DE3781878T2 - Antibiotikum-a10255-komplex und faktoren, verfahren, mikroorganismen fuer seine herstellung. - Google Patents

Antibiotikum-a10255-komplex und faktoren, verfahren, mikroorganismen fuer seine herstellung.

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DE3781878T2 DE8787310953T DE3781878T DE3781878T2 DE 3781878 T2 DE3781878 T2 DE 3781878T2 DE 8787310953 T DE8787310953 T DE 8787310953T DE 3781878 T DE3781878 T DE 3781878T DE 3781878 T2 DE3781878 T2 DE 3781878T2
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Description

  • Die Erfindung betrifft neu entdeckte antibiotische Substanzen, die willkürlich hier als Antibiotikum A10255 bezeichnet werden. Das Antibiotikum A10255 setzt sich aus einer Mischung von sechs einzelnen Verbindungen oder Faktoren zusammen (Faktoren B, C, E, F, G und H). Die Mischung der Faktoren wird zusammen produziert, indem die neuen Stämme Streptomyces gardneri NRRL 15537, NRRL 18260, NRRL 15922 oder eine A10255 produzierende Mutante davon unter aeroben Submersfermentationsbedingungen gezüchtet werden, bis ein wesentlicher Gehalt des Antibiotikums A10255 erzeugt wird. Die gleichzeitig produzierten Faktoren B, C, E, F, G und H werden aus der Fermentationsbrühe (in kleineren Mengen) und aus den Myzelien (in größeren Mengen) mit Lösungsmitteln extrahiert. Die koproduzierten Faktoren werden als Mischung abgetrennt, indem die Extrakte eingeengt werden und das Konzentrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert wird, der Extrakt eingeengt wird, gesammelt wird und der entstehende, den Komplex enthaltende Niederschlag getrocknet wird. Es sollte angemerkt werden, daß der Ausdruck "antibiotischer Komplex" und "A10255-Komplex", wie er auf dem Gebiet der Fermentation und in dieser Beschreibung verwendet wird, sich nicht auf einen kovalent gebundenen chemischen Komplex bezieht, sondern auf eine Mischung zusammen produzierter einzelner Antibiotika- Faktoren. Wie von denjenigen, die mit dem Gebiet der antibiotischen Fermentation vertraut sind, erkannt wird, kann das Verhältnis der einzelnen Faktoren, die in einem antibiotischen Komplex erzeugt werden, variieren abhängig von den verwendeten Fermentationsbedingungen. Der A10255-Komplex wird weiter gereinigt und in die einzelnen Faktoren B, C, E, F, G und H mit einer Reihe chromatographischer Verfahren aufgetrennt.
  • Der antibiotische A10255-Komplex und die einzelnen Faktoren B, C, E, F, G und H hemmen das Wachstum von Mikroorganismen, die für Menschen und Tiere pathogen sind. Der A10255-Komplex und die einzelnen Faktoren erhöhen auch die Futterverwertungseffizienz bei Hühnern und Vieh und fördern das Wachstum und erhöhen die Futterverwertungseffizienz von entwöhnenden Schweinen.
  • Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung schliefen biologisch reine Kulturen der Mikroorganismen Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces gardneri NRRL 18260 und Streptomyces gardneri NRRL 15922 oder einer A10255-produzierenden Mutante davon und Verfahren zur Herstellung A10255-Komplexes ein. Die Erfindung liefert auch Futterzusammensetzungen, die den A10255-Komplex oder einzelne A10255-Faktoren enthalten zusammen mit dem geeigneten Futter für Hühner, entwöhnende Schweine und Vieh. Die Erfindung umfaßt auch verschiedene pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen geeigneten Träger und eine therapeutisch wirksame Menge des A10255-Komplexes, von A10255-Faktor B, A10255-Faktor C, A10255-Faktor E, A10255-Faktor F, A10255-Faktor G oder A10255-Faktor H umfassen. Der erfindungsgemäße A10255-Komplex kann verwendet werden, um Streptomyceszellen zu selektieren, die das Thiostreptonresistenzgen aufweisen, als weiterer Aspekt der Erfindung.
  • Beschreibung der Zeichnungen Die Infrarotabsorptionsspektren der einzelnen A10255-Faktoren B, C, E, F, G und H, die in KBr-Scheiben aufgenommen wurden, sind in den Zeichnungen dargestellt wie folgt:
  • Fig. 1 - A10255-Faktor B
  • Fig. 2 - A10255-Faktor C
  • Fig. 3 - A10255-Faktor E
  • Fig. 4 - A10255-Faktor F
  • Fig. 5 - A10255-Faktor G
  • Fig. 6 - A10255-Faktor H
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Der A10255-Komplex, der sich hauptsächlich aus den Faktoren B, C, E, F, G und H zusammensetzt, wird erzeugt, indem in einem wäßrigen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenhydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, die bisher nicht beschriebenen Stämme Streptomyces gardneri, Stamm NRRL 15537 oder NRRL 18260, oder eine A10255-produzierende Mutante davon gezüchtet werden, bis der A10255-Komplex erzeugt wird.
  • Wie bei vielen Antibiotika produzierenden Kulturen führt die Züchtung eines A10255-produzierenden Stammes von S. gardneri NRRL 15537, NRRL 18260 oder NRRL 15922 zur Coproduktion einer Reihe antibiotischer Substanzen. Faktor B des Antibiotikums A10255 ist der Hauptfaktor, der von der NRRL 15537-Kultur erzeugt wird, und die Faktoren C, E, F, G und H werden in geringeren, jedoch isolierbaren Mengen erzeugt. Andere Faktoren sind entweder in so geringen Mengen vorhanden, daß sich ihre Isolierung nicht rentiert oder sind relativ instabil. Die Faktoren G und H wurden bei Züchtung der NRRL 18260-Kultur isoliert, wobei Faktor G der Hauptfaktor ist. Die Mengen der einzelnen Faktoren, die gleichzeitig produziert werden, können von Züchtung zu Züchtung irgendeines der oben beschriebenen Mikroorganismen variieren.
  • Die antibiotischen Faktoren B, C, E, F, G und H, die während der Fermentation gleichzeitig erzeugt werden und als Mischung erhalten werden, werden als A10255-Komplex bezeichnet. Die einzelnen Faktoren werden voneinander getrennt und isoliert als distinkte Einheiten mit den folgenden physikalischen und biologischen Eigenschaften.
  • Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbare Salze" schließt Alkali- und Erdalkalisalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ein, zum Beispiel Lithium-, Natrium-, Kalium- und Calciumsalze, ebenso wie Säureadditionssalze, wie zum Beispiel solche, die von den Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure gebildet werden.
    • Physikalische Eigenschaften der antibiotischen Faktoren A10255-Faktor B
  • A10255-Faktor B ist ein nicht-kristallines weites bis hellgelbes Pulver, das in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform/Methanol-Mischungen und 4 : 1 (V:V) Tetrahydrofuran:Wasser löslich ist.
  • Die Elementaranalyse von Faktor B liefert die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung (Durchschnitt): Kohlenstoff 49,25%, Wasserstoff 3,94%, Stickstoff 15,65%, Sauerstoff 21,36% und Schwefel 6,73%.
  • Das scheinbare Molekulargewicht von A10255-Faktor B wurde mit Fast Atom Bombardment-Massenspektrometrie bestimmt mit ungefähr 1244 Dalton.
  • Die elektrometrische Titration von A10255-Faktor B in 66%-igem wäßrigem Dimethylformamid zeigt das Vorhandensein von drei titrierbaren Gruppen mit pKa-Werten von 4,9, 11,2 und 12,8.
  • Die Aminosäureanalyse von Faktor B (nach Hydrolyse mit 6N Chlorwasserstoffsäure) zeigt das Vorhandensein von Ammoniak (5268 mmol/mg) und Threonin (629 mmol/mg). Die Analyse liefert auch einen großen, nicht identifizierten Peak, der vor der Position für den Histidin-Peak kommt.
  • Das Ultraviolettabsorptionsspektrum für Faktor B, erhalten in neutralem, saurem und basischem Methanol zeigt λmax von 245 nm (ε = 66 000).
  • Das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Scheibe) ist in Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Die wichtigeren Absorptionsmaxima, die bei dem Spektrum beobachtet wurden, sind die bei 3373, 2969, 2932, 2875, 1661, 1598, 1520, 1494, 1395, 1250, 1114, 1084, 996, 932 und 900 cm&supmin;¹.
  • Das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von Faktor B wurde erhalten in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid mit 500 MHz und hatte die folgenden Signale: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität * doppelt intensiv &spplus; dreifach intensiv
  • Das kernmagnetische ¹³-Resonanzspektrum von Faktor B wurde in perdeutertiertem Dimethylsulfoxid bei 125 MHz erhalten und hatte die folgenden Signale: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität S = Singulett, D = Dublett, T = Triplett, Q = Quartett
    • A10255-Faktor C
  • A10255-Faktor: C, ist ein nicht-kristallines weißes bis hellgelbes Pulver, das in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, 1 : 1 (V:V) Methylenchlorid/Methanol und 4 : 1 (V:V) Tetrahydrofuran:Wasser löslich ist.
  • Die Elementaranalyse von Faktor c zeigt die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung (Durchschnitt): Kohlenstoff 49,18%, Wasserstoff 3,86%, Stickstoff 17,89%, Sauerstoff 18,28% und Schwefel 6,46%.
  • Das scheinbare Molekulargewicht von A10255-Faktor C wurde bestimmt mit Fast Atom Bombardment-Massenspektrometrie als ungefähr 1174 Dalton. Unter Verwendung von CsI als Referenzstandard wurde die exakte Masse bestimmt als 1175,35 (M + H).
  • Die elektometrische Titration von A10255-Faktor C in 66%-igem wäßrigem Dimethylformamid (Anfangs-pH 7,29) zeigte das Vorhandensein zweier titrierbarer Gruppen mit pKa-Werten von 2,9 (unsicher) und 12,0. Die Aminosäureanalyse von Faktor C (nach Hydrolyse mit 6N Chlorwasserstoffsäure) zeigte das Vorhandensein von Ammoniak (7429 mmol/mg) und Threonin (758 mmol/mg). Die Analyse zeigte auch einen großen, nicht-identifizierten Peak, der vor der Position für den Histidin-Peak erschien.
  • Das Ultraviolettabsorptionsspektrum für Faktor C, das in neutralem, saurem und basischem Methanol erhalten wurde, zeigte λmax von 245 nm (ε = 63 000).
  • Das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Scheibe) ist in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Die wichtigeren Absorptionsmaxima, die in dem Spektrum beobachtet wurden, treten auf bei 3375, 2973, 2932, 2876, 1661, 1597, 1494, 1427, 1345, 1305, 1249, 1111, 1083, 984, 933 und 894 cm&supmin;¹.
  • Das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von Faktor C wurde in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid bei 360 MHz erhalten und hatte die folgenden Signale: 6 10,51, 10,08, 9,84, 9,57, 9,10, 8,88, 8,03, 7,94, 7,53, 5,15 (alle vorhergehenden Signale sind mit D&sub2;O austauschbar), 8,67, 8,59, 8,51, 8,49, 8,38, 8,25, 8,24, 6,57, 6,52, 6,38, 6,11, 5,91, 5,78, 5,74, 5,70, 5,65, 5,63, 5,44, 5,15, 4,79, 4,67, 4,63, 4,23, 2,21, 1,62, 1,11 und 1,01.
    • A10255-Faktor E
  • A10255-Faktor: E ist ein nicht-kristallines weißes bis hellgelbes Pulver, das in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Cloroform/Methanol-Mischungen und 4 : 1 (V:V) Tetrahydrofuran:Wasser löslich ist.
  • Die Elementaranalyse von Faktor E zeigt die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung (Durchschnitt): Kohlenstoff 48,03%, Wasserstoff 3,91%, Stickstoff 15,76%, Sauerstoff 17,09% und Schwefel 5,63%.
  • Das scheinbare Molekulargewicht von A10255-Faktor E wurde mit Fast Atom Bombardment Massenspektrometrie bestimmt als ungefähr 1258 Dalton. Die genaue Masse von Faktor E wurde bestimmt als 1259,55 (M + H) unter Verwendung von CsI als Referenzstandard.
  • Die elektrometrische Titration von A10255-Faktor E in 66%-igem wäßrigem Dimethylformamid zeigt das Vorhandensein dreier titrierbarer Gruppen mit pKa-Werten von 4,85, 11,1 und 13,2. Die Aminosäureanalyse von Faktor E (nach Hydrolyse mit 6N Chlorwasserstoffsäure) zeigt das Vorhandensein von Ammoniak (8580 mmol/mg) und Threonin (716 mmol/mg). Die Analyse zeigt auch einen großen, nicht-identifizierten Peak, der vor der Position des Histidin-Peaks erscheint.
  • Das Ulaviolettabsorptionsspektrum für Faktor E, erhalten in neutralem, saurem und basischem Methanol, zeigt ein λmax von 245 nm (ε 77 000).
  • Das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Scheibe) ist in Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Die wichtigeren Absorptionsmaxima, die in dem Spektrum beobachtet wurden, treten auf bei 3367, 3361, 2966, 1664, 1501, 1389, 1254, 1102 und 889 cm&supmin;¹.
  • Das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von Faktor E wurde in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid mit 270 MHz erhalten und hatte die folgenden Signale: 6 10,54, 10,00, 9,94, 9,81, 9,60, 9,56, 9,45, 8,89, 8,84, 8,66, 8,59, 8,50, 8,47, 8,39, 8,25, 8,22, 8,10, 6,53, 6,50, 6,24, 5,95, 5,86, 5,84, 5,77, 5,64, 5,55, 5,52, 5,44, 5,10, 4,80, 4,66, 4,64, 4,22, 2,78, 1,60, 1,11 und 1,00.
    • A10255-Faktor F
  • A10255-Faktor F ist ein weißes bis hellgelbes nichtkristallines Pulver, das in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, 1 : 1 (V:V) Methylchlorid/Methanol und 4 : 1 (V:V) Tetrahydrofuran:Wasser löslich ist.
  • Die Elementaranalyse von Faktor F zeigt die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung (Durchschnitt): Kohlenstoff 49,65%, Wasserstoff 4,23%, Stickstoff 17,11%, Sauerstoff 22,08% und Schwefel 7,78%.
  • Das scheinbare Molekulargewicht von A10255-Faktor F wurde bestimmt durch Felddesorptionsmassenspektrometrie mit ungefähr 1188 Dalton.
  • Die elektrometrische Titration von A10255-Faktor F in 66%-igem wäßrigem Dimethylformamid (Ausgangs-pH 7,08) zeigt das Vorhandensein einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 12,5.
  • Die Aminosäureanalyse von Faktor F (nach Hydrolyse mit 6N Chlorwasserstoffsäure) zeigt das Vorhandensein von Ammoniak (7226 mmol/mg) und Threonin 735 mmol/mg). Die Analyse liefert auch einen großen, nicht-identifizierten Peak, der vor der Position des Histidin-Peaks erscheint.
  • Das Ultraviolettabsorptionsspektrum für Faktor F, erhalten in neutralem, saurem und basischem Methanol, zeigte ein λmax von 245 nm (ε = 71500).
  • Das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Scheibe) ist in Fig. 4 der beigefügten Zeichnungen wiedergegeben. Die wichtigeren Absorptionsmaxima, die in dem Spektrum beobachtet wurden, treten auf bei 3369, 2943, 2907, 2846, 1663, 1588, 1519, 1493, 1425, 1337, 1288, 1251, 1151, 1110, 1083, 995, 927, 890, 807, 776 und 751 cm&supmin;¹.
  • Das kernmagnetische Protonenresonanzspektrum von Faktor F wurde in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid bei 360 MHz erhalten und hatte die folgenden Signale: 6 10,51, 10,17, 9,88, 9,77, 9,54, 9,10, 8,90, 8,88, 8,66, 8,59, 8,51, 8,49, 8,38, 8,25, 8,24, 8,06, 7,94, 7,53, 6,56, 6,51, 6,27, 6,23, 6,12, 6,12, 5,96, 5,77, 5,76, 5,71, 5,71, 5,64, 5,62, 5,47, 5,14, 4,77, 4,65, 4,62, 4,20, 2,77, 2,48, 2,48, 1,58, 1,08, 0,98 und 0,98.
    • A10255-Faktor G
  • A10255-Faktor G ist ein nicht-kristallines weißes bis hellgelbes Pulver, das in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform/Methanol-Mischungen und 4 : 1 (V:V) Tetrahydrofuran:Wasser löslich ist.
  • Die Elementaranalyse von Faktor G zeigt die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung:
    • Elementaranalyse
  • Gefunden (%)
  • C 51,46
  • H 3,82
  • N 17,62
  • O 19,38
  • S 7,03
  • 99,31%
  • Das Ultraviolettabsorptionsspektrum für Faktor G in neutralem Ethanol zeigte ein λmax = 247 nm (ε = 72200); in saurer Lösung λmax = 247 nm (ε = 73400) und in basischer Lösung λmax = 211 nm (ε = 27200).
  • Das Infrarotspektrum (KBr-Scheibe) für A10255-Faktor G ist in Fig. 5 der beigefügten Zeichnungen dargestellt:
  • Das kernmagnetische ¹H-Resonanzspektrum von Faktor G wurde in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid bei 500 MHz erhalten und hatte die folgenden Signale: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität * doppelt intensiv BS = breites Singulett DD = Dublett von Dubletts DQ = Dublett von Quartett
  • Das kernmagnetische ¹³C-Resonanzspektrum von Faktor G wurde in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid bei 125 MHz erhalten: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität
    • A10255-Faktor H
  • A10255-Faktor H ist ein nicht-kristallines weißes bis hellgelbes Pulver, das in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, 1 : 1 (V:V) Methylenchlorid/Methanol und 4 : 1 (V:V) Tetrahydrofuran:Wasser löslich ist.
  • Die Elementaranalyse von Faktor H zeigt die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung:
    • Elementaranalyse:
  • Gefunden (%)
  • C 50,36
  • H 3,73
  • N 18,61
  • O 18,54
  • S 8,20
  • 99,43%
  • Das Ultraviolettabsorptionsspektrum für Faktor H in neutralem Ethanol zeigte ein λmax von 244 nm (ε = 74000), in saurer Lösung λmax = 245 nm (ε = 74500) und in basischer Lösung λmax = 211 nm (ε = 23800).
  • Das kernmagnetische ¹³-Resonanzspektrum von A10255-Faktor H bei 125 MHz in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid hatte die folgenden Signale: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität * doppelt intensiv
  • Das kernmagnetische ¹H-Resonanzspektrum bei 500 MHz in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid hatte die folgenden Signale: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität
  • Das Infrarotspektrum (KBr-Scheibe) für A10255-Faktor H ist in Fig. 6 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.
  • Das Molekulargewicht von A10255-Faktor H wurde bestimmt mit Fast Atom Bombardment-Massenspektrometrie als ungefähr 1160; die genaue Masse wurde bestimmt als 1161,32 (M + H) unter Verwendung von CsI als Referenzstandard.
  • Der A10255-produzierende Elternstamm S. gardneri NRRL 15537, ursprünglich auch identifiziert als A10255.1, wurde klassifiziert mit taxonomischen Untersuchungen, die durchgeführt wurden, wie in den folgenden Absätzen beschrieben.
    • Taxonomie des A10255 : 1-Stammes
  • Taxonomische Untersuchungen des A10255.1-Stammes wurden durchgeführt von Frederick P. Mertz bei den Lilly Research Laboratories. Auf Basis dieser Untersuchungen wird der Organismus klassifiziert als neuer Stamm von Streptomyces gardneri (Waksman 1942) Waksman 1961 ATCC 23911. Diese Klassifizierung basiert auf einer Untersuchung veröffentlichter Beschreibungen dieser Art [R.E. Buchanan und N.E. Gibbons (Herausgeber), "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Ausgabe, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974; E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces", Int. J. Syst. Bacteriol. 18(4):279-392 (1968), und S.A. Waksman, "The Actinomycetes Vol. 11", The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961] und gleichzeitige Laborvergleiche.
  • Die von dem International Streptomyces Project (ISP) für die Charakterisierung von Streptomyces-Arten [E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16(3), 313-340 (1966)] empfohlenen Methoden wurden befolgt zusammen mit bestimmten ergänzenden Tests [D.J. Blazevic und G.M. Ederer, "Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology", John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975].
  • Die Kohlenstoffverwertung wurde bestimmt auf ISP Nr. 9 Grundmedium, dem filtersterilisierte Kohlenstoffquellen zugesetzt wurden auf eine Endkonzentration von 1,0 Prozent. Die Platten wurden bei 30ºC inkubiert und nach 14 Tagen abgelesen.
  • Die Melanoidpigmentproduktion (Chromogenizität) wurde bestimmt mit ISP Nr. 1 (Trypton-Hefeextrakt-Brühe), ISP Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar), ISP Nr. 7 (Tyrosin-Agar) und modifiziertem ISP Nr. 7, bei dem Tyrosin entfernt worden war.
  • Die Stärkehydrolyse wurde bestimmt, indem die Gegenwart von Stärke mit Iod auf ISP Nr. 4 (anorganische Salze-Stärkeagar) Platten getestet wurde (siehe Blazevic und Ederer, oben).
  • Die Morphologie wurde untersucht unter Verwendung eines Lichtmikroskops. Ein Rasterelektronenmikroskop (SEM) wurde verwendet, um das Oberflächenmuster der Sporen zu untersuchen.
  • Die Natriumchloridtoleranz wurde gemessen durch Zugabe von Natriumchlorid zu ISP Nr. 2 Agar auf die gewünschte Konzentration.
  • Die ICSS-NBS Centroid Color Charts, Standardprobe Nr. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C.) und das Color Harmony Manual (4. Ausgabe, Color Standards Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) wurden verwendet, um die Farbnamen zuzuordnen.
  • Die Zellwandzucker wurden bestimmt mit dem Verfahren von M.P. Lechevalier, "Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinical Importance", J. Lab. Clin. Med., 71, 934-944 (1968). Die Isomere der Diaminopimelinsäure (DAP) wurden festgestellt durch chromatographische Methoden, wie in B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon und H.A. Lechevalier, "Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 11, 421-423 (1964) angegeben.
    • Kultureigenschaften
  • A10255.1 ist gekennzeichnet durch ein begrenztes vegetatives und sehr wenig entwickeltes Luftmycel. Das Luftmyzel hat eine Farbe der Sporenmasse in der Farbreihe von weiß (W) bis grau (GY). Die nächste passende Farbe im Tresner und Backus System [Color Harmony Manual, oben, und E.J. Backus und H.D. Tresner, "System of Color Wheeles for Streptomyces Taxonomy", Appl. Microbiol., 11, 335-338 (1956)] für die weiße Farbserie ist b austerweiß und in der grauen Farbreihe d hellgrau. Dieses Kulturmerkmal wird am besten auf Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr. 5) beobachtet. Das Luftmyzel ist so gering entwickelt auf den meisten Medien, daß eine Farbbestimmung sehr schwierig ist.
  • Die Rückseite dieser Kultur hat keine unterscheidbaren Pigmente. Die Farbe der Rückseite ist orange-gelb bis gelblich braun und die Farbe wird nicht durch den pH beeinflußt. Das einzige erzeugte lösliche Pigment ist ein hellbraunes Pigment auf Tyrosin-Agar (ISP Nr. 7) und Tomatenpaste-Hafermehl-Agar (TPO) und ein helloranges Pigment, erzeugt auf Glycerin- Glycin-Agar. Die Kultur war, bei Plattierung auf Variabilität, stabil und homogen.
  • Die Kultureigenschaften des A10255.1-Stammes und von S. gardneri ATCC 23911 sind unten in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Kultureigenschaften von A10255.1 und S. gardneri ATCC 23911 Agar ziemlich Nr. wenig: b weiß (nur Kanten) d hellgrau keine Spuren bis Calciummalat Czapek's 93.yGrau reichlich Glucose-Asparagin gut hellbraun sehr reichlich Tabelle 1 - Fortsetzung Kultureigenschaften von A10255.1 und S. gardneri ATCC 23911 Agar ziemlich S. gardneri (faltige Oberfläche) Glycerin (keine pH-Änderung) Glycin keine hellorange gut wenig (nur Kanten) fahl orangegelb hellgrau hell orangebraun Nr. wenig: b weiß bis d 1. Grau a G = Wachstum; R = Rückseite; Am = Luftmyzel; Sp = lösliches Pigment b Die Angabe der Farben der Rückseite erfolgt nach dem ICSS-NBS-System, oben. c Die Angabe der Farbe des Luftmyzels erfolgt nach dem Color Harmony Manual, oben.
    • Morphologische Eigenschaften
  • Die Kultur A10255.1 erzeugt ein wenig entwickeltes, nicht-fragmentierendes Luftmyzel, das monopodial verzweigt ist. Die Sporophoren sind in geraden und gebogenen Ketten angeordnet. Es wurden keine Spiralen, Sklera, Sporangien oder bewegliche Sporen beobachtet. A10255.1 ist im Rectus-flexibilus (RF) Bereich von Prjdham et al. [T.G. Pridham et al., "A Guide for the Classification of Streptomyces According to Selected Groups", Appl. Microbiol., 6, 52-79 (1957)] angeordnet.
  • Dieselbe Morphologie wird auf allen Medien beobachtet, wo Luftmyzelien beobachtet wurden. Reife Sporenketten enthalten im allgemeinen 10 bis 50 Sporen pro Kette.
  • Die Sporenform ist zylindrisch. Die Sporengröße liegt im Bereich von 0,9 bis 1,0 um Länge und 0,5 bis 0,6 um Breite. Die durchschnittliche Größe ist 1,6·0,6 um. Das Oberflächenmuster der Sporen ist glatt.
    • Physiologische Eigenschaften
  • Hydrolysate ganzer Zellen enthalten LL-Diaminopimelinsäure, wobei kein meso-Isomer vorhanden ist. Die in den Hydrolysaten der Gesamtzellen vorhandenen Zucker waren Glucose, Mannose und Ribose. Diese Eigenschaften stellen eine Zellwand Typ I und ein NC- oder kein charakteristisches Zuckermuster dar [M.P. Lechevalier, oben]. Diese Kombination der Hauptzellwandkomponenten deutet auf den Genus Streptomyces ]M.P. Lechevalier, oben, und R.E. Buchanan und N.E. Gibbons (Herausgeber), oben].
  • Das Kohlenstoffverwertungsmuster für A10255.1 ist wie folgt L-Arabinose, D-Fructose, D-Galactose, D-Glucose, I-Inosit, Raffinose und D-Xylose werden für das Wachstum verwertet. D-Mannit, L-Rhamnose, Salicin und Saccharose unterstützen das Wachstum nicht. Tabelle 2 unten vergleicht die für A10255.1 und S. gardneri ATCC 23911 beobachteten Kohlenstoffverwertungsmuster. Tabelle 2 Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch A10255.1 und S. ardneri ATCC 23911 Kohlenstoffquelle S. gardneri kein Kohlenstoff L-Arabinose D-Fructose D-Galactose D-Glucose I-Inosit D-Mannit Raffinose L-Rhamnose Salicin Saccharose D-Xylose - a = keine Verwertung + b = Verwertung
  • Die Kultur A10255.1 hydrolysierte Stärke und hydrolysierte Magermilch teilweise, produzierte Katalase, verflüssigte Gelatine und reduzierte Nitrate zu Nitriten.
  • A10255.1 toleriert bis zu 6% Natriumchlorid und wächst bei Temperaturen im Bereich von 4 bis 40ºC.
  • Melanoidpigmente werden erzeugt, wenn A10255.1 in Trypton-Hefeextrakt-Brühe (ISP Nr. 1) und als Schrägkultur von Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar (ISP Nr. 6) gezüchtet wird. Es werden keine Melanoidpigmente bei Schrägkultur von Tyrosin-Agar (ISP Nr. 7) erzeugt.
    • Bestimmung der Arten
  • Unter Verwendung der Kultur-, morphologischen und physiologischen Eigenschaften von A10255.1 folgte ein Vergleich mit den veröffentlichten Beschreibungen ähnlicher Arten. Vier Arten von Streptomyces wurden ausgewählt zur Untersuchung bei einem gleichzeitigen Laborvergleich:
  • Streptomyces aureofasciculusaa
  • Streptomyces aureomonopodialesa
  • Streptomyces flavochromogenesb
  • Streptomyces gardneric a E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces", Int. J. Syst. Bacteriol. 19(4), 375-390 (1969) b E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces", Int. J. Syst. Bacteriol. 22(4), 265-394 (1972) c E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces", Int. J. Syst. Bacteriol. 18(4), 279-392 (1968)
  • Der Laborvergleich zeigte wesentliche Unterschiede zu S. aureofasciculus und S. flavochromogenes und eine gute Übereinstimmung mit S. aureomonopodiales und S. gardneri. Jedoch wurde S. aureomonopodiales, da er nicht in der zugelassenen Liste der Bakteriennamen aufgeführt ist, nicht in die Betrachtungen miteinbezogen.
  • A10255.1 ist S. gardneri in Bezug auf die Kultureigenschaften, morphologischen und physiologischen Eigenschaften ziemlich ähnlich. Das vorherrschende Kulturmerkmal, das beide Stämme unterscheidet, ist die der geringe Bildung von Lufthyphen auf den meisten Medien. S. gardneri wird in der Literatur beschrieben als zu den Grau(GY)-Reihen gehörig. Jedoch produzierte er in der ursprünglichen Beschreibung von Waksman [S.A. Waksman, oben] und im Laborvergleich mit A10255.1 weiße (W) und graue (GY) Lufthyphen. Die Farbe der Rückseite beider Kulturen ist fast identisch. Beide Kulturen besitzen eine Rectus-flexibilus(RF)-Morphologie, ein glattes Oberflächenmuster der Sporen, eine zylindrische Sporenform und Ketten mit 10 bis 50 Sporen.
  • Die Katalaseproduktion, Verflüssigung von Gelatine, Melanoidpigmentproduktion, Reduktion von Nitrat und Hydrolyse von Milch und Stärke waren für beide Stämme gleich.
  • Die Unterschiede zwischen A10255.1 und S. gardneri sind minimal. S. gardneri hat eine geringere Toleranz gegenüber Natriumchlorid und einen niedrigeren Temperaturbereich als A10255.1. Die Verwertung von L-Rhamnose, Saccharose und die Unfähigkeit I-Inosit zu verwerten, unterscheidet S. gardneri von A10255.1. Diese Ähnlichkeiten und Unterschiede sind unten zusammengefaßt.
    • Vergleich zwischen A10255.1 und Streptomyces gardneri
  • Ähnlichkeiten Unterschiede
  • Farbe der Luftsporenmasse (W) Kohlenstoffverwertung
  • Katalase positiv Natriumchloridtoleranz
  • Zellwandhydrolysate (LL-DAP) Temperaturbereich
  • unterscheidbare Pigmente nicht vorhanden
  • Gelatineverflüssigung
  • Morphologie (RF)
  • Nitratreduktion
  • teilweise Milchhydrolyse
  • Pigmentierung der Rückseite
  • lösliche Pigmente nicht vorhanden
  • Sporenkettenlänge
  • Sporenform
  • Oberflächenmuster der Sporen (Sm)
  • Stärkehydrolyse
  • Die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den zwei Kulturen sind unten im Detail in Tabelle 3 angegeben: Tabelle 3 Eigenschaften S. gardneri Farbe der Luftsporenmasse Kohlenstoffverwertungsmuster I-Inosit L-Rhamnose Saccharose Katalase Zellwandtyp unterscheidbare Pigmente Gelatineverflüssigung Melanoidpigmentproduktion ISP Nr. Morphologie NaCl-Toleranz-% Nitratreduktion Farbe der Rückseite Hydrolyse von Magermilch teilweise lösliche Pigmente Sporenkettenlänge Sporenform zylindrisch Sporenoberfläche glatt Stärkehydrolyse Temperaturbereich
  • Die obigen Vergleiche zeigen, daß A10255.1 S. gardneri sehr ähnlich ist. Deshalb wird die Kultur A10255.1 als ein Stamm von Streptomyces gardneri (Waksman, 1942) Waksman 1961, ATCC 23911 klassifiziert. S. gardneri wird in der zugelassenen Liste von Bakteriennamen [V.B.D. Skerman et al., "Approved Lists of Bacterial Names", Int. J. Syst. Bacteriol., 30(1), 225-420 (1980)] anerkannt und ist demzufolge eine gültig veröffentlichte Art.
  • Es sollte angemerkt werden, daß Kurylowicz et al. [W. Kurylowicz, A. Paszkiewicz, W. Woznicka und W. Kurzatkowski, "Numerical Taxonomy of Streptomyces", Polish Medical Publishers, 1975] bei der Klassifizierung von Streptomyces bei den numerischen Verfahren sowohl bezüglich dem Wroclaw-Dentrit der Ähnlichkeit als auch dem Verfahren der Gesamtähnlichkeit S. aureomonopodiales und S. gardneri dem gleichen Cluster zuordnen. Ein Dendrogramm auf Basis dieser Untersuchung ordnet diesen zwei Stämmen einen Prozentanteil an Ähnlichkeit von 94 zu. Wegen dieser Ähnlichkeit ist eine Unterscheidung in Arten nicht gerechtfertigt.
  • Die oben beschriebene Streptomyces gardneri Kultur wurde hinterlegt und Teil der Mikroorganismensammlung der Northern Regional Research Division, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, IL, 61604. Bei Veröffentlichung der vorliegenden Anmeldung wird die Kultur für die Öffentlichkeit zugänglich bei dem Department of Agriculture unter der Nummer NRRL 15537 und ansonsten wie es gemäß Regel 28 EPC erforderlich ist.
    • Beschreibung des A10255.10-Stammes (NRRL 18260)
  • Der A10255.10-Stamm NRRL 18260 leitet sich von dem Elternstamm A10255.1, NRRL 15537 ab, durch eine Reihe aufeinanderfolgender Behandlungen mit NTG (N-Nitrosoguanidin). NRRL 18260 wurde hinterlegt und Teil der Mikroorganismensammlung der Northern Regional Research Division, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, IL, 61604. Bei Veröffentlichung der vorliegenden Anmeldung wird die Kultur für die Öffentlichkeit zugänglich bei dem Department of Agriculture und ansonsten wie von Regel 28 EPC vorgeschrieben.
    • Taxonomie des A10255.2-Stammes
  • Der A10255.2-Stamm (oben bezeichnet als Streptomyces gardneri Stamm NRRL 15922) ist eine NTG (N-Nitrosoguanidin)-Mutante des A10255.1-Stammes. Letzterer Stamm ist Streptomyces gardneri NRRL 15537.
  • Es gibt viele Ähnlichkeiten in der Taxonomie des Stämme A10255.1 und A10255.2. Der taxonomische Vergleich zwischen A10255.1 und A10255.2 ist unten in Tabellenform angegeben. Tabelle 4 Kultureigenschaften von A10255.1 und A10255.2 Agar ziemlich Nr. wenig: b weiß (nur Kanten) d hellgrau fahlgelb keine Spuren bis Calciummalat (Malat nicht hydrolysiert) Czapek's Glucose-Asparagin gut hellbraun Tabelle 4 - (Fortsetzung) Vergleich der Kujtureigenschaften von A10255.1 und A10255.2 Glycerin ziemlich reichlich (keine pH-Änderung) Glycin keine gut hellorange gut 51.tief O wenig (nur Kanten) fahlgelb fahlorange-gelb hell orangebraun wenig: b weiß bis d 1.grau a G = Wachstum; R = Rückseite; Am = Luftmyzel; Sp = lösliches Pigment b Die Angabe der Farben der Rückseite erfolgt nach dem ICSS-NBS-System, oben. c Die Angabe der Farbe des Luftmyzels erfolgt nach dem Color Harmony Manual, oben. Tabelle 5 Vergleich der Stämme A10255.1 und A10255.2 Eigenschaften Farbe der Luftsporenmasse Kohlenstoffverwertungsmuster identisch Katalase Kultureigenschafaten: Lufthyphen auf Glycerin-Glycin-Agar Wachstum auf Czapek's-Agar unterscheidbare Pigmente auf bestimmte Medien Gelatineverflüssigung Melanoidpigmentproduktion Morphologie NaCl-Toleranz % Nitratreduktion Farbe der Rückseite Hydrolyse von Magermilch teilweise vollständig lösliche Pigmente Sporenkettenlänge Sporenform Sporengröße - um Sporenoberfläche glatt Stärkehydrolyse Temperaturbereich - ºC
  • Die oben beschriebene Streptomyces gardneri Kultur A10255.2 wurde hinterlegt und Teil der Mikroorganismensammlung der Northern Regional Research Division, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, IL, 61604. Bei Veröffentlichung der vorliegenden Anmeldung wird die Kultur für die Öffentlichkeit zugänglich beim Department of Agriculture unter der Hinterlegungsnummer NRRL 15922 und ansonsten wie gemäß Regel 28 EPC erforderlich.
    • Produktion der Antibiotikafaktoren und ihre biologische Aktivität
  • Der antibiotische A10255-Komplex kann erzeugt werden, indem der bisher nicht beschriebene Mikroorganismus Streptomyces gardneri, NRRL 15537, Stamm NRRL 18260 oder Stamm NRRL 15922, oder eine A10255-produzierende Mutante davon in einem Kulturmedium, das assimilierebare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersfermentationsbedingungen gezüchtet wird, bis der antibiotische A10255-Komplex erzeugt wird und vorzugsweise bis ein wesentlicher Gehalt an antibiotischer Aktivität erzeugt wird. Das meiste an antibiotischer Aktivität findet sich im allgemeinen gebunden in den Myzelien, während sich geringere Mengen an antibiotischer Aktivität in der Brühe finden. Der A10255-Komplex wird am leichtesten von der Fermentationsmischung abgetrennt durch Entfernung der Myzelien (der Biomasse) durch Filtration. Die Brühe wird im allgemeinen verworfen. Der antibiotische Komplex wird dann aus den Myzelien isoliert.
  • Der Elternstamm NRRL 15537 produziert Faktor B am reichlichsten. Der Mutantenstamm NRRL 18260 produziert die Faktoren B und G am reichlichsten. Die verbleibenden Faktoren C, E, F und H wurden bisher nur in geringeren Mengen von beiden Stämmen erzeugt.
  • Die Myzelien werden mit polaren Lösungsmitteln (zum Beispiel 4 : 1 Aceton:Wasser) extrahiert, eingeengt, angesäuert, wiederum extrahiert mit einem organischen Lösungsmittel (zum Beispiel Ethylacetat) und die entstehenden Lösungen werden eingeengt, um den A10255-Komplex auszufällen.
  • Der A10255-Komplex kann ohne weitere Reinigung verwendet werden und direkt in das Tierfutter oder die Tierfuttervormischung gemischt werden. Alternativ kann der antibiotische A10255-Komplex weiter gereinigt werden und in die einzelnen Faktoren mit wohlbekannten chromatographischen Verfahren wie zum Beispiel Dünnschichtchromatographie, Säulenchromatographie und insbesondere verschiedene Arten von Hochleistungsflüssigchromatographie aufgetrennt werden. Einige spezifische Verfahren zur Isolierung der einzelnen Faktoren werden im experimentellen Abschnitt diskutiert.
  • Eine Anzahl verschiedener Medien kann verwendet werden für NRRL 15537, NRRL 18260 oder NRRL 15922 zur Erzeugung des A10255-Komplexes. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit bei der Herstellung, der optimalen Ausbeute und der Leichtigkeit der Isolierung des Produktes sind jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Diese Medien sollten assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthalten. Geeignete Kohlenstoffquellen schließen Glucose, Stärke, Maltose, Fructose und Glycerin ein. Optimale Gehalte an Kohlenstoffquellen sind etwa 2 bis etwa 5 Gew.-%.
  • Bevorzugte Stickstoffquellen schließen den sauren Aufschluß von Sojabohnen, den sauren oder enzymatischen Aufschluß von Kasein, Ammoniumsalze, Nitratsalze, Glycin, Alanin, Serin, Asparagin und Glutamin ein.
  • Essentielle Spurenelemente, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus notwendig sind, können als Verunreinigungen in anderen Komponenten der Medien vorhanden sein in Mengen, die ausreichen, um die Erfordernisse für das Wachstum und biosynthetische Erfordernisse des Organismus zu erfüllen. Jedoch kann es günstig sein, dem Kulturmedium zusätzliche lösliche anorganische Nährsalze zuzusetzen, die Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen-, Chlorid-, Carbonat-, Phosphat-, Sulfat-, Nitrat- und ähnliche Ionen liefern.
  • Obwohl kleine Mengen des Antibiotikums A10255 durch Schüttelflaschenkultur erhalten werden können, ist die aerobe Submersfermentation in Tanks ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung wesentlicher Mengen des Antibiotikums A10255. Bei der Tankfermentation ist es bevorzugt, ein vegetatives Inokulum zu verwenden. Das vegetative Inokulum wird hergestellt, indem ein geringes Volumen Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Myzelfragmenten beimpft wird, um eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus zu erhalten. Das vegetative Inokulum wird dann in einen größeren Tank überführt, wo nach einer geeigneten Inkubationszeit das Antibiotikum A10255 in optimaler Ausbeute produziert wird.
  • Die A10255-produzierenden Organismen erzeugen den A10255-Komplex in einem Temperaturbereich von etwa 23 bis etwa 37ºC. Die optimale Produktion des antibiotischen A10255-Komplexes scheint bei einer Tempratur von etwa 30 bis etwa 32ºC zu erfolgen.
  • Wie es für aerobe Submerskulturverfahren üblich ist, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Für ein effizientes Wachstum des Organismus ist das Luftvolumen, das bei der Tankproduktion verwendet wird, im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,5 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute (V.V.m), bei etwa 100 bis etwa 300 Upm Bewegung. Eine optimale Rate in einem 165-l-Gefäß, das 100 l Fermentationsmedium enthält, ist etwa 0,125 V/V/m, wobei die Bewegung mit einem Rührflügel, der sich mit etwa 200 Upm dreht, erfolgt.
  • Die Fermentation erzeugt im allgemeinen nach etwa 40 Stunden antibiotische Aktivität. Die Antibiotika-Spitzenproduktion tritt in dem Zeitintervall von etwa 110 bis etwa 140 Stunden Fermentationszeit auf.
  • Die Produktion des Antibiotikums A10255 kann während der Fermentation überwacht werden entweder durch Agardiffusion unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 oder mit einem turbidimetrischen Verfahren unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC 9114.
  • Der A10255-Komplex und die einzelnen Faktoren sind antimikrobielle Mittel und insbesondere aktiv gegen gram-positive Mikroorganismen, wie im folgenden anhand der in vitro und in vivo Testdaten gezeigt wird. In der folgenden Tabelle 6 ist die minimale Hemmkonzentration (MIC in ug/ml) für die Faktoren dargestellt gegen eine Probe pathogener gram-positiver und gram-negativer Bakterien. Die MIC-Werte wurden erhalten mit dem Standard-Agarverdünnungstestverfahren. Tabelle 6 Aktivität von A10255-Verbindungen gegenüber pathogenen Mikroorganismen Testorganismus Staphylococcus aureus epidermidisStreptococcus pyogenes pneumoniae Park I Gruppe D Haemophilus influenzae C.L. (sens.) (res.)
  • Die A10255-Verbindungen zeigen auch eine ausgezeichnete antimikrobielle Aktivität gegenüber einer Anzahl von Clostridium difficile-Stämmen. Insbesondere zeigten bei Standard-Agarverdünnungstests der A10255-Komplex und die Faktoren B, C, E und F MIC's von ≥ 0,03 ug/ml. Zum Vergleich wies das Antibiotikum Vancomycin bei den gleichen Tests wie für den Komplex und die Faktoren B und C eine MIC von 2 oder 4 ug/ml auf.
  • Der A10255-Komplex und Faktor C wurden gegen verschiedene Bacteroides-Arten getestet und zeigten ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitäten. Die Ergebnisse dieses Agarverdünnungstests sind unten in Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 Aktivität von A10255-Verbindungen gegen ausgewählte Bacteroides-Arten Testorganismus B. fragilis Stämme A10255-Komplex Faktor C B. corrodens B. vulgatis B. thetaiotaomicron
  • Der A10255-Komplex und die einzelnen Faktoren zeigten eine antimikrobielle Aktivität gegenüber einer großen Vielzahl von anaeroben Mikroorganismen. Die antimikrobielle Aktivität ist unten in Tabelle 8 angegeben. Die Ergebnisse in der Tabelle sind MIC-Werte aus einem Standard-Agarverdünnungstest. Tabelle 8 Aktivität von A10255-Verbindungen geben anaerobe Bakterien Testorganismus Komplex Clostridium difficile perfringens septicum septicum Eubacterium aerofaciens Peptococcus asaccharolyticus prevoti Peptostreptococcus anaerobius intermedius Propionibacterium acnes Bacteroides fragilis thetaiotaomicron melaninogenicus vulgatis corrodens Fusobacteriuim symbiosum necrophorum
  • Der A10255-Komplex und Faktor B zeigten eine LD&sub5;&sub0; von mehr als 300 mg/kg·1 bzw. mehr als 75 mg/kg·1. Die Ergebnisse wurden erhalten durch intraperitoneale Injektion in Mäuse.
  • Die A10255-Antibiotika sind wachstumsfördernde Mittel für wirtschaftlich wichtige warmblütige Tiere wie Geflügel, Schweine und Kühe. Bei Hühnern verbesserte der A10255-Komplex Gewichtszunahme und Futterverwertung. Tabelle 9 stellt die Ergebnisse von zwei Tests zusammen, bei denen der Komplex ad libitum an 7 Tage alte Hühner 14 Tage lang in einem Batterietest (10 Käfige mit 7 Hühnern pro Behandlung) gefüttert wurde. Die Wachstumsdaten für die mit dem Komplex behandelten Hühner wurden verglichen mit denen einer gleichen Zahl von Wiederholungsproben einer gleichzeitig durchgeführten Kontrollbehandlung.
  • Der das Wachstum verbessernde Effekt bei Geflügel wird mit den folgenden Testdaten, die mit Hühnern erhalten wurden, gezeigt. Tabelle 9 Wachstums fördernde Aktivität des A10255-Komplexes bei Hühnern Diät Behandlung (g/Tonne) Gewichtszunahme Gewicht g % Verbesserung Futter/Zunahme Verhältnis A10255-Komplex Roggen Kontrolle 1) Behandlungsdurchschnitt/Kontrolldurchschnitt·100 = % Verbesserung
  • Um das Wachstum von Hühnern zu fördern, sollte der A10255-Komplex oder die einzelnen Faktoren davon mit dem Futter der Hühner verabreicht werden in Raten von etwa 0,5 bis etwa 50 g A10255-Komplex oder einzelner Faktor pro Tonne Hühnerfutter. Die günstigsten Ergebnisse wurden beobachtet, wenn der A10255-Komplex oder der einzelne Faktor mit Raten von etwa 5 bis etwa 20 g A10255-Komplex oder Faktor pro Tonne Hühnerfutter verabreicht wurden.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Futterzusammensetzung zur Erhöhung der Futterverwertungseffizienten und zur Förderung des Wachstums bei Geflügel. Die Futterzusammensetzung umfaßt Hühnerfutter und eine wirksame Menge von A10255-Komplex, A10255-Faktor B, A10255-Faktor C, A10255-Faktor E, A10255-Faktor F, A10255-Faktor G oder A10255-Faktor H. Eine "wirksame Menge" des Komplexes oder der einzelnen Faktoren ist etwa 0,5 bis etwa 50 g pro Tonne und vorzugsweise etwa 5 bis etwa 20 g pro Tonne Hühnerfutter. Das Hühnerfutter, das für die Futterzusammensetzung verwendet wird, kann irgendeine Standardration für Hühner sein.
  • Die Formulierung der Futterzusammensetzung wird erreicht durch Mischverfahren, die auf dem veterinärpharmazentischen Gebiet wohlbekannt sind.
  • Eine bevorzugte Futterzusammensetzung umfaßt eine wirksame Menge des A10255-Komplexes und Hühnerfutter.
  • Der A10255-Komplex zeigte eine wachstumsfördernde und die Futtereffizienz verbessernde Aktivität bei entwöhnenden Schweinen. Ein Nachweis für diese Aktivität ist unten in Tabelle 10 angegeben, wo die Ergebnisse von neun Versuchen mit Anwendung des Komplexes zusammengefaßt sind. Bei diesen Versuchen hatten die Schweine zu Beginn ein durchschnittliches Gewicht von 24 Pfund und beendeten die Untersuchung mit einem durchschnittlichen Gewicht von 53 Pfund. Jeweils 4 Schweine waren in einem Käfig in einer bezüglich der Umgebung kontrollierten Aufzuchteinrichtung untergebracht und wurden ad libitum mit einer 18% Protein-Mais-Soja-Diät gefüttert. Alle Untersuchungen erstreckten sich über 35 Tage, es wurden 2 bis 3 Versuchseinheiten pro Behandlung verwendet und durchschnittlich 14 Tiere pro Behandlung wurden angewendet.
  • In Tabelle 10 geben die Zahlen in Klammern die Änderung in Prozent bezogen auf die Kontrollgruppe an. Eine negative Prozentänderung in der Spalte "Futter/Zunahme" zeigt eine Verbesserung des Verhältnisses Futter/Zunahme (Futtereffizienz) bei Schweinen, die mit dem A10255-Komplex gefüttert wurden. Tabelle 10 Wirkung von A10255-Komplex auf entwöhnende Schweine Versuch Nr. Durchschnittl. Anfangsgewicht des Schweins Gesamtanzahl Schweine/Behandlung Verbindung Gehalt tägliche Zunahme tägliches Futter Futter/Zunahme Kontrolle
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Futterzusammensetzung zur Erhöhung der Futterverwertungseffizienz und zur Förderung des Wachstums bei entwöhnenden Schweinen. Die Futterzusammensetzung umfaßt Schweinefutter und eine wirksame Menge von A10255-Komplex, A10255-Faktor B, A10255-Faktor C, A10255- Faktor E, A10255-Faktor F, A10255-Faktor G oder A10255-Faktor H.
  • Der Ausdruck "wirksame Menge" bei der Futterzusammensetzung für entwöhnende Schweine bedeutet ungefähr 20 bis ungefähr 40 Teile pro Million des A10255-Komplexes oder des einzelnen Faktors pro Einheit Gesamtfutter. Das Futter, das für die Zuammensetzung für entwöhnende Schweine verwendet wird, ist irgendeine normale Futterration, die für entwöhnende Schweine verwendet wird. Die Futterzusammensetzung kann mit irgendeinem auf dem veterinärpharmazentischen Gebiet wohlbekannten Verfahren formuliert werden.
  • Eine bevorzugte Futterzusammensetzung für entwöhnende Schweine umfaßt Schweinefutter und eine wirksame Menge des A10255-Komplexes.
  • Der A10255-Komplex verbessert auch die Futterverwertungseffizienz bei Wiederkäuern, die eine entwickelte Pansenfunktion haben. Die Erhöhung der Effizienz, die durch A10255-Antibiotika verursacht wird, kann überwacht werden, indem die Produktion und Konzentration von Propionatverbindungen im Pansen beobachtet wird unter Anwendung des von James R. Beck und Joseph A. Yahner in US-Patent Nr. 4 333 923, ausgegeben am 8. Juni 1982, beschriebenen Verfahrens, das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Tabelle 11 zeigt das Verhältnis der Produktion von flüchtigen Fettsäuren (VFA) in mit A10255-Komplex behandelten Kolben zur Produktion in Kontrollkolben, das in diesem Test mit dem Verfahren von Beck und Yahner erhalten wurde. Tabelle 11 Wirkung von A10255-Komplex auf die Futterverwertungseffizienz bei Wiederkäuern¹ Dosierung Propionat Acetat Butyrat Gesamt ¹ Verhältnis der Produktionsraten (mol/d) in behandelten Kolben zu Produktionsraten in Kontrollkolben
  • Die A10255-Verbindungen sind typischerweise wirksam, indem sie Propionat und dadurch die Effizienz der Futterverwertung erhöhen, wenn sie oral an Wiederkäuer verabreicht werden.
  • Die folgende Tabelle 12 faßt Daten zusammen, die die Wirkungen des A10255-Komplexes auf Wachstum und Futterverwertung bei Vieh zeigen. Die Untersuchung wurde über einen Zeitraum von 79 Tagen an drei Gruppen von Tieren durchgeführt. Tabelle 12 Wirkung von A10255-Komplex auf das Wachstum von Rindvieh Gruppe Dosis Gewichtszunahme b Reaktion Futterumwandlung a mg/Kopf/Tag b pro Tag Tiere
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Futterverwertungseffizienz bei Vieh, das umfaßt, daß man an Vieh eine wirksame Menge von A10255-Komplex oder eine wirksame Menge eines A10255-Faktors verabreicht. Ein bevorzugtes Verfahren umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge von A10255-Komplex an Vieh.
  • Gemäß dem hier zur Verfügung gestellten Verfahren zur Förderung des Wachstums bei Vieh wird den Tieren oral eine wirksame Menge des A10255-Komplexes oder eines Faktors davon verabreicht. Der Ausdruck "wirksame Menge" bezieht sich auf etwa 0,05 mg/kg/Tag bis etwa 5,0 mg/kg/Tag. Bevorzugte Raten für die orale Verabreichung sind etwa 0,1 mg/kg/Tag bis etwa 3,0 mg/kg/Tag. Der antibiotische Komplex oder Faktor kann oral mit dem Viehfutter verabreicht werden; er kann jedoch auch auf anderen Wegen verabreicht werden, zum Beispiel als Arzneitrank, Bolus oder Kapsel. Das Vermischen der A10255-Verbindung mit dem Viehfutter ist der bevorzugte Weg der Verabreichung. Die Formulierung dieser verschiedenen Dosierungsformen wird mit auf dem veterinärpharmazentischen Gebiet wohlbekannten Verfahren erreicht.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Futterzusammensetzung zur Erhöhung der Futterverwertung bei Vieh. Die Futterzusammensetzung umfaßt Viehfutter und eine wirksame Menge des A10255-Komplexes oder eines A10255-Faktors. Eine bevorzugte Futterzusammensetzung für Vieh umfaßt Viehfutter und eine wirksame Menge des A10255-Komplexes. Die am meisten bevorzugte Futterzusammensetzung für Vieh umfaßt das Viehfutter und eine wirksame Menge entweder des A10255-Faktors B oder des A10255-Faktors G. Die einzelnen A10255-Faktoren B, C, E, F, G und H scheinen grob minimal bioäquivalent zu sein.
  • Bei den obigen Futterzusammensetzungen für Vieh ist der Ausdruck "wirksame Menge" wie für das Verfahren zur Verbesserung der Futterverwertung bei Vieh definiert. Das Viehfutter, das zusammen mit der Futterzusammensetzung verwendet wird, kann irgendeine übliche Futterration für Vieh sein.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung sind der A10255-Komplex und die Faktoren und insbesondere A10255-Faktor B nützlich zur Identifizierung von Streptomyces-Arten, die ein Gen besitzen, das die Thiostreptonresistenz vermittelt. Eine solche Art kann natürlich ein Thiostreptonresistenzgen haben oder kann ein Thiostreptonresistenzgen nach Transformation mit einem Plasmid oder einem anderen Klonierungsvektor, der ein Thiostreptonresistenzgen enthält, haben. Somit sind A10255B und der A10255-Komplex austauschbar mit dem Antibiotikum Thiostrepton zum Nachweis des Thiostreptonresistenzmarkers bei rekombinanten DNA-Versuchen mit Streptomyces-Stämmen.
  • Genauer werden Protoplasten der Art S. fradiae, S. lividans oder S. griseofuscus mit einem Plasmid (zum Beispiel plJ702 oder pHJL401), das das die Thiostreptonresistenz vermittelnde Gen enthält (C.J. Thompson et al., Nature, 286, S. 525-527 (1980)), transformiert. Die Protoplasten werden auf ein festes Medium, das geeignet ist zur Zellwandregeneration, geimpft und über Nacht (ungefähr 16 Stunden) bei 29ºC inku- A10255 wird zu einer Weichagarüberschichtung zugegeben, die dann auf die Oberfläche der Platte, die die regenerierenden Protoplasten enthält, gegossen wird. Die Menge des für die Überschichtung verwendeten A10255-Antibiotikums muß ausreichend sein, um eine Konzentration von ungefähr 50 ug/ml nach Aufbringung auf das Regenerationsmedium zu liefern. Die Platten werden dann 7 bis 14 Tage bei 29ºC inkubiert, um das Auswachsen der Subpopulation von Zellen zuzulassen, die das von dem Plasmid stammende, die Thiostreptonresistenz vermittelnde Gen enthalten. Unten diesen Bedingungen wachsen Zellen, die das Plasmid nicht erhalten haben, nicht. Die A10255-resistenten Transformanten werden dann in ein Medium überführt, das 50 ug/ml A10255 enthält, was die Erhaltung des Plasmids, das das die Thiostreptonresistenz vermittelnde Gen trägt, sicherstellt.
  • Die antimikrobiellen Verbindungen (d. h. A10255-Komplex und einzelne Faktoren) der Erfindung sind geeignet für die therapeutische oder prophylaktische Behandlung von Infektionen bei Warmblütern, die durch pathogene Bakterien verursacht werden. Die antimikrobiellen Verbindungen können oral, parenteral (zum Beispiel intravenös, intramuskulär oder subkutan) oder als topische Salbe oder Lösung verabreicht werden zur Behandlung bakterieller Infektionen bei Warmblütern.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen des A10255-Komplexes oder der einzelnen Faktoren. Diese Zuammensetzungen setzen sich aus einer therapeutisch aktiven Menge der jeweiligen antibiotischen Verbindung (d. h. des A10255-Komplexes oder von Faktor B, Faktor C, Faktor E, Faktor F, Faktor G oder Faktor H, jeweils separat) und einem geeigneten Träger zusammen. Bezogen auf Zusammensetzungen für die orale Verabreichung (zum Beispiel Tabletten und Kapseln) bedeutet der Ausdruck "geeigneter Träger" übliche Hilfsstoffe wie Bindemittel, zum Beispiel Sirup, Gummi arabikum, Gelatine, Sorbit, Traganth, Polyvinylpyrrolidon (Povidone), Methylcellulose, Ethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Saccharose und Stärke; Füllstoffe und Träger, zum Beispiel Maisstärke, Gelatine, Lactose, Saccharose, mikrokristalline Cellulose, Kaolin, Mannit, Dicalciumphosphat, Natriumchlorid und Alginsäure; Trennmittel wie Natriumcroscarmellose, mikrokristalline Cellulose, Maisstärke, Natriumstärkeglykolat, Alginsäure, und wechselseitige Benetzungsmittel wie Natriumlaurylsulfat und Gleitmittel wie Magnesiumstearat und andere metallische Stearate, Stearinsäure, Silikonflüssigkeit, Talkum, Wachse, Öle und kolloidales Siliciumoxid. Aromatisierungsmittel wie Pfefferminz, Goultheriaöl, Kirscharoma oder dergleichen können auch verwendet werden. Es kann wünschenswert sein, einen Farbstoff zuzugeben, um der Dosierungsform ein ansprechendes Äußeres zu geben oder die Identifizierung des Produktes zu erleichtern. Die Tabletten können auch mit auf diesem Gebiet wohlbekannten Verfahren beschichtet werden.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch in Form von oralen flüssigen Präparaten sein, die entweder a) wäßrige oder ölige Suspensionen, Lösungen, Emulsionen oder Sirupe oder b) trockenes Pulver, das mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung rekonstituiert werden kann, sind. Im Zusammenhang mit solchen oralen flüssigen Präparaten bedeutet der Ausdruck "geeigneter Träger" übliche Additive wie Suspensionsmittel, zum Beispiel Sorbit, Sirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Aluminiumstearatgel oder hydrierte eßbare Öle, zum Beispiel Mandelöl, fraktioniertes Kokosnußöl, Ölester, Propylenglykol oder Ethylalkohol, und Konservierungsmittel wie Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch für intravenöse (IV) Verwendung vorgesehen sein. Genauer kann eine wasserlösliche Form der antibiotischen Verbindung in einer der üblicherweise verwendeten intravenösen Flüssigkeiten gelöst werden und durch Infusion verabreicht werden. Im Zusammenhang mit Zusammensetzungen für IV-Verwendung bedeutet der Ausdruck "geeigneter Träger" Flüssigkeiten wie physiologische Kochsalzlösung, Ringer-Lösung oder 5%-ige Dextroselösung.
  • Für intramuskuläre Präparate kann eine sterile Formulierung eines geeigneten Salzes der antibiotischen Verbindung (zum Beispiel das Hydrochloridsalz oder Natriumsalz) mit einem "geeigneten Träger" formuliert werden. Beispiele solcher sterilen Präparate sind ein geeignetes Salz entweder gelöst in einem pharmazeutischen Verdünnungsmittel (zum Beispiel Wasser-zur-Injektion, physiologische Kochsalzlösung, 5% Glucose) oder suspendiert in einem wäßrigen Grundstoff oder einem pharmazeutisch annehmbaren Ölgrundstoff (zum Beispiel einem Ester einer langkettigen Fettsäure wie Ethyloleat).
  • Topische Zusammensetzungen können mit "geeigneten Trägern" wie hydrophoben oder hydrophilen Grundstoffen formuliert werden. Solche Grundstoffe schließen Salben, Cremes oder Lotionen ein.
  • Veterinärpharmazeutische Zusammensetzungen der antibiotischen Verbindungen können mit dem Futter oder dem Trinkwasser von Nutztieren verabreicht werden. Alternativ können die Verbindungen als Intramammärpräparate mit "geeigneten Trägern" wie Grundstoffen mit Langzeit- oder Kurzzeitfreisetzung formuliert werden.
  • Die antibiotischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Einheitsdosierungsform in sterilen Glasfläschchen, sterilen Kunststoffbeuteln, die ein Septum aufweisen, oder sterilen, hermetisch versiegelten Ampullen formuliert werden. Die antibiotische Verbindung (oder das entsprechende pharmazeutisch annehmbare Salz) kann ein trockenes Pulver sein oder in kristalliner oder lyophilisierter Form sein. Die Menge der antibiotischen Verbindung pro Einheitsdosierung kann im Bereich von etwa 250 mg bis etwa 10 g variieren.
  • Eine "therapeutisch wirksame Menge" der antibiotischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist etwa 3,5 mg bis etwa 50 mg Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht. Diese Menge ergibt im allgemeinen etwa 1 g bis etwa 27 g pro Tag für einen erwachsenen Menschen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung oder Kontrolle infektiöser Erkrankungen, die durch gram-positive und gram-negative Organismen bei Warmblütern verursacht werden. Dieses Verfahren umfaßt, daß man dem Tier eine therapeutisch wirksame Menge der vorliegenden antibiotischen Verbindungen verabreicht. Eine typische tägliche Dosis für einen erwachsenen Menschen bei diesem Verfahren ist etwa 1 g bis etwa 12 g.
  • Bei Durchführung dieses Verfahrens kann die antibiotische Verbindung in einer einzigen täglichen Dosis oder in mehreren Dosen pro Tag verabreicht werden. Der Behandlungsplan kann die Verabreichung über einen verlängerten Zeitraum erfordern, zum Beispiel mehrere Tage oder 2 bis 3 Wochen. Die pro Dosis verabreichte Menge oder die verabreichte Gesamtmenge hängt ab von Faktoren wie Art und Schwere der Infektion, Alter und allgemeiner Gesundheitszustand des Patienten und Toleranz der antibiotischen Verbindung sowohl durch den Patienten als auch den Mikroorganismus oder die Mikroorganismen, die die Infektion verursachen.
  • Als weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Tierfuttervormischung zur Verfügung gestellt, die als aktiven Inhaltsstoff A10255-Komplex oder Faktor B, C, E, F, G oder H in irgendeiner Kombination oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem geeigneten Träger umfaßt. Der Fachmann weiß natürlich, welche Träger ausgewählt werden können.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von A10255-Komplex zur Verfügung gestellt, das umfaßt, daß man a) Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces gardneri 18260, Streptomyces gardneri 15922 oder eine A10255-produzierende Mutante davon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersfermentationsbedingungen züchtet, bis der antibiotische A10255-Komplex erzeugt wird; b) gegebenenfalls den A10255-Komplex von dem Kulturmedium abtrennt und
  • c) gegebenenfalls einen oder mehrere der antibiotischen A10255-Faktoren B, C, E, F, G und H aus dem abgetrennten A10255-Komplex isoliert.
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern. Der Schutzbereich der Erfindung soll nicht durch eines der folgenden Beispiele beschränkt werden.
    • Experimenteller Abschnitt Beispiel 1
  • Das folgende Medium wurde hergestellt zur Verwendung für die Schrägagarkultur des A10255-produzierenden Mikroorganismus:
    • Herstellung von A10255-Komplex
  • Inhaltsstoff Menge (g/l)
  • vorgekochtes Hafermehl 60,0
  • Hefe 2,5
  • K&sub2;HPO&sub4; 1,0
  • KCl 0,5
  • MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,5
  • FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,1
  • deionisiertes Wasser q.s. auf 1 l
  • Der pH des entstehenden Mediums wurde auf 7,3 eingestellt mit wäßrigem Natriumhydroxid. Das Medium wurde dann autoklaviert, was ein steriles Medium mit einem pH von 6,7 lieferte.
  • Sporen von S. gardneri NRRL 15537 wurden auf einen Nährschrägagar, der aus dem oben sterilisierten Medium bestand, geimpft. Der beimpfte Schrägagar wurde 7 bis 10 Tage bei einer Temperatur von 30ºC inkubiert. Die reife Schrägagarkultur wurde dann mit Kälberserum bedeckt und mit einem sterilen Werkzeug abgeschabt, um Sporen und Myzel zu lockern. Die entstehende Suspension wurde in kleine Röhrchen überführt und zur Konservierung lyophilisiert. Ein lyophilisiertes Pellet wurde verwendet, um ein steriles vegetatives Kulturmedium (50 ml, in einem 250 ml Weithals-Erlenmeyer-Kolben) der folgenden Zusammensetzung zu impfen:
  • Inhaltsstoff Menge (g/l)
  • Glucose 15,0
  • Dextrin 20,0
  • Sojabohnenkleie 10,0
  • Maiseinweichwasser 10, 0
  • Hefeextrakt 1,0
  • CaCO&sub3; 2,0
  • Leitungswasser q.s. auf 1 l
  • Der pH des Mediums wurde auf 6,7 eingestellt mit wäßrigem Natriumhydroxid. Das Medium wurde autoklaviert, was den pH des Mediums auf 6,8 bis 7,0 erhöhte.
  • Das beimpfte vegetative Medium wurde 48 Stunden bei 30ºC inkubiert auf einem Schüttler, der sich mit einem Bogen mit 2 inch Durchmesser mit 250 Upm drehte. Die entstehende vegetative Mediumkultur wurde verwendet, um entweder kleine Fermenter zu beimpfen (wobei das Inokulum etwa 1 Volumen-% bezogen auf Fermentermedium ist) oder um Kolben der zweiten Stufe für die Produktion eines größeren Volumens von Inokulum zu beimpfen.
    • "Anstoß"-Medium
  • Zwei Weithals-Erlenmeyer-Kolben (2 l Fassungsvermögen) wurden mit einem Medium beschickt (jeweils 400 ml), das die folgende Zusammensetzung hatte:
  • Inhaltsstoff Menge (g/l)
  • Glucose 15,0
  • Dextrin 20,0
  • Sojabohnenkleie 15,00
  • Maiseinweichwasser 10,0
  • Hefeextrakt 1,0
  • CaCO&sub3; 5,0
  • Leitungswasser q.s. auf 1 l
  • Das Medium in jedem Erlenmeyer-Kolben wurde mit der obigen vegetativen Kultur beimpft. Das Volumen des Inokulums war 2,5 Volumen-% bezogen auf das Medium in dem Erlenmeyer-Kolben. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei 30ºC inkubiert auf einem Schüttler, der mit 250 Upm und einer Platte mit einem Winkel von 10º kreiste, um eine "Anstoß"-Kultur zu liefern.
    • Fermentation im großen Maßstab
  • Ein Teil der obigen "Anstoß"-Kultur (800 ml) wurde verwendet, um das folgende Medium (100 l) zu beimpfen:
  • Inhaltsstoff Menge (g/l)
  • Entschäumer * 0,200
  • Propylenglykol (MW2000) 2,000 ml
  • Propylenglykol (MW2000) 10,000
  • Glycerin 40,000
  • Bacto-Pepton ** 10,000
  • Kasein 10,000
  • NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O 0,100
  • Restmelasse 40,000
  • CaCO&sub3; 2,500
  • Leitungswasser q.s. auf 100 l
  • * Dow-Corning Entschäumer
  • ** Fleischhydrolysat (Difco Laboratories, Detroit, MI)
  • Das Medium war in einem 165-l-Fermenter enthalten. Der pH des Mediums wurde mit 5N wäßrigem Natriumhydroxid auf 6,9 eingestellt. Die Mischung wurde 45 Minuten mit 17 bis 19 psi bei 121ºC sterilisiert. Nach dem Sterilisierungsverfahren hatte das Medium einen pH von 7,0. Das sterilisierte Medium wurde mit steriler Luft mit einer Rate von 0,125 V/V/m belüftet, mit einem üblichen Rührer mit 200 Upm gerührt und etwa 6 Tage bei einer Temperatur von 30ºC fermentieren gelassen.
    • Beispiel 2 Isolierung des antibiotischen A10255-Komplexes
  • Die gesamte Fermentationsbrühe (3780 l) wurde filtriert unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-Cel, Johns-Manville Products Corp.). Der die Myzelien enthaltende Filterkuchen wurde mit 300 l Wasser gewaschen, dann wurden die Myzelien zweimal mit Aceton:Wasser (4 : 1) extrahiert. Der erste Extrakt war 900 l, der zweite 800 l. Die Extrakte wurden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 450 l einer wäßrigen Lösung eingeengt. Der pH der Lösung wurde auf 3,0 mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt, dann dreimal mit Ethylacetat extrahiert (Extraktvolumina 165 l, 280 l bzw. 225 l). Die Extrakte und die wäßrige Phase wurden auf biologische Aktivität analysiert mit einem Papierscheibentest auf Agarplatten, die mit B. subtilis 6633 beimpft waren. Die Extrakte wurden vereinigt und auf ein Volumen von 23 l eingeengt unter vermindertem Druck. Die Feststoffe, die während der Einengung ausgefallen waren, wurden durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet, was 216 g A10255-Antibiotikumkomplex lieferte (Test: 90,7 g Aktivität). Das Filtrat wurde weiter auf 900 ml eingeengt und dann filtriert. Der zweite Niederschlag wurde im Vakuum getrocknet, was 16,2 g A10255-Antibiotikumkomplex lieferte (Test: 9,1 g Aktivität).
    • Beispiel 3 Auftrennung der Faktoren des A10255-Antibiotikumkomplexes
  • A10255-Komplex (20 g) wurde in Chloroform:Methanol (9 : 1, 400 ml insgesamt) gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde auf eine Säule aus rostfreiem Stahl (8·100 cm), die mit 13 bis 24 micron LPS-1 Silicagel (4 l, Whatman Chemical Separation Inc., Clifton, New Jersey) gepackt war, aufgegeben. Die Säule war Teil einer Chromatospac Prep-100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal 91160, Longjumeau, Frankreich). Eine Reihe von 240 ml Fraktionen wurde von der Säule gesammelt, die mit 60 ml/Minute Durchflußrate eluiert wurde, zuerst mit einer 9 : 1 Chloroform:
  • Methanol-Mischung (7 l), dann mit einer 3 : 1 Chloroform:Methanol-Mischung (15 l). Während der Chromatographie wurde der HPLC-Detektor auf 280 nm gesetzt. Alle Fraktionen wurden auf Agarplatten, die mit Micrococcus luteus ATCC 9341 beimpft waren, gebracht, um die biologische Aktivität nachzuweisen. Die folgenden Fraktionen wurden vereinigt: Fraktionen Faktoren Ausbeute
  • Der Pool, der die Faktoren B und E enthielt, wurde auf 400 ml eingeengt. Der entstehende Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, im Vakuum getrocknet, was 5,86 g Material lieferte, das hauptsächlich aus Faktor B mit einer geringen Menge Faktor E bestand. (Test: 3,6 g Aktivität.) Der Überstand der Ausfällung wurde wiederum eingeengt. Das Konzentrat wurde zu Diethylether zugegeben, was 0,64 g Niederschlag lieferte, der eine ähnliche Mischung der Faktoren B und E enthielt (Test: 0,3 g Aktivität).
    • Beispiel 4 Isolierung des Antibiotikumfaktors A10255B
  • Ein 1,5 g Anteil des Materials der Fraktionen 30-63 im obigen Beispiel 3 wurde in einer Mischung von Tetrahydrofuran: Wasser (35 : 65, 150 ml) gelöst. Die Probe wurde auf eine Säule aus rostfreiem Stahl (8·100 cm), die mit LPI-C18 Reversed Phase Silicagel (4 l) gepackt war, aufgetragen. (Das Silicagel wurde hergestellt mit einem Verfahren, wie es in den Beispielen 6 und 7 von B.J. Abbott et al., US-Patent Nr. 4 299 763, ausgegeben am 10. Nov. 1981, beschrieben ist.) Die Säule wurde mit einer Durchflußrate von 60 ml/min mit einer Mischung von Tetrahydrofuran:Wasser:Dinatriumhydrogenphosphat (3 : 7 : 0,05M, 12 l, pH 7,8 (Phosphorsäure)) eluiert und 240 Fraktionen gesammelt. Der HPLC-Detektor wurde auf 280 nm gesetzt während der Chromatographie. Einzelne Fraktionen wurden mit analytischer HPLC untersucht.
  • (Die analytische HPLC wurde auf einer Säule aus rostfreiem Stahl mit 4,6·250 nm mit Reversed Phase Material Ultrasphere ODS 5 um (altex Scientific Inc., Berkeley, CA) durchgeführt. Die Säule wurde mit einer Durchflußrate von 1 ml/min mit einer Mischung von Tetrahydrofuran:Wasser: Natriumhydrogenphosphat (1 : 2 : 0,05M, mit einem pH von 7,8 durch Zugabe von Phosphorsäure) eluiert. Der Detektor wurde auf 254 nm während der Chromatographie eingestellt.) Fraktionen Faktoren Ausbeute
  • Die Fraktionen wurden wie folgt gesammelt:
  • Der die Fraktionen 24-35 enthaltende eingeengte Pool wurde auf 300 ml mit deionisiertem Wasser verdünnt und der pH der entstehenden Mischung wurde mit Phosphorsäure auf 3,0 eingestellt. Die Lösung wurde mit einer 7 : 3-Mischung von Chloroform:Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockne eingeengt und mit HPLC chromatographiert. Die HPLC wurde durchgeführt mit einer Michel-Miller Hochleistungniedrigdruckflüssigchromatographie-("HPLPLC")-Glassäule (wie beschrieben bei K. Michel et al., US-Patent Nr. 4 131 547, ausgegeben am 26. Dez. 1978), die einen Silicagelträger enthielt (100-200 Woelm Pharma). Die Säule wurde mit einer Mischung von Chloro- (7 : 3) eluiert. Der HPLC-Monitor wurde während der Chromatographie auf 254 nm gesetzt. Die Fraktionen, die das Haupt-UV-Chromophor enthielten, wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und lyophilisiert, was 659 mg Faktor B ergab.
    • Beispiel 5 Reinigung von Antibiotikumfaktor A10255E
  • Der Pool der Fraktionen 38-45 von Beispiel 4 wurde mit den Pools mit ähnlicher Zusammensetzung aus fünf zusätzlichen Chromatographiedurchläufen derselben Art auf LPI-C&sub1;&sub8; Träger von Beispiel 4 vereinigt. Der pH der vereinigten Pools (800 ml) wurde auf pH 3,0 mit Phosphorsäure eingestellt. Die vereinigten Pools wurden mit einer 7 : 3-Mischung Chloroform:Methanol extrahiert (2·, 800 ml), dann mit einer weiteren kleineren Menge (400 ml) der Lösungsmittelmischung. Die Extrakte wurden vereinigt, zur Trockne eingeengt und in 50 ml einer CHCl&sub3;:MeOH-Mischung (7 : 3, 500 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf eine 5,1·42 cm Michel-Miller HPLPLC-Glassäule, die einen Silicagelträger enthielt (500 ml, 100-200 um, Woelm) aufgetragen. Die Säule wurde mit einer Mischung von 7 : 3 (V:V) Chloroform:Methanol eluiert und das Haupt-UV-Chromophor (254 nm) wurde gesammelt und zur Trockne gebracht, was 349 mg reinen Faktor E lieferte.
    • Beispiel 6 Reinigung der Antibiotikumfaktoren C und F
  • Das aus dem Pool der Fraktionen 11-23 in Beispiel 3 erhaltene getrocknete Präparat (0,68 g) wurde mit Präparaten vereinigt, die auf die gleiche Weise erhalten worden waren, was insgesamt 3,03 g Feststoff ergab. Dieses Material wurde in einer Mischung von Tetrahydrofuran:Wasser (6 : 4) gelöst und die Lösung wurde auf Reversed Phase Silicagel (4 l) in einer Säule aus rostfreiem Stahl (8·100 cm) chromatographiert und mit einer Durchflußrate von 60 ml/min mit einer Mischung von 3 : 7 Tetrahydrofuran:Wasser (39 l) eluiert und bei 280 nm überwacht. Die gesammelten 480 ml Fraktionen wurden auf Agarplatten, die mit Micrococcus luteus ATCC 9341 beimpft waren, gebracht, um die biologische Aktivität nachzuweisen. Biologisch aktive Fraktionen wurden weiter analysiert mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Analyse-HPLC-System. Die Fraktionen wurden wie folgt gesammelt: Fraktionen Faktoren Ausbeute unbekannt (unrein) (rein)
  • Jeder Pool wurde eingeengt und der entstehende Niederschlag wurde auf einem Filter gesammelt und im Vakuum getrocknet.
    • Beispiel 7
  • Das Schrägagarmedium, das in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde verwendet, um den A10255-produzierenden Mikroorganismus 18260 zu züchten.
  • Es wurde ein lyophilisiertes Pellet aus dem obigen Verfahren verwendet, um steriles vegetatives Kulturmedium (50 ml, enthalten in einem 250 ml Weithals-Erlenmeyer-Kolben) mit der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:
  • Inhaltsstoff Menge (g/l)
  • Trypticase-Sojabrühe 30,0
  • Enzym-hydrolysiertes Kasein (Universal Foods, Juneau, WI) 5,0
  • Glucose 5,0
  • Glycerin 10,0
  • Dextrin 10,0
  • CaCO&sub3; 10,0
  • Leitungswasser q.s. auf 1 l
  • Der pH des Mediums wurde mit wäßrigem Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt vor dem Autoklavieren.
  • Das beimpfte vegetative Medium wurde 72 Stunden bei 30ºC inkubiert auf einem Schüttler, der mit einem Bogen von 2 inch Durchmesser mit 250 Upm kreiste. Die entstehende vegetative Mediumkultur wurde entweder verwendet, um kleine Fermenter zu beimpfen (wobei das Inokulum ungefähr 1 Volumen-% bezogen auf Fermentermedium ausmachte) oder um Kolben in zweiter Stufe zu beimpfen für die Herstellung eines größeren Volumens an Inokulum.
    • "Anstoß"-Medium
  • Zwei Weithals-Erlenmeyer-Kolben (2 l Fassungsvermögen) wurden mit einem Medium (jeweils 400 ml) beschickt, das identisch war mit dem oben beschriebenen vegetativen Medium.
  • Das Medium in jedem Erlenmeyer-Kolben wurde mit der obigen vegetativen Kultur beimpft. Das Volumen des Inokulums war insgesamt 2,5 Volumen-% bezogen auf das Medium in dem Erlenmeyer-Kolben. Das beimpfte Medium wurde 48 Stunden bei 30ºC inkubiert auf einem Schüttler, der mit 250 Upm in einem Winkel von 10º von der Horizontalen kreiste, was eine "Anstoß"-Kultur lieferte.
    • Fermentation in großem Maßstab
  • Ein Teil der obigen "Anstoß"-Kultur (800 ml) wurde verwendet, um das folgende Medium (100 l) zu beimpfen:
  • Inhaltsstoff Menge (g/l)
  • Sag 471 0,2
  • P-2000 0,1
  • Glucose 1,0
  • NH&sub4;Cl 1,0
  • Na&sub2;SO&sub4; 2,0
  • ZnCl&sub2; 0,019
  • MgCl&sub2;·6H&sub2;O 0,304
  • FeCl&sub3; 0,062
  • MnCl&sub2;·4H&sub2;O 0,035
  • CaCl&sub2; 0,06
  • CuCl&sub2;·2H&sub2;O 0,005
  • KH&sub2;PO4* 0,67
  • Leitungswasser q.s. auf 110 l
  • * Getrennt sterilisiert in deionisiertem H&sub2;O, nachdem es auf pH 6,0 mit KOH eingestellt wurde.
  • Das Medium war in einem 165-l-Fermenter enthalten. Die Mischung wurde durch Anwendung von 20 Fo Heizeinheiten dampfsterilisiert (wobei 1 Fo genau 1 Minute bei 121ºC entspricht). Nach dem Sterilisationsverfahren hatte das Medium einen pH von 8,3. Der pH nach KH&sub2;PO&sub4;-Zugabe war 7,0. Das sterilisierte Medium wurde mit steriler Luft belüftet und mit einem üblichen Rührer gerührt, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff bei 45% Luftsättigung bei 5 psi über dem atmosphärischen Druck zu halten, und etwa 7 Tage bei einer Temperatur von 30ºC fermentieren gelassen.
  • Während der Fermentation in großem Maßstab, wie oben ausgeführt wurde gefunden, daß es wirkungsvoll ist, die Fermentationsmischung mit Glucose mit einer Rate von 5,7 g/l/Tag "anzureichern". Kaseinhydrolysat wurde ebenso nach 17 Stunden mit 4,5 g/l/Tag zugeführt.
    • Beispiel 8 Isolierung des Antibiotikumfaktors A10255G
  • Ein Anteil von 1,0 g des Antibiotikumkomplexes von Beispiel 2 wurde in 2 l H&sub2;O:CH&sub3;CN (4 : 1) mit pH 6,0 gelöst. Diese Lösung wurde unter Verwendung einer C18 Kartusche-Säule auf Waters Prep 500 aufgetragen. Die Säule wurde unter Verwendung eines flachen linearen Gradienten von 4 l (A) H&sub2;O:CH&sub3;CN:THF:HOAc (70 : 30 : 5 : 0,5) bis 4 l (B) H&sub2;O:CH&sub3;N:THF:HOAc (65 : 35 : 5 : 0,5) mit einer Durchflußrate von 250 ml pro Minute eluiert, wobei eine Fraktion pro Minute gesammelt wurde. Anschließend wurden 2 l Lösungsmittel (B) aufgetragen. Das Säulenelulat wurde bei 280 nm überwacht. Sieben weitere Durchläufe wurden gemacht unter Anwendung identischer Bedingungen. Die Pools, die eine Mischung der Faktoren C und G enthielten, wurden vereinigt, der pH wurde unter Verwendung von 5N NaOH auf 6,0 eingestellt, mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt (auf ein Gesamtvolumen von 26 l) und in zwei separaten Durchläufen chromatographiert unter Verwendung von jeweils 13 l. Diese Durchläufe wurden auch auf einer C18 Kartusche-Säule auf Waters Prep 500 durchgeführt. Ein linearer Gradient von 4 l Lösungsmittel (A) 0,05N NH&sub4;OAc (pH 5,5):CH&sub3;CN (75 : 25) bis 4 l Lösungsmittel (B) 60 : 40 wurden für die Chromatographie verwendet, und anschließend wurden 2 l Lösungsmittel (B) angewendet. Die verwendete Durchflußrate war 250 ml pro Minute und pro Minute wurde eine Fraktion gesammelt. Die Fraktionen, die hauptsächlich Faktor G enthielten, wurden vereinigt, unter Verwendung eines gleichen Volumens Wasser verdünnt und nochmals auf einer C18 Kartusche-Säule chromatographiert unter Verwendung von Prep 500. Der folgende lineare Gradient wurde verwendet: (A) 4 l H&sub2;O:CH&sub3;CN:THF:HOAc (70 : 30 : 5 : 0,5) bis (B) 4 l (65 : 35:5:0,5), mit derselben Durchflußrate wie oben beschrieben. Die Fraktionen, die nur Faktor G enthielten, wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt zu einer wäßrigen Lösung. Der ausgefällte Faktor G wurde dann durch Zentrifugation abgetrennt, mit Wasser gewaschen, in Wasser suspendiert und lyophilisiert, was 686 mg Faktor G lieferte.
    • Beispiel 9 Isolierung des Antibiotikumfaktors A10255H
  • Ein Anteil von 1,0 g des Antibiotikumkomplexes von Beispiel 2 wurde in 2 l H&sub2;O:CH&sub3;CN (4 : 1) mit pH 5,0 gelöst und durch Glaswolle in einem Filtertrichter filtriert. Die Lösung wurde auf eine C18 Kartusche-Säule auf einem Waters Prep 500 aufgetragen. Die Säule wurde eluiert unter Verwendung eines linearen Gradienten von 4 l (A) H&sub2;O:CH&sub3;CN:THF:HOAc (70 : 30 : 5 : 0,5) bis 4 l (B) 65 : 35 : 5 : 0,5 mit einer Durchflußrate von 250 ml pro Minute, wobei pro Minute eine Fraktion gesammelt wurde. Anschließend wurden 2 l Lösungsmittel (B) angewendet.
  • Das Säuleneluat wurde bei 280 nm überwacht. Dreizehn zusätzliche Durchläufe wurden gemacht unter Verwendung der identischen Bedingungen. Alle Pools, die Faktor H enthielten, wurden vereinigt (17 l), eingeengt und im Vakuum getrocknet, was 690 mg rohen Faktor H ergab. Dieses Material wurde mit 329 mg eines ähnlichen Präparats vereinigt, in 3 l H&sub2;O:CH&sub3;CN:THF (75 : 20 : 5) mit pH 6,0 gelöst und auf eine C18 Kartusche-Säule, wie oben beschrieben, aufgetragen. Ein linearer Gradient von 4 l Lösungsmittel (A) 0,05M NH&sub4;OH:CH&sub3;CN (75 : 25) bis 4 l Lösungsmittel (B) 0,05M NH&sub4;OH:CH&sub3;CN (60 : 40) wurde für die Chromatographie verwendet. Anschließend wurden 2 l Lösungsmittel (B) verwendet. Durchflußrate und Fraktionsvolumen waren ebenso wie oben beschrieben. Die Fraktionen, die Faktor H enthielten, wurden vereinigt (750 ml), zu einem gleichen Volumen Wasser zugegeben und wiederum auf eine C18 Kartusche-Säule, wie oben beschrieben aufgetragen. Die Säule wurde entwickelt mit einem linearen Gradienten von 4 l (A) H&sub2;O:CH&sub3;CN:THF:HOAc (75 : 25 : 5 : 0,5) bis 4 l (B) H&sub2;O:CH&sub3;CN:THF:HOAc (60 : 40 : 5 : 0,5), wobei jede Minute eine 250 ml Fraktion gesammelt wurde. Die den Faktor H enthaltenden Fraktionen 23-29 wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt auf ein Volumen von 450 ml. Der ausgefällte Faktor H wurde durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, was 285 mg Faktor H ergab.
    • Beispiel 10 Futterzusammensetzung zur Förderung des Wachstums bei Vieh
  • Der A10255-Komplex oder seine einzelnen Faktoren können oral an Vieh verabreicht werden, indem eine wirksame Menge des Komplexes oder des Faktors mit dem Futter vermischt wird. Zum Beispiel ist ein Aspekt der Erfindung eine Standardfutterration der Zusammensetzung:
  • Inhaltsstoff Menge
  • Maissilage (ganze Pflanze, Ähre intakt) 50%
  • Mais mit hoher Feuchtigkeit 44%
  • Ergänzung (insgesamt) 6%
  • wobei die Ergänzung sich wie folgt zusammensetzt:
  • Inhaltsstoff Menge
  • Alfalfamehl (entwässert, 17%) 12,00%
  • Sojaölmehl (lösungsmittelextrahiert) 45,40%
  • Harnstoff, Futterqualität 5,00%
  • Dicalciumphosphat 8,00%
  • Salz 10,00%
  • Calciumcarbonat 11,00%
  • Spurenmineralvormischung 0,80%
  • Vitamin A + D3 Vormischung 1,40%
  • Vitamin E Vormischung 1,40%
  • Kaliumchlorid 5,00%
  • Vor der Verabreichung wurde die Standardration mit einer A10255-Komplex enthaltenden Vormischung vermischt. Die Vormischung setzte sich aus den folgenden Inhaltsstoffen zusammen:
  • Inhaltsstoff Menge
  • Maiskörner 48,00%
  • Grit-O-Cobs 20/40 50,00%
  • Mineralöl 2,00%
  • 100,00%
  • Die Vormischung wurde zuerst mit dem A10255-Komplex gemischt mit einer Anwendungsrate von zum Beispiel 275 mg/Kopf/Tag oder 550 mg/Kopf/Tag (was sich in diesem speziellen Versuch umrechnet in 28,6 bzw. 61,7 g/Tonne). Die A10255-Komplex enthaltende Vormischung wird dann oben auf die obige Standardfutterration aufgebracht (und anschließend vermischt) mit einer Aufbringungsrate von 0,35 lb/Kopf/Tag.
    • Beispiel 11
  • Das folgende Medium wurde hergestellt zur Verwendung für die Schrägagarkultur des A10255.2-produzierenden Mikroorganismus:
    • Produktion von A10255-Komplex
  • Inhaltsstoff Menge (g/l)
  • vorgekochtes Hafermehl 60,0
  • Hefe 2,5
  • K&sub2;HPO&sub4; 1,0
  • KCl 0,5
  • MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,5
  • FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,1
  • Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 l
  • Der pH des entstehenden Mediums wurde mit wäßrigem Natriumhydroxid auf 7,3 eingestellt. Das Medium wurde dann autoklaviert, was ein sterilisiertes Medium mit einem pH von 6,7 lieferte.
  • Sporen von 8. gardneri NRRL 15922 wurden auf einen Nährschrägagar, der aus dem obigen sterilisierten Medium zusammengesetzt war, geimpft. Der beimpfte Schrägagar wurde 7 bis 10 Tage bei einer Temperatur von 30ºC inkubiert. Die reife Schrägagarkultur wurde dann mit Kälberserum bedeckt und mit einem sterilen Werkzeug abgeschabt, um die Sporen und Myzelien zu lockern. Die entstehende Suspension wurde in kleine Röhrchen überführt und zur Konservierung lyophilisiert. Ein lyophilisiertes Pellet wurde verwendet, um ein steriles vegetatives (50 ml, enthalten in einem 250 ml Weithals-Erlenmeyer-Kolben) mit der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:
  • Inhaltsstoff Menge (g/l)
  • Glucose 15,0
  • Dextrin 20,0
  • Sojabohnenkleie 10,0
  • Maiseinweichwasser 10,0
  • Hefeextrakt 1,0
  • CaCO&sub3; 2,0
  • Leitungswasser q.s. auf 1 l
  • Der pH des Mediums wurde mit wäßrigem Natriumhydroxid auf 6,7 eingestellt. Das Medium wurde autoklaviert, was den pH des Mediums auf 6,8 bis 7,0 erhöhte.
  • Das beimpfte vegetative Medium wurde 48 Stunden bei 30ºC inkubiert auf einem Schüttler, der mit einem Bogen von 2 inch Durchmesser mit 250 Upm kreiste. Die entstehende vegetative Mediumkultur wurde verwendet, entweder um kleine Fermenter zu beimpfen (wobei das Inkolum etwa 1 Volumen-% bezogen auf Fermentermedium ausmachte) oder um Kolben der zweiten Stufe zu beimpfen zur Produktion eines größeren Volumens Inokulum.
    • "Anstoß"-Medium
  • Zwei Weithals-Erlenmeyer-Kolben (2 l Fassungsvermögen) wurden mit einem Medium (jeweils 400 ml) der folgenden Zusammensetzung beschickt:
  • Inhaltsstoff Menge (g/l)
  • Glucose 15,0
  • Dextrin 20,0
  • Sojabohnenkleie 15,0
  • Maiseinweichwasser 10,0
  • Hefeextrakt 1,0
  • CaCO&sub3; 5,0
  • Leitungswasser q.s. auf 1 l
  • Das Medium in jedem Erlenmeyer-Kolben wurde mit 2,5 Volumen-% der obigen vegetativen Kultur beimpft. Das beimpfte Medium wurde bei 30ºC 23 Stunden auf einem Schüttler, der mit 250 Upm kreiste, beimpft, was eine "Anstoß"-Kultur lieferte.
    • Fermentation in großem Maßstab
  • Ein Teil der: obigen "Anstoß"-Kultur (800 ml) wurde verwendet, um das folgende Medium (115 l) zu beimpfen:
  • Inhaltsstoff Menge (g/l)
  • Entschäumer * 0,200
  • Propylenglykol (MW2000) 2,000 ml
  • Glucose 1,000
  • Kasein 16,000
  • NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O 0,100
  • Restmelasse 40,000
  • CaCO&sub3; 5,000
  • Leitungswasser q.s. auf 110 l
  • * Sag 471, Silikonentschäumungsmittel, Dow- Corning Co.
  • Das Medium war in einem 165-l-Fermenter enthalten. Der pH des Mediums wurde auf 6,9 eingestellt mit 5N wäßrigem Natriumhydroxid. Die Mischung wurde 45 Minuten bei 17 bis 19 psi bei 121ºC sterilisiert. Nach dem Sterilisierungsverfahren hatte das Medium einen pH von 6,8. Das sterilisierte Medium wurde mit steriler Luft mit einer Rate von 0,5 V/V/m belüftet und mit üblichen Rührern mit einer Anfangsrate von 300 Upm gerührt und etwa 7 Tage bei einer Temperatur von 30ºC fermentieren gelassen. Während des Fermentationszeitraumes wurde der pH auf 7,0 gehalten, der Gehalt an gelöstem Sauerstoff wurde auf 45% Luftsättigung gehalten und Glucose wurde dem Medium mit einer konstanten Rate von 3,5 bis 4,0 g/l/Tag zugeführt. Nach 24 Stunden wurde dem Medium auch Hy Case Amino (saures Kaseinhydrolysat, Humko Sheffield Chemical Co., Lyndhurst, NJ) mit einer konstanten Rate von 3 g/l/Tag zugeführt.
  • Der rohe A10255-Komplex wurde isoliert auf gleiche Weise wie in Beispiel 13 unten.
    • Beispiel 12 Fermentation mit großem Volumen des A10255.2-Stammes Vegetatives Inokulum
  • Als Ausgangspunkt für eine Fermentation mit großem Volumen des A10255.2-Stammes (d. h. größere Volumina als in Beispiel 1 oben) wird ein vegetatives Inokulum in zwei Stufen hergestellt. Bei beiden Stufen wird das folgende Medium verwendet:
  • Inhaltsstoffe Menge
  • Glucose 1,5%
  • Sojabohnenkleie 1,5%
  • Kartoffeldextrin 2,0%
  • Maiseinweichwasser 1,0%
  • Hefeextrakt 0,1%
  • Calciumcarbonat 0,2%
  • Leitungswasser auf Volumen
  • Die erste Inkubationsstufe wurde durchgeführt in einem 250 ml Kolben, der 80 ml sterilisiertes Medium enthielt. Der Kolben wurde mit einem lyophilisierten Pellet der A10255.2-Kultur beimpft. Das Medium wurde 48 Stunden bei 30ºC auf einem Schüttler, der mit 250 Upm kreiste, inkubiert.
  • Ein Teil (10 ml) des Inokulums der ersten Stufe wurde verwendet, um ein sterilisiertes Inkubationsmedium für die zweite Stufe zu beimpfen, das aus 400 ml des obigen Mediums zusammengesetzt war und in einem 2 l Weithals-Erlenmeyer-Kolben enthalten war. Dieses Zweitstufenmedium wurde 24 Stunden bei 30ºC auf einem Schüttler, der mit 250 Upm, kreiste,
  • Das inkubierte Medium wurde unten verwendet für die Tankfermentation.
    • Tankfermentation
  • Das Medium des obigen vegetativen Zweitstufeninokulums wurde verwendet, um das folgende Tankmedium zu beimpfen, das in einem 150-l-Fermenter enthalten war:
  • Inhaltsstoffe Menge
  • Cerelose 1,5%
  • Kartoffeldextrin 2,0%
  • Maiseinweichwasser 1,0%
  • Sojabohnenkleie 1,5%
  • Calciumcarbonat 0,5%
  • SAG 471 * 0,01%
  • Leitungswasser auf 120 l
  • * Silikonentschäumungsmittel, Dow Corning Co.
  • Dieses Medium wurde zuerst durch Autoklavieren sterilisiert. Nach der Sterilisierung wurde der pH des Mediums auf 6,5 eingestellt durch Zugabe von 5N Natriumhydroxidlösung. Das Medium wurde dann beimpft und etwa 24 Stunden bei 30ºC fermentiert. Während der Fermentation wurde das Medium mit steriler Luft belüftet mit einer Anfangsrate von 1 Kubikfuß pro Minute (cfm) und mit einem üblichen Rührer mit einer Anfangsrate von 350 Upm gerührt.
    • Fermentation in großem Maßstab
  • Ein Teil des obigen Tankmediums (40 l) wurde verwendet, um das folgende Medium für die Fermentation in großem Maßstab zu beimpfen:
  • Inhaltsstoffe Menge
  • Entschäumer * 0,02%
  • Propylenglykol (MW2000) 0,02%
  • Melasse 4,00%
  • Calciumcarbonat 0,50%
  • saures Kaseinhydrolysat ** 1,60%
  • NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O 0,01%
  • Glucose 0,10%
  • Leitungswasser auf 1200 Gallonen
  • * SAG 471 Silikonentschäumungsmittel
  • ** Hy Case, Humko Scheffiled Chemical Co., Lyndhurst, NJ
  • Das Medium war in einem 1600 Gallonen Fermenter enthalten. Der pH des Mediums wurde durch Zugabe von 5N Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Das Medium wurde 30 Minuten bei 121ºC und 17 psi sterilisiert. Das sterilisierte Medium wurde mit steriler Luft mit einer Anfangsrate von 20 Kubikfuß pro Minute belüftet, mit einem üblichen Rührer mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 100 Upm gerührt und etwa 6 Tage bei 30ºC fermentieren gelassen. Während des Fermentationszeitraumes wurde der pH des Mediums auf etwa 7,0 gehalten, der Gehalt des Mediums an gelöstem Sauerstoff wurde auf etwa 45% Luftsättigung gehalten und Glucose wurde dem Medium mit einer konstanten Rate von 4 g/l/Tag zugeführt. Nach 24 Stunden wurde auch Hy Case dem Medium mit einer Rate von 3 g/l/Tag zugeführt.
    • Beispiel 13 Isolierung des A10255-Antibiotikumkomplexes
  • Die gesamte Fermentationsbrühe (5000 l) des A10255.2-Organismus wurde geerntet und unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-Cel, Johns Manville Products Corp.) filtriert. Das Filtrat und die Waschwässer (1200 l Wasser) der Biomasse wurden verworfen.
  • Die Biomasse wurde dann chargenweise mit einer Mischung von 1 : 4 Wasser:Aceton (2000 l) extrahiert. Die Extraktion wurde wiederholt und die Extrakte wurden vereinigt (insgesamt 4000 l). Die vereinigten Extrakte enthielten die Hauptmenge des A10255-Komplexes.
  • Die vereinigten Extrakte wurden im Vakuum zu einer wäßrigen Suspension eingeengt. Beim Stehen fiel ein feiner Feststoff aus der Suspension aus. Der Feststoff war der rohe A10255-Komplex. Die eingeengten Extrakte wurden dann zentrifugiert und der Überstand verworfen.
  • Die bei der Zentrifugation erhaltenen Feststoffe wurden im Vakuum getrocknet, was 1,5 kg braunes Pulver ergab, das 423 ug/mg A10255 antibiotische Aktivität enthielt.

Claims (18)

1. Antibiotikum, das hergestellt werden kann, indem Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces gardneri NRRL 18260 und Streptomyces gardneri NRRL 15922 in einem um, das assimilierbare Quellen für Kohlenhydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersfermentationsbedingungen kultiviert werden.
2. Faktor B von Antibiotikum A10255, der ein nichtkristallines weißes bis hellgelbes Pulver ist, mit den folgenden Eigenschaften:
(a) eine ungefähre durchschnittliche Elementaranalyse von 49,25% Kohlenstoff, 3,94% Wasserstoff, 15,65% Stickstoff, 21,63% Sauerstoff und 6,73% Schwefel;
(b) ein Infrarotabsorptionsspektrum in einem Kaliumbromidpellet mit wesentlichen Absorptionsmaxima bei den folgenden Frequenzen (in cm&supmin;¹): 3373, 2969, 2932, 2875, 1661, 1598, 1520, 1494, 1395, 1250, 1114, 1084, 996, 932 und 900;
(c) titrierbare Gruppen, gemessen in 66% wäßrigem Dimethylformamid mit pKa-Werten von ungefähr 4,9, 11,2 und 12,8;
(d) ein Molekulargewicht von etwa 1244 Dalton bestimmt mit Fast Atom Bombardment-Massenspektroskopie;
(e) ist löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform/Methanol-Mischungen und einer ungefähr 4 : 1 (V:V) Mischung von Tetrahydrofuran:Wasser;
(f) enthält ungefähr 629 mmol/mg Threonin und ungefähr 5268 mmol Ammoniakäquivalente pro mg, bestimmt durch Hydrolyse mit 6N Chlorwasserstoffsäure;
(g) ein Ultraviolettabsorptionsspektrum in saurem, basischem und neutralem Methanol mit einem Absorptionsmaximum bei 245 nm (ε = 66000);
(h) ein kernmagnetisches Protonenresonanzspektrum in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid bei 500 MHz mit den folgenden Signalen: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität
(i) ein kernmagnetisches ¹³C-Resonanzspektrum in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid bei 125 MHz mit den folgenden Signalen: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität
wobei: S = Singulett, D = Dublett, T = Triplett, Q = Quartett
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
3. Faktor C von Antibiotikum A10255, der ein nichtkristallines weißes bis hellgelbes Pulver ist, mit den folgenden physikalischen Eigenschaften:
(a) eine ungefähre durchschnittliche Elementaranalyse von 49,18% Kohlenstoff, 3,86% Wasserstoff, 17,89% Stickstoff, 18,28% Sauerstoff und 6,46% Schwefel;
(b) ein kernmagnetisches Protonenresonanzspektrum in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid bei 360 MHz mit Signalen bei den folgenden 6-Werten: 10,51, 10,08, 9,84, 9,57, 9,10, 8,88, 8,03, 7,94, 7,53, 5,15 (austauschbar), 8,67, 8,59, 8,51, 8,49, 8,38, 8,25, 8,24, 6,57, 6,52, 6,38, 6,11, 5,91, 5,78, 5,74, 5,70, 5,65, 5,63, 5,44, 5,15, 4,79, 4,67, 4,63, 4,23, 2,21, 1,62, 1,11 und 1,01,
(c) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Kaliumbromid mit Absorptionsmaxima bei 3375, 2973, 2932, 2876, 1661, 1597, 1494, 1427, 1345, 1305, 1249, 1111, 1083, 981, 933 und 894 cm&supmin;¹
(d) ein Ultraviolettabsorptionsspektrum - mit einem Absorptionsmaximum bei 245 nm (ε = 63000) in neutralem, saurem und basischem Methanol;
(e) Molekulargewicht von ungefähr 1174 Dalton, bestimmt mit Fast Atom Bombardment-Massenspektralanalyse;
(f) titrierbare Gruppen, gemessen in 66% wäßrigem Dimethylformamid mit pKa-Werten von ungefähr 2,9 und 12;
(g) enthält ungefähr 758 mmol/mg Threonin und ungefähr 7429 mmol/mg Ammoniakäquivalente, bestimmt durch Standardhydrolyseverfahren mit 6N Chlorwasserstoffsäure;
(h) ist löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, 1 : 1 (V:V) Chloroform:Methanol und 4 : 1 (V:V) Tetrahydrofuran:
Wasser;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
4. Faktor E von Antibiotikum A10255, der ein nichtkristallines weißes bis hellgelbes Pulver ist, mit den folgenden Eigenschaften:
(a) ungefähre durchschnittliche Elementaranalyse von 48,03% Kohlenstoff, 3,91% Wasserstoff, 15,76% Stickstoff, 17,09% Sauerstoff und 5,63% Schwefel;
(b) Infrarotabsorptionsspektrum in einem Kaliumbromidpellet mit wesentlichen Absorptionsmaxima bei den folgenden Frequenzen (in cm&supmin;¹): 3367, 3361, 2966, 1664, 1501, 1389, 1254, 1102 und 889;
(c) titrierbare Gruppen gemessen in 66% wäßrigem Dimethylformamid mit pKa-Werten von ungefähr 4,85, 11,1 und 13,2;
(d) Molekulargewicht von etwa 1258 Dalton bestimmt mit Fast Atom Bobardment-Massenspektroskopie;
(e) ist löslich in Dimthylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin und einer ungefähr 4 : 1 (V:V) Mischung von Tetrahydrofuran:Wasser;
(f) enthält ungefähr 716 mmol/mg Threonin und ungefähr 8580 mmol Ammoniakäquivalente pro mg, bestimmt durch Hydrolyse mit 6N Chlorwasserstoffsäure;
(g) Ultraviolettabsorptionsspektrum in saurem, basischem und neutralem Methanol zeigt ein Absorptionsmaximum bei 245 nm (ε = 77000);
(h) kernmagnetisches Protonenresonanzspektrum in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid bei 270 MHz weist Signale auf bei 6 10,54, 10,00, 9,94, 9,81, 9,60, 9,56, 9,45, 8,89, 8,84, 8,66, 8,59, 8,50, 8,47, 8,39, 8,25, 8,22, 8,10, 6,53, 6,50, 6,24, 5,95, 5,86, 5,84, 5,77, 5,64, 5,55, 5,52, 5,44, 5,10, 4,80, 4,66, 4,64, 4,22, 2,78, 1,60, 1,11 und 1,00;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
5. Faktor F von Antibiotikum A10255, der ein nichtkristallines weißes bis hellgelbes Pulver ist, das die folgenden physikalischen Eigenschaften besitzt:
(a) ungefähre durchschnittliche Elementaranalyse von 49,65% Kohlenstoff, 4,23% Wasserstoff, 17,11% Stickstoff, 22,08% Sauerstoff und 7,78% Schwefel;
(b) kernmagnetisches Protonenresonanzspektrum in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid bei 360 MHz mit Signalen bei 6 10,51, 10,17, 9,88, 9,77, 9,54, 9,10, 8,90, 8,88, 8,66, 8,59, 8,51, 8,49, 8,38, 8,25, 8,24, 8,06, 7,94, 7,53, 6,56, 6,51, 6,27, 6,23, 6,12, 6,12, 5,96, 5,77, 5,76, 5,71, 5,71, 5,64, 5,62, 5,47, 5,14, 4,77, 4,65, 4,62, 4,20, 2,77, 2,48, 2,48, 1,58, 1,08, 0,98 und 0,98;
(c) Infrarotabsorptionsspektrum in Kaliumbromid mit Absorptionsmaxima bei 3369, 2943, 2907, 2846, 1663, 1588, 1519, 1493, 1425, 1337, 1288, 1251, 1151, 1110, 1083, 995, 927, 890, 807, 776 und 751 cm&supmin;¹;
(d) ein Ultraviolettabsorptionsspektrum mit einem Absorptionsmaximum bei 245 nm (ε = 71500) in neutralem, saurem und basischem Methanol;
(e) ein Molekulargewicht von ungefähr 1188 Dalton, bestimmt mit Fast Atom Bombardment Massenspektroskopie;
(f) eine titrierbare Gruppe gemessen in 66% wäßrigem Dimethylformamid mit einem pKa von 12,5;
(g) enthält ungefähr 735 mmol/mg Threonin und ungefähr 7226 mmol/mg Ammoniakäquivalente, bestimmt durch Standardhydrolyseverfahren mit 6N Chlorwasserstoffsäure;
(h) ist löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, 1 : 1 (V:V) Chloroform:Methanol und 4 : 1 (V:V) Tetrahydrofuran:
Wasser;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
6. Faktor G von Antibiotikum A10255, der ein nichtkristallines weißes bis hellgelbes Pulver ist, das in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform/Methanol-Mischungen und 4 : 1 (V:V) Tetrahydrofuran:Wasser löslich ist, mit den folgenden physikalischen Eigenschaften:
(a) ein Ultraviolettspektrum in neutralem Ethanol, das ein λmax = 247 nm (ε = 72200) zeigt, in saurer Lösung λmax = 247 nm (ε = 73400) und in basischer Lösung λmax = 211 nm (ε = 27200); ein kernmagnetisches ¹H-Resonanzspektrum bei 500 MHz in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid mit den folgenden Signalen: Resonanz-Nr. Verschiebung (δ) Multiplizität * doppelt intensiv BS = breites Singulett DD = Dublett von Dubletts DQ = Dublett von Quartett
(c) kernmagnetisches ¹³C-Resonanzspektrum bei 500 MHz in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid mit den folgenden Adsorptionsmaxima: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität
und
eine Elementaranalyse, die die folgende prozentuale Zuammensetzung anzeigt:
Elementaranalyse
Gefunden (%)
C 51,46
H 3,82
N 17,62
O 19,38
S 7,03
99,31%
und (e) ein Infrarotspektrum wie in Fig. 5 gezeigt.
7. Faktor H von Antibiotikum A10255, der ein nichtkristallines weißes bis hellgelbes Pulver ist, das in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, 1 : 1 (V:V) Methylenchlorid:Methanol und 4 : 1 (V:V) Tetrahydrofuran:Wasser löslich ist, mit den folgenden physikalischen Eigenschaften:
(a) ein Ultraviolettspektrum in neutralem Ethanol, das ein λmax = 244 nm (ε = 74000) zeigt; in saurer Lösung λmax = 245 nm (ε = 74500) und in basischer Lösung λmax = 211 nm (ε = 23800); und
(b) ein Molekulargewicht von 1162,32 Dalton;
(c) ein kernmagnetisches ¹³C-Resonanzspektrum bei 125 MHz in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid mit den folgenden Signalen: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität * doppelt intensiv
(d) kernmagnetisches ¹H-Resonanzspektrum bei 500 MHz in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid mit den folgenden Signalen: Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität Resonanz-Nr. Verschiebung Multiplizität
und (e) ein Infrarotspektrum, wie in Fig. 6 gezeigt.
8. Verfahren zur Herstellung von A10255-Komplex oder Faktor B, C, E, F, G oder H oder irgendeiner Kombination davon, das umfaßt, daß man
a) Streptomyces gardneri NRRL 15537, Streptomyces gardneri 18260, Streptomyces gardneri NRRL 15922 oder eine A10255- produzierende Mutante davon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersfermentationsbedingungen züchtet, bis der antibiotische A10255-Komplex erzeugt wird;
b) gegebenenfalls den A10255-Komplex von dem Kulturmedium abtrennt und
c) gegebenenfalls einen oder mehrere antibiotische A10255- Faktoren B, C, E, F, G und H von dem abgetrennten A10255-Komplex isoliert.
9. Verfahren nach Anspruch 8 unter Anwendung der Züchtung von Streptomyces gardneri NRRL 15537 oder einer A10255-produzierenden Mutante davon.
10. Verfahren nach Anspruch 8 unter Verwendung der Züchtung von Streptomyces gardneri NRRL 15922 oder einer A10255-produzierenden Mutante davon.
11. Verfahren nach Anspruch 8 unter Verwendung der Züchtung von Streptomyces gardneri NRRL 18260 oder einer A10255-produzierenden Mutante davon.
12. Futterzusammensetzung zur Erhöhung der Futterverwertungseffizienz, die ein Tierfutter und den A10255-Komplex, einen A10255-Faktor ausgewählt aus der Gruppe der A10255-Faktoren B, C, E, F, G und H oder eine Kombination eines oder mehrerer der Faktoren umfaßt.
13. Tierfuttervormischung, umfassend als aktiven Inhaltsstoff den A10255-Komplex oder Faktor B, C, E, F, G oder H in irgendeiner Kombination oder ein physiologisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem geeigneten inerten Träger.
14. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus gardneri NRRL 15537, NRRL 15922 oder NRRL 18260 oder eine Mutante davon, die den antibiotischen A10255-Komplex produziert.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als aktiven Inhaltsstoff den A10255-Komplex, einen A10255-Faktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A10255-Faktor B, A10255-Faktor C, A10255-Faktor E, A10255-Faktor F, A10255-Faktor G und A10255-Faktor H oder eine Mischung von einem oder mehreren dieser Faktoren oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Hilfsstoffen dafür.
16. Verfahren zur Erhöhung der Futterverwertungseffizienz eines Nutztieres, umfassend, daß man dem Nutztier einen A10255-Komplex, einen A10255-Faktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A10255-Faktor B, A10255-Faktor C, A10255-Faktor E, A10255-Faktor F, A10255-Faktor G und A10255-Faktor H oder eine Kombination eines oder mehrerer dieser Faktoren verabreicht.
17. Verfahren zur Bestimmung der Thiostreptonresistenz einer Streptomyces-Art, umfassend, daß man den A10255-Komplex, A10255-Faktor B, A10255-Faktor C, A10255-Faktor E, A10255-Faktor F, A10255-Faktor G oder A10255-Faktor H in das Kulturmedium einer Streptomyces-Art bringt.
18. Pharmazeutisch annehmbares Salz des A10255-Komplexes.
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