DE3781846T2

DE3781846T2 - Antibiotikum-a-42867 und dessen zusatzsalze.

Info

Publication number: DE3781846T2
Application number: DE8787110373T
Authority: DE
Inventors: Giovanni Cassani; Maurizio Denaro; Francesco Parenti; Ernesto Riva; Enrico Selva
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1986-07-29
Filing date: 1987-07-17
Publication date: 1993-02-11
Anticipated expiration: 2007-07-18
Also published as: ZA874164B; US4804534A; FI872860A; AU602700B2; EP0254999A2; JPS6341490A; ES2046184T3; ATE80914T1; IL83225A; NO872811D0; GB8618445D0; GR3006514T3; DE3781846D1; CA1337978C; FI87469C; AU7445187A; JPH07114704B2; HUT46361A; EP0254999A3; DK392087A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue, antibiotisch wirksame Substanz, die mit Antibiotikum A 42867 bezeichnet wird, die Additionssalze davon, die pharmazeutischen Zusammensetzungen davon und deren Verwendung als Arzneimittel, insbesondere bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, an denen Mikroorganismen beteiligt sind, welche für solche Antibiotika empfindlich sind.
Die Verbindungen der Erfindung sind auch als wuchsbeschleunigende Mittel bei Tieren, wie Geflügel, Schweinen, Wiederkäuern usw. , wirksam.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum A 42867, bei dem der neue Stamm Nocardia sp. ATCC 53492 oder eine Antibiotikum A 42867-erzeugende Mutante oder Variante davon kultiviert wird.
Nocardia sp. ATCC 53492 ist aus einer Bodenprobe isoliert worden und wurde am 23. Mai 1986 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, 20852 Maryland, USA, unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt. Dem Stamm ist die Sammlungsnummer ATCC 53492 zugeteilt worden.
Im Hinblick auf die Ähnlichkeiten zwischen den antimikrobiellen Wirksamkeiten von Antibiotikum A 42867 und den entsprechenden pharmazeutisch annehmbaren Salzen sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wenn die biologischen Eigenschaften von Antibiotikum A 42867 behandelt werden, auch die entsprechenden Salze miteingeschlossen, und umgekehrt ist bei der Behandlung der biologischen Eigenschaften eines pharmazeutisch annehmbaren Additionssalzes von Antibiotikum A 42867 auch die entsprechende "Nicht-Additionssalz-" -form mitumfaßt. Die Erzeugung von Antibiotikum A 42867 wird bewirkt, indem man eine zu dessen Herstellung befähigte Nocardia sp., nämlich Nocardia sp. ATCC 53492 oder eine Antibiotikum A 42867-erzeugende Mutante oder Variante davon,unter aeroben Bedingungen in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, kultiviert. Viele der Nährmedien, die üblicherweise auf dem Fermentationsgebiet angewendet werden, können verwendet werden, jedoch sind bestimmte Medien bevorzugt. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Mannose, Galactose, Stärke, Maismehl u.dgl.. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Ammoniak, Nitrate, Sojabohnenmehl, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton, Aminosäuren u.dgl.. Zu den anorganischen Salzen, die den Kulturmedien im Rahmen der vorliegenden Erfindung einverleibt werden können, gehören die üblichen löslichen Salze, die zur Bildung von Natrium-, Kalium-, Eisen-, Zink-, Kobalt-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Phosphat- Nitrat- u.dgl. -ionen befähigt sind.
Üblicherweise wird der Antibiotikum-erzeugende Stamm in einem Schüttelkolben vorkultiviert, und dann wird die Kultur zur Beimpfung von Topffermentern zur Erzeugung wesentlicher Mengen der antibiotischen Substanzen verwendet. Das für die Vorkultur verwendete Medium kann das gleiche sein wie das für größere Fermentationen angewendete, doch können auch andere Medien angewendet werden. Der Antibiotikum A 42867-erzeugende Stamm kann bei Temperaturen zwischen 20 und 40ºC, vorzugsweise zwischen 24 und 35º C, gezüchtet werden.
Während der Fermentation kann die Antibiotikumerzeugung durch Prüfen von Brühen- oder Myzelextraktproben auf antibiotische Wirksamkeit überwacht werden, beispielsweise mittels Bioassays oder mittels dünnschichtchromatographischer oder HPLC-Verfahrensweisen.
Gegen Antibiotikum A 42867 empfindliche Organismen, wie Baciilus subtilis und S. aureus, können als Testorganismen verwendet werden. Der Bioassay wird zweckmäßigerweise nach der Agardiffusionsmethode auf Agarplatten ausgeführt. Eine maximale Produktion an antibiotischer Aktivität tritt im allgemeinen zwischen dem zweiten und dem fünften Tag der Fermentation auf.
Antibiotikum A 42867 wird durch Züchten des Stammes Nocardia sp. ATCC 53492 oder einer Antibiotikum A 42867-erzeugenden Mutante oder Variante davon produziert und findet sich hauptsächlich in den Kulturbrühen.

Morphologische Eigenschaften von Nocardia sp. ATCC 53492

Die Morphologie dieses auf Bodenagarmedium kultivierten Stammes ist jener von Actinomyceten ähnlich und zeigt eine Entwicklung eines reichlichen Luftmyzels mit langen, mäßig verzweigten Hyphen. Ein morphologisches Hauptkennmerkmal dieses Stammes ist die Fragmentierung von Substrat- und Luftmyzel in stabähnliche Elemente. Eine Fragmentierung von Substratmyzel wurde auf allen für die Kulturcharakterisierung verwendeten Agarmedien beobachtet, doch wurde auf Medium Nr. 5, Medium Nr. 7, Hickey-Tresner und Eialbumin eine vollständige Fragmentierung festgestellt. Substrathyphen von Nocardia sp. ATCC 53492 wurden in Abhängigkeit vom Alter der Kultur mit verzweigten und fragmentierten, stabähnlichen Elementen voll entwickelt. Luftmyzel wurde auf Bodenagar und auf Wasseragar gut entwickelt. Die Lufthyphen waren auf Bodenagar lange und gerade und bildeten manchmal Knoten oder nestähnliche Verwicklungen. Die Morphologie dieses Stammes gleicht jener der Nocardia-Gattung.
Die morphologische Charakterisierung dieses Stammes wurde auf den gleichen Platten vorgenommen, die zum Studium der Kultureigenschaften benutzt wurden. Um zu ermitteln, ob die Fragmentierung auf Agarplatten erfolgt, wurde die Oberfläche des Mediums mit einem Kunststoffmesser abgetragen, und die Probe wurde auf einem Objektträger unter einem optischen Mikroskop beobachtet.In flüssiger Kultur zeigte dieser Stamm eine ausgedehnte Fragmentierung in stäbchenförmige Elemente.

Kulturkennmerkmale von Nocardia sp. ATCC 53492

Zur Prüfung der Kulturkennmerkmale wurde Nocardia sp. ATCC 53492 auf verschiedenen, von Shirling und Gottlieb (Shirling E.B. und Goddlieb D., 1966 - Method for characterization of Streptomyces species - Int. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340) vorgeschlagenen Standardmedien, und zusätzlich auf verschiedenen,von Waksman empfohlenen Medien kultiviert (Waksman, S.A. 1961 - The Actinomycetes - The Williams and Wilkins Co., Baltimore; Bd. 2, 328-334).
Die Farbbestimmung erfolgte erforderlichenfalls nach der Methode von Maerz und Paul (Maerz A. u nd M. Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2. Auflage McGraw-Hill Book Company Inc., New York).
Die Fähigkeit des Organismus, verschiedene Kohlenstoffquellen zu verwerten, wurde nach der von Shirling und Gottlieb beschriebenen Methode untersucht.
Die Kultur- und physiologischen Kennmerkmale und die Verwertung von Kohlenstoffquellen sind in den Tabellen I, II, III, IV und V angegeben.
Die in Tabelle I enthaltenen Feststellungen wurden nach zweiwöchiger Bebrütung bei 28º C getroffen. TABELLE I Kulturkennmerkmale von Stamm Nocardia sp. ATCC 53492 Kulturmedien Kennmerkmale Medium Nr. 2 (Hefeextrakt - Malzagar) Medium Nr. 3 (Hafermehlagar) Medium Nr. 4 (anorganische Salze-Stärkagar) Medium Nr. 5 (Glycerin-Asparagin-Agar) Medium Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar) Medium Nr. 7 (Tyrosinagar) Czapek's Saccharoseagar Hafermehlagar Reichlicher Wuchs, Oberfläche gerunzelt, Farbe braun 15/H/11, gelbes lösliches Pigment Mäßiger Wuchs, Oberfläche glatt, Farbe orange 12/L/12, Spuren von weißem Luftmyzel Reichlicher Wuchs, Oberfläche gerunzelt, Farbe orange-dunkel 13/L/12, Spuren von weißem Luftmyzel, Spuren von löslichem Pigment mit rosenroter Farbe Reichlicher Wuchs, Oberfläche gerunzelt, Farbe orange-dunkel 13/L/12 Spuren von Weißem Luftmyzel Mäßiger Wuchs, Oberfläche schwach gerunzelkt, Farbe Aprikose 10/F/7 Reichlicher Wuchs, Oberfläche gerunzelt, Farbe braun 15/H/11, Spuren von weißem Luftmyzel Reichlicher Wuchs, Oberfläche glatt, Farbe gelb-orange 9/G/8, Spuren von Luftmyzel Reichlicher Wuchs, Oberfläche schwach gerunzelt, Farbe orange 12/F/10, Spuren von weißem Luftmyzel, Spuren von löslichem, rosenrotem Pigment TAB. I, Forts. Kulturmedien Kennmerkmale Hickey's und Tresner's Agar Calciummalatagar Benett's Agar Czapek's Glucoseagar Glucose-Asparagin-Agar Nähragar Magermilchagar Eialbuminagar Sabouraud-Agar Kartoffelagar Wasseragar Bodenagar Dextrosetriptonagar Reichlicher Wuchs, Oberfläche gerunzelt, Farbe gold 9/I/6 Reichlicher Wuchs, Oberfläche glatt, Farbe blaß-gelb 10/C/4, Spuren von weißem Luftmyzel Reichlicher Wuchs, Oberfläche gerunzelt, Farbe braun 15/H/11 Reichlicher Wuchs, Oberfläche gerunzelt, Farbe braun 7/E/12, lösliches, dunkelgelbes Pigment Mäßiger Wuchs, Oberfläche schwach rindig; Farbe gelb 10/L/5 Reichlicher Wuchs, Oberfläche glatt, Farbe gelb-orange 9/G/6 Reichlicher Wuchs, Oberfläche glatt, Farbe Pfirsich 9/I/5, Spuren von weißem Luftmyzel Mäßiger Wuchs, Oberfläche glatt, farblos, Spuren von Luftmyzel Reichlicher Wuchs, Oberfläche gerunzelt, Farbe braun 10/L/10 Reichlicher Wuchs, Oberfläche gerunzelt, Farbe gelb 10/L/7, Spuren von weißen Luftmyzel, lösliches, rosenrotes Pigment Sehr spärlicher Wuchs, Oberfläche glatt, farblos, gute Bildung von weißem Luftmyzel Mäßiger Wuchs, Oberfläche glatt, farblos, reichliche Bildung von Luftmyzel Reichlicher Wuchs, Oberfläche gerunzelt, Farbe gelb 10/L/7
Die Buchstaben und Zahlen verweisen auf die gemäß Maerz und Paul (2) bestimmte Farbe. Physiologische Kennmerkmale von Nocardia sp. ATCC 53492 TABELLE II Tests Ergebnisse Stärkehydrolyse Tyrosinreaktion Caseinhydrolyse Solubilisierung von Calciummalat Nitrit aus Nitrat Cellulosezersetzung Bildung von Schwefelwasserstoff Lackmusmilch Peptonisierung Lackmusmilch Koagulation positiv positiv mit Bleiacetatstreifen negativ Temperaturtoleranz TABELLE III
Die geeignetste Temperatur für die Entwicklung der Kolonien liegt, wie gefunden wurde, im Bereich von etwa 22º C bis etwa 42º C.
Die Optimaltemperatur beträgt 28º C bis 37º C. pH-Toleranz TABELLE IV - = kein Wuchs + = mäßiger Wuchs ++ = reichlicher Wuchs
Für die Versuche zur Ermittlung physiologischer Kennmerkmale sowie von pH-und Temperaturtoleranz wurde Hickey's und Tresner's Agarmedium angewendet. Verwertung von Kohlenstoffquellen TABELLE V Kohlenstoffverwertung Kohlenstoffquelle Wuchs Lactose Arabinose Xylose Mannose Fructose Cellobiose Galactose Inosit Glucose Raffinose Ribose Saccharose Salicin Cellulose Rhamnose
- = kein Wuchs
+ = mäßiger Wuchs
++ = reichlicher Wuchs
Für diesen Test wurde Medium Nr. 8 verwendet, und die Ergebnisse wurden nach 10 Tagen Bebrütung bei 28º C - 30º C ermittelt.

Chemotaxonomische Untersuchungen

Der Stamm wurde in V-6-Medium (Rindfleischextrakt 0,5 %, autolysierte Hefe 0,5 %, Pepton 0,5 %, hydrolysiertes Casein 0,3 %, Glucose 2 %, NaCl 0,15 %) kultiviert, wobei auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 200 UpM bei 30º C 72 Stunden lang bebrütet wurde. Der Myzelwuchs im V-6- Medium wurde durch Zentrifugieren (3000 UpM x 10 min) geerntet und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Myzel wurde weiterhin mit Ethanol gewaschen, worauf es bei Zimmertemperatur unter einer laminaren Strömung getrocknet wurde.
Das getrocknete Myzel wurde als Gesamtzellenpräparat verwendet.

Aminosäurenanalyse:

Die Aminosäurenanalyse wurde ausgeführt, wie von Becker und Mitarbeitern ("Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates", Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964)) beschrieben worden ist, und zeigte das Vorliegen von Meso-diaminopimelinsäuren.

Zuckeranalyse:

Die Analyse des Zuckergehaltes wurde gemäß M.P. Lechevalie ("Identification of aerobic actinomycetes of clinical importance", J. Lab. Clin. Med. 71, 934-944 (1968)) unter Verwendung von Dünnschichtchromatographieplatten, wie von J.L. Staneck und G.D. Roberts ("Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography", 28, 226-231 (1974)) beschrieben, ausgeführt und zeigte das Vorliegen von Arabinose und Galactose.

Identität von Nocardia sp. ATCC 53492

Das Vorliegen von Meso-diaminopimelinsäuren zusammen mit diagnostischen Zuckern, wie Galactose und Arabinose, zeigt an, daß dieser Stamm ein Actinomyzetenstamm vom Zellwandtypus IV,nach der Klassifikation von Lechevalier M.P. und H. Lechevalier ("Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic actinomycetes", Int. Journ. Syst. Bacterial. 20, 435-443 (1970)), ist.
Wie bei anderen Mikroorganismen, unterliegen die Kennmerkmale des A 42867-erzeugenden Stammes der Variation. Beispielsweise können künstliche Varianten und Mutanten des Stammes durch Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutagenen, wie UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktiven Strahlen und Chemikalien, wie Salpetriger Säure, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, und vielen anderen erhalten werden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten, die zu den Spezies der Gattung Nocardia gehören und A 42867-Antibiotika erzeugen, sind dem Stamm Nocardia so. ATCC 53492 als äquivalent anzusehen und sind im Rahmen dieser Erfindung liegend zu betrachten.
Die Gewinnung von A 42867-Antibiotika aus Fermentationsbrühen des erzeugenden Mikroorganismus wird nach an sich bekannten Methoden ausgeführt, zu welchen Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung durch Zugabe von Nicht-Lösungsmitteln oder durch Änderung des pH-Wertes der Lösung, Verteilungschromatographie, Umkehrphasenverteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie u.dgl., gehören.
Eine bevorzugte Verfahrensweise umfaßt eine Affinitätschromatographie auf immobilisiertem D-Alanyl-D-Alanin mit anschließender Umkehrphasensäulenchromatographie.
Immobilisierte D-Alanyl-D-Alanin-Matrizes, die für das vorliegende Gewinnungsverfahren geeignet sind, sind in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 83112555 beschrieben. Die bevorzugte Matrix ist in vorliegenden Verfahren D-Alanyl- D-Alanin, gekuppelt mit einem vernetzten Polydextran mit kontrollierter Porengröße.
Die filtrierten Fermentationsbrühen werden dann einer Affinitätschromatographie an immobilisiertem D-Alanyl-D- Alanin unterworfen, das entweder in einer Säule vorliegen oder absatzweise angewendet werden kann.
Die Bindung der antibiotischen A 42867-Substanz an die Affinitätsmatrix wird vorzugsweise bei einem pH von etwa 7,0 - 8,0 ausgeführt, und deren Eluierung wird bei basischeren pH-Werten (vorzugsweise zwischen 9,0 und 11,5) mittels einer wässerigen Base vorgenommen. Diese wässerige Base kann Ammoniak, ein flüchtiges Amin, ein Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxid oder eine basisch gepufferte Lösung, gegebenenfalls in Gegenwart eines polaren, organischen Lösungsmittels, wie eines polaren, wassermischbaren Lösungsmittels, wie unten definiert, sein.
Nach Entfernen der Verunreinigungen durch Waschen der Säule mit wässerigem Puffer vom pH 4-8, der gegebenenfalls Salze, Harnstoff und/oder mit Wasser mischbare Lösungsmittel enthält, wird das Antibiotikum A 42867 mit dem oben beschriebenen Eluierungsgemisch eluiert. Die rohe, antibiotische Substanz wird dann gewonnen, vorzugsweise, indem Wasser aus den vereinigten, Antibiotikum-hältigen Fraktionen durch azeotrope Destillation mit einem organischen Lösungsmittel, das zur Bildung von Minimumazeotropgemischen mit Wasser geeignet ist, vollständig entfernt wird, worauf ein Zusatz eines Nicht-Lösungsmittels erfolgt, um das gewünschte Produkt zu fällen.
Repräsentative Beispiele für organische Lösungsmittel, die zur Bildung von Minimumazeotropgemischen mit Wasser geeignet sind, sind n-Butanol, Benzol, Toluol, Butylether, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Cyclohexan, 2,5-Dimethylfuran, Hexan und m-Xylol; das bevorzugte Lösungsmittel ist n-Butanol.
Beispiele für Nicht-Lösungsmittel sind: Petrolether, Niedrigalkylether, wie Ethylether, Propylether und Butylether, und Niedrigalkylketone, wie Aceton.
Alternativ werden die vereinigten, Antibiotikum-hältigen Fraktionen auf ein kleines Volumen, vorzugsweise durch azeotrope Destillation mit einem wie oben definierten, organischen Lösungsmittel eingeengt und die entstandene wässerige Lösung wird lyophilisiert.
Falls die bei der Eluierung angewendete wässerige Base nicht-flüchtig ist, kann es erforderlich sein, das Konzentrat vor der Fällung oder vor dem Gefriertrocknen zu neutralisieren und zu entsalzen.
Eine zweckmäßige Entsalzungsverfahrensweise umfaßt das Aufbringen der Antibiotikum-hältigen, wässerigen Lösung auf eine silanisiertes Silicagel enthaltende Säule, Waschen mit destilliertem Wasser und Eluieren mit einem Gemisch aus einem polaren, wassermischbaren Lösungsmittel und Wasser.
Repräsentative Beispiele für polare, wassermischbare Lösungsmittel sind: wasserlösliche Alkohole (wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Butanol), Aceton, Acetonitril, Niedrigalkylalkanoate (wie Ethylacetat), Tetrahydrofuran, Dioxan und Dimethylformamid und Mischungen davon; das bevorzugte, polare, wassermischbare Lösungsmittel ist Acetonitril.
Alternativ kann das Entsalzen durch Aufbringen der Antibiotikum-hältigen Lösung auf die oben beschriebene Affinitätssäule, Waschen mit destilliertem Wasser und Eluieren mit einer flüchtigen, wässerigen Base,wie oben für die Eluierung bei der Affinitätschromatographie beschrieben, ausgeführt werden.
Das so erhaltene Produkt ist Antibiotikum A 42867. Eine zweckmäßige Verfahrensweise zur Gewinnung von reinem Antibiotikum A 42867 wird durch eine weitere Reinigung des wie oben erhaltenen Produktes an einer Affinitätschromatographiesäule repräsentiert. Im allgemeinen wird die gleiche stationäre Phase wie oben (immobilisiertes D-Alanyl- D-Alanin) angewendet, und die gewünschte antibiotische Substanz wird gemäß der Affinitätschromatographieverfahrensweise an immobilisiertem D-Alanyl-D-Alanin, wie sie oben beschrieben ist, eluiert.
Ein bevorzugtes, immoöilisiertes D-Alanyl-D-Alanin ist Sepharose-&epsi;-aminocaproyl-D-Alanyl-D-Alanin ein bevorzugtes Equilibrierungsgemisch ist 0,16 %iges (Gew./Vol.) Ammoniak, das 2M NaCl enthält und auf pH 7-8 eingestellt ist, eine bevorzugte Waschlösung ist 0,16 %iges (Gew./Vol.) Ammoniak, das 2M NaCl enthält und auf pH≤7-8 eingestellt ist, und ein bevorzugtes Eluierungsgemisch ist 0,16 %iges (Gew./Vol.) Ammoniak.
Alternativ kann die antibiotische Substanz der Erfindung aus der Fermentationsbrühe isoliert oder mittels starker oder schwacher Anionenharze, darunter funktionalisierte Polystyrol-, Acrylsäure- oder Polydextranmatrizes, weiter gereinigt werden. Beispiele für schwache Anionenaustauscherharze sind jene, die unter den folgenden Handelsnamen vertrieben werden: Dowex MWA-1 oder WGR (Dow Chemical), Amberlite IRA-73 (Rohm and Haas), DEAE-Sephadex (Pharmacia). Beispiele für starke Anionenaustauscherharze, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen solche, die unter den folgenden Handelsnamen vertrieben werden: Dowex MSA-1, SBR, SBR-P (Dow Chemical), Amberlite IR-904 (Rohm and Haas) und QAE-Sephadex (Pharmacia).
Die Eluierung der antibiotischen A 42867-Substanz aus diesen Harzen wird unter Verwendung von Lineargradientengemischen wässeriger Lösungen von Elektrolyten, wie Natrium- oder Kaliumhydrochloriden, in Wasser oder in Gemischen aus Wasser und einem organischen, wassermischbaren Lösungsmittel, wie einem niedrigen Alkohol (z.8. (C&sub1;-C&sub4;-Alkanol) oder niedrigen Alkylketonen (z.B. Aceton, Methylethylketon usw. ), ausgeführt.

Physiko-chemische Kennmerkmale von Antibiotikum A 42867:

A) Ultraviolettabsorptionsspektrum, das in Fig. 1 der angeschlossenen Zeichnungen dargestellt ist und die folgenden Absorptionsmaxima zeigt:
λ max (nm)
a) 0,1 N HCl 282
b) Wasser 282
c) Phosphatpuffer pH 7,4 282
d) Phosphatpuffer pH 9 282
305 (Schulter)
e) 0,1N NaOH 305
265 (Schulter)
B) Infrarotabsorptionsspektrum, welches in Fig. 2 der angeschlossenen Zeichnungen dargestellt ist und die folgenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹) zeigt:
3700-3100, 3000-2800 (Nujol); 1650; 1580; 1460 (Nujol);
1375 (Nujol); 1300; 1235, 1210; 1160; 1130; 1060; 1025;
1000; 970; 840; 790-700; 720 (Nujol)
C) ¹H-NMR-Spektrum, welches in Fig. 3 dargestellt ist und die folgende Gruppe von Signalen (in ppm) bei 270 MHz, aufgezeichnet in DMSO d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als dem internen Standard (0,00 ppm), (δ = ppm) zeigt:
0,90, d [(CH&sub3;)&sub2;-(CH)]; 1,02, d [CH&sub3;-(CH)];
1,23, d [CH&sub3;-(CH)]; 1,52, s [CH&sub3;- ];
1,77, m [CH(CH&sub3;)&sub2;]; 2,38, s (N-CH&sub3;); 3,0-6,35, s und m (aromatische, Zucker- und peptidische CH-Gruppierungen); 6,27-9,29 (aromatische CH-Gruppierungen, peptidische NH-Gruppierungen und phenolische OH-Gruppierungen)
d = Doublett
s = Singlett
m = Multiplett
D) Retentionszeit (Rt) von 0,537 in bezug auf Vancomycin.HCl (Vancocin, Eli Lilly, Rt = 16,36 min) bei Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen:
Säule: Ultrasphere ODS (5 um) Altex (Beckman) 4,6 mm (Innendurchmesser) x 250 mm
Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (5 um)
Eluierungsmittel: Wasser:Acetonitril:2-Ethanolamin: Trifluoressigsäure 9:1:0,01:0,01 (Vol./Vol.)
Fließgeschwindigkeit: 1,6 ml/min
UV-Detektor: 254 nm
Interner Standard: Vancomycin.HCl (Rt = 16,36 min) (Vancocin, Eli Lilly)
E) Retentionszeit (Rt) von 0,665 in bezug auf Vancomycin.HCl (Vancocin, Eli Lilly, Rt 9,96 min) bei Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen:
Säule: Ultrasphere ODS (5 um) Altex (Beckman) 4,6 mm (Innendurchmesser) x 250 mm
Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (5 um)
Eluierungsmittel A: CH&sub3;CN 2 %
(2,5 g/l) NaH&sub2;PO&sub4;.H&sub2;O 98 % eingestellt auf pH 6,0
Eluierungsmittel B: CH&sub3;CN 70 %
(2,5 g/l) NaH&sub2;PO&sub4;.H&sub2;O 30 % eingestellt auf pH 6,0
Eluierung: linearer Gradient von 5 % bis 60 % des Eluierungsmittels B in Eluierungsmittel A, in 40 min
Fließgeschwindigkeit: 1,6 ml/min
UV-Detektor: 254 nm
Interner Standard: Vancomycin.HCl (Rt = 9,96 min) (Vancocin, Eli Lilly)
F) Elementaranalyse, nachdem die Probe vorher bei etwa 140º C unter einer Inertatmosphäre getrocknet worden ist, wobei die folgende annähernde prozentuelle Zusammensetzung (Durchschnitt) ermittelt wird: Kohlenstoff 53,3 %; Wasserstoff 5,9 %; Stickstoff 7,85 %; Chlor (insgesamt) 4,41 %; Chlor (ionisch) 2,22 %. Anorganischer Rückstand bei 900º C in Luft: 0,875 %.
G) Säure-Base-Titrationsprofil in Wasser bei der Titration mit 0,05N wässeriger KOH einer Probe, die vorher mit überschüssiger wässeriger HCl versetzt worden ist,welches Profil pKa-Werte bei 3,2, 7,1 und 8,3 zeigt
H) Rf-Wert von 0,56 in dem folgenden chromatographischen System:
(Wässerige Natriumchloridlösung, 87,5 g/ l:wässerige NaH&sub2;PO&sub4;-Lösung 0,5 g/l) 70 % CH&sub3;CN 30 % eingestellt auf pH 6
unter Verwendung von silanisierten Silicagel-Umkehrphasenplatten (RA-18 F&sub2;&sub5;&sub4;)
Sichtbarmachung:
- UV-Licht bei 254 nm
gelbe Farbe mit Pauly-Reagens, nämlich diazotierter
Sulfanilsäure (J. Chromatog. 20, 171 (1965) Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953))
-Bioautographie unter Verwendung von B. subtilis ATCC 6633 auf Davis-Minimalmedium.
I) Molekulargewicht von etwa 1559, errechnet aus einem FAB-MS-Spektrum, das den M+H -Peak bei 1560 zeigt.
Das Antibiotikum A 42867 besitzt saure und basische Funktionen und kann neben der Bildung von inneren Salzen unter entsprechenden pH-Bedingungen Salze mit organischen und anorganischen Gegenionen gemäß üblichen Verfahrensweisen bilden.
Repräsentative und geeignete Säureadditionssalze dieser Verbindungen der Erfindung umfassen jene Salze, die durch Standardumsetzung mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren, wie z.B. Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Triehloressigsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoasäure, Schleimsäure, Glutaminsäure, Camphersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure u.dgl. Säuren, gebildet werden.
Repräsentative Beispiele für diese Basen sind: Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxid, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- und Bariumhydroxid; Ammoniak und aliphatische, alicyclische oder aromatische organische Amine, wie Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin und Picolin.
Die Umwandlung der "Nichtsalz-" -verbindungen der Erfindung in die entsprechenden Additionssalze, und das Umgekehrte, nämlich die Umwandlung eines Additionssalzes einer Verbindung der Erfindung in die Nichtsalzform, liegen innerhalb des durchschnittlichen Fachwissens und werden durch die vorliegende Erfindung mitumfaßt.
Beispielsweise kann Antibiotikum A 42867 in das entsprechende Säureadditionssalz umgewandelt werden, indem die Nichtsalzform in einem wässerigen Lösungsmittel aufgelöst und mit einem geringen, molaren Überschuß der ausgewählten Säure oder Base versetzt wird. Die entstandene Lösung oder Suspension wird dann zur Gewtnnung des gewünschten Salzes lyophilisiert.
Für den Fall, daß das Endsalz in einem Lösungsmittel unlöslich ist, in dem die Nichtsalzform löslich ist, wird dieses Salz durch Filtration aus der organischen Lösung der Nichtsalzform nach Zugabe der stöchiometrischen Menge oder eines geringen, molaren Überschusses der ausgewählten Säure oder Base gewonnen.
Die Nichtsalzform kann aus einem entsprechenden, in einem wässerigen Lösungsmittel gelösten Säure- oder Basensalz, das dann zur Freisetzung der Nichtsalzform neutralisiert wird, hergestellt werden.
Falls nach der Neutralisation die Beseitigung des Überschusses von Säure oder Base notwendig ist, kann eine übliche Entsalzungsverfahrensweise angewendet werden.
Beispielsweise kann zweckmäßigerweise Säulenchromatographie an silanisiertem Kieselsäuregel, nicht-funktionalisiertem Polystyrol-, Acrylsäure- und kontrollierte Porengröße aufweisenden Polydextranharzen (wie Sephadex LH 20) oder an aktivierter Kohle angewendet werden. Nach Eluierung der unerwünschten Salze mit einer wässerigen Lösung wird das gewünschte Produkt mittels eines Gemisches aus Wasser und einem polaren oder apolaren, organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril/Wasser von 50:50 bis etwa 100 % Acetonitril, das einen linearen oder einen Stufengradienten aufweisen kann, eluiert.
Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann die Salzbildung min entweder pharmazeutisch annehmbaren Säuren (oder Basen) oder pharmazeutisch nicht-annehmbaren Säuren (oder Basen) als eine zweckmäßige Reinigungsmethode angewendet werden. Nach Bildung und Isolierung kann die Salzform eines A 42867- Antitiotikums in die entsprechende Nichtsalzform oder in eine pharmazeutisch annehmbare Salzform umgewandelt werden.
in einigen Fällen ist ein Basenadditionssalz des Antibiotikum A 42867 in Wasser und hydrophilen Lösungsmitteln löslicher.
Die antibakterielle Aktivität der Verbindung der Erfindung kann in vitro mit Hilfe von Standardverdünnungstests an verschiedenen Mikroorganismenkulturen gezeigt werden.
Die Kulturmedien und Wuchsbedingungen für MIC-(minimale Hemmkonzentrations) Bestimmungen waren wie folgt: Isosensitestbrühe (Oxoid), 24 h, für Staphylokokken, Strep. faecalis und gram-negative Bakterien (Escherichia coli); Todd-Hewitt- Brühe (Difco), 24 h, für andere Streptokokkenspezies; GC-Basenbrühe (Difco) + 1 % Isovitalex (BBL), 48 h, an CO&sub2; angereicherte Atmosphäre, für Neisseria gonorrhoeae; Brain Heart-Brühe (Difco) + 1 % Supplement C (Difco), 48 h, für Haemophilus influenzae; AC-Brühe (Difco), 24 h, anaerobe Atmosphäre, für Clostridium perfringens; Wilkins- Chalgren Agar (Literatur: T.D. Wilkins & S. Chalgren, 1976, Antimicrob. Ag. Chemother. 10, 926), 48 h, anaerobe Atmosphäre, für die anderen Anaeroben (C. difficile, Propionibacterium acnes, Bacteroides fragilis); PPLO-Brühe (Difco) + 10 % Pferdeserum + 1 % Glucose, 48 h, für Mycoplasma gallisepticum; PPLO-Brühe mit Ergänzungen, wie von R.T. Evans und D. Taylor-Robinson (J. Antimicrob. Chemother. 4, 57) beschrieben, 24 h, für U. urealyticum. Die Bebrütung erfolgte bei 37º C Die Beimpfungen waren wie folgt : 1 % (Vol./Vol.) einer 48 h alten Brühenkultur für M. gallisepticum; etwa 10&sup4; Farbänderungseinheiten/ml für U. urealyticum; etwa 10&sup4; - 10&sup5; Koloniebildungseinheiten/ml für andere Brühenverdünnungs-MICs; etwa 10&sup4; - 10&sup5; Bakterien/Fleck (beimpft mit einem Vielpunktebeimpfungsgerät) für Agarverdünnungs-MICs (C. difficile, P. acnes, B. fragilis).
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC, ug/ml) für einige Mikroorganismen sind nachstehend in Tabelle VI angegeben. TABELLE VI Stamm M.I.C. (ug/ml) Antibiotikum A 42867 Staph. aureus L165 (10&sup4; cfu/ml) Staph. epidermis L147 ATCC 12228 (Koagulase negativ) Strep. pyogenes L49 C203 Strep. pneumonia L44 UC41 Strep. faecalis L149 ATCC 7080 Strep. mitis L796 (klinisches Isolat) Clostridium perfringens L290 ISS 30543 Clostridium difficile L1363 ATCC 9689 Propionibacterium acnes L1014 ATCC 6919 Neisseria gonorrhoeae L997 ISM68/126 Haemophilus influenza type b L 970 ATCC 19418 Proteus vulgaris ATCC 881 L 79 Escherichia coli L47 SKF 12140 P. aeruginosa ATCC 10145 L 4 Candida albicans SKF 2270 L 145 Mycoplasma gallisepticum L431 S6 Weybridge
Antibiotium A 42867 ist, wie gefunden wurde, gegen Koagulase-negative Staphylokokken wirksam. Die M.I.C. (ug/ml), bezogen auf eine Reihe von klinischen Isolaten von S. epidermidis und S. haemolyticus, sind nachstehend angegeben: TABELLE VII Stamm Antibiotikum A 42867 M.I.C. (ug/ml) S. epidermidis L S. haemolyticus L
Die antimikrobielle Wirksamkeit der Verbindungen der Erfindung wird auch bei experimenteller Septikämie bei der Maus bestätigt.
Kontrollgruppen und Behandlungsgruppen umfaßten 10 CD-1-Mäuse (Charles River) mit einem Gewicht von 18-22 g. Sie wurden intraperitoneal mit 0,5 ml Bakteriensuspension infiziert, die durch Verdünnen einer über Nacht entstandenen Kultur von S. pyogenes C 203 (L 49) mit steriler, peptonisierter Kochsalzlösung hergestellt worden war. Die Inokulate wurden so eingestellt, daß unbehandelte Tiere innerhalb von 48 h an Septikämie starben. Die zu prüfenden Verbindungen wurden subkutan unmittelbar nach der Infektion verabreicht. Am 7. Tag wurde die ED&sub5;&sub0; in mg/kg nach der Methode von Spearman und Kärber (D.J. Finney "Statistical Methods in Blological Assay", Griffin, S. 524, 1952) aus dem Prozentsatz der überlebenden Tiere bei jeder Dosis errechnet.
Unter diesen Bedingungen betrug der ED&sub5;&sub0;-Wert von Antibiotikum A 42867 1,54 mg/kg.
Im allgemeinen können zur antibakterieilen Behandlung Antibiotikum A 42867 sowie die nicht-toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, oder Mischungen davon, auf verschiedenen Wegen, wie topisch oder parenteral, verabreicht werden. Die parenterale Verabreichung ist im allgemeinen der bevorzugte Verabreichungsweg.
Zusammensetzungen für Injektionszwecke können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässerigen Vehikeln haben, und können Adjuvanzien, wie Suspendiermittel, Stabilisierungsmittel und/oder Dispergierungsmittel, enthalten.
Alternativ kann der Wirkbestandteil in Pulverform zur Rekonstitution im Zeitpunkt der Abgabe, wenn ein geeignetes Vehikel, wie steriles Wasser, zugesetzt wird, vorliegen.
In Abhängigkeit vom Verabreichungsweg können diese Verbindungen in verschiedenen Dosierungsformen formuliert werden.
In einigen Fällen kann es möglich sein, die Verbindungen der Erfindung in Dosierungsformen für orale Verabreichung mit darmlöslichem Überzug zu formulieren, welche, wie auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, S. 1614), hergestellt werden können.
Dies könnte insbesondere der Fall sein, wenn die Absorption der antimikrobiellen Substanz im Darmträkt besonders erwünscht ist, wahrend der Magentrakt unverändert passiert werden soll.
Die Menge des zu verabreichenden Wirkprinzips hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie der Größe und dem Zustand des zu behandelnden Patienten, dem Weg und der Häufigkeit der Verabreichung und dem betreffenden Erreger.
Die antibiotischen Substanzen der vorliegenden Erfindung und die physiologisch annehmbaren Salze davon sind im allgemeinen hei einer Tagesdosis zwischen etwa 0,5 und 50 mg des Wirkbestandteils je kg Körpergewicht des Patienten, gegebenenfalls aufgeteilt in 1 bis 4 Verabreichungen pro Tag, wirksam.
Besonders wünschenswerte Zusammensetzungen sind jene, die in Dosierungseinheiten hergestellt sind, welche etwa 100 bis etwa 5000 mg je Einheit enthalten.
Repräsentative Beispiele für zu Injektionszwecken geeignete Vehikel sind: steriles Wasser für Injektionszwecke, Ringer'sche Lösung, 0,9 %ige Kochsalzlösung und 5 %ige Dextroselösung.
Für intravenöse Infusion liegt die geeignete Konzentration des Antibiotikums in dem Vehikel zwischen etwa 5 % und 10 %. Andere geeignete Formulierungen für Dosierungseinheiten sind hermetisch verschlossene Phiolen , Kunststoffbeutel, sterile, gummiverschlossene Fläschchen u.dgl..
Außerdem kann die antibiotische Substanz der vorliegenden Erfindung als eine topische Zubereitung, wie eine Lösung, eine Creme oder eine Lotion, formuliert werden. Diese Zubereitungen enthalten zweckmäßigerweise 0,1 bis 15 % (Gew./Vol.) des Wirkbestandteils.
Weiterhin sind die antibiotischen Substanzen der Erfindung zur Unterdrückung des Wuchses von Clostridium difficile, welches Colitis pseudomembranacea im Darm hervorruft, lich. Diese Antibiotika könnten bei der Behandlung von Colitis pseudomembranacea durch die orale Verabreichung einer wirksamen Dosis der Antibiotika oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, zubereitet in einer pharmazeutisch annehmbaren Dosierungsform, verwendet werden. Für eine solche Verwendung können die Antibiotika in Gelatinekapseln oder in flüssiger Suspension verabreicht werden.
Neben seiner Wirksamkeit als Arzneimittel kann Antibiotikum A 42867, oder ein annehmbares Salz davon, als ein Tierwachstumsbeschleuniger verwendet werden.
Für diesen Zweck wird eine Verbindung der Erfindung oral in einem geeigneten Futter verabreicht. Die genaue angewendete Konzentration ist jene, die erforderlich ist, um das wirkende Mittel in einer wachstumsbeschleunigenden Wirkmenge zur Verfügung zu stellen, wenn normale Futtermengen aufgenommen werden.
Die Zugabe der Wirkverbindung der Erfindung zum Tierfutter wird vorzugsweise bewirkt, indem ein entsprechendes Futtervorgemisch hergestellt wird, das die Wirkverbindung in einer wirksamen Menge enthält, und indem das Vorgemisch der vollständigen Futtermenge einverleibt wird.
Alternativ kann in das Futter ein den Wirkbestandteil enthaltendes Zwischenkonzentrat oder eine den Wirkbestandteil enthaltende Futterergänzung eingemischt werden.
Die Art und Weise, in welcher solche Futtervorgemische und vollständigen Futterrationen hergestellt und verabreicht werden können, ist in Standardwerken (wie "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., S. Francisco, USA, 1969, oder "Livestock Feeds and Feeding", O and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977) beschrieben, und entsprechende Angaben werden in die vorliegenden Unterlagen durch Bezugnahme darauf aufgenommen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung näher und sollten in keiner Weise als einschränkend betrachtet werden.

Beispiel 1: Herstellung von Antibiotikum A 42867

Die Stammkultur des produzierenden Organismus (Nocardia sp. ATCC 53492) wird auf Hafermehlschrägagarnährböden aufgestrichen und 2 Wochen lang bei 28º C bebrütet.
Eine Tragschlingenmenge des wachsenden Stammes wird in einen 500 ml-Erlenmayerkolben überimpft, der 100 ml eines Impfmediums enthält, das aus 2,0 % Dextrose, 0,8 % Sojabohnenmehl, 0,2 % Hefeextrakt, 0,1 % NaCl und 0,4 % CaCO&sub3; zusammengesetzt ist, wobei der pH-Wert des Mediums vor der Sterilisierung auf 7,3 eingestellt worden ist. Der Kolben wird auf einer Rotationsschüttelmaschine 72 h lang bei 28º C bebrütet. Ein aliquoter Anteil von 100 ml der Kultur wird dann in einen Topffermenter überimpft, der 4 l des gleichen Impfmediums enthält, und die Kultur wird bei 28º C 48 h lang unter Rühren mit etwa 900 UpM und Belüftung mit einem Standardliter Luft je Volumsteil pro Minute bebrütet. Nach Überimpfung von 4 l der Impfkultur in einen Topffermenter, der 200 l Fermentationsmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie das Impfmedium enthält, wird die Fermentation 96 h lang unter Rühren bei etwa 250 UpM und Belüftung mit einem Standardliter Luft je Volumen je Minute ausgeführt.
Die antibiotische Aktivität wurde daren mikrobiologischen Test unter Verwendung von B. subtilis, der auf Davis- Minimalmedium kultiviert wurde, überwacht.

Beispiel 2: Gewinnung von Antibiotikum A 42867

Die gesamte Fermentationsbrühe (400 l), die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten worden ist, wird unter Verwendung eines Filtrierhilfsmittels (Hyflo-FloMa ) auf einem Rotationsfilter filtriert. Die filtrierte Brühe wird mit 2N Chlorwasserstoffsäure auf pH 7,5 eingestellt und zu 1000 ml vorgequollener D-Ala-D-Ala-aminocaproyl- Sepharose-4B-modifizierter Matrix (hergestellt wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 83112555.4 beschrieben) gegeben und über Nacht unter sanftem Rühren belassen. Das Harz wird durch Filtration abgetrennt und mit etwa 10 l 0,5 %igem (Gew./Vol.) HCl-Trispuffer vom pH 7,5, der 5 % (Gew./Vol.) NaCl enthält, und dann mit Wasser (4 x 5 l) gewaschen, während die Brühe verworfen wird. Das Produkt, das selektiv an das Harz gebunden ist, wird mit 1,5 %igem (Gew./Vol.) Ammoniumhydroxid (4 x 5 l) eluiert und auf ein kleines Volumen (etwa 1800 ml) durch azeotrope Destillation mit n-Butanol unter vermindertem Druck eingeengt.
Die konzentrierte, wässerige Lösung wird lyophilisiert, wobei rohes Antibiotikum A 42867 (75,6 g) erhalten wird.

Beispiel 3: Reinigung von rohem Antibiotikum A 42867

Rohes Antibiotikum A 42867, das nach der Verfahrensweise von Beispiel 2 erhalten worden ist (75 g), wird in 2 l Wasser, das 2M Natriumchlorid enthält, aufgelöst, der pH-Wert wird mit 0,1N Natriumhydroxidlösung auf 7,5 eingestellt, und dann wird filtriert.
Das Filtrat wird in einer Menge von 500 ml/h auf eine 1000 ml-Säule (0,1 x 0,1 m) aus vorgequollener D-Ala- D-Ala-6-aminocaproyl-Sepharose-4B-modifizierter Matrix (hergestellt wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 83112555.4 beschrieben) aufgebracht, welche vorher min 0,04M Boratpuffer vom pH 7,5, der 2M Natriumchlorid und 0,6 ml Triton X 100 (Baker-Qualität) enthält, ins Gleichgewicht gebracht worden ist.
Die Säule wird mit 8 l 8M Harnstoff (PH 7,5) bei einer Fließgeschwindigkeit von 500 ml/h und anschließend mit 70 l wässeriger NaOH vom pH 10 gewaschen, wobei Fraktionen zu je 1000 ml gesammelt werden.
Diese Fraktionen werden auf B. subtilis-Kulturen unter Anwendung des Agar-Scheibentests geprüft, und jene Fraktionen, die nicht aktiv sind, werden verworfen, während jene, die (wie im vorliegenden Fall die Fraktionen 63-70) aktiv sind, vereinigt, unter vermindertem Druck mittels azeotroper Destillation mit n-Butanol auf ein kleines Volumen (500 ml ) eingeengt und lyophilisiert werden, wobei Antibiotikum A 42867 (4 g) erhalten wird.

Beispiel 4: Reinigung und Entsalzung von Antibiotikum A 42867

3,5 g von Antibiotikum A 42867, das nach der Verfahrensweise von Beispiel 3 erhalten worden ist, werden in 70 ml einer Lösung von Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat (2,5 g/l) und Acetonitril (91:9) aufgelöst und filtriert. 10 ml dieses Filtrats werden auf eine Edelstahlsäule (2 x 50 cm) aufgebracht, die mit 40 g von 10 um RP 18 Lichrosorb-Umkehrphasensilicagel (Merck) gepackt ist. Die Säule ist ein Teil einer Chromatospac Modulprep-Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue de Canal 91169 Longjumeau, Frankreich).
Die Säule wird mit 8 ml/min unter Verwendung der gleichen Lösung eluiert, die zur Auflösung der Probe verwendet wurde, und es werden Fraktionen zu 50ml gesammelt.
Jede Fraktion wird durch HPLC und durch Papierscheibenbioassay gegenüber empfindlichen Mikroorganismen, wie B. subtilis, überwacht.
Die gegen B. subtilis wirksamen Fraktionen von sieben Durchläufen werden vereinigt, Acetonitril wird durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird mit einer Menge an Wasser verdünnt, welche etwa das Volumen der Anfangslösung hat.
Die Lösung wird auf pH 7,5 eingestellt und später bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/h auf eine Säule (5 x15 cm) von vorgequollener D-Ala-D-Ala-6-aminocaproyl- Sepharose-4B-modifizierter Matrix (hergestellt die in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 83112555.4 beschrieben), die vorher mit einem 0,04M Boratpuffer vom pH 7,5 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufgebracht.
Die Säule wird mit 8 l Wasser (das mit 0,5 ml 1N Chlorwasserstoffsäure pro Liter angesäuert ist) gewaschen.
Die Säule wird dann mit 1,5 %igem (Gew./Vol.) Ammoniumhydroxid eluiert, wobei Fraktionen zu je 100 ml gesammelt werden. Jene Fraktionen, die gegen B. subtilis wirksam sind, werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wobei 1,2 g einer entsalzten Zubereitung von Antibiotikum A 42867 erhalten werden, dessen physikochemische Kennmerkmale oben angegeben sind.

Claims

1. Antibiotikum A 42367 oder ein Salz davon, welches in der Nichtsalzform die folgenden Kennmerkmale aufweist:

Physiko-chemische Kennmerkmale von Antibiotikum A 42867:

A) Ultraviolettabsorptionsspektrum, das in Fig. 1 der angeschlossenen Zeichnungen dargestellt ist und die folgenden Absorptionsmaxima zeigt:

λ max (nm)

a) 0,1 N HCl 282

b) Wasser 282

c) Phosphatpuffer pH 7,4 282

d) Phosphatpuffer pH 9 282

305 (Schulter)

e) 0,1N NaOH 305

265 (Schulter)

B) Infrarotabsorptionsspektrum, welches in Fig. 2 der angeschlossenen Zeichnungen dargestellt ist und die folgenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹) zeigt:

3700-3100, 3000-2800 (Nujol); 1650; 1580; 1460 (Nujol);

1375 (Nujol); 1300; 1235; 1210; 1160; 1130; 1060; 1025;

1000; 970; 840; 790-700; 720 (Nujol)

C) ¹H-NMR-Spektrum, welches in Fig. 3 dargestellt ist und die folgende Gruppe von Signalen (in ppm) bei 270 MHz, aufgezeichnet in DMSO d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als dem internen Standard (0,00 ppm), (δ = ppm) zeigt:

0 90, d [(CH&sub3;)&sub2;-(CH)]; 1,02, d [CH&sub3;-(CH)];

1,23, d [CH&sub3;-(CH)]; 1,52, s [CH&sub3;- ];

1,77, m [CH(CH&sub3;)&sub2;]; 2,38, s (N-CH&sub3;); 3,0-6,35, s und m (aromatisch, Zucker- und peptidische CH-Gruppierungen); 6,27-9,29 (aromatische CH-Gruppierungen, peptidische NH-Gruppierungen und phenolische OH-Gruppierungen)

d = Doublett

s = Singlett

m = Multiplett

D) Retentionszeit (Rt) von 0,537 in bezug auf Vancomycin.HCl (Vancecin, Eli Lilly, Rt 16,36 min) bei Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen:

Säule: Ultrasphere ODS (5 um) Altex (Beckman) 4,6 mm (Innendurchmesser) x 250 mm

Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (5 um)

Eluierungsmittel: Wasser:Acetonitril:2-Ethanolamin: Trifluoressigsäure 9:1:0;01:0,01 (Vol./Vol.)

Fließgeschwindigkeit: 1,6 ml/min

UV-Detektor: 254 nm

Interner Standard: Vancomycin.HCl (Rt 16,36 min) (Vancocin, Eli Lilly)

E) Retentionszeit (Rt) von 0,665 in bezug auf Vancomycin.HCl (Vancocin, Eli Lilly, Rt 9,96 min) bei Analyse durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen:

Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (5 um)

Eluierungsmittel A: CH&sub3;CN 2%

(2,5 g/I) NaH&sub2;PO&sub4;.H&sub2;O 98 % eingestellt auf pH 6,0

Eluierungsmittel B: CH&sub3;CN 70 %

(2,5 g/l) NaH&sub2;PO&sub4;.H&sub2;O 30 % eingestellt auf pH 6,0

Eluierung: linearer Gradient von 5 % bis 60 % des Eluierungsmittels B in Eluierungsmittel A, in 40 min

Fließgeschwindigkeit: 1,6 ml/min

UV-Detektor: 254 nm

Interner Standard: Vancomycin.HCl (Rt = 9,96 min) (Vancocin, Eli Lilly)

F) Elementaranalyse, nachdem die Probe vorher bei etwa 140º C unter einer Inertatmosphäre getrocknet worden ist, wobei die folgende annähernde prozentuelle Zusammensetzung (Durchschnitt) ermittelt wird: Kohlenstoff 53,3 %; Wasserstoff 5,9 %; Stickstoff 7,85 %; Chlor (insgesamt) 4,41 %; Chlor (ionisch) 2,22 %. Anorganische Rückstand bei 900º C in Luft: 0,875 %.

G) Säure-Base-Titrationsprofil in Wasser bei der Titration mit 0,05N wässeriger KOH einer Probe, die vorher mit überschüssiger wässeriger HCl versetzt worden ist,welches Profil pKa-Werte bei 3,2, 7,1 und 8,3 zeigt

H) Rf-Wert von 0,56 in dem folgenden chromatographischen System:

(Wässerige Natriumchloridlösung, 87,5 g/l : wässerige NaH&sub2;PO&sub4;-Lösung 0,5 g/l) 70 %

CH&sub3;CN 30% eingestellt auf pH 6

unter Verwendung von silanisierten Silicagel-Umkehrphasenplatten (RA-18 F&sub2;&sub5;&sub4;)

Sichtbarmachung:

- UV-Licht bei 254 nm

gelbe Farbe mit Pauly-Reagens, nämlich diazotierter Sulfanilsäure (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953))

-Bioautographie unter Verwendung von B. subtilis ATCC 6633 auf Davis-Minimalmedium.

I) Molekulargewicht von etwa 1559, errechnet aus einem FAB-MS-Spektrum, das den M+H -Peak bei 1560 zeigt.

2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Nocardia sp ATCC 53492 oder eine Antibiotikum A 42867- erzeugende Mutante oder Variante davon unter submersen, aeroben Bedingungen in Gegenwart von assimilierbaren Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen kultiviert, das genannte Antibiotikum aus den Fermentationsbrühen gewinnt und isoliert und es erforderlichenfalls in das gewünschte Salz überführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm bei einer Temperatur zwischen 20º C und 40º C kultiviert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Temperatur zwischen 24º C und 35º C anwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gewinnung und Isolierung der antibiotischen Substanzen vornimmt, indem man die filtrierte Fermentationsbrühe einer Affinitätschromatographie an immobilisiertem D-Alanyl-Alanin mit anschließender Verteilungs-, Umkehrphasen- oder Ionenaustauschchromatographie unterwirft.

6. Eine Verbindung des Anspruchs 1 zur Verwendung als Arzneimittel.

7. Die Verwendung einer Verbindung des Anspruchs 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die antibiotische Therapie oder als ein wuchsförderndes Mittel.

8. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkbestandteil eine Verbindung von Anspruch 1 enthält.

9. Eine öiologisch reine Kultur von Nocardia sp. ATCC 53492 oder einer Antibiotikum A 42867-erzeugenden Mutante oder Variante davon, wobei die genannte Kultur geeignet ist, Antibiotikum A 42867 in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Substanzen enthält, in gewinnbarer Menge zu erzeugen.

10. Nocardia sp. ATCC 53492.