzoát vagy szorbinsav.
A gyógyszerkészítményt használhatjuk intravénás (i.v.) bevitelhez is. Az antibiotikumokat vízoldékony formájukban oldjuk az intravénás készítmények szokásos oldószereinek valamelyikében, és infuzáljuk. Az oldószer ez esetben fiziológiás sóoldatot, Ringer oldatot vagy 5%-os dextróz oldatot jelent.
Az intramuszkuláris készítmények alkalmas steril antibiotikumból (például hidroklorid-sóból vagy nátriumsóból) és „alkalmas vivőanyagból állnak. Az ilyen steril készítmény például az alkalmas só állapotában levő antibiotikum, amit gyógyászati szempontból alkalmazható oldószerben (pl. Water-for-Injectionban, fiziológiás sóoldatban, 5%-os glükózban) oldunk vagy vizes, illetve gyógyászati szempontból alkalmazható olajos közegben (pl. hosszú szénláncú zsírsavak észterében, mint amilyen az etil-oleát) szuszpendálunk.
A helyileg alkalmazandó készítmények „alkalmas vivőanyagai hidrofóbok vagy hidrofilek lehetnek. A készítmény kenőcs, krém vagy borogatóvíz.
Az antibiotikumokat tartalmazó gyógyszerkészítményeket a táplálékukban vagy ivóvizükben adhatjuk be az állatoknak. Alkalmazhatjuk a vegyületeket megfelelő vivőanyaggal az emlőkbe ültetett preparátumként, lassan vagy gyorsan felszabaduló bázisok alakjában.
A találmány szerinti antibiotikumokat egységnyi adagokra szétosztva is megformálhatjuk steril csövekben, válaszfalakkal rekeszekre osztott steril műanyagtasakban vagy steril, légmentesen lezárt ampullákban. A száraz poralakban levő antibiotikum (vagy gyógyászati szempontból alkalmazható sója) lehet kristályos vagy liofilizált állapotban. Az egyes egységnyi dózisok antibiotikumtartalma 250 mg-tól 10 grammig változhat.
A találmány szerinti antibiotikumok „gyógyászatilag hatásos mennyisége testsúly26
I kilogrammonként 3,5—50 mg között lehet. Ez egy felnőtt embernél napi 1—27 gramm mennyiséget jelent.
Foglalkozik a találmány olyan módszerrel is, mellyel a melegvérű állatokat kezelhetjük Gram pozitív és Gram negatív kórokozókkal történt fertőzöttség esetén. A módszer abban áll, hogy az állatnak a szóbanforgó antibiotikumok gyógyászatilag hatásos menynyiségét adjak be. E módszer szerint egy felnőtt ember tipikus napi dózisa 1—12 g.
Az antibiotikumot alkalmazhatjuk napi egy dózisban vagy több adagban elosztva. A kezelés igényelhet kiterjedtebb időtartamot is, például néhány napot vagy 2—3 hetet. A beadott dózisok mennyisége vagy a beadott összmennyiség több tényezőtől függ, például a fertőzés természetétől és súlyosságától, a beteg korától és általános egészségi állapotától, a beteg reagálásától, illetve a fertőzést kiváltó mikroorganizmus vagy mikroorganizmusok antibiotikummal szembeni ellen állóképességétől.
A találmány további tárgya állati premix, mely az alkalmas hordozóanyag mellett hatóanyagként A10255 komplexet, vagy a B, C, E, F, G és H faktor bármilyen kombinációját vagy ezek gyógyászati szempontból alkalmazható sóit tartalmazza. Szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy milyen hordozóanyagok használhatók.
A találmány további tárgya eljárás az A10255 antibiotikumkomplex előállítására, mely abból áll, hogy a) Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces fardneri NRRL 18260, Streptomyces gardneri 15922 törzset vagy ezek A10255 antibiotikumot termelő mutánsát süllyesztett, aerob körülmények között tenyésztjük szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, amíg az A10255 komplex termelődik.
b) adott esetben az A10255 komplexet a fermentléből elválasztjuk; és
c) adott esetben egy vagy több faktort az AI0255 A, C, E, F, G és H faktorok keverékéből elválasztunk.
Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.
1. példa
Az A10255 termelő mikroorganizmushoz használt ferdeagar elkészítéséhez az alábbi összetételű táptalajt használjuk:
előfőzött zabliszt 60,0 g élesztő 2,5 g kálium-hidrogén-íoszfát 1,0 g kálium-klorid 0,5 g magnézium-szulfát-7 víz 0,5 g vas(II)-szulfát-7 víz 0,1 g ionmentes vízzel kiegészítve 1 literre.
A tápközeg kémhatását nátrium-hidroxid vizes oldatával pH=7,3 értékre állítjuk be. A táptalajt autoklávozzuk, a sterilizálás utár kémhatása pH=6,7.
-26HU 199559 Β
A S.gardneri NRRL 15537 törzs spóráival beoltjuk a fenti sterilizált táptalajjal készített ferdeagarokat. A beoltott ferdeagarokat 30°C hőmérsékleten inkubáljuk 7—10 napon keresztül. A kinőtt tenyészetet borjúszérummal fedjük, és a spórákat és a micéliumot steril eszközzel lekaparjuk. A szuszpenziót kis csövekbe osztjuk szét, és fagyasztva szárítjuk eltartásra. Ezzel a liofilizált peljettel oltunk be 250 milliliteres szélesszájú Erlenmeyer lombikban levő 50 ml alábbi összetételű táptalajt:
glükóz 15,0 g dextrin 20,0 g szójadara 10,0 g kukoricalekvár 10,0 g élesztőkivonat 1,0 g kálium-karbonát 2,0 g csapvízzel kiegészítve 1 literre.
A táptalaj kémhatását nátrium-hidroxid vizes oldatával beállítjuk pH=6,7 értékre. Autoklávban való sterilizálás után a kémhatás pH=6,8—7,0.
A beoltott vegetatív táptalajt 30°C hőmérsékleten rázatjuk 5 cm kitérésű rázógépen, percenként 250 fordulatszámmal 48 órán keresztül. A kapott vegetatív tenyészetet használjuk fel kis fermentorok (1% oltóanyagot adva) beoltásra, vagy nagyobb térfogatú oltóanyag előállításához a kétlépéses inokulum készítésnél.
A második lépés tenyészetének elkészítéséhez a következő összetételű táptalajt használjuk:
glükóz 15,0 g dextrin 20,0 g szójadara 15,0 g kukoricalekvár 10,0 g élesztőkivonat l*,0 g kalcium-karbonát 5,0 g csapvízzel kiegészítve 1 literre.
literes szélesszájú Erlenmeyer lombikban 400 ml táptalajt beoltunk a fenti tenyészettel. Az oltóanyag a lombikban levő táptalaj térfogatának 2,5%-a. A beoltott táptalajt 30°C hőmérsékleten inkubáljuk 24 órán keresztül, percenként 250-es fordulatszámmal rázatva egy 10°-os rázótálcájú körkörös rázógépen.
A fenti tenyészet 800 milliliterével oltjuk be az alábbi összetételű 100 literes táptalajt:
alkotórész mennyiség, g/liter
habzásgátló (Dow-Corning) 0,20 g
propilénglikol (MW 2000) 2,00 ml
glükóz 10,00 g
glicerin 40,00 g
Bacto-Pepton (Difco Lab.hus-
hidrolizátum) 10,00 g
kazein 10,00 g
nátrium-dihidrogén-foszfát-viz 0,1 g
melasz 40,00 g
kálcium-karbonát 25,00 g
csapvízzel kiegészítve 100 literre.
A 100 liter táptalajt egy 165 literes fermentorba töltjük. A táptalaj összetételét 5n nátrium-hidroxiddal pH=6,9 értékre állítjuk be. A keveréket 45 percen át steriiezzük 121°C hőmérsékleten 0,13—0,14 MPa nyomáson. A sterilezés ,után a táptalaj kémhatása pH= =7,0. A beoltott tenyészetet percenként a tenyészet térfogatának 0,125-öd részének megfelelő steril levegővel levegőztetjük, miközben szokásos keverőberendezéssel kevertetjük percenként 200 fordulatszám mellett. A fermentálást 6 napon keresztül végezzük. 30°C hőmérsékleten.
2. példa
3780 liter fermentlevet szűrési segédanyag (Hyflo Super-Cel, Johs-Manville Products Corp.) jelenlétében leszűrünk. A kipréselt, kiszűrt micéliumot 300 liter vizzel mossuk, majd a micéliumot aceton/víz, 4:1 arányú elegyével kétszer extraháljuk. Az első extraktum 900 liter, a második 800 liter térfogatú. Az extraktumokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk, amíg a térfogat 450 liter vizes oldat nem lesz. Az oldat kémhatását sósavval pH=3,0 értékre állítjuk be, majd etil-acetáttal háromszor extraháljuk — az extraktumok térfogatai: 165, 280, illetve 225 liter. Az extraktumok és a vizes fázis biológiai aktivitását papírkorongos módszerrel analizáljuk B. subtilis ATCC 6633 tesztorganizmussal beoltott agar lemezen. Az extraktumokat egyesítjük és térfogatát 23 literre tóményítjük csökkentett nyomáson. A betöményítés. alatt kiváló csapadékot kiszűrjük, csökkentett nyomáson szárítjuk, 216 g A10255 antibiotikum komplexet nyerve (90,7 g aktivitás). A szűrletet tovább töményítjük 900 ml térfogatra, majd az ekkor kivált csapadékot is kiszűrjük és szárítjuk, 16,2 g A10255 antibiotikumkomplexhez jutva (9,1 g aktivitás).
3. példa
Az egyes faktorok elválasztását az alábbiak szerint végezzük. 20 g A10255 komplexet kloroform/metanol 9:1 arányú elegyének 400 milliliterében oldunk és az oldatot szűrjük. A szűrletet egy 8x100 cm méretű rozsdamentes acélcsőben 4 liter 13—24 mikronos LPS-1 szilikagélből (Whatman Chemical Separation Inc., Clifton, New Yersey, USA) kialakított oszlopra visszük. A kromatografáláshoz egy Chromatospac Prep-100 készüléket használunk (Jobin Yvon, 16—18 Rue du Canal 91160, Longjumean, Franciaország). 240 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az eluens kezdetben kloroform/metanol, 9:1 arányú elegye (7 liter), majd kloroform/ /metanol, 3:1 arányú elegye (15 liter). Az átfolyási sebesség 60 ml/perc. A detektálást 280 nm-en végezzük. Valamennyi frakció biológiai aktivitását Micrococcus luteus ATCC 9341 tesztorganizmussal beoltott agarlemezen analizáljuk a papírkorongos módszerrel. A frakciókat az alábbiak szerint gyűjtjük össze:
-27HU 199559 Β frakció faktor termék (g)
11—23. C, F 0,68
30—63. Β, E 6,50
A B és E frakciókat tartalmazó eluenst 400 ml térfogatúra töményítjük. A keletkezett csapadékot szűréssel összegyűjtjük, csökkentett nyomáson szárítjuk, 5,86 g anyagot nyerve, ami főleg B faktorból és egy kevés E faktorból áll (3,6 g aktivitás). A csapadék anyalúgját tovább töményítjük, a betőményített oldathoz dietil-étert adva, 0,64 g csapadékot kapunk, ami a B és E faktorok hasonló keveréke (0,3 g aktivitás).
4. példa
Az A10255 B faktor elválasztásához a 3. példa 30—63. frakciójából nyert anyag 1,5 grammját 150 ml tetrahidrofurán/víz, 35:65 arányú elegyében oldjuk. 8x100 cm méretű rozsdamentes acélcsőben 4 liter LP1-C18 fordított fázisú szilikagélből oszlopot készítünk, és erre visszük a fenti oldatot. (A szilikagélt Abbot és munkatársai 1981. novem54 bér 10-én kibocsátott 4 299 763 számú USA szabadalmak 6. és 7. példájában leírtak szerint készítjük el). Az oszlopot 12 liter tetrahfdrofuran/víz/dinátrium-hidrogén-foszfát, 3:7:0, 0,5M (pH= 7,8, foszforsavval beállítva) eluenssel eluáljuk, 60 ml/perc átfolyási sebességnél 240 ml-es frakciókat gyűjtve. A detektálást 280 nm-en végezzük. Az egyes frakciókat analitikai HPLC-vel vizsgáljuk meg.
Az analitikai HPLC-hez 5 mikronos ultrasphere ODS fordított fázisú adszorbenssel (Altex Scientific Inc., Berkley, CA, USA) töltött, 4,6x250 mm méretű rozsdamentes acéloszlopokat használunk. Az eluálás tetrahidrofurán/víz/nátrium-hidrogén-foszfát, 1:2:0, 05M eleggyel történik (pH = 7,8, foszforsavval beállítva), 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett.
Detektálás 254 nm-nél.
Az alábbi frakciókat egyesítjük:
frakciók faktorok
17-23.
2h-35.
B (szennyezett) 150 ml
B (tiszta) 200 ml
38-2|5. E
A betöményített, egyesített 24—35. frakciót 300 ml ionmentes vízben oldjuk, az oldat kémhatását foszforsavval pH = 3,0 értékre állítjuk be. Az oldatot kloroform/metanol, 7:3 eleggyel extraháljuk. Az extraktumot szárazra pároljuk, és HPLC-vel elválasztjuk. A kromatografálást nagy elválasztóképességű, alacsony nyomású folyadékkromatografálással („HPLPLC) végezzük 100— 200 mikronos szilikagél hordozóval (Woelm Pharma) töltött üvegoszlopon (K. Michel és munkatársai, 1978. december 26-án kibocsátott 4 131 547 számú USA szabadalom). Az eluálást kloroform/metanol 7:3 arányú elegyével végezzük, az eluátumot 254 nm-nél detektálva. Az UV pozitív anyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, és fagyasztva szárítjuk, 659 mg B faktort nyerve. A termék fizikai állandóját a leíró részben ismertettük.
5. példa
Az A10255E faktor tisztításához a 4. példa LP1-C18 gyantán végzett kromatografálást ötször elvégezve, az egyes kromatografálások egyesített 38—45. frakcióit összeöntve, 800 ml eluenst kapunk, melynek kémhatását pH=3,0 értékre állítjuk be foszforsavval. Az oldatot 2x800, majd 400 ml kloroform/ /metanol, 7:3 arányú elegyével extraháljuk, az extraktumokat egyesítjük, szárazra párol1OO ol juk és a maradékot 50 ml kloroform/metanol, 7:3 elegyben oldjuk. Az oldatot 500 ml 100—200 mikronos szilikagélhordozóval (Woelm) töltött 5,1x42 cm méretű Michel35 -Miller HPLPLC üvegoszlopra visszük. Az eluálást kloroform/metanbl, 7:3 (térfogat) eleggyel végezzük. A 254 nm-nél elnyelést mutató frakciókat összegyűjtjük, szárazra pároljuk, 349 mg tiszta E faktorhoz jutva.
A termék fizikai állandóit a leíró részben ismertettük.
6. példa
Az A10255 C és E faktor tisztításához a 3. példa szerinti 11—23. frakciókból elő45 állított 3,03 g szilárd anyagot tetrahidrofurán/víz, 6:4 elegyében oldjuk, és az oldatot 4 liter fordított fázisú szilikagélen, 8x100 cm méretű rozsdamentes acéloszlopban kromatografáljuk, eluensként 39 liter tetrahid50 rofurán/víz elegyet használva. Átfolyási sebesség 60 ml/perc, detektálás 280 nm-en. A 480 milliliteres frakciók biológiai aktivitását Micrococcus luteus ATCC 9341 tesztorganizmussal beoltott agarlemezen vizs55 gáljuk a papírkorongos módszerrel. A biológiailag aktív frakciókat tovább analizáljuk analitikai HPLC-vel, a 4. példában leírtak szerint. A frakciókat az alábbiak szerint öntjük össze:
-28HU 199559 Β frakció faktor termék (mg)
28-37. ismeretied 186
40-50. C (szennyezett) 373
51-55. C (.tiszta) 302
56-62. C (szennyezett) 70
66-75. F (tiszta) 56
Valamennyi egyesített frakciót betöményítjük, a csapadékot kiszűrjük és csökkentett nyomáson szárítjuk. A C és F faktor fizikai állandóit a leíró részben ismertettük.
7. példa
Az 1. példában ismertetett összetételű ferdeagart A10255 antibiotikumot termelő NRRL 18260 törzzsel oltjuk be.
Az ismertetett módon nyert, fagyasztva szárított pellettel 250 ml-es széles szájú Erlenmeyer lombikban beoltunk 50 ml alábbi összetételű táptalajt:
Trypticase szója 30,0 g enzim-hidrolizált kazein (Universal Foods, Junean, WI,
USA) 5,0 g glükóz 5,0 g glicerin 10,0 g dextrin 10,0 g kálcium-karbonát 10,0 g csapvízzel kiegészítve 1 literre.
A táptalaj kémhatását a sterilezés előtt nátrium-hidroxid vizes oldatával pH=7,0 értékre állítjuk be.
A beoltott vegetatív táptalajt 72 órán keresztül inkubáljuk 30°C hőmérsékleten 5 cm kitérésű körkörös rázógépen 250 percenkénti fordulatszámmal.
A kapott vegetatív tenyészetet használjuk kis fermentorok beoltására (1% oltóanyaggal), vagy nagyobb térfogatú oltóanyag előállítására a kétlépcsős inokulumkészítésnél.
Két széles szájú, kétliteres Erlenmeyer lombikba 400—400 fenti összetételű vegetatív táptalajt töltünk.
Mindegyik edényt beoltjuk a fentiek szerint kapott vegetatív tenyészettel. Oltáshoz a táptalaj 2,5 térfogatszázalékának megfelelő oltóanyagot .használunk. A beoltott táptalajt 48 órán keresztül inkubáljuk 30°C hőmérsékleten egy, a vízszinteshez 10°-os szögben álló rázótálcán, 250 percenkénti fordulatszámnál.
A fenti '.enyészet 800 milliliterével beoltunk 100 liter alábbi összetételű táptalajt: alkotórész mennyiség (g/1)
Ság 471 0,2
P-2000 0,1 ml glükóz 1.0
ammónium-klorid 1.0
nátrium-szulfát 2,0
cink-klorid 0,019
magnézium-klorid-6 víz 0,304
vas (III)-klorid 0,062
mangán (11)-klorid-4 víz 0,035
kálcium-klorid 0,06
réz-klorid-2 víz 0,005
kálium-dihidrogén-foszfát1 csapvízzel a térfogatot 0,67
feltöltve 110 literre.
* A kálium-dihidrogén-foszfát ionmentes vízben készült oldatát külön sterilezzük, miután kémhatását kálium-hidroxiddal pH=6,0 értékre állítottuk be.
A táptalajt 165 literes fermentorba töltjük, gőzzel sterilezzük 121°C hőmérsékleten.
Sterilezés-után a táptalaj kémhatása pH=8,3. A kálium-dihidrogén-foszfát oldat hozzáadása után a kémhatás pH=7,0-re változik. A beoltott táptalajt steril levegővel levegőztetjük, miközben szokásos keverőberendezéssel kevertetjük. A levegőáramlást úgy állítjuk be, hogy az oltott oxigén szintje a 3,5· 104 Pa nyomásnál kialakuló levegőtelítettségi szint 45%-át érje el. A fermentálást 7 napon át végezzük 30°C hőmérsékleten.
A fenti nagyméretű fermentálásnál úgy 40 találtuk, hogy hatásos, ha naponként és literenként 5,7 g glükózt adunk a fermentléhez. A 17. óra után kazeint is adagoltunk a tenyészethez, naponként és literenként 4,5 g-ot.
8. példa
Az 10255G faktor elválasztásához 1,0 g,
2. példa szerint kapott antibiotikum komplexet feloldunk 2 liter víz/acetonitril, 4:1 arányú elegyében pH=6,0 kémhatásnál. Az ol55 datot egy Waters Prep 500 készülék C18 készoszlopára (cartridge) visszük. Az oszlopot enyhe emelkedésű gradienselúcióval eluáljuk, amit 4 liter viz/acetonitril/tetrahidrofurán/ecetsav, 70:30:5:0,5 A^ oldatnak 4 lim tér víz/acetonitril/tetrahidrofurán/ecetsav, 00 65:35:5:0,5 B oldathoz való adagolásával állítunk elő. Átfolyási sebesség 250 ml/perc, percenként gyűjtünk egy frakciót. Ezt követően 2 liter £ oldattal eluálunk. Az eluátumot 280 nm-en detektáljuk. Hét kromatograíáθ5 lást futtatunk le azonos módon. A C és G fak29
-29HU 199559 Β torokat tartalmazó összeöntött frakciókat egyesítjük, az oldatok kémhatását 5n nátrium-hidroxiddal pH=6,0 értékre állítjuk be, azonos térfogatú vízzel hígítjuk (össztérfogat: 26 liter), és két különálló futtatásban kromatografáljuk, 13 litert alkalmazva egy kromatografálásnál. Ezeket a kromatografálásokat ugyancsak a Waters Prep 500 C18 készoszlopán végezzük. A lineáris grádiens létrehozásához 4 liter 0.,05n ammónium-acetát (pH=5,5)/acetonitril, 75:25 összetételű _A oldatot adagolunk 4 liter 0,05n ammónium-acetát oldat (pH=5,5)/acetonitril, 60:40 öszszetételű B. oldathoz, majd a kromatografálást 2 liter B oldattal folytatjuk. Átfolyási sebesség 250 ml/perc; percenként egy frakciót gyűjtünk. A főként G faktort tartalmazó frakcókat egyesítjük, azonos térfogatú víz-, zel hígítjuk, és újra kromatografáljuk C18 készoszlopon Prep 500 készülékkel. Ekkor a lineáris grádiens kialakításához 4 liter víz/ /acetonitril/tetrahidrofurán/ecetsav, 70:30: :5:0,5 összetételű A_ oldatot adagolunk 4 liter 65:35:5:0,5 összetételű B. oldathoz. Átfolyási sebesség percenként 250 ml. A csak G faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson vizes oldatig bepároljuk. A kicsapódó G faktort centrifugálással elválasztjuk, vízzel mossuk, vízben szuszpendáljuk, és fagyasztva szárítjuk, 686 mg G faktort nyerve. A termék fizikai állandóit a leíró részben ismertettük.
9. példa
Az A10255H faktor elválasztásához a 2. példa alapján nyert antibiotikum komplex 1,0 grammját feloldjuk 2 liter víz/acetonitril, 4:1 elegyében, pH=5,0 kémhatásnál, majd szűrőtölcsérben üveggyapott rétegen átszűrjük. A szűrletet egy Waters Prep 500 készülék C18 készoszlopára visszük. Az oszlopot lineáris grádiens elúcióval eluáljuk, 4 liter víz/acetonitril/tetrahidrofurán/ecetsav, 70:30:5:0,5 összetételű A. oldatot adagolva 4 liter viz/acetonitril/tetrahidrofurán/ecetsav, 70:30:5:0,5 összetételű B oldathoz. Az átfolyási sebesség percenként 250 ml. Percenként gyűjtünk egy frakciót. A grádienst követően az oszlopot még további 2 liter B. oldattal eluáljuk.
Az eluátumot 280 nm-en detektáljuk. Tizenhárom azonos kromatografálás H faktort tartalmazó frakcióit egyesítjük, a kapott 17 liter oldatot bepároljuk, a maradékot csökkentett nyomáson szárítjuk, 690 mg nyers H faktort nyerve. Ezt az anyagot egyesítjük 329 mg azonos preparátummal,. és feloldjuk 3 liter víz/acetonitril/tetrahidrofurán, 70:20:5 elegyben, pH=6,0 kémhatásnál. Az oldatot a fent említett C18 készoszlopra viszszük. A kromatografáláshoz használt lineáris grádienst 4 liter 0,05M ammónium-hidroxid/acetonitril, 75:25 összetételű A_ elegynek 4 liter víz/acetonitril/tetrahidrofurán/ /ecetsav, 60:40:5:0,5 összetételű B. elegyhez való adagolásával kialakítva. Percenként 30
250 milliliteres frakciókat gyűjtünk. A H faktort tartalmazó 23—29. frakciókat egyesítve, a térfogatot csökkentett nyomáson 450 ml-re pároljuk be. A kicsapódó H faktort szűréssel összegyűjtjük, vízzel mossuk és csökkentett nyomáson szárítjuk, 285 mg H faktort nyerve. A termék fizikai állandóit a leíró részben ismertettük.
10. példa
A szarvasmarhák növekedését serkentő tápkészítmény összeállításához az A10255 komplexnek vagy egyes faktorainak hatékony mennyiségét hozzákeverjük az állatok eleségéhez. Egy szokásos takarmánykeverék összetétele például a következő:
kukoricasiló (teljes növény, teljes csövekkel) 50% nagy nedvességtartalmú kukorica 44% adalékanyag 6% ahol az adalékanyag a következő alkotórészekből áll:
lucernaliszt (dehidrált,
17%-os) 12,00% szójaliszt (oldószerrel extrahált) 43,40% karbamid, tápminőségű 5,00% dikálcium-foszfát 8,00% só 10,00% kálcium-karbonát 11,00% nyomelem premix 0,80%
A + D3 vitamin premix 1,40%
E vitamin premix 1,40% kálium-klorid 5,00%.
Etetés előtt a takarmányt A10255 komplexet tartalmazó premixxel keverjük össze. A premix az alábbi összetételű:
sárga kukorica 48,00% grit-0-cobs 20/40 50,00% ásványi olaj 2,00%.
A premixhez először hozzáadjuk az adagolás sebessége által meghatározott A10255 komplex mennyiségét, például naponként és fejenként 275 vagy 550 mg-ot (mely ebben a példában tonnánként '28,6 és 61,7 grammot jelent). Az A10255 komplexet tartalmazó premixet hozzáadjuk a fenti eleséghez és összekeverjük. Naponként és fejenként 0,16 g premixet adunk az állatoknak.
11. példa
Az A10255 antibiotikumot termelő mikroorganizmust. az alábbi összetételű táptalajt tartalmazó ferdeagaron növesztjük ki:
előfőzöt zabliszt 60 g élesztő 2,5 g dikálium-hidrogén-foszfát l,0g kálium-klorid 0,5 g magnézium-szulfát-7 víz 0,5 g vas(H)-szulfát-7 víz 0,1 g ionmentes vízzel kiegészítve 1 literre.
A táptalaj kémhatását pH= 7,3 értékre állítjuk be nátrium-hidroxid vizes oldatával. A táptalajt autoklávban sterilizáljuk, mely alatt a kémhatása pH= 6,7 értékre változik.
A fenti táptalajt tartalmazó ferdeagart S.gardneri NRRL 15922 törzs spóráival olt-30HU 199559 Β juk be. A beoltott táptalajt 7—10 rtapon keresztül 30°C hőmérsékleten inkubáljuk. A kinőtt tenyészetre borjúszérumot adunk, és steril eszközzel lekaparjuk a spórát és a micé· liumot. A nyert szuszpenziót kis csövekbe visszük át, és fagyasztva szárítjuk.eltartásra.
A liofilizált pelletet oltjuk be a széles szájú, 250 milliliteres Erlenmeyer lombikban levő 50 ml alábbi összetételű táptalajt.
glükóz 15,0 g dextrin 20,0 g szójadara 10’Og kukoricalekvár 10,0 g élesztőkivonat 1,0 g kálcium-karbonát 2,0 g csapvízzel kiegészítjük 1 literre.
A táptalaj kémhatását nátrium-hidroxid vizes oldatával pH=6’7 értékre állítjuk be. A táptalajt autoklávban sterilizáljuk, ami alatt a kémhatása pH=6,8—7,0 értékre változik.
A beoltott vegetatív táptalajt 48 órán keresztül 30°C hőmérsékleten inkubáljuk 5 cm kitérésű, körkörös rázógépen percenként 250 fordulatszám mellett. A kapott vegetatív tenyészettel vagy kisebb fermentorokatoltunk be (1% inokulumot használva), vagy nagyobb térfogatú inokulum elkészítéséhez használjuk a második lépcső beoltásához.
literes, széles szájú Erlenmeyer lombikokba 400—400 ml alábbi összetételű táptalajt adunk:
glükóz 15,0 g dextrin 20,0 g szójadara 15,0g kukoricakeményítő 10,0 g élesztőkivonat 1,0 g kálcium-karbonát 5,0 g csapvízzel kiegészítjük 1 literre.
Az Erlenmeyer lombikokat 2,5% fenti vegetatív oltóanyaggal oltjuk be. A beoltott táptalajt 30°C hőmérsékleten inkubáljuk 23 órán keresztül percenként 250 fordulatszámú körkörös rázógépen.
800 ml fenti tenyészettel oltunk be 115 liter alábbi összetételű táptalajt:
alkotórész mennyiség (g/1)
habzásgátló (Ság 471, Silicone
antifoaming agent, Dow Corning Co.) 0,200
propilénglikol (MS 2000) 2,000 ml
glükóz 1,000
kazein 16,000
nátrium-dihidrogén-fosz- fát-víz 0,100
melasz 40,000
kálcium-karbonát 5,000
csapvízzel kiegészítjük 110 literre.
A táptalajt 165 literes fermentorba öntjük. A táptalaj kémhatását 5n nátrium-hidroxiddal pH=6,9 értékre állítjuk be. A táptalajt 45 percen át sterilezzük 0,13—0,14 MPa nyo60 máson 121°C hőmérsékleten. A sterilizálás után a táptalaj kémhatása pH=6,8. A beoltott tenyészetet steril levegővel levegőztetjük, induláskor percenként a tenyészet térfogatának felével azonos térfogatú levegőt vezetve át rajta. A kevertetés szokásos keverőberendezéssel végezzük percenként 300-as fordulatszámnál. A fermentálást 7 napon keresztül végezzük 30°C hőmérsékleten. Az oldott oxigén koncentrációját a levegőtelítettségi érték 45%-án tartjuk. Naponként és literenként 3,5-4,0 g glükózt adunk a tenyészethez. 24 óra elteltével naponként és literenként 3 g savhidrolizált kazeint (Hy Case Amino, Humko Sheffield Chemical Co., Lyndhurst, NJ, USA) is adunk a fermentorhoz.
A nyers A10255 komplexet a 13. példában leírtak szerint nyerjük ki (lásd aláb).
12. példa
Az A10255.2 törzset nagy térfogatban az alábbiak szerint fermentáljuk.
Kétlépéses eljárással elkészítjük oltóanyagként az A 10255.2 törzs vegetatív tenyészetét. Mindkét lépésnél az alábbi összetételű táptalajt használjuk:
glükóz 1,5% szójadara 1,5% burgonyadextrin 2,0% kukoricalekvár 1,0% élesztőkivonat 0,1% kálcium-karbonát 0,2% csapvíz kellő térfogatra.
Az első lépésnél 80 ml táptalajt teszünk 250 milliliteres lombikba és sterilezés után fagyasztva szárított A10255.2 tenyészettel beoltjuk. A beoltott táptalajt 30°C hőmérsékleten inkubáljuk 48 órán keresztül körkörös rázógépen, percenként 250 fordulatszámnál.
ml fenti tenyészettel oltunk be 400 ml steril táptalajt egy kettőliteres, széles szájú Erlenmeyer lombikban. Ezt a tenyészetet 30°C hőmérsékleten inkubáljuk 24 órán keresztül körkörös rázógépen, percenként 250 fordulatszám mellett. Ezt a tenyészetet használjuk fel az alábbi táptalaj beoltására egy 150 literes fermentorban:
cerelose 1,5% burgonyadextrin 2,0% kukoricalekvár 1,0% szójadara 1,5% kálcium-karbonát 0,5%
SÁG 471 habzásgátló (Dow
Corning Co.) 0,01% csapvízzel kiegészítve 120 literre.
A táptalajt autoklávozással sterilizáljuk. Sterilizálás után a kémhatását 5n nátrium-hidroxiddal pH= 6,5 értékre állítjuk be. A beoltott táptalajt 30°C hőmérsékleten inkubáljuk 24 órán keresztül. Fermentálás alatt steril levegővel levegőztetjük a tenyészetet, percenként 0,028 m3 levegőt átvezetve. A tenyészetet szokásos keverőberendezéssel kevertetjük percenként 350 fordulatszám mellett.
A fenti tenyészet 40 literével oltjuk be az alábbi, nagyméretű fermentációs táptalajt:
-31HU 199559 Β
SÁG 471 habzásgátló (szilikon habzásgátló) 0,02% propilénglikol (MS 2000) 0,02% melasz 4,00% kálcium-karbonát 0,50% kazein savhidrolizátum (Hy Case,
Humko Sheffield Chemical Co.,
Lyndhurst, NJ., USA) 1,60% nátrium-dihidrogén-foszfát-víz 0,01 % glükóz 0,1% csapvízzel feltöltve 5450 literrel (1200 gallon).
A fenti táptalaj egy 7270 literes (1600 gallon) fermentorban van. A táptalaj kémhatását 5n nátrium-hidroxiddal pH=7,0 értékre állítjuk be, majd 30 percen át sterilezzük 12l°C hőmérsékleten és 0,13 MPa nyomáson. A sterllezett, beoltott táptalajt steril levegővel levegőztetjük kezdetben percenként 0,56 m3 (20 köbláb) levegőt áthajtva. A kevertetést szokásos keverőberendezéssel végezzük kezdetben percenként 100 fordulatszám mellett. A fermentációt 6 napon át végezzük 30°C hőmérsékleten. A fermentáció alatt a tenyészet kémhatását pH=7,0 értéken tartjuk. A táptalaj oldott oxigén koncentrációját a levegőtelítettség 45%-át kitevő értéken tartjuk. Naponként és literenként 4 g glükózt adunk a táptalajhoz. 24 óra elteltével naponként és literenként 3 g Hy Case savhidrolizált kazeint is adunk a tenyészethez.
13. példa
Az A10255 komplex kinyeréséhez 5000 liter Al0255.2 törzs fermentlevet szörőadalékanyag mellett (Hyflo Super-Cel, Johns Manville Products Corp.) leszűrünk. A szűrletet és a biomassza 1200 liter mosóvizét elöntjük.
A biomasszát egy adagban extraháljuk 2000 liter víz/aceton, 1:4 összetételű elegyével. Az extrahálást megismételjük, és az extraktumokat egyesítjük (4000 liter össztérfogat). Az egyesített extraktum tartalmazza a termelt A10255 komplex nagy részét.
Az egyesített extraktumot csökkentett nyomáson vizes oldatig pároljuk. Állás közben finom szilárd anyag válik ki a szuszpenzióból. Ez a nyers A10255 komplex. A betöményített extraktumot centrifugáljuk, a felüluszót eldobjuk.
A centrifugálással kapott szilárd anyagot csökkentett nyomáson szárítjuk, 1,5 kg barna port nyerve, melynek A10255 antibiotikum aktivitása 423 gg/mg.
A komplexet a 3—9. példákban leírtak szerint választjuk szét az egyes komponenseket. A kapott faktorok fizikai állandói megegyeznek a leírásban megadottakkal.

Claims (11)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás az A10255 komplex és a B, C, E, F, G és H faktorának bármilyen kombinációban való előállítására,azzal jellemezve, hogy a Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces gardneri NRRL 18260, Streptomyces gardneri NRRL 15922 törzset vagy ezek bármelyikének A10255 antibiotikumot 5 termelő mutánsát asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, aerob fermentációs körülmények között tenyésztjük, majd kívánt esetben az A10255 komplexet a
    10 fermentléből elválasztjuk, és kívánt esetben egy vagy több faktort az
    A10255 B, C, E, F, G és H faktorok közül elkülönítünk az A10255 komplexből.
    (Elsőbbsége: 1987.12.14.)
    15
  2. 2. Eljárás az A10255 komplex és a B, C,
    E, és F faktorának bármilyen kombinációban való előállítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces gardneri NRRL 15922 törzset vagy
    20 ezek bármelyikének A10255 antibiotikumot termelő mutánsát asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, aerob fermentációs körülmények között tenyésztjük, majd
    25 adott esetben az A10255 komplexet a fermentléből elválasztjuk; és adott esetben egy vagy több faktort az A10255 B, C, E és F faktorok közül elkülönítünk az A10255 komplexből.
    30 (Elsőbbsége: 1986.12.15.)
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Streptomyces gardner NRRL 15537 törzset vagy annak A10255 antibiotikumot termelő mutánsát tenyésztjük.
    35 (Elsőbbsége: 1986.12.15.)
  4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Streptomyces gardneri NRRL 15922 törzset vagy annak A10255 antibiotikumot termelő mutánsát tenyésztjük.
    40 (Elsőbbsége: 1986.12.15.)
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Streptomyces gardneri NRRL 18260 törzset vagy annak A10255 antibiotikumot termelő mutánsát tenyésztjük.
    45 (Elsőbbsége: 1987.12.14.)
  6. 6. A 2—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az A10255B faktor előállítására, azzal jellemezve, hogy a keletkezett A10255 komplexből a B faktort választjuk 50 (Elsőbbsége: 1986.12.15.)
  7. 7. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, az A10255G faktor előállítására, azzal jellemezve, hogy a keletkezett A10255
    55 komplexből a G faktort választjuk el.
    (Elsőbbsége: 1987.12.14.)
  8. 8. Eljárás tápanyaghasznosítást növelő tápkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az állati eleséget az 1—7. igénypontok θθ bármelyike szerint előállított A10255 komplexet vagy A10255 B, C, E, F, G vagy H faktort vagy ezek bármilyen kombinációját keverünk.
    (Elsőbbsége: 1987.12.15.)
  9. 9. Eljárás állatok tápanyaghasznosítását θθ fokozó készítmény előállítására, azzal jelle-32HU 199559 Β mezve, hogy állatok számára elfogadható hordozóanyagot és az 1—7. igénypontok bármelyike szerint előállított A10255 komplexet, vagy az A10255B faktor, az A10255C .faktor, az A10255E faktor, az AT0255F faktor, az A10255G faktor vagy az A10255H faktor bármelyikét vagy ezek bármilyen kombinációjú keverékét keverjük össze.
    (Elsőbbsége: 1987.12.14.)
  10. 10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az állati eleséget és a 2. igénypont szerint előállított komplexet vagy
    A10255 B, C, E vagy F faktort vagy ezek bármilyen kombinócióját keverjük össze.
    (Elsőbbsége: 1987.12.14.)
  11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal
    5 jellemezve, hogy állatok számára elfogadható hordozóanyag és az 1—7. igénypontok bármelyike szerint előállított A10255 komplexet, vagy az A10255B faktor, az A10255C faktor, az A10255E faktor vagy az A10255F faktor
    10 bármelyikét vagy ezek bármilyen kombinációjú keverékét keverjük össze.
HU875637A 1986-12-15 1987-12-14 Process for producing antibioticum a 10255 complex and factors and pharmaceutical compositions containing them HU199559B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94189486A 1986-12-15 1986-12-15
US94147386A 1986-12-15 1986-12-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT49376A HUT49376A (en) 1989-09-28
HU199559B true HU199559B (en) 1990-02-28

Family

ID=27130157

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU875637A HU199559B (en) 1986-12-15 1987-12-14 Process for producing antibioticum a 10255 complex and factors and pharmaceutical compositions containing them

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0274873B1 (hu)
JP (1) JPS63258585A (hu)
KR (1) KR880007553A (hu)
CN (1) CN1023758C (hu)
AU (1) AU604806B2 (hu)
DE (1) DE3781878T2 (hu)
DK (1) DK654987A (hu)
ES (1) ES2052584T3 (hu)
GR (1) GR3006408T3 (hu)
HU (1) HU199559B (hu)
IE (1) IE60394B1 (hu)
IL (1) IL84819A (hu)
MX (1) MX170925B (hu)
NZ (1) NZ222895A (hu)
PT (1) PT86364B (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229362A (en) * 1986-12-15 1993-07-20 Eli Lilly And Company Antibiotic A10255 complex and factors, and process and production therefor
ZA879415B (en) * 1986-12-15 1989-08-30 Lilly Co Eli Antibiotic a10255 complex and factors,microorganisms,process and production therefor
DE3851268T2 (de) * 1987-06-19 1995-01-26 Sandoz Ag Zyklische Peptolide.
IT1234197B (it) * 1988-06-14 1992-05-06 Mini Ricerca Scient Tecnolog Antibiotici ottenuti mediante coltivazione aerobica controllata dello streptomyces s.p. ncib 12629
US7056906B2 (en) 2001-09-21 2006-06-06 Schering Corporation Combinations of hormone replacement therapy composition(s) and sterol absorption inhibitor(s) and treatments for vascular conditions in post-menopausal women
MXPA05008717A (es) 2003-02-18 2005-09-20 Incro Ltd Boquilla surtidora.
DE602004018617D1 (de) 2003-03-07 2009-02-05 Schering Corp Substituierte azetidinon-derivate, deren pharmazeutische formulierungen und deren verwendung zur behandlung von hypercholesterolemia
JP5137228B2 (ja) 2003-03-07 2013-02-06 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション 高コレステロール血症の処置のための置換アゼチジノン化合物、置換アゼチジノン処方物およびそれらの使用
JP2013503624A (ja) * 2009-09-02 2013-02-04 ピラマル・ライフ・サイエンシーズ・リミテッド 抗生物質化合物
CN101878782B (zh) * 2010-07-26 2012-05-02 黑龙江省农垦科学院植物保护研究所 防治玉米丝黑穗病的sf-1水溶性生物种衣剂

Also Published As

Publication number Publication date
IL84819A (en) 1993-07-08
EP0274873B1 (en) 1992-09-23
EP0274873A3 (en) 1989-08-09
MX170925B (es) 1993-09-22
CN87108341A (zh) 1988-08-10
CN1023758C (zh) 1994-02-16
EP0274873A2 (en) 1988-07-20
PT86364B (pt) 1990-11-07
IE873390L (en) 1988-06-15
NZ222895A (en) 1992-08-26
DK654987D0 (da) 1987-12-14
DE3781878D1 (de) 1992-10-29
ES2052584T3 (es) 1994-07-16
DE3781878T2 (de) 1993-03-11
AU8249387A (en) 1988-07-28
HUT49376A (en) 1989-09-28
IE60394B1 (en) 1994-07-13
AU604806B2 (en) 1991-01-03
JPS63258585A (ja) 1988-10-26
PT86364A (en) 1988-01-01
DK654987A (da) 1988-09-23
GR3006408T3 (hu) 1993-06-21
KR880007553A (ko) 1988-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0055069B1 (en) Derivatives of actaplanin
US5229362A (en) Antibiotic A10255 complex and factors, and process and production therefor
US4994270A (en) A54145 antibiotics and process for their production
US5286631A (en) Process for producing the A10255 complex and corresponding microorganism
HU199559B (en) Process for producing antibioticum a 10255 complex and factors and pharmaceutical compositions containing them
US4548974A (en) Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum shearer
US5013550A (en) Antibiotics called &#34;chloropolysporins B and C&#34;, a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use
EP0218416B1 (en) Kibdelosporangium aridum sk&amp;f-aad-609
US4870021A (en) Pure culture of antibiotic A42125-producing strains of Nocardia aerocolonigenes
KR950001704B1 (ko) 항생제 10381b의 제조방법
US4517178A (en) Novel antibiotic 76-11, process for the production thereof, anticoccidiosis agent and domestic animals growth accelerator comprising the same as an effective ingredient
US4557933A (en) Antibiotic called &#34;chloropolysporin&#34;, a process for its preparation, and its therapeutic and veterinary use
HU204893B (en) Process for producing polyether antibiotics and pharmaceutical compositions comprising same
US5073369A (en) Efomycins as performance promoters in animals
US4461723A (en) Antibiotic A-4696 factor G
US4672036A (en) Pure cultures of Kibdelsporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 and mutants thereof
EP0055071A1 (en) Antibiotic A-4696 factor G
US4637981A (en) Antibiotic A-4696 factor G
US4996148A (en) A80407 antibiotics
US5213797A (en) A80407 antibiotics
KR900005858B1 (ko) 신규의 항생물질 6270의 제조법
US4797280A (en) Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323
JPS6358542B2 (hu)
EP0385594A2 (en) Acidic polycyclic ether antibiotic

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee