DE3780644T2

DE3780644T2 - Glykopeptid-antibiotika.

Info

Publication number: DE3780644T2
Application number: DE8787906741T
Authority: DE
Inventors: Grazia Beretta; Angelo Borghi; Maurizio Denaro; Enrico Selva
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Vicuron Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1986-10-10
Filing date: 1987-10-08
Publication date: 1992-12-10
Anticipated expiration: 2007-10-09
Also published as: CA1337861C; PT85885A; EP0327548B1; KR960013074B1; JPH02500742A; IE872709L; ATE78490T1; JP2554350B2; US5567676A; IE60281B1; EP0327548A1; WO1988002755A1; GR871488B; CN87106876A; DE3780644D1; DK312688A; DK312688D0; IL84092A0; ES2010729A6; KR880701734A

Description

Glycopeptidantibiotika

Das Antibiotikum A 40926 ist ein glycopeptidisches Antibiotikum, das aus einer Actinomadura-Kultur isoliert wurde und Actinomadura sp. ATCC 39727 genannt wird. Es ist ein Komplex, dessen Faktoren Faktor A, Faktor B, Faktor B&sub0;, Faktor PA und Faktor PB heißen. Es wurde in der EP-A-177882 beschrieben.
Das Antibiotikum A 40926 kann durch saure Hydrolyse unter kontrollierten Bedingungen gemäß EP 86117452 in das entsprechende N-Acylaminoglucuronylaglyconderivat umgewandelt werden.
Der Antibiotikum-A 40926-Komplex, die Faktoren davon, der entsprechende N-Acylaminoglucuronylaglyconkomplex und Faktoren davon sind hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien und Neisseriae wirksam.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Desacylderivate der vorstehend genannten Verbindungen, die das Merkmal einer über eine O-glycosidische Bindung, an einen Peptidrest gebundenen N-Acylaminoglucuronylgruppe gemeinsam haben. Sie werden Desacylantibiotikum A 20926, Desacylantibiotikum A 20926 P und Antibiotikum A 40926-Aminoglucuronylaglycon genannt und können durch die nachstehende Formel I wiedergegeben werden (die Numerierung ist analog jener, die von Williams J. et al., in J. Am. Chem. Soc., 106 (1984) 4895- 4908 für andere Glycopeptid-Antibiotika vorgeschlagen wurde):
in der:
A eine 2-Amino-2-desoxy-β-D-glucopyranosiduronsäuregruppe und B ein Wasserstoffatom, eine α-D-Mannopyranosyloder 6-Acetyl-α-D-mannopyranosylgruppe darstellt,
und die Additionssalze davon.
Diese desacylierten Derivate werden insgesamt als "Desacyl A 40926 Antibiotika" bezeichnet und allgemein wird jedes von ihnen als "Desacyl A 40926 Antibiotikum" bezeichnet.
Die vorstehend genannten Ausgangsstoffe, d. h. der antibiotische A 40926-Komplex und Faktoren davon, der entsprechende N-Acylaminoglucuronylaglyconkomplex und Faktoren davon, können durch die vorstehende Formel 1 wiedergegeben werden, in der A eine 2-Desoxy-2-(C&sub1;&sub1;-C&sub1;&sub2;)acylamino-β-D- glucuronylgruppe bedeutet und B ein Wasserstoffatom, eine α- D-Mannosyl- oder 6-Acetyl-α-D-mannosylgruppe darstellt, oder durch ein Säureadditionssalz davon.
Insbesondere ist der Antibiotikum A 40926-Faktor A die Verbindung der vorstehenden Formel, in der A durch die 2-Desoxy-2-undecanoylamino-β-D-glucopyranosiduronylgruppe dargestellt wird und B eine Mannosylgruppe bedeutet, der Antibiotikum A 40926-Faktor B&sub0; die Verbindung der vorstehenden Formel, in der A die 2-Desoxy-2-isododecanoylamino-β-D- glucuronylgruppe bedeutet und B die α-D-Mannosylgruppe wiedergibt, der Antibiotikum A 40926-Faktor B&sub1; die Verbindung der vorstehenden Formel, in der A eine 2-Desoxy-2-dodecanoylamino-β-D-glucuronylgruppe bedeutet und B eine α-D- Mannosylgruppe wiedergibt.
Die Antibiotikum A 40926-Faktoren der "P"-Serien, wie Faktor PA und Faktor PB&sub0;, weichen von den entsprechenden Faktoren (Faktor A bzw. B&sub0;) dadurch ab, daß die Mannoseeinheit durch eine 6-Acetylmannoseeinheit ersetzt ist,
Antibiotikum A 40926 N-Acylaminoglucuronylaglycone werden durch die vorstehende Formel wiedergegeben, in der A wie vorstehend definiert ist und B ein Wasserstoffatom bedeutet. Ihre Acylkette an der Aminoglucuronylgruppe entspricht jener der Einzelfaktoren des Antibiotikums A 40926.
Auf der Basis verfügbarer Daten und durch Vergleich bekannter Stoffe kann man dem Desacyl-Antibiotikum A 40926 die vorstehende Formel zuordnen, in der A eine 2-Amino-2- desoxy-β-D-glucuronylgruppe bedeutet und B eine α-D-Mannosylgruppe bedeutet, dem Desacyl-Antibiotikum A 40926 P die vorstehende Formel, in der A eine 2-Amino-2-desoxy-β-D- glucuronylgruppe bedeutet und B eine 6-Acetyl-α-D-mannosylgruppe darstellt und dem Antibiotikum A 40926-Aminoglucuronylaglycon die vorstehende Formel, in der A eine 2-Amino-2- desoxy-β-D-glucuronylgruppe bedeutet und B ein Wasserstoffatom darstellt.
Die Antibiotikum A 40926-Faktoren PA und PB sind zumindest unter bestimmten Fermentationsbedingungen die antibiotischen Hauptprodukte von durch Mikroorganismen hergestelltem A 40926.
Die Antibiotikum A 40926-Faktoren A und B sind hauptsächlich Umwandlungsprodukte des Antibiotikum A 40926 Faktor PA bzw. Faktor PB und sind häufig bereits in der Fermentationsbrühe vorhanden.
Es wurde gefunden, daß unter basischen Bedingungen Antibiotikum A 40926 Faktor PA zum Antibiotikum A 40926 Faktor A und Antibiotikum A 40926 Faktor PB zu Antibiotikum A 40926 Faktor B umgewandelt werden kann, was zu einer Entfernung der Acetylgruppe der Mannoseeinheit ohne Entfernung der Acylgruppe der Aminoglucuronyleinheit führt.
Im Ergebnis, falls die Fermentationsbrühe oder ein Antibiotikum A 40926 haltiger Extrakt oder ein Konzentrat davon eine bestimmte Zeit basischen Bedingungen ausgesetzt wird (z. B. einer wäßrigen Lösung einer nukleophilen Base; bei einem pH > 9, über Nacht) wird ein Antibiotikum A 40926 Komplex erhalten, der mit Antibiotikum A 40926 Faktor A und Faktor B angereichert ist (vgl. EP-A-177882).
Der gleiche Umwandlungstyp unter basischen Bedingungen kann für die Umwandlung eines Desacyl-Antibiotikums A 40926 P zum Desacyl-Antibiotikums A 40926 angewendet werden.
Desacyl-Antibiotikum A 40926 besitzt die nachstehenden physikochemischen Eigenschaften:
A) Das Ultraviolettabsorptionsspektrum, abgebildet in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen, zeigt die nachstehenden Absorptionsmaxima: b) Phosphatpuffer pH 6,0 c) Phosphatpuffer pH 7,4
B) Das Infrarotabsorptionsspektrum, abgebildet in Figur 2 der beigefügten Zeichnungen, zeigt die nachstehenden Absorptionsmaxima in Nujol (u, cm&supmin;¹):
3700-3100; 3000-2800 (Nujol) ; 1650; 1590; 1505; 1460 (Nujol); 1375 (Nujol); 1300; 1230, 1210, 1150, 1060, 1030, 970, 810, 720 (Nujol)
C) Das ¹H-NMR-Spektrum, abgebildet in Figur 3 der beigefügten Zeichnungen, zeigt die nachstehenden Signalgruppen (in ppm) bei 270 MHz, erstellt in DMSO d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) [( , ppm; m; Bedeutungen)]
2,30, s (N-CH&sub3;); 2,49, s (DMSOd&sub5;); 2,7-3,8, m (Zucker CH-Gruppen); 2,79 m (Z2); 4,08 m (X6); 4,33 s (X1); 4,37 d (X5); 4,37 d (X7); 4,86 m (X2); 5,08 s (4f); 5,08 s (Z6); 5,27 s (anomeres Proton der Mannose), 5,35 d (anomeres Proton der Aminoglucuronsäure); 5,61 d (X4); 5,86 s (4b); 6,05, d (X3); 7,73 s (6b); 6,45-8,49 (aromatisches Protonen und peptidische NH-Gruppen)
s = Singulett; d = Dublett; m = Multiplett
D) Retentionszeit (Rt) 0,34, bezogen auf Vancomycin (Eli Lilly)
Säule: silanisiertes Kieselgel Ultrasphere ODS (5 um) 4,6 mm x 25 cm Altex (Beckman)
Isokratische Eluierung mit 18 mM Natriumphosphatpuffer/CH&sub3;CN 92/8 (V/V)
Fließgeschwindigkeit: 1,8 ml/min
Detektor: UV 254 nm
Innerer Standard: Vancomycin (Eli Lilly) Rt 8,4 min
E) Molekulargewicht von 1548 bestimmt durch FAB-MS- Spektroskopie.
Durch Vergleich mit den physikochemischen Daten der Ausgangsstoffe insbesondere in bezug auf das NMR-Spektrum wird ersichtlich, daß die aliphatischen Protonen im Bereich von 0,8 bis 2,0 ppm entsprechenden Peaks in dem neuen Molekül nicht mehr vorliegen.
Auch im Falle des Desacyl-Antibiotikums A 40926 P und des Antibiotikums A 40926 Aminoglucuronylaglycons besteht der Hauptunterschied zwischen den NMR-Spektren dieser Verbindungen und den entsprechenden "acylierten" Verbindungen in der Abwesenheit der Signale für aliphatische Protonen im Bereich von 0,8 - 2,0 ppm.
Genauer gesagt, weist das ¹H-NMR-Spektrum des Desacyl-Antibiotikums A 40926 P die nachstehenden Signalgruppen (ppm) bei 270 mHz auf, erstellt in DMSO d&sub6; [ , ppm, m (Bedeutung)]:
2,0, s(CH&sub3;CO); 2,3, s (NCH&sub3;); 2,5, s (DMSO d&sub5;); 2,7-3,8, m (Zucker CHF); 2,8, m (Z2); 4,1, m (X6); 4,l, m (CH&sub2;O, Zucker); 4,4 s (X1); 4,4 d (X5); 4,4 d (X7); 4,9 m (X2); 5,1, s (4f); 5,1, s (Z6); 5,3, s (anomeres Mannoseproton); 5,4, d (anomeres Aminoglucuronsäureproton); 5,6, d (X4); 5,8, s (4b); 6,1 d (X3); 7,7, s (6b); 6,5-8,6 (aromatische und peptidische NHF).
Das ¹H-NMR-Spektrum des Antibiotikum A 40926 Aminoglucuronylaglycons besitzt die nachstehenden Signalgruppen (ppm) bei 270 MHz, erstellt in DMSO d&sub6; [a ppm, m, (Bedeutung)]:
2,3, s (NCH&sub3;); 2,5, s (DMSO d&sub5;); 2,7-3,8 m (Zucker CHF); 2,8, m (Z2); 4,1, m (X6); 4,4, s (X1); 4,4, d (X5); 4,4 d (X7); 4,9, m (X2); 5,1, s (4f); 5,1, s (Z6); 5,4 d (anomeres Aminoglucuronsäureproton); 5,5 d (X4); 5,7, s (4b); 6,1, d (X3); 7,7, s (6b); 6,2-8,5 (aromatische und peptidische NHF).
Die antibakterielle Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in vitro mit Hilfe von Standardverdünnungstests an verschiedenen Mikroorganismuskulturen gezeigt werden.
Die Kulturmedia und Wachstumsbedingungen für die MIC (minimale Inhibitorkonzentration)-Bestimmungen waren wie folgt: Isosensitest-Brühe (Oxoid), 24 H, für Staphylococcen, Strep. faecalis und gram-negative Bakterien (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae); Todd-Hewitt-Brühe (Difco), 24 h für andere streptococcale Spezies; GC-Grund-Brühe (Difco) + 1 % Isovitalex (BBL), 48 h, CO&sub2;-angereicherte Atmosphäre für Neisseria gonorrhoeae, Hirn-Herz-Brühe (Difco) + l % Supplement C (Difco), 48 h für Haemophilus influenzae; AC- Brühe (Difco), 24 h, anaerobe Atmosphäre für Clostridium perfringens; PPLO-Brühe mit Zusätzen nach R. T. Evans und D. Taylor-Robinson (J. Antimicrob. Chemother. 4, 57), 24 h für U. urealvticum. Die Inkubation erfolgte bei 37ºC. Die Beimpfung erfolgte wie nachstehend: etwa 10&sup4; farbändernde Einheiten/ml für U. urealyticum; etwa 10&sup4;-10&sup5; koloniebildende Einheiten/ml für andere Brüheverdünnungs-MICs.
Die minimalen Inhibitorkonzentrationen (MIC, ug/ml) für einige Mikroorganismen sind in der nachstehenden Tabelle I angeführt. Tabelle I Stamm M.I.C. (microg/ml) De-acyl Antibiotikum A 40926 Staph. aureus L165 Staph. aureus (10&sup6; cfu/ml) Staph. aureus (30% Rinderserum) Staph. epidermidis L147 ATCC 12228 (Coagulase negativ) Staph. haemolyticus L602 (klinisches Isolat) Strep. pyogenes L49 C203 Strep. pneumoniae L44 UC41 Strep. faecalis L149 ATCC 7080 Strep mitis L796 (klinisches Isolat) Clostridium perfringens L290 ISS 30543 Neisseria gonorrhoeae L997 ISM68/126 Haemophilus influenzae L970 Typ b ATCC 19418 Escherichia coli L47 SKF 12140 Proteus vulgaris L79 X19H ATCC881 Pseudomonas aeruginosa L4 ATCC10145 Ureaplasma urealyticum L1479 (klinisches Isolat) Klebsiella pneumoniae L142
Das Antibiotikum A 40926 Aminoglucuronylaglycon und das Desacyl-Antibiotikum A 40926 P zeigen im wesentlichen den gleichen Grad antimikrobieller Wirksamkeit, der vorstehend für das Desacyl-Antibiotikum A 40926 angeführt wurde.
Die antimikrobielle Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wird auch durch experimentell hervorgerufene Septikämie bei Mäusen bestätigt.
Kontroll- und Behandlungsgruppen können zehn CD-1- Mäuse (Charles River) mit einem Gewicht von 18 - 22 g einschließen. Sie werden intraperitoneal mit 0,5 ml einer bakteriellen Suspension infiziert, die durch Verdünnen einer Übernachtkultur von S. pyogenes C 203 (L 49) mit steriler peptonisierter Salzlösung hergestellt wurde. Die Beimpfungen werden so eingestellt, daß die unbehandelten Tiere innerhalb von 48 h an Septikämie sterben. Die zu prüfenden Verbindungen werden subkutan unmittelbar nach der Infektion verabreicht. Am siebten Tag wird der ED&sub5;&sub0;-Wert in mg/kg gemäß dem Verfahren von Spearman und Kärber (D. J. Finney "Statistical Methods in Biological Assay", Griffin, Seite 524, 1952) aus dem prozentualen Anteil der überlebenden Tiere bei jeder Dosis berechnet.
Unter diesen Bedingungen ist der ED&sub5;&sub0;-Wert für das Desacyl-Antibiotikum A 40926 z. B. 2,33 mg/kg, s.c.
Die Desacyl A 40926 Antibiotika besitzen saure und basische Funktionen und können mit organischen und anorganischen Gegenionen nach üblichen Verfahren Salze bilden.
Repräsentative und geeignete Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen sind jene Salze, die durch Standardumsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren hergestellt werden, z. B. Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Trifluoressig-, Trichloressig-, Bernstein-, Zitronen-, Ascorbin-, Milch-, Malein-, Fumar-, Palmitin-, Cholin-, Pamoin-, Schleim-, Glutamin-, Campher-, Glutar-, Glykol-, Phthal-, Wein-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Sorbin-, Picrin-, Benzoe- oder Zimtsäure und ähnliche Säuren.
Repräsentative Beispiele für diese Basen sind: Alkalimetall oder Erdalkalimetallhydroxide, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- oder Bariumhydroxid; Ammoniak und aliphatische, alicyclische oder aromatische organische Amine, wie Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin und Picolin.
Die Überführung der "Nicht-Salz" -Verbindungen der Erfindung in die entsprechenden Additionssalze und zurück, d. h. Überführung eines Additionssalzes einer erfindungsgemäßen Verbindung in eine Nicht-Salz-Form, liegt innerhalb normalen technischen Fachwissens und wird von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt.
Zum Beispiel können das Desacyl-Antibiotikum A 40926, das Antibiotikum A 40926 Aminoglucuronylaglycon oder das Desacyl-Antibiotikum A 40926 P durch Lösen der Nicht-Salz- Form in einem wäßrigen Lösungsmittel und Zugabe eines leichten molaren Überschusses der ausgewählten Säure oder Base in das entsprechende Säure- oder Basenadditionssalz überführt werden. Die erhaltene Lösung oder Suspension wird dann lyophilisiert, um das gewünschte Salz zu gewinnen.
Falls das endgültige Salz in einem Lösungsmittel nicht löslich ist, jedoch die Nicht-Salz-Form löslich ist, wird es durch Filtration aus der organischen Lösung der Nicht-Salz-Form nach Zugabe einer stöchiometrischen Menge eines geringen molaren Überschusses der ausgewählten Säure oder Base gewonnen.
Die Nicht-Salz-Form kann aus einem in einem wäßrigen Lösungsmittel gelösten entsprechenden Säure- oder Basensalz, das dann unter Freisetzung der Nicht-Salz-Form neutralisiert wird, hergestellt werden.
Folgt man diesem Schritt, so ist die Beseitigung eines Säure- oder Basenüberschusses erforderlich. Dafür kann ein übliches Entsalzungsverfahren Anwendung finden.
Zum Beispiel kann Säulenchromatographie an silanisiertem Kieselgel, nicht-funktionalisiertem Polystyrol-, Acryl- oder kontrolliert porösem Polydextranharz (wie Sephadex LH 20) oder aktiviertem Kohlenstoff in üblicher Weise Anwendung finden. Nachdem die unerwünschten Salze mit einer wäßrigen Lösung eluiert wurden, wird das gewünschte Produkt mit Hilfe eines linearen oder stufenförmigen Gradienten eines Gemisches aus Wasser und einem polaren oder apolaren organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril/Wasser von 50:50 bis etwa 100 % Acetonitril, eluiert.
Es gehört zum Fachwissen, daß die Salzbildung sowohl mit pharmazeutisch verträglichen Säuren (oder Basen) als auch nichtpharmazeutisch verträglichen Säuren (oder Basen) für übliche Reinigungstechniken verwendet werden kann. Nach der Bildung und Isolierung kann die Salzform eines A 40926 Antibiotikums in die entsprechende Nicht-Salz-Form oder in eine pharmazeutisch verträgliche Salzform überführt werden.
In einigen Fällen ist ein Basenadditionssalz eines Desacyl A 40926 Antibiotikums mehr in Wasser und hydrophilen Lösungsmitteln löslich.
Das Desacyl-Antibiotikum A 40926, Desacyl-Antibiotikum A 40926 P und Antibiotikum A 40926-Aminoglucuronylaglycon werden aus Antibiotikum A 40926 Komplex oder einem Faktor davon, Antibiotikum A 40926 Faktor PA oder Faktor PB oder einem Gemisch davon bzw. Antibiotikum A 40926 N- Acylaminoglucuronylaglyconkomplex oder einem Faktor davon durch mikrobiologische Umwandlung mit geeigneten Actinoplanes-Stämmen hergestellt, wie Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, Actinoplanes missouriensis ATCC 23342, Actinoplanes missouriensis NRRL 15647 oder NRRL 15646 und Actinoplanes NRRL 3884. Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 ist im US-Patent 4,239,751 beschrieben, Actinoplanes missouriensis ATCC 23342 ist im US-Patent 3,952,095 beschrieben, Actinoplanes missouriensis NRRL 15647 und NRRL 15646 sind im US-Patent 4,587,218 beschrieben, während Actinoplanes NRRL 3884 im US-Patent 3,780,174 beschrieben ist. Alle diese Stämme sind von den entsprechenden Hinterlegungsstellen erhältlich.
Insbesondere wird das selektierte Ausgangsmaterial entweder in reiner Form oder in Form einer beliebigen rohen Zubereitung davon, einschließlich der geernteten Fermentationsbrühe von Actinomadura sp. ATCC 39727 oder einer produzierenden Mutante oder Variante davon, mit einer Kultur eines Actinoplanes-Stammes, wie Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, Actinoplanes missouriensis ATCC 23342, Actinoplanes missouriensis NRL 15646, Actinoplanes missouriensis NRRL 15647 oder Actinoplanes NRRL 3884, vorzugsweise während der Fermentation, in Kontakt gebracht.
Ein Actinoplanes-Stamm, wie vorzugsweise Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, Actinoplanes missouriensis ATCC 23342, Actinoplanes missouriensis NRRL 15646, Actinoplanes missouriensis NRRL 15647 oder Actinoplanes NRRL 3884, wird unter gewöhnlichen submersen aeroben Bedingungen in einem assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Medium kultiviert. Beispiele für solche Medien sind die in den vorstehend zitierten US- Patentschriften angegebenen und weitere aus dem Stand der Technik bekannte.
Im allgemeinen kann das vorstehend genannte Ausgangsmaterial zu einer Kultur eines Actinoplanes-Stammes, vorzugsweise Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, Actinoplanes missouriensis ATCC 23342, Actinoplanes missouriensis NRRL 15646, Actinoplanes missouriensis NRRL 15647 oder Actinoplanes NRRL 4885, zu einer Zeit zugegeben werden, die vom Zeitpunkt Null bis zu jenem Zeitpunkt variiert, bei dem die Kultur ihr maximales Wachstum erreicht hat. In manchen Fällen ist eine Zugabe nach 36 bis 72 h Wachstum bevorzugt.
Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen zwischen 20ºC und 40ºC, vorzugsweise zwischen 24ºC und 35ºC und am bevorzugtesten zwischen 25ºC und 32ºC.
Die Reaktionszeit, d. h. die Zeit, die der Ausgangsstoff der mikrobiellen Kulturumgebung bis zur Gewinnung des Endproduktes ausgesetzt wird, kann in Abhängigkeit von den spezifischen angewendeten Bedingungen zwischen 100 und 300 h variieren. Da die Umsetzung z. B. durch Verfolgen der Abnahme an Ausgangsmaterial und/oder der Zunahme des Endproduktes in üblicher Weise durch HPLC verfolgt werden kann, ist der Fachmann jedenfalls in der Lage, in leichter Weise zu bestimmen, wann die Umsetzung als vollständig bezeichnet werden und die Isolierung beginnen kann.
Anstelle der Anwendung einer Anzuchtkultur eines Actinoplanes-Stammes, wie Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, Actinoplanes missouriensis ATCC 23342, Actinoplanes missouriensis NRRL 15646, Actinoplanes missouriensis NRRL 15647 oder Actinoplanes NRRL 3884, kann man eine Kultur einer beliebigen Mutante oder Variante davon verwenden, die in der Lage ist, das vorstehend erwähnte Ausgangsmaterial zu den desacylierten Verbindungen der Erfindung zu desacylieren. Ein beliebiges Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, welches eine solche beliebige Mutante oder Variante anwendet, wird als vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen betrachtet. Actinoplanes missouriensis NRRL 15646 und NRRL 15647 wurden tatsächlich durch chemische Mutagenese von Actinoplanes missouriensis ATCC 31683 erhalten, das wiederum ein Mutationsprodukt von Actinoplanes missouriensis ATCC 23342 ist, Actinoplanes missouriensis ATCC 31683 wird in US-Patent 4,322,406 und 4,375,513 mit Actinoplanes missouriensis ATCC 31682 und ATCC 32680 beschrieben und ist wie die anderen angeführten Actinoplanes-Stämme von der Hinterlegungsstelle erhältlich.
Ein Mutantenstamm von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 wurde am 21. Juli 1987 bei ATCC hinterlegt und erhielt die Eingangsnummer 53649. Dieser Stamm wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt.
Anstelle der Verwendung einzelner reiner Kulturen der vorstehenden desacylierenden Mikroorganismen kann jedes Gemisch davon in jeglichem Verhältnis verwendet werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach dem Verfahren der Erfindung auch unter Verwendung des gewaschenen Mycels einer der vorstehend genannten desacylierenden Mikroorganismuskulturen, übliches Resuspendieren in ein physiologisch verträgliches Medium, einer zellfreien Zubereitung, erhältlich durch Sprengung der Zellen, z. B. durch Beschallen und Sammeln der Debris durch Zentrifugieren oder eines zellfreien wasserlöslichen Extraktes oder Konzentrates, erhältlich aus einer Zubereitung zersprengter Zellen, hergestellt werden. Die Reaktionszeit und -temperatur kann in diesem Fall eine bestimmte Anpassung erfordern, aber im wesentlichen gilt das vorstehend Angeführte auch für die gesamte mikrobielle Kultur, sogar wenn die Temperatur, die vorzugsweise zwischen 25ºC und 50ºC liegt, mindestens bei einigen Fällen, bis zu 50º-60ºC anwachsen kann.
Die Gewinnung der antibiotischen Stoffe aus dem Reaktionsmedium erfolgt dann mit an sich bekannten Techniken, wie Lösungsmittelextraktion, Ausfällung durch Zugabe von Nicht-Lösungsmitteln oder Änderung des pHs der Lösung, Verteilungschromatographie, Umkehrphasenverteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und ähnliche.
Ein bevorzugtes Verfahren ist die Affinitätschromatographie an immobilisiertem D-Alanyl-D-alanin, gefolgt durch Trennung bei einem unterschiedlichen pH-Wert.
Für das vorliegende Gewinnungsverfahren geeignete immobilisierte D-Alanyl-D-alanin-Matrices sind in der EP-A- 122969 beschrieben. Die bevorzugte Matrix für dieses Isolierungsverfahren ist an ein kontrolliert poröses, vernetztes Polydextran gekuppeltes D-Alanyl-D-alanin, das ebenfalls dort beschrieben ist.
Das Reaktionsmedium kann direkt nach dem Filtrieren oder nach einem vorläufigen Reinigungsverfahren der Affinitätschromatographie unterzogen werden. Das letztere Verfahren bedeutet somit, daß das gesamte Medium vorzugsweise zwischen pH 8,5 und 10,5 basisch gemacht wird und dann, falls zweckmäßig, in Gegenwart einer Filtrierhilfe filtriert wird. Falls das Reaktionsmedium für eine gewisse Zeit beim basischen pH-Wert gehalten wird, wird Desacyl-Antibiotikum A 40926 P analog der Umwandlung der betreffenden Ausgangsstoffe unter den gleichen Bedingungen in Desacyl-Antibiotikum A 40926 umgewandelt. (Diese Umwandlung kann, wie gewöhnlich, durch HPLC verfolgt werden.)
Das klare Filtrat wird dann auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8 eingestellt und dann einer Affinitätschromatographie an immobilisiertem D-Alanyl-D-alanin entweder in einer Säule oder im Batchverfahren unterzogen.
Da die Bindung der Substanz an die Affinitätsmatrix vorwiegend beim pH von etwa 7,0 bis 8,0 erfolgt, wird die Eluierung bei basischeren pH-Werten (vorzugsweise zwischen 9,0 und 10,5) mit Hilfe einer wäßrigen Base durchgeführt. Diese wäßrige Base kann Ammoniak, ein flüchtiges Amin, ein Alkalimetall oder Erdalkalimetallhydroxid oder eine basische Pufferlösung, gegebenenfalls in Gegenwart eines polaren organischen Lösungsmittels, wie ein polares mit Wasser mischbares Lösungsmittel, sein.
Repräsentative Beispiele polarer, mit Wasser mischbarer Lösungsmittel sind: mit Wasser mischbare Alkohole (wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Butanol), Aceton, Acetonitril, Alkansäureniederalkylester (wie Essigsäureethylester), Tetrahydrofuran, Dioxan und Dimethylformamid und Gemische davon. Das bevorzugte polare, mit Wasser mischbare Lösungsmittel ist Acetonitril.
Nach Entfernen der Verunreinigungen durch Spülen der Säule mit einem wäßrigen Puffer vom pH 4 bis 9, der gegebenenfalls Salze, Harnstoff und/oder mit Wasser mischbare Lösungsmittel enthält, wird die antibiotische Substanz Desacyl A 40926 mit dem vorstehenden Eluierungsgemisch eluiert.
Dieses Eluat wird mit einer organischen oder einer Mineralsäure auf den pH 2,5 bis 4,0 eingestellt, um die Stoffe, die bei diesem pH-Wert unlöslich sind, zu entfernen.
Der Niederschlag wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt. Der das Antibiotikum Desacyl A 40926 enthaltende Überstand wird dann zweckmäßigerweise entsalzt.
Ein zweckmäßiges Entsalzungsverfahren besteht im Aufbringen der das Antibiotikum enthaltenden wäßrigen Lösung auf eine silanisierte Kieselgelsäule, Waschen mit destilliertem Wasser und Eluieren mit einem Gemisch eines wie vorstehend definierten polaren, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels und Wasser. Als Alternative kann die Entsalzung durch Aufbringung der das Antibiotikum enthaltenden Lösung auf die vorstehend beschriebene Affinitätssäule, Waschen mit destilliertem Wasser und Eluieren, wie vorstehend bei der Affinitätschromatographie beschrieben, mit einer flüchtigen wäßrigen Base durchgeführt werden.
Das erhaltene Produkt, nämlich Desacyl A 40926 Antibiotikum, Antibiotikum A 40926-aminoglucuronylaglycon oder Desacyl-Antibiotikum A 40926 P wird durch Konzentrieren der diese Substanzen enthaltenden eluierten Fraktionen (HPLC- Analyse), gefolgt von Ausfällen durch Zugabe eines Nicht- Lösungsmittels oder Lyophilisieren, im wesentlichen rein erhalten.
Beispiele für Nicht-Lösungsmittel sind mit Wasser mischbare Ketone, wie Aceton oder Methylethylketon, oder mit Wasser mischbare Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Propanol und ähnliche, sowie auch deren Gemische mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Petrolether und Niederalkylether, wie Ethylether, Propylether und Butylether.
Desacyl-Antibiotikum A 40926, Desacyl-Antibiotikum A 40926 P und Antibiotikum A 40926-aminoglucuronylaglycon sind gegen gram-positive Bakterien wirksam, die für viele weitverbreitete Infektionen verantwortlich sind. Da diese pathogenen Keime gegen übliche therapeutische Behandlungen wachsenden Widerstand zeigen, besteht ein großer Bedarf an neuen antibiotischen Stoffen.
Im allgemeinen können Desacyl-Antibiotikum A 40926, Desacyl-Antibiotikum A 40926 P und Antibiotikum A 40926- Aminoglucuronylaglycon sowie auch ihre nicht-toxischen pharmazeutisch verträglichen Salze oder Gemische davon zur antibakteriellen Behandlung in verschiedener Weise, z. B. örtlich oder parenteral, verabreicht werden. Die parenterale Verabreichung ist im allgemeinen die bevorzugte Verabreichungsform.
Injektionsmittel können als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern vorliegen und können Hilfsstoffe, wie suspendierende, stabilisierende und/oder dispergierende Mittel, enthalten.
Alternativ dazu kann der Wirkstoff zum Zeitpunkt der Lieferung in Pulverform zur Rekonstitution vorliegen, falls ein geeigneter Träger, wie steriles Wasser, dazugegeben wird.
In Abhängigkeit von der Verabreichungsform können diese Verbindungen in verschiedenen Dosierungsformen formuliert werden.
In einigen Fällen ist es möglich, die Verbindungen der Erfindung in darmlöslicher Dosierungsform zur oralen Verabreichung, wie sie in bekannter Weise hergestellt werden, zu formulieren (siehe z. B. "Remington's Pharmaceutical Sciences", fünfzehnte Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, Seite 1614).
Dies kann insbesondere dann der Fall sein, wenn die Absorption des antimikrobiellen Stoffes im Darmtrakt besonders erwünscht ist, während es den Magentrakt unverändert passieren soll.
Die Menge des zu verabreichenden Wirkstoffs hängt von verschiedenen Faktoren, wie Größe und Befinden des zu behandelnden Subjekts, des Weges und des zeitlichen Abstands der Verabreichung und des verursachenden Agens ab.
Die antibiotischen Stoffe der vorliegenden Erfindung, nämlich Desacyl-Antibiotikum A 40926, Desacyl-Antibiotikum A 40926 P und Antibiotikum A 40926-aminoglucuronylaglycon und die physiologisch verträglichen Salze davon sind im allgemeinen bei einer täglichen Dosis zwischen etwa 0,5 und 50 mg Wirkstoff je Kilogramm Körpergewicht des Patienten, gegebenenfalls aufgeteilt auf ein bis vier Verabreichungen je Tag, wirksam.
Besonders wünschenswerte Mittel sind jene, die in Dosierungseinheiten, die etwa 100 bis etwa 5000 mg je Einheit enthalten, hergestellt werden.
Langzeitwirkende Formulierungen können auf der Basis verschiedener Mechanismen und Methoden in an sich bekannter Weise hergestellt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer langzeitwirkenden Formulierung, die Desacyl-antibiotikum A 40926, Desacyl-antibiotikum A 40926 P oder das Antibiotikum A 40926-aminoglucuronylaglycon enthält, beinhaltet die Verwendung einer wasserunlöslichen Form des Antibiotikums, die in einem wäßrigen oder öligen Medium suspendiert ist.
Vorzugsweise sind die pharmazeutischen Zubereitungen der Erfindung zur Therapie (einschließlich Prävention, Behandlung, Heilung etc.) bei Menschen gedacht, jedoch können Primaten und Säugetiere im allgemeinen, als auch Haustiere ebenso mit den Verbindungen und Zubereitungen der Erfindung behandelt werden.

Herstellung von Arzneimitteln:

Eine Einheitsdosierungsform zur intramuskulären Injektion wird mit 5 ml einer sterilen Suspension USP, enthaltend 8 % Propylenglykol und 500 mg eines physiologisch verträglichen Basenadditionssalzes eines Desacyl-antibiotikums A 40926 hergestellt.
Eine Einheitsdosierungsform zur intramuskulären Injektion wird mit 5 ml einer sterilen Suspension USP, enthaltend 8 % Propylenglykol und 500 mg eines physiologisch verträglichen Basenadditionssalzes des Antibiotikums A 40926- aminoglucuronylaglycon hergestellt.
Eine Einheitsdosierungsform zur intramuskulären Injektion wird mit 5 ml einer sterilen Suspension USP, enthaltend 8 % Propylenglykol und 250 mg eines physiologisch verträglichen Basenadditionssalzes von Antibiotikum A 40926- aminoglucuronylaglycon hergestellt.
Eine Einheitsdosierungsform zur intramuskulären Injektion wird mit 1000 mg Antibiotikum A 40926-aminoglucuronylaglycon in wasserunlöslicher Form, suspendiert in 5 ml sterilem Wasser zur Injektion, zubereitet.
Des weiteren können die antibiotischen Substanzen der Erfindung zur Wachstumshemmung von Clostridium difficile verwendet werden, welches im Darm pseudomembranöse Colitis hervorruft. Diese Antibiotika können bei der Behandlung von pseudomembranöser Colitis durch orale Verabreichung einer wirksamen Dosis eines Antibiotikums oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, hergestellt in einer pharmazeutisch verträglichen Dosierungsform, verwendet werden. Für eine derartige Verwendung können die Antibiotika in Gelatinekapseln oder als flüssige Suspension verabreicht werden.
Neben ihrer Wirksamkeit als Arzneimittel können Desacyl-antibiotikum A 40926, Desacyl-antibiotikum A 40926 P und Antibiotikum A 40926-aminoglucuronylaglycon und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon als Wachstumspromotoren für Tiere verwendet werden.
Der Ausdruck "Tier" in diesem Zusammenhang schließt jedes beliebige nicht-menschliche Warmbluttier ein, insbesondere jene, die zur menschlichen Ernährung gezüchtet werden, und Haustiere.
Zu diesem Zweck wird eine Verbindung der Erfindung oral in einem geeigneten Futter verabreicht. Die genaue Konzentration, die angewendet wird, ist jene, die, falls normale Futtermengen verbraucht werden, für den Wirkstoff in einer wachstumsfördernd wirksamen Menge erforderlich ist.
Die Zugabe der wirksamen Verbindung der Erfindung zum Tierfutter wird vorzugsweise durch Zubereiten des geeigneten vorvermischten Futters, das die wirksame Verbindung in einer wirksamen Menge enthält, und Einbringen der Vormischung in die vollständige Ration erfolgen.
Alternativ dazu kann ein den Wirkstoff enthaltendes Zwischenkonzentrat oder Futterzusatz in das Futter eingemischt werden.
Die Art und Weise, in der solche Vormischungen und vollständigen Rationen hergestellt und verabreicht werden können, sind in Monographien (wie "Applied Animal Nutrition", W. H. Freedman und Co., S. Francisco, USA, 1969 oder "Livestock Feeds and Feeding" O and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977) beschrieben und hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Die Herstellung des Antibiotikum A 40926-Komplex und der Einzelfaktoren davon aus Actimomadura sp. ATCC 39727 oder einer produzierenden Mutante oder Variante davon ist in der EP-A-177882 beschrieben.

Herstellung von Antibiotikum A 40926 N- Acylaminoglucuronylaglycon

Antibiotikum A 40926-N-acylaminoglucuronylaglycon-Komplex AB, -N-acrylaminoglucuronylaglycon Faktor A, -N- acylamnoglucuronylaglycon Faktor B, Antibiotikum A 40926 N- acylaminoglucuronylaglycon Faktor B&sub0;, Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon Faktor B&sub1; und Antibiotikum A 40926-aglycon werden aus Antibiotikum A 40926-Komplex oder einem Einzelfaktor oder einem Gemisch der Faktoren in beliebigen Verhältnissen, d. h. A 40926-Faktor A, A 40926-Faktor B, A 40926-Faktor PH, A 40926-Faktor PB, A 40926-Faktor B&sub0; und A-40926 Faktor B&sub1; durch kontrolliert saure Hydrolyse hergestellt.
Im allgemeinen wird diese Hydrolyse in Gegenwart einer starken Säure in einem geeigneten organischen Lösungsmittel durchgeführt. Die Reaktionstemperatur kann ºC und 100ºC, am meisten bevorzugt zwischen 25ºC und 80ºC.
Die Reaktionszeit variiert in Abhängigkeit von den speziellen Reaktionsbedingungen.
Im allgemeinen beträgt die Reaktionszeit zwischen 30 min und 120 h.
Da der Reaktionsverlauf jedoch durch TLC oder HPLC verfolgt werden kann, ist der Fachmann in der Lage zu entscheiden, wann die Hydrolyse für das Ausgangsmaterial als vollständig abgelaufen zu bezeichnen ist und wann mit der Isolierung begonnen werden kann.
Repräsentative Beispiele starker Säuren sind Mineraloder starke organische Säuren wie Halogenwasserstoffe, z. B. Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäuren, Schwefelsäure, halogenierte Essigsäuren, z. B. Trichloressigsäure, Trifluoressigsäure, Chlordifluoressigsäure und ähnliche.
Geeignete organische Lösungsmittel sind jene, die die Eigenschaft besitzen, daß
a) sie zumindest teilweise das Ausgangsmaterial zu lösen vermögen,
b) einmal erhaltene Produkte sich von ihnen entweder trennen oder von ihnen mit üblichen Techniken getrennt werden können, und
c) sie auf keinen Fall in unerwünschter Weise den Reaktionsverlauf stören.
Beispiele für organische Lösungsmittel sind protische oder aprotische Lösungsmittel, wie (C&sub1;-C&sub4;)Alkylsulfoxide, z. B. Dimethylsulfoxid und Diethylsulfoxid, (C&sub1;- C&sub4;)Alkylformamide, z. B. Dimethylformamid, Diethylformamid, Dioxan, Tetrahydrofuran und ähnliche Lösungsmittel, die natürlich mit der gewählten Säure kompatibel sind.
Im allgemeinen wird die Hydrolyse in Gegenwart einer begrenzten Menge Wasser, z. B. von 0,1 bis 10 % (Gew./Gew.) des Reaktionsgemisches durchgeführt. Diese Wassermenge kann offensichtlich schon entweder in den Ausgangsmaterialien, Lösungsmitteln und/oder Reagenzien vorliegen oder kann ad hoc, falls erforderlich, zugegeben werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens wird wiedergegeben durch die Verwendung eines Gemisches von Dimethylsulfoxid/konzentrierter Salzsäure bei einer Temperatur zwischen 40ºC und 80ºC. Typisch ist ein Mischungsverhältnis von Dimethylsulfoxid zu konzentrierter Salzsäure von 8:2 bis 9,5:0,5. Die bevorzugte konzentrierte Salzsäure ist 37%ig (Gew. /Gew.) an Chlorwasserstoffsäure.
Im allgemeinen ist das Reaktionsprodukt ein Gemisch aus den N-Acylaminoglucuronylaglyconen und dem Aglycon. Durch Steuerung der Temperatur und in einigen Fällen auch der Konzentration und der Säurestärke ist es möglich, das Verfahren zumindest in einem bestimmten Ausmaß zu führen, um eines oder zwei Hauptprodukte, d. h. Antibiotikum A 40926 N- acylaminoglucuronylaglycone oder Antibiotikum A 40926-aglycon herzustellen. Insbesondere werden durch Einhalten vergleichsweise niedriger Temperatur mögliche Verminderung der Säurestärke im Gemisch und genaue Kontrolle der Reaktionszeit die Ausbeuten an N-Acylaminoglucuronylaglyconen erhöht, dagegen wird bei vergleichsweise höheren Temperaturen und längeren Zeiten das Aglycon allein erhalten.
Auch in diesem Falle wird der Reaktionsverlauf durch TLC oder vorzugsweise HPLC verfolgt und die Umsetzung gestoppt, wenn die optimale Produktion des gewünschten Stoffes erreicht ist, um die Ausbeuten des nachfolgenden Isolierungsverfahrens zu maximieren.
Falls ein Produkt erhalten wird, das ein Gemisch aus Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglyconen und Antibiotikum A 40926-aglycon ist, so kann es durch Chromatographie, wie Flüssig/Flüssig-Chromatographie, Blitzchromatographie, Hochdruckflüssigchromatographie und Affinitätschromatographie getrennt werden.
Falls Affinitätschromatographie zur Anwendung kommt, ist ein immobilisiertes D-Alanyl-D-alanin, wie in EP-A- 122969 beschrieben, bevorzugt. Besonders bevorzugt ist Agarose-Σ-aminocaproyl-D-alanyl-D-alanin. Das Elutionsgemisch ist ein Gemisch aus wäßrigem Puffer und einer Salzlösung. Durch Einstellen des pH-Werts und der Salzkonzentration werden die Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycone vom Antibiotikum A 40926-Aglycon getrennt.
Ein bevorzugtes Verfahren, um hauptsächlich Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Komplex AB oder einen Faktor davon herzustellen, ist ein Verfahren, welches die Hydrolyse vom Antibiotikum A 40926-Komplex oder einem Einzelfaktor davon, Antibiotikum A 40926-Komplex AB, Antibiotikum A 40926-Faktor A, Antibiotikum A 40926-Faktor B, Antibiotikum A 40926-Faktor B&sub0;, Antibiotikum A 40926-Faktor B&sub1;, Antibiotikum A 40926-Faktor PA und Antibiotikum A 40926-Faktor PB unter kontrollierten Bedingungen mit einem Gemisch aus einem polaren aprotischen Lösungsmittel und einer starken Mineral- oder organischen Säure in Gegenwart einer begrenzten (0,1-10 %, Gew./Gew.) Wassermenge bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 100ºC, vorzugsweise zwischen 40ºC und 65ºC, und in einem Zeitraum von 3 h bis 120 h umfaßt.
Am meisten bevorzugt ist ein Hydrolysegemisch aus einem Gemisch aus Dimethylsulfoxid und 37%iger Salzsäure im Verhältnis 9:1 bis 9,5:0,5, eine Temperatur von 65ºC und eine Reaktionszeit von 5 h.
Falls als Ausgangsmaterial für die Herstellung des N- Acylaminoglucuronylaglycons Antibiotikum A 40926-Komplex verwendet wird, so wird ein Endprodukt erhalten, das wiederum ein Gemisch aus Faktoren ist, die im wesentlichen jenen des ursprünglichen Komplexes entsprechen. Falls dagegen ein Einzelfaktor verwendet wird, wie Antibiotikum A 40926- Faktor A oder -Faktor B, so wird ein einzelner N-Acylamino- glucoronylaglycon-Faktor erhalten, der auf Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Faktor-A und Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Faktor-B bezogen ist (die wiederum in die Faktoren B&sub0; und B&sub1; getrennt werden können).
Falls ein Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Komplex AB erhalten wird, so kann er mittels an sich bekannter Techniken, wie Flüssig/Flüssig-Chromatographie und vorzugsweise präparativer HPLC, in seine Einzelfaktoren getrennt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren ist die Umkehrphasenflüssigchromatographie, vorzugsweise in Edelstahlsäulen unter Mitteldruck (5 bis 50 bar) oder bei Hochdruck (100 bis 200 bar). Die feste Phase kann ein silanisiertes Kieselgel mit einer Kohlenwasserstoffphase mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen (vorzugsweise C 18) oder eine Phenylgruppe sein, und das Eluierungsmittel ist ein Gemisch aus einem wie vorstehend definierten, polaren, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, und einem wäßrigen Puffer mit einem pH, der mit dem Harz kompatibel ist (vorzugsweise pH 4-8).
Am meisten bevorzugt ist ein Gemisch für lineare Gradientenelution aus einem polaren, mit Wasser mischbaren aprotischen Lösungsmittel, ausgewählt aus Acetonitril und einer wäßrigen Pufferlösung mit einem pH zwischen 4 und 8, vorzugsweise etwa 6, mit einem linearen Gradienten von 5 % bis 45 % eines Gemisches aus Acetonitril/Phosphatpuffer, pH 6, 70:30, und einem Gemisch Acetonitril/Phosphatpuffer, pH 6, 10:90.
Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon- Komplex AB (in der Nicht-Additionssalzform) besitzt die nachstehenden Eigenschaften.
A) Das Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt die nachstehenden Absorptionsmaxima: b) Phosphatpuffer pH 7,4
B) Das Infrarotabsorptionsspektrum zeigt die nachstehenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹):
3700-3100; 3000-2800 (Nujol); 1650; 1620-1550; 1500; 1460 (Nujol) ; 1375 (Nujol) ; 1300; 1250-1180; 1150; 1060; 1010; 970; 930; 840; 820
C) Das ¹H-NMR-Spektrum zeigt die nachstehenden Signalgruppen (in ppm), erstellt bei 270 MHz in DMSO d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) und CF&sub3;COOH unter Verwendung von TMS als innerem Standard (0,00 ppm), ( = ppm):
0,84, d und t [Isopropyl-CH&sub3;-Gruppen und endständige CH&sub3;-Gruppe]; 1,14, m [(CH&sub2;)n]; 1,44, m [-CH&sub2;-C-CO und Isopropyl-CH]; 2,00, t [-CH&sub2;-(CO)]; 2,5 s (DMSOd&sub5;); 2,5 s (N-CH&sub3;); 2,93, m [CH, (Z2)]; 3,33, m [CH, (Z'2)]; 3,20-3,80, m [Zucker CH-Gruppen]; 5,34, d [anomeres Proton von Acylaminoglucuronsäure]; 4,10 m (X6); 4,33 d, (X5); 4,43 d (X7); 4,9 m (X2); 5,1 (4f und Z6); 5,4 s (X1); 5,58 d (X4); 5,7 s (4b); 6,06 d (X3); 7,73 s (6b); 6,26-8,42 s und m [aromatische CH-Gruppen und peptidische NH-Gruppen]; 8,70-10,5, br s [phenolische OH-Gruppen und NH&sub2;&spplus;]
br = breit
c = Dublett
m = Multiplett
s = Singulett
t = Triplett
D) Retentionszeiten (Rt) von 1,20 und l,30, bezogen auf Teicoplanin A&sub2; Komponente 2 (Rt = 20,3 min), falls mit Umkehrphasen-HPLC unter den nachstehenden Bedingungen analysiert wird:
Säule: Ultrasphere ODS (5 um) Altex (Beckman) 4.6 mm (i.d.) x 250 mm
Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (5 um)
Eluent A:
Eluent B:
E) Säurefunktionen, die in der Lage sind, Salze zu bilden
F) Aminofunktion, die in der Lage ist, Salze zu bilden
G) Keine an den zentralen Rest gebundene Mannoseeinheit.
Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon- Faktor A (in der Nicht-Additions-Salzform) besitzt die nachstehenden Eigenschaften:
A) Das Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt die nachstehenden Absorptionsmaxima: b) Phosphatpuffer pH 7,4
B) Das Infrarotabsorptionsspektrum zeigt die nachstehenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹):
3700-3000; 3000-2800; 1650; 1585; 1505; 1460 (Nujol); 1375 (Nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1060; 1010; 845; 820; 720 (Nujol)
C) Das ¹H-NMR-Spektrum zeigt die nachstehenden Signalgruppen (in ppm), erstellt bei 270 MHz in DMSO d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als innerem Standard (0,00 ppm), (δ = ppm):
0,85 t (endständige CH&sub3;-Gruppe; 1,0-1,3 (aliphatische CH&sub2;-Gruppen); 1,42 m ((OC-C)CH&sub2;); 2,00 t ((CO)CH&sub2;); 2,35 s (NCH&sub3;); 2,49 s (DMSOd&sub5;); 2,82 m (Z2); 2,8 -3,8 (Zuckerprotonen und Z'2); 4,12 m (X6); 4,56 s (X1); 4,34 d (X5); 4,41 d (X7); 4,96 m (X2); 5,08-5,12 (4f und Z6); 5,40 d (anomere Protonen von Acylaminoglucuronsäure); 5,58 d (X4); 5,74 s (4b); 6,05 d (X3); 7,75 s (6b); 6,25-8,40 s, d und m (aromatische CH-Gruppen und peptidische NH- Gruppen)
D) Retentionszeit (Rt) von 1,20, bezogen auf Teicoplanin A&sub2;-Komponente 2 (Rt = 20,3 min), falls mit Umkehrphasen-HPLC unter den nachstehenden Bedingungen analysiert wird:
Säule: Ultrasphere ODS (5 um) Altex (Beckman) 4.6 mm (i.d.) x 250 mm
Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (5 um)
Eluent A:
Eluent B:
E) Molekulargewicht von etwa 1554, bestimmt durch FAB-MS
F) Säurefunktionen, die in der Lage sind, Salze zu bilden
G) Aminofunktion, die in der Lage ist, Salze zu bilden
H) Keine an den zentralen Rest gebundene Mannoseeinheit.
Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon Faktor B&sub0; (in der Nicht-Additions-Salzform) besitzt die nachstehenden Eigenschaften:
A) Das Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt die nachstehenden Absorptionsmaxima: b) Phosphatpuffer pH 7,4
B) Das Infrarotabsorptionsspektrum zeigt die nachstehenden Absorptionsmaxima (cm&supmin;¹):
3700-3100; 3000-2800 (Nujol) 1650; 1585; 1505; 1460 (Nujol); 1375 (Nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1060; 1010; 980; 840; 820; 720 (Nujol)
C) Das ¹H-NMR-Spektrum zeigt die nachstehenden Signalgruppen (in ppm), erstellt bei 270 MHz in DMSO d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) unter Verwendung von TMS als innerem Standard (0,00 ppm), (δ= ppm):
0,84, d (Isopropyl-CH&sub3;-Gruppen); 1,0-1,3 (aliphatische CH&sub2;-Gruppen); 1,3-1,6 ((OC-C)-CH&sub2; und Isopropyl-CH-Gruppe); 2,00 t ((OC)CH&sub2;); 2,32 s (NCH&sub3;); 2,49 s (DMSOd&sub5;); 2,82 m (Z2); 2,9-3,8 (Zuckerprotonen); 4,12 m (x6); 4,44 s (x1); 4,33 d (X5); 4,37 d (X7); 4,95 m (X2); 5,06-5,10 (4f und Z6); 5,38 d (anomere Protonen von Acylaminoglucuronsäure); 5,59 (X4); 5,72 s (4b); 6,05 d (X3); 7,74 s (6b); 6,27-8,5 (aromatische Protonen und peptidischen NH-Gruppen)
D) Retentionszeit (Rt) von 1,30, bezogen auf Teicoplanin A&sub2;-Komponente 2 (Rt = 20,3 min), falls mit Umkehrphasen-HPLC unter nachstehenden Bedingungen analysiert wird:
Säule: Ultrasphere ODS (5 um) Altex (Beckman) 4.6 mm (i.d.) x 250 mm
Vorsäule: Brownlee Labs RP 18 (5 um)
Eluent A:
Eluent B:
Elution: Lineargradient von 5 % bis 60 % von Eluent B in Eluent A, in 40 min
Flußgeschwindigkeit 1,8 ml/min
UV-Detektor: 254 nm
innerer Standard: Teicoplanin A&sub2; Komponente 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.)
E) Molekulargewicht von etwa 1568, bestimmt durch FAB-MS
F) Säurefunktionen, die in der Lage sind, Salze zu bilden
G) Aminofunktion, die in der Lage ist, Salze zu bilden
H) Keine an den zentralen Rest gebundene Mannoseeinheit.
Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Faktor B&sub1; (in der Nicht-Additions-Salzform) besitzt die nachstehenden Eigenschaften:
hat ein Molekulargewicht von etwa 1568, bestimmt durch FAB-MS, und im wesentlichen die gleichen physikochemischen Eigenschaften wie sie für Antibiotikum A 40926 N- acylaminoglucuronylaglycon-Faktor B&sub0; angegeben werden, mit der Ausnahme, daß das vorstehend angegebene NMR-Spektrum ein Triplett bei 0,84 ppm besitzt, daß der Methylgruppe eine n-Propylfunktion zugeordnet wird und daß es eine bezüglich der Teicoplanin A&sub2;-Komponente 2 relative Retention von 1,32 im vorstehend angeführten System besitzt.
Die nachstehenden "Herstellungen" sind ein Beispiel für einen Weg, mit dem der Antibiotikum A 40926 N- acylaminoglucuronylaglycon-Komplex und die Faktoren davon hergestellt werden können:

Herstellung 1

Herstellung von Antibiotikum A 40926 N- acylaminoglucuronylaglycon-Komplex AB

a) 750 mg Antibiotikum A 40926-Komplex AB (hergestellt im wesentlichen nach dem Verfahren von Beispiel 3 aus EP-A-177882) werden in 150 ml eines Gemisches aus Dimethylsulfoxid (DMSO)/37 % (Gew./Gew.) Salzsäure (HCl), 9:1 (V/V) gelöst und das Reaktionsgemisch wird auf etwa 65ºC erhitzt.
Der Reaktionsverlauf wird mit HPLC verfolgt, und die Reaktion wird, wenn das Ausgangsmaterial vollständig umgesetzt ist (nach etwa 5 Stunden), mit kaltem Wasser (600 ml) gestoppt und der pH des erhaltenen Gemisches auf 7,5 eingestellt. Dieses Gemisch enthält ein Gemisch der Titelverbindungen, die durch Affinitätschromatographie nach folgendem Verfahren in zwei Hauptkomponenten getrennt werden.
b) Das vorstehend erhaltene wäßrige Gemisch (750 ml) wird auf eine Sepharose-D-Alanyl-D-alanin-Chromatographiesäule, hergestellt gemäß EP-A-177882 und EP-A-122969, Beispiel 1.A) gegeben (100 ml gequollenes Harz in 100 m; TRIS.HCl pH 7,5-Puffer; Betthöhe 10 cm).
0,05 M NH&sub4;OH.HCl PH 7,5, enthaltend 2 M NaCl (200 ml) (Puffer B) werden durch die Säule geschickt; dann wird A 40926-Aglycon selektiv von der Säule durch Eluieren mit 0,05 M NH&sub4;OH.HCl pH 9,5 enthaltend 2 M NaCl (1500 ml), (Puffer C) isoliert.
Der N-Acylaminoglucuronylaglycon-Komplex AB wird dann mit 0,1 M wäßrigem Ammoniak (Puffer D) eluiert. Die eluierten Fraktionen werden dann gemäß ihrem Antibiotikumgehalt gesammelt, auf etwa pH 7,5 eingestellt und jede Antibiotikum-haltige Lösung an einer Sepharose-D-Alanyl-D- alanin-Säule (100 ml gequollenes Harz in 10 mM TRIS.HCl pH 7,5 Puffer, Betthöhe 10 cm) chromatographiert. Dann wird destilliertes Wasser durch die Säule gegeben, bis die anorganischen Salze heruntergewaschen sind. Die Antibiotika werden dann mit 0,1 N wäßrigem Ammoniak eluiert. Diese eluierten Fraktionen werden gemäß ihrem Antibiotikumgehalt gesammelt, unter vermindertem Druck durch azeotrope Destillation mit n-Butanol auf ein geringes Volumen konzentriert und gefriergetrocknet, wobei 201 mg N-Acylaminoglucuronylaglycon-Komplex AB und 236 mg A 40926-Aglycon erhalten werden.
Durch Wiederholung des gleichen vorstehend beschriebenen Versuchs unter Verwendung eines Gemisches von DM50/37 % HCl 95:5 bei etwa 40ºC für etwa 5 Tage erhöht sich die Ausbeute von N-Acylaminoglucuronylaglycon-Komplex AB um etwa 15 %, während die Ausbeute an A 40926 Aglycon folglich vermindert ist.
Durch Wiederholung dieser Versuche, ausgehend vom Antibiotikum A 40926-Komplex, Antibiotikum A 40926-Faktor A, Antibiotikum A 40926 Faktor-B, Antibiotikum A 40926-Faktor B&sub0;, Antibiotikum A 40926-Faktor B&sub1;, Antibiotikum A 40926- Faktor PA und Antibiotikum A 40926-Faktor PB werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten (d. h. die Ausbeuten variieren im Bereich von ± 5 %). Insbesondere ausgehend vom Antibiotikum A 40926-Faktor A oder -Faktor PA ist das erhaltene Produkt Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Faktor A, ausgehend vom Antibiotikum A 40926- Faktor PB&sub0;, oder -Faktor B&sub0; ist das erhaltene Produkt Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Faktor B&sub0;, ausgehend von Antibiotikum A 40926-Faktor B oder PB ist das erhaltene Produkt Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Faktor B, welches wieder in die Faktoren B&sub0; und B&sub1; getrennt werden kann und ausgehend vom Antibiotikum A 40926 Faktor B&sub1;, wird Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon Faktor B&sub1; erhalten.

Herstellung 2

Trennung von Antibiotikum A 40926 N-Acylaminoglucuronylaglycon-Faktoren A, B&sub0; und B&sub1;

20 mg Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Komplex AB werden in 1 ml 18 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,0, enthaltend 10 % Acetonitril, gelöst. Die Lösung wird in eine präparative HPLC-Säule injiziert (7 mm Innendurchmesser x 250 mm), Lichrosorb RP18 silanisiertes Kieselgel (Merck Co.) mit 7 um Teilchengröße.
Die Säule wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min von Phase A und B mit einem Lineargradienten von 10 % bis 55 % in Phase A in 55 min eluiert.
Phase A: 18 mM Natriumphosphat/CH&sub3;CN 30/70 mit NaOH auf pH 6,0 gebracht
Phase B: 18 mM Natriumphosphat/CH&sub3;CN 90/10 mit NaOH auf pH 6,0 gebracht
Die UV-Absorption der Säuleneluate wird bei 254 nm aufgezeichnet, und die Elutionsfraktionen mit homogenem Gehalt werden gesammelt, in drei Gruppen von Eluaten getrennt, die die Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon- Faktoren A, B&sub0; bzw. B&sub1; enthalten.
Die Eluate, die die gereinigten Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Faktoren von 11 aufeinanderfolgenden chromatographischen Versuchen enthalten, werden gesammelt und wie üblich entsalzt, indem sie auf eine Säule von 5 ml gequollenem Sepharose-D-Ala-D-Ala (siehe oben) gegeben werden. Nach Entfernung der Salze mit 10 ml 1 mM HCl, gefolgt von 5 x 10 ml destilliertem Wasser, wird das Antibiotikum mit 5 x 10 ml 1 % Gew./V wäßrigem Ammoniak eluiert. Die Ammoniakeluate werden dann getrennt gesammelt und ergeben gefriergetrocknet 15 mg von Antibiotikum A 40926 N- acylaminoglucuronylaglycon-Faktor A, 51 mg Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Faktor B&sub0; und 3 mg Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Faktor B&sub1;, deren physikochemische Daten und chemische Formel vorstehend in der Beschreibung angeführt sind.
Die nachstehenden Beispiele erläutern zusätzlich die Erfindung und sollen nicht deren Schutzbereich einschränken.

Beispiel 1:

Fermentation von Actinoplanes teichomyceticus

Eine Probe einer gefrorenen Stammkultur von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 wird verwendete um 100 ml eines Wachstumsmediums mit der nachstehenden Zusammensetzung zu beimpfen:
Glucose 10 g
Pepton 4 g
Hefeextrakt 4 g
MgSO&sub4; 0.5 g
KH&sub2;PO&sub4; 2 g
K&sub2;HPO&sub4; 4 g
Deionisiertes Wasser 1000 ml
100 ml des beimpften Mediums werden 48 h in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 28ºC auf einem Rotationsschüttler inkubiert. 200 ml dieser Kultur werden verwendet, um 4 l Fermentationsmedium mit der nachstehenden Zusammensetzung zu beimpfen:
Pepton 4 g
Hefeextrakt 1 g
Sojamehl 10 g
Malzextrakt 4 g
Glucose 5 g
NaCl 2.5 g
CaCO&sub3; 5 g
Deionisiertes Wasser 1000 ml
Das beimpfte Medium wird bei etwa 28ºC unter 0,5 V/V/min sterilen Luftstrom bei etwa 900 rpm für etwa 48 h fermentiert.
Actinoplanes teichomyceticus ATCC 53649 kann anstelle von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 verwendet werden.

Beispiel 2:

Fermentation von Actinoplanes missouriensis ATCC 23342

Ein lyophilisiertes Fläschchen, enthaltend Actinoplanes missouriensis Stamm ATCC 23342 wird geöffnet und aseptisch in eine Schrägflasche mit Hafermehlagar gegeben. Nach 12tägiger Inkubation bei 28ºC wird die Kultur in destilliertem Wasser suspendiert und in 10 Erlenmeyer-Kolben jeweils mit 100 ml eines Mediums mit nachstehender Zusammensetzung beimpft:
Hefeextrakt 2 g
Sojamehl 8 g
Dextrose 20 g
NaCl 1 g
CaCO&sub3; 4 g
H&sub2;O-1000 ml
Das beimpfte Medium wird 48 h bei 30ºC in einem Rotationsschüttler bei 200 rpm inkubiert.
Actinoplanes missouriensis NRRL 15646, NRRL 15647, ATCC 31683, ATCC 31682, ATCC 32680 oder ein Gemisch davon in beliebigen Verhältnissen können anstelle von Actinoplanes missouriensis ATCC 23342 verwendet werden. h

Fermentation von Actinoplanes NRRL 3884

Ein lyophilisiertes Fläschchen, enthaltend Actinoplanes Stamm NRRL 3884, wird geöffnet und aseptisch in eine Schrägflasche mit Hafermehlagar gegeben. Nach 12 Tagen Inkubation bei 28ºC wird die Kultur in destilliertem Wasser suspendiert und in 10 Erlenmeyer-Kolben, jeweils enthaltend 100 ml eines Mediums mit nachstehender Zusammensetzung beimpft:
Hefeextrakt 2 g
Sojamehl 8 g
Dextrose 20 g
NaCl 1 g
CaCO&sub3; 4 g
H&sub2;0 1000 ml
Das beimpfte Medium wird 48 h bei 30 ºC auf einem Rotationsschüttler bei 200 rpm inkubiert.

Beispiel 4

Herstellung von Desacyl-Antibiotikum A 40926

a) Biotransformation von Antibiotikum A 40926-Komplex AB

Antibiotikum A 40926 Komplex AB (im wesentlichen hergestellt wie in EP-A-177882 beschrieben) wird 48 h nach der Beimpfung aseptisch zu der fermentierten Kultur, hergestellt im wesentlichen nach Beispiel 1, 2 oder 3, gegeben. Das Biotransformationsverfahren wird durch HPLC-Analyse der Brühe verfolgt. Glycopeptidantibiotika werden an Sepharose- D-Alanyl-D-alanin (vgl. EP-A-122969) gereinigt und werden gemäß nachstehender HPLC-Methode analysiert:
Säule: Ultraspher ODS (5 um) 4,6 mm x 25 cm Altex (Beckman)
Vorsäule: Brownlee labs RP18 (5 um)
Phase A: 18 mM Natriumphosphatpuffer/CH&sub3;CN 98/2 (V/V) mit NaOH auf pH 6,0 gebracht
Phase B: 18 mM Natriumphosphatpuffer/CH&sub3;CN 30/70 (V/V) mit NaOH auf pH 6,0 gebracht
Elution: Lineargradient von 5 % bis 65 % von Phase B in 43 min
Fließgeschwindigkeit: 1,8 ml/min
Detektion: UV 254 nm
Die Retentionszeit von Desacyl-Antibiotikum A 40926 liegt im Bereich von 8,3 bis 9.
Die Gewinnungszeit liegt bei etwa 196 h nach der Zugabe von Antibiotikum A 40926-Komplex AB zum Medium von Actinoplanes NRRL 3884, etwa 168 h für Actinoplanes missouriensis ATCC 23342, ATCC 31683, ATCC 31682, ATCC 32680, NRRL 15646 und NRRL 15647 und etwa 192 h für Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 und ATCC 53649. Die Desacylierungswirksamkeit ist im wesentlichen bei jeder der vorstehenden Kulturen gleich.

b) Gewinnung und Reinigung

Die geerntete Brühe, erhältlich aus den gesammelten Inhalten der Erlenmeyer-Kolben wird mit NaOH auf pH 9,5 gebracht und mit Hyflo-FloMa-Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wird verworfen, während das klare Filtrat mit HCl auf pH 7,5 eingestellt wird. 10 ml gequollenes Sepharose-D- Alanyl-D-alanin (siehe oben) werden zugegeben und dieses Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wird dann durch Filtrieren zurückgewonnen und nachfolgend mit 4 x 40 ml 40 mM TRIS.HCl-Puffer (pH 6,5) [2-Amino-2-hydroxy- methyl-1,3-propandiol] und 6 x mit 40 ml destilliertem Wasser auf dem Filter gewaschen. Dann wird das Gemisch vom Harz mit 3 x 40 ml 1%igem (Gew./V) wäßrigem NH&sub4;OH eluiert. Diese Lösung wird auf etwa 4ºC abgekühlt und mit H&sub2;SO&sub4; auf pH 3,5 gebracht. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt, während der Überstand, der das biotransformierte Antibiotikum A 40926 in der Lösung (150 ml) enthält, mit NaOH auf etwa pH 7,0 gebracht wird und auf eine Säule (Durchmesser 1 cm), enthaltend 25 ml in destilliertem Wasser gequollenes Sepharose-D-Alanyl-D-alanin gegeben wird. Die Säule wird nacheinander mit 50 ml destilliertem Wasser und 200 ml Ethanol/Wasser 1/9 (V/V) eluiert. Die antibiotische Titelsubstanz wird dann mit 35 ml 1%igem (Gew./V) wäßrigem NH&sub4;OH eluiert. Diese Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert und dann gefriergetrocknet, wobei 41-45 mg Desacyl-Antibiotikum A 40926 erhalten werden. Die physikochemischen Eigenschaften sind vorstehend in der Beschreibung angeführt.
Durch Wiederholung des gleichen Verfahrens, ausgehend von Antibiotikum A 40926-Faktor A oder Antibiotikum A 40926- Faktor B oder B&sub0; wird das gleiche Produkt in ähnlichen Ausbeuten erhalten.

Beispiel 5

Herstellung von Antibiotikum A 40926 aminoglucuronylaglycon

Wenn das Verfahren nach Beispiel 4, ausgehend von Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucoronylaglycon-Komplex AB, Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucuronylaglycon-Faktor A, Faktor B, Faktor B&sub0; oder B&sub1; (wie vorstehend beschrieben hergestellt) wiederholt wird, wird Antibiotikum A 40926 aminoglucuronylaglycon erhalten, welches die vorstehend in der Beschreibung angeführten Eigenschaften besitzt.

Beispiel 6:

Herstellung von Desacyl-Antibiotikum A 40926 P

Durch Wiederholung des Verfahrens nach Beispiel 4, jedoch ausgehend von Antibiotikum A 40926-Faktor PA oder Faktor PB, oder einem Gemisch in einem beliebigen Verhältnis davon und Reduktion der Permanenz der Reaktionsmasse bei basischen pH-Werten auf ein Minimum wird Desacyl-Antibiotikum A 40926 P erhalten, dessen Eigenschaften wie vorstehend angegeben sind.

Claims

1. Desacyl A 40926 Antibiotikum der Formel:

in der:

A eine 2-Amino-2-desoxy-β-D-glucopyranosiduronsäuregruppe und

ein Wasserstoffatom, eine α-D-Mannopyranosyl- oder 6-Acetyl-α-D-mannopyranosylgruppe darstellt, und die Additionssalze davon.

2. Desacyl-Antibiotikum A 40926 oder ein Additionssalze davon, mit dem nachstehenden Eigenschaften in der Nicht- Additionssalzeform:

A)Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den nachstehenden Absoptionsmaxima: b) Phosphatpuffer pH 6,0 c) Phosphatpuffer pH 7,4B) Infrarotabsorptionsspektrum mit den nachstehenden Absorptionsmaxima in Nujolsuspension (ν,cm&supmin;¹):

3700-3100; 3000-2800 (Nujol); 1650; 1590; 1505; 1460 (Nujol); 1375 (Nujol); 1300; 1230, 1210, 1150, 1060, 1030, 970,810, 720 (Nujol)

C) ¹H-NMR-Spektrum mit den nachstehenden Signalgruppen (in ppm) bei 270 MHz, erstellt in DMSO d&sub6; (Hexadeuterodimethylsulfoxid) [(δ, ppm; m (Bedeutungen)] 2,30, s (N-CH&sub3;); 2,49, s (DMSOd&sub5;); 2,7-3,8, m (Zucker CH-Gruppen); 2,79 m (Z2); 4,08 m (X6); 4,33 s (X1); 4,37 d (X5); 4,37 d (X7); 4,86 m (X2); 5,08 s (4f); 5,08 s (Z6); 5,27 s (anomeres Proton der Mannose), 5,35 d (anomeres Proton der Aminoglucoronsäure); 5,61 d (X4); 5,86 s (4b);6,05, d (X3); 7,73 s (6b); 6,45-8,49 (aromatisches Protonen und peptidische NH-Gruppen)

D) Retentionszeit (Rt) von 0,34, bezogen auf Vancomycin (Eli Lilly)

Säule: silanisiertes Kieselgel Ultrasphere ODS (5 um) 4,6 mm x 25 cm Altex (Beckman)

Isokratische Eluierung mit 18 mM Natriumphosphatpuffer/CH&sub3;CN 92/8 (V/V)

Fließgeschwindigkeit: 1,8 ml/min

Detektor: UV 254 nm

Innerer Standard: Vancomycin (Eli Lilly) Rt 8,4 min

E) Molekulargewicht von 1548 bestimmt durch FAB-MS- Spektroskopie.

3.Antibiotikum A 40926 aminoglucuronylaglycon, das eine Verbindung gemäß Anspruch 1 ist, wobei A wie vorstehend definiert ist und B ein Wasserstoffatom darstellt oder ein Additionssalze davon.

4. Desacyl-Antibiotikum A 40926 P, das eine Verbindung gemäß Anspruch 1 ist, in der A wie vorstehend definiert ist und B eine 6-Acetyl-α-D-mannosylgruppe darstellt, oder ein Additionssalze davon.

5. Desacyl-Antibiotikum A 40926, das eine Verbindung gemäß Anspruch 1 ist, wobei A wie vorstehend definiert ist und B eine α-D-Mannosylgruppe darstellt oder ein Additionssalz davon.

6. Verfahren zu Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, umfassend die Umsetzung einer Verbindung der Formel

in der A eine 2-Desoxy-2-(C&sub1;&sub1;-C&sub1;&sub2;)acylamino-β-D-glucopyranosiduronsäuregruppe bedeutet und B ein Wasserstoffatom, eine α-D-Mannosyl- oder 6-Acetyl-α-D-mannosylgruppe bedeutet, eines Additionssalzes davon und/oder eines Gemisches davon in beliebigen Verhältnissen, mit einer Kulturanzucht eines Stammes der Gattung Actinoplanes, ausgewählt aus Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, Actinoplanes teichomyceticus ATCC 53649, Actinoplanes NRRL 3884, Actinoplanes missouriensis ATCC 23342, Actinoplanes missouriensis NRRL 15646, Actinoplanes missouriensis NRRL 15647, Actinoplanes missouriensis ATCC 31683, Actinoplanes missouriensis ATCC 31682, Actinoplanes missouriensis ATCC 32680, und einer Mutante oder Variente davon, die die Desacylierungsfähigkeit des Elternstamms beibehält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei ein gewaschenes Mycel, ein zellfreier Extrakt oder ein Konzentrat anstelle der Kulturanzucht der desacylierenden Mikroorganismen verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Anspruche 6 oder 7, wobei die Reaktionstemperatur zwischen 20 und 40ºC betruagt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Reaktionstemperatur zwischen 25 und 50ºC beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung von Desacylantibiotikum A 40926 aus Antibiotikum A 40926-Komplex, Faktor A, B oder B&sub0;.

11. Verfahren nach Anspruch 6 zur Herstellung des Antibiotikums A 40926 aminoglucoronylaglycon aus Antibiotikum A 40926 N-acylaminoglucoronylaglycon-Komplax, Faktor A, B oder B&sub0;.

12. Verbindung nach Anspruch 1, 2, 3 4 oder 5 zur Verwendung als Arzneimittel.

13. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur antimikrobiellen Behandlung.

14. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5 im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.