DE3881775T2

DE3881775T2 - De-mannosylteicoplanin-Derivate.

Info

Publication number: DE3881775T2
Application number: DE88110195T
Authority: DE
Inventors: Piero Antonini; Angelo Borghi; Giancarlo Lancini
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1987-07-03
Filing date: 1988-06-27
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2008-06-28
Also published as: DK357488A; HU200488B; ATE90731T1; EP0301247A2; IL86895A; HUT49379A; DK357488D0; JPS6429398A; CA1334655C; ES2055719T3; US5064811A; KR890002214A; DE3881775D1; EP0301247A3; ZA884577B; GB8715735D0; EP0301247B1; IL86895A0; JPH0819155B2

Description

Ziel dieser Erfindung sind antibiotische De-mannosylteicoplanin-Derivate der Formel
worin
R für N-(Z-4-Decenoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl, N-(8-Methyl-nonanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl, N-Decanoyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl, N-(8-Methyl-decanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl oder N-(9-Methyl-decanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;
R&sub1; N-Acetyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl bedeutet;
R&sub2; Wasserstoff darstellt,
ihre Additionssalze mit Säuren und Basen und jedes beliebige Gemisch hievon in jedem beliebigen Verhältnis.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung der genannten antibiotischen Derivate aus den entsprechenden mannosylierten Teicoplanin-Precursoren.
Teicoplanin ist ein Antibiotikum, welches durch Kultivieren des Stammes Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 in einem assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Kulturmedium hergestellt wird.
Das Hauptprodukt, welches von dem oben erwähnten Stamm gebildet wird, war ein Gemisch aus drei Hauptfaktoren (A&sub1;, A&sub2; und A&sub3;), welche ursprünglich als Teichomycin (US-PS 4 239 751) bezeichnet wurden.
Die jüngeren Teicoplanin-Zubereitungen, welche durch Reinigen des aus der Fermentationsbrühe gewonnenen Produktes erhalten und für die chemotherapeutische Verwendung zur Behandlung von durch gram-positive Organismen verursachten Infektionen geeignet sind (H.H. Williams et al.: Journal of Hospital Infection (1986), 7 (Supplement A), 101-103), enthalten als Hauptkomponente einen Komplex aus fünf strukturell eng verwandten Substanzen, welche ursprünglich als Ganzes als Teichomycin Faktor A&sub2; bezeichnet wurden. Die oben erwähnten fünf eng verwandten Substanzen sind nacheinander isoliert und als einzelne Komponenten des Komplexes charakterisiert worden, welcher Komplex dann gegenwärtig in den wissenschaftlichen Zeitungen und in der Patentliteratur als "Teicoplanin A&sub2;" oder "Teicoplanin-Komplex" bezeichnet wurde.
Die fünf Hauptkomponenten des Teicoplanin-Komplexes (welche üblicherweise als: TA2-1, TA2-2, TA2-3, TA2-4 und TA2-5 bezeichnet werden) können durch die vorstehende allgemeine Formel (I) oben dargestellt werden, worin R jeweils
TA2-1) : N-(Z-4-Decenoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl;
TA2-2): N-(8-Methyl-nonanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl;
TA2-3): N-Decanoyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl;
TA2-4) : N-(8-Methyl-decanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl;
TA2-5): N-(9-Methyl-decanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl;
darstellt;
R&sub1; N-Acetyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl bedeutet;
R&sub2; alpha-D-Mannopyranosyl ist.
Ihre jeweiligen Verhältnisse im Teicoplanin-Komplex können in Abhängigkeit von den Fermentationsbedingungen und den zum Fermentationsmedium zugesetzten Precursoren variieren, wie es in der EP-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. 204 179 beschrieben ist.
Im Stand der Technik sind das Aglycon von Teicoplanin (L 17392), d.i. die Verbindung der obigen Formel (I), worin R, R&sub1; R&sub2; Wasserstoff sind, und zwei Pseudoaglycone beschrieben, nämlich die Verbindung L 17054 (Formel I, worin R Wasserstoff ist, R&sub1; für N-Acetyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht, R&sub2; alpha-D-Mannopyranosyl bedeutet) und die Verbindung L 17046 (Formel I, worin R, R&sub2; Wasserstoff sind; R&sub1; für N-Acetyl-beta- D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht).
Die vorstehend erwähnten Teicoplanin-Derivate werden durch Unterwerfen des Teicoplanin-Komplexes oder der einzelnen Hauptkomponenten hievon unter geeignete saure Hydrolysebedingungen erhalten. Siehe beispielsweise die europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 146 053, die europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 119 575 und die europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 119 574.
Zusammengefaßt wird durch die milden sauren Hydrolysebedingungen der Acylglucosaminrest ersetzt, durch eine stärker saure Behandlung wird die Mannoseeinheit ersetzt und eine weitere saure Behandlung ermöglicht das Ersetzen des verbleibenden N-Acetyl- glucosamin-Restes, wobei das Aglycon erhalten wird.
De-mannosylteicoplanin-Derivate, d.s. Teicoplanin-Derivate, worin R und R&sub1; die gleichen Bedeutungen wie im oben dargestellten Teicoplanin-Komplex besitzen und R&sub2; Wasserstoff darstellt, sind bis jetzt nicht beschrieben worden und können anscheinend nicht durch saure Behandlung erhalten werden. Die basische Behandlung von Teicoplanin führt zur Epimerisierung am chiralen Zentrum der dritten Aminosäure (ausgehend vom N-Terminus) unter einer bemerkenswerten Verringerung der Aktivität (siehe J.C.J. Barna et al.: The Journal of Antibiotics, 37, Nr. 10, S. 1204-1208, 1984).
Gemäß der vorliegenden Erfindung können de-mannosylierte Teicoplanin-Derivate in guter Ausbeute durch mikrobiologische Umwandlung eines Substrates erhalten werden, welches Substrat unter Teicoplanin-Komplex, jedem beliebigen Gemisch der einzelnen Komponenten und einer einzelnen Komponente hievon ausgewählt ist, mit Kulturen von Nocardia orientalis NRRL 2450 oder Streptomyces candidus NRRL 3218, den natürlichen Mutanten oder Varianten hievon, welche die gleiche Eigenschaft des Aufspaltens der glykosidischen Bindung des D-Mannose-Restes in dem Teicoplanin-Molekül zeigen, mit dem gewaschenen Myzel oder der zellfreien Zubereitung hievon.
Der erste oben erwähnte Stamm wird in der jüngsten Literatur auch als Streptomyces orientalis NRRL 2450 bezeichnet (siehe S.K. Chung et al., The Journal of Antibiotics, 39, Nr. 5, S. 652-659, 1986).
Proben der genannten Stämme, welche unsere internen Codes A/156 bzw. S/802 tragen, wurden am 10. Juni 1987 bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA) unter den Bedingungen hinterlegt, welche durch den Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren geschaffen wurden, wo sie die folgenden ATCC-Nummern 53630 bzw. 53629 erhalten haben.
Wenn der Teicoplanin-Komplex oder ein Gemisch seiner einzelnen Komponenten als ein Substrat für die mikrobiologische Umwandlung verwendet wird, ist das entstehende Produkt ein Gemisch aus fünf De-mannosyl-Derivaten der obigen Formel I in jedem beliebigen Verhältnis. Auch diese Gemische fallen in den Rahmen dieser Erfindung. Die genannten Gemische können als solche für die hierin beschriebenen Anwendungen verwendet oder sie können wahlweise mittels bekannter Verfahren, wie beispielsweise der Reversphasenverteilung, der Ionenaustauschchromatographie oder der präparativen HPLC (siehe als Referenz die US-PS 4 542 018) in die fünf Einzelkomponenten aufgetrennt werden.
Die De-mannosylteicoplanin-Derivate dieser Erfindung sind antibiotisch wirksame Verbindungen.
Aus Gründen der Kürze wird jede D-mannosylteicoplanin-Verbindung dieser Erfindung hierin nachstehend mit einem herkömmlichen Namen bezeichnet werden, welcher sich auf die Hauptkomponente des Teicoplanin-Komplexes bezieht, aus welchem sie stammt, welchem Namen das Akronym DM vorgestellt wird.
Daher bezeichnen:
DM-TA2-1 das De-mannosyl-Derivat der Komponente 1 (TA2-1);
DM-TA2-2 das De-mannosyl-Derivat der Komponente 2 (TA2-2);
DM-TA2-3 das De-mannosyl-Derivat der Komponente 3 (TA2-3);
DM-TA2-4 das De-mannosyl-Derivat der Komponente 4 (TA2-4);
DM-TA2-5 das De-mannosyl-Derivat der Komponente 5 (TA2-5).
Die antibakterielle Wirksamkeit der Verbindungen der Erfindung kann in vitro mittels Standardverdünnungstests auf verschiedenen Mikroorganismenkulturen gezeigt werden.
Die Kulturmedien und die Wachstumsbedingungen für MIC (minimale Inhibitionskonzentrations)-Bestimmungen waren wie folgt: Isosensitest-Broth (Oxoid, 24 h, für Staphylococcen, Strep. faecalis und gram-negative Bakterien (Escherichia coli); Todd-Hewitt Broth (Difco), 24 h, für andere Streptococcenspezies; GC-Basis-Broth (Difco) + 1% Isovitalex (BBL), 48 h, CO&sub2;-angereicherte Atmosphäre für Neisseria gonorrhoeae; Brain-Heart-Broth (Difco) + 1% Supplement C (Difco), 48 h, für Haemophilus influenzae; die Impflösungen bestanden aus etwa 10&sup4;-10&sup5; koloniebildenden Einheiten/ml für durch Broth-Verdünnung ermittelte MICen.
Die minimalen Inhibitionskonzentrationen (MIC, Mikrogramm/ml) der obigen De-mannosylteicoplanin-Derivate für einige Mikroorganismen sind nachstehend in Tabelle I angeführt. TABELLE I Stamm Staph. aureus L165 Staph. aureus (10&sup6; Kolonie bidende Einheiten/ml) Staph. aureus (30% Rinderserum) Staph. epidermidis L147 ATCC 12228 (Koagulase-negativ) Strep. pyogenes L49 C203 Strep. pneumoniae L44 UC41 Strep. faecalis L149 ATCC 7080 Strep. mitis L796 (klinisches Isolat) Neisseria gonorrhoeae L997 ISM68/126 Haemophilus influenza L 970 type b ATCC 19418 Escherichia coli L47 SKF 12140 Proteus vulgaris L79 X19H ATCC881 Pseudomonas aeruginosa L4 ATCC10145 Staph. haemolyticus L602 (klinisches Isolat)
Die De-mannosylteicoplanin-Derivate besitzen saure und basische Funktionen und können nach herkömmlichen Verfahren Salze mit organischen und anorganischen Gegenionen ausbilden.
Beispielhafte und geeignete Säureadditionssalze der Verbindungen der Erfindung umfassen jene Salze, welche durch Standardreaktion mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren gebildet werden, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Trichloressigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholinsäure, Pamoasäure, Schleimsäure, Glutaminsäure, Camphersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und dgl. Säuren.
Repräsentative Beispiele von Basen sind: Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxid, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Bariumhydroxid; Ammoniak und aliphatische, alicyclische oder aromatische organische Amine, wie Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin und Picolin.
Die Überführung der "Nicht-Salz" -Verbindungen der Erfindung in die entsprechenden Additionssalze und umgekehrt, d.h. die Überführung eines Additionssalzes einer Verbindung der Erfindung in die Nicht-Salzform liegen im Rahmen der herkömmlichen technischen Fähigkeiten und werden von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Beispielsweise können De-mannosylteicoplanin-Derivate in das entsprechende Säure- oder Basenadditionssalz übergeführt werden durch Lösen der Nicht-Salzform in einem wäßrigen Lösungsmittel und Zusetzen eines geringen molaren Überschusses von der ausgewählten Säure oder Base. Die entstehende Lösung oder Suspension wird anschließend lyophilisiert, um das gewünschte Salz zu gewinnen.
Im Fall, daß das Endsalz in einem Lösungsmittel unlöslich ist, worin die Nicht-Salzform löslich ist, wird es durch Filtration aus der organischen Lösung der Nicht-Salzform nach Zugabe der stöchiometrischen Menge oder eines geringen molaren Überschusses von der ausgewählten Säure oder Base gewonnen.
Beispiele dieser unlöslichen Salze sind Calcium-, Magnesium- und Bariumsalze.
Die Nicht-salzform kann aus einem entsprechenden Säure- oder Basensalz hergestellt werden, welches in einem wäßrigen Lösungsmittel gelöst ist, das anschließend neutralisiert wird, um die Nicht-Salzform freizusetzen.
Wenn auf die Neutralisation folgend die Entfernung des Überschusses an Säure oder Base erforderlich ist, kann ein herkömmliches Entsalzungsverfahren angewandt werden.
Zum Beispiel kann eine Säulenchromatographie über silanisiertes Silicagel, nicht-funktionalisiertes Polystyrol, Acryl- und Polydextranharze mit kontrollierter Porengröße (wie Sephadex LH 20) oder über Aktivkohle in zweckmäßiger Weise angewandt werden. Nach dem Eluieren der ungewünschten Salze mit einer wäßrigen Lösung wird das gewünschte Produkt mittels eines linearen Gradienten oder eines stufenweisen Gradienten von einem Gemisch aus Wasser und einem polaren oder apolaren organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril/Wasser von 50:50 bis etwa 100% Acetonitril, eluiert.
Es ist in der Technik bekannt, daß die Salzbildung entweder mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren (oder Basen) oder mit nicht-pharmazeutisch annehmbaren Säuren (oder Basen) als praktisches Reinigungsverfahren verwendet werden kann. Nach der Bildung und Isolierung kann die Salzform eines De-mannosylteicoplanin-Antibiotikums in die entsprechende Nicht-Salzform oder in eine pharmazeutisch annehmbare Salzform übergeführt werden.
Die De-mannosylteicoplanin-Derivate dieser Erfindung werden durch Unterwerfen eines Substrates, welches unter Teicoplanin-Komplex, jedem beliebigen Gemisch der einzelnen Komponenten und einer einzelnen Komponente hievon ausgewählt -ist, welche durch die obige allgemeine Formel I dargestellt werden kann, worin R
in TA2-1) für N-(Z-4-Decenoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;
in TA2-2) für N-(8-Methyl-nonanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;
in TA2-3) für N-Decanoyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;
in TA2-4) für N-(8-Methyl-decanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht; bzw.
in TA2-5) für N-(9-Methyl-decanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;
R&sub1; N-Acetyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl darstellt;
R&sub2; alpha-D-Mannopyranosyl ist,
unter eine mikrobiologische Umwandlung mit einem Mikroorganismus, welcher vom Stamm Nocardia orientalis NRRL 2450, Streptomyces candidus NRRL 3218, den natürlichen Varianten und Mutanten hievon, welche die gleiche Eigenschaft des Aufspaltens der glykosidischen Bindung des D-Mannose-Restes im Teicoplanin- Molekül ausgewählt ist, mit dem gewaschenen Myzel und einer zellfreien Zubereitung hievon hergestellt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird ein ausgewähltes Ausgangsmaterial entweder in reiner Form oder in der Form jeder beliebigen rohen Zubereitung hievon, einschließlich der erhaltenen Fermentationsbrühe von Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121, mit einer wachsenden Kultur von einem der obigen Stämme unter Fermentationsbedingungen in Kontakt gebracht.
Die oben erwähnten Stämme werden unter herkömmlichen aeroben Submersbedingungen in einem Medium, welches assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, kultiviert.
Im allgemeinen kann das oben erwähnte Ausgangsmaterial zu einer Kultur von Nocardia orienatalis NRRL 2450 oder Streptomyces candidus NRRL 3218 zu einem Zeitpunkt zugesetzt werden, welcher von 18 h der Inokulationsdauer bis zu dem Zeitpunkt reicht, bei welchem die Kultur ihr Maximalwachstum erreicht hat, jedoch ist die Zugabe nach 24-72 h nach der Inokulierung zumindest in einigen Fällen bevorzugt.
Die Reaktionsdauer, d.h. die Dauer des Aussetzens des Ausgangsmaterials unter die mikrobielle Kultur vor der Gewinnung des Endproduktes kann von 48 bis 140 Stunden, in Abhängigkeit von den angewandten speziellen Bedingungen variieren. Da die Reaktion, wie in der Technik bekannt, beispielsweise durch Verfolgen der Verringerung des Ausgangsmaterials und/oder des Ansteigens des Endproduktes durch HPLC überwacht werden kann, ist der Fachmann jedenfalls fähig, ohne weiteres zu bestimmen, wann die Reaktion als vollständig zu betrachten ist und das Gewinnungsverfahren begonnen werden kann.
Anstelle eine wachsende Kultur von Nocardia orientalis NRRL 2450 oder Streptomyces candidus NRRL 3218 anzuwenden, kann man eine Kultur von jeder beliebigen Mutante oder Variante hievon verwenden, welche noch fähig ist, die glykosidische Bindung zwischen dem Phenolrest und dem Mannoseteil des oben erwähnten Ausgangsmaterials zu spalten, um die de-mannosylierten Verbindungen der Erfindung zu ergeben. Jedes Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, worin irgendeine derartige Mutante oder Variante angewandt wird, wird als vom Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt betrachtet.
Darüber hinaus können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Verwenden eines Myzels der oben identifizierten de-mannosylierenden Mikroorganismenkultur hergestellt werden, welches in einer isotonischen Salzlösung, zweckmäßigerweise NaCl, gewaschen wurde, um die genannte wäßrige Lösung des Myzels nicht zu zerstören.
Nachdem das Myzel gewaschen wurde, wird es zweckmäßigerweise in einem physiologisch annehmbaren Medium resuspendiert. Das Verfahren des gewaschenen Myzels kann verwendet werden, um die Menge an umzusetzenden Teicoplanin-Verbindungen zu erhöhen, wobei optimale Ausbeuten aufrecht erhalten werden. Es ist auch möglich, eine zellfreie Zubereitung zu verwenden, welche durch Aufsprengen der Zellen, z.B. durch Beschallung, erhalten wurde.
Die Gewinnung der antibiotischen Substanzen aus dem Reaktionsmedium wird anschließend gemäß an sich bekannter Verfahren durchgeführt, welche die Extraktion mit Lösungsmitteln, die Fällung durch Zusetzen von Nicht-Lösungsmitteln oder durch Ändern des pH-Wertes der Lösung, die Verteilungschromatographie, die Umkehrphasenverteilungschromatographie, die Ionenaustauschchromatographie, die Affinitätschromatographie und dgl. beinhalten.
Ein bevorzugtes Verfahren umfaßt eine Affinitätschromatographie auf immobilisiertem D-Alanyl-D-Alanin, gefolgt von einer Auftrennung bei einem unterschiedlichen pH-Wert.
Immobilisierte D-Alanyl-D-Alanin-Matrizes, welche für das vorliegende Gewinnungsverfahren geeignet sind, sind in der europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 122 969 beschrieben. Die bevorzugte Matrix dieses Gewinnungsverfahrens ist D-Alanyl-D-Alanin, gekoppelt mit einem vernetzten Polydextran mit einer kontrollierten Porengröße.
Das Reaktionsmedium kann der Affinitätschromatographie direkt nach der Filtration oder nach einem vorhergehenden Reinigungsverfahren unterworfen werden. Dieses letztgenannte Verfahren umfaßt das Basischmachen des ganzen Mediums, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8,5 bis 11, und das anschließende Filtrieren in Gegenwart eines Filterhilfsmittels, wenn dies zweckmäßig ist.
Das klare Filtrat wird anschließend auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt und danach einer Affinitätschromatographie über immobilisiertes D-Alanyl-D-Alanin, entweder in einer Säule oder diskontinuierlich, unterworfen.
Obwohl das Binden der Substanz an die Affinitätsmatrix vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,0 erfolgt, wird seine Eluierung bei basischeren pH-Werten (vorzugsweise von 9,0 bis 10,5) mittels einer wäßrigen Base durchgeführt. Diese wäßrige Base kann Ammoniak, ein flüchtiges Amin, ein Alkali- oder Alkalimetallhydroxid oder eine basisch gepufferte Lösung, wahlweise in Gegenwart eines polaren organischen Lösungsmittels, wie eines polaren wassermischbaren Lösungsmittels, sein.
Repräsentative Beispiele von polaren wassermischbaren Lösungsmitteln sind: wasserlösliche Alkohole (wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Butanol), Aceton, Acetonitril, Niederalkylalkanoate (wie Ethylacetat), Tetrahydrofuran, Dioxan und Dimethylformamid und Gemische hievon; wobei das bevorzugte polare wassermischbare Lösungsmittel Acetonitril ist.
Nach dem Entfernen der Verunreinigungen durch Spülen der Kolonne mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4-9, welcher wahlweise Salze (z.B. Ammoniumformiat), Harnstoff und/oder wassermischbare Lösungsmittel enthält, wird die antibiotische De-mannosylteicoplanin-Substanz mit dem vorstehenden Eluierungsgemisch eluiert. Das Eluat wird durch HPLC analysiert und die Fraktionen, welche das gewünschte Material enthalten, werden vereinigt.
Dieses Eluat wird mit einer organischen Säure oder einer Mineralsäure auf einen pH-Wert von 7,0-7,5 eingestellt.
Das Eluat wird anschließend Konzentrierungs- und Entsalzungsverfahren unterworfen.
Ein zweckmäßiges Entsalzungsverfahren umfaßt das Aufbringen der das Antibiotikum enthaltenden wäßrigen Lösung auf eine Kolonne mit silanisiertem Silicagel, Waschen mit destilliertem Wasser und Eluieren mit einem Gemisch aus einem polaren wassermischbaren Lösungsmittel, wie es vorstehend definiert ist, und Wasser.
In alternativer Weise wird die wäßrige Lösung des de-mannosylierten Teicoplanin-Derivates (der de-mannosylierten Teicoplanin-Derivate) gleichzeitig ablaufenden Konzentrations-/Entsalzungsverfahren unterworfen, durch Ultrafiltration durch-eine Ultrafiltrationsmembran mit einem nominalen Molekulargewichtslimit (NMWL) von 1000 Dalton oder darunter.
Die aus dem obigen Verfahren erhaltene Lösung wird anschließend lyophilisiert, und das gewonnene Material wird einer weiteren Reinigung unterworfen.
In einigen Fällen, insbesondere für Zubereitungen im Großmaßstab, wird es bevorzugt, die genannte Reinigung in zwei Stufen auszuführen. Die erste Stufe wird gemäß einer Umkehrphasenchromatographie durchgeführt, wobei das allgemeine Verfahren bereits in der US- 4 542 018 für die Auftrennung der einzelnen Faktoren des Teicoplanin-Komplexes beschrieben ist. Gemäß einer speziellen Ausführungsform des genannten Verfahrens wird das De-mannosylteicoplanin-Derivatprodukt (werden die De-mannosylteicoplanin-Derivatprodukte), welches (welche) aus der Lyophilisierung erhalten wird (werden), in einem Ammoniumformiat/Acetonitril-Gemisch gelöst und mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, und die erhaltene Lösung wird durch eine Kolonne mit silanisiertem Silicagel geleitet und anschließend wird die Kolonne mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in Ammoniumformiatlösung eluiert. Das Eluat wird durch HPLC überwacht und die Fraktionen, welche das gewünschte Material (die gewünschten Materialien) enthalten, werden vereinigt und unter verringertem Druck eingedampft, wobei das gewünschte feste Material erhalten wird. Dieses Verfahren ist auch für die Auftrennung der einzelnen De-mannosyl-Derivate des TeicoplaninKomplexes nützlich, wenn dieser letztgenannte oder ein Gemisch aus einzelnen Komponenten anstelle der einzelnen Komponenten als Ausgangsmaterial verwendet wird.
Der erste Reinigungsschritt kann vermieden werden, wenn das für die mikrobielle Umwandlung angewandte Ausgangsmaterial ausreichend rein ist und im wesentlichen aus einer Einzelkomponente des Teicoplanin-Komplexes besteht.
Der zweite Reinigungs schritt beinhaltet eine semi-präparative HPLC Ubereine chemisch modifizierte silanisierte präparative HPLC-Säule unter Verwendung von zwei Gemischen aus Acetonitril/Ammoniumformiat in unterschiedlichen Verhältnissen als mobile Phasen und das Beibehalten eines linearen Gradienten von Acetonitril in Ammoniumformiat. Die eluierten Fraktionen werden durch HPLC-Analyse überwacht und jene, welche das gewünschte Produkt enthalten, werden vereinigt, das organische Lösungsmittel wird unter verringertem Druck abgedampft und anschließend wird die wäßrige Lösung einer gleichzeitig erfolgenden Konzentrierung/Entsalzung durch Ultrafiltration, wie oben beschrieben, unterworfen. Die aus der Ultrafiltration erhaltene Lösung wird anschließend lyophilisiert, um das gewünschte reine Produkt zu erhalten.
Die De-mannosylteicoplanin-Derivate dieser Erfindung sind gegenüber gram-positiven Bakterien, welche für viele weit verbreitete Infektionen verantwortlich sind, wirksam.
Insbesondere zeigen die Verbindungen dieser Erfindung eine bemerkenswerte Wirksamkeit gegenüber Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus haemolyticus.
Im allgemeinen können die De-mannosylteicoplanin-Derivate sowie die nicht-toxischen pharmazeutisch annehmbaren Salze hievon oder das Gemisch hievon für die antibakterielle Behandlung auf verschiedenen Wegen, wie topisch oder parenteral, verabreicht werden. Die parenterale Verabreichung ist im allgemeinen der bevorzugte Verabreichungsweg.
Zusammensetzungen für die Injektion können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern annehmen und können Hilfsmittel wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel beinhalten.
In alternativer Weise kann der wirksame Bestandteil in Pulverform zur Wiederherstellung zum Zeitpunkt der Einnahme vorliegen, wenn ein geeigneter Träger wie steriles Wasser dazu zugesetzt wird.
In Abhängigkeit vom Verabreichungsweg können diese Verbindungen in verschiedenen Dosierungsformen formuliert werden.
In einigen Fällen kann es möglich sein, die Verbindungen der Erfindung in enterisch beschichteten Dosierungsformen für die orale Verabreichung zu formulieren, welche nach technikbekannter Weise hergestellt werden können (siehe beispielsweise "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, S. 1614).
Dies könnte im speziellen der Fall sein, wenn die Absorption der antimikrobiellen Substanz im Darmtrakt besonders gewünscht wird, wogegen sie durch den Magentrakt unverändert hindurchtreten soll.
Die Menge an zu verabreichendem wirksamem Prinzip hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie der Größe und dem Zustand des zu behandelnden Patienten, dem Verabreichungsweg und der Häufigkeit der Verabreichung und dem involvierten verursachenden Mittel.
Die antibiotischen Substanzen der vorliegenden Erfindung und die physiologisch annehmbaren Salze hievon sind im allgemeinen bei einer täglichen Dosierung von etwa 0,5 bis 50 mg an wirksamem Bestandteil je kg Körpergewicht des Patienten, wahlweise in 1 bis 4 tägliche Verabreichungen aufgeteilt, wirksam.
Besonders wünschenswerte Zusammensetzungen sind jene, welche in Dosierungseinheiten hergestellt werden, die etwa 50 bis etwa 2.000 mg je Einheit enthalten.
Verzögernd wirkende Formulierungen können, wie in der Technik bekannt, auf verschiedenen Mechanismen und Verfahren basierend hergestellt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer verzögert wirkenden Formulierung, welche die De-mannosyl-antibiotischen Substanzen enthält, beinhaltet die Verwendung einer wasserunlöslichen Form des Antibiotikums, welche in einem wäßrigen oder öligen Medium suspendiert ist.
Neben ihrer Wirksamkeit als Medikamente können die De-mannosyl- Antibiotika dieser Erfindung und die nicht-toxischen Salze hievon als das Tierwachstum fördernde Mittel verwendet werden, d.h. um die Nahrungseffizienz von fleisch- oder milchproduzierenden Tieren zu erhöhen.
Für diesen Zweck wird eine Verbindung der Erfindung oral in einem geeigneten Futter verabreicht. Die genaue angewandte Konzentration ist jene, welche benötigt wird, damit das wirksame Mittel in einer das Wachstum fördernden Menge bereitgestellt wird, wenn übliche Mengen an Futter konsumiert werden.
Die Zugabe der wirksamen Verbindung der Erfindung zu Tierfutter wird vorzugsweise durch Herstellen eines geeigneten Futtervorgemisches, welches die wirksame Verbindung in einer wirksamen Menge enthält, und das Einverleiben des Vorgemisches in der vollständigen Ration durchgeführt.
In alternativer Weise kann ein Zwischenkonzentrat oder ein Futterzusatz, welche den wirksamen Bestandteil enthalten, in das Futter eingemischt werden.
Der Weg, auf welchem solche Futtervorgemische und vollständige Rationen hergestellt und verabreicht werden können, ist in Referenzbüchern beschrieben (wie "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., S.Francisco, USA, 1969, oder "Livestock Feeds and Feeding", O and B Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977) und hierin durch Bezugnahme aufgenommen.

Detaillierte Beschreibung der Herstellung der De-mannosylteicoplanin-Derivate

1. Herstellung von De-mannosylteicoplanin-Komplex-Komponente 2 (DM-TA2-2)

Ein lyophilisiertes Rohr, welches Nocardia orientalis NRRL 2450 enthält, wird geöffnet und aseptisch in eine Schicht aus Hafermehl-Agar übergeführt. Nach 7-tägiger Inkubation bei 28ºC wird die Kultur in destilliertem Wasser suspendiert und es werden 2 Erlenmeyer-Kolben beimpft, wovon jeder 100 ml an vegetativem Medium S/bis mit der folgenden Zusammensetzung enthält:
Hefeextrakt 4 g
Pepton 4g
Glucose 10 g
MgSO&sub4; 0,5 g
KH&sub2;PO&sub4; 2g
K&sub2;HPO&sub4; 4g
Destilliertes Wasser auf 1000 ml
pH-Wert nach der Sterilisation: 7
Das beimpfte Medium wird 48 h bei 28ºC auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 UpM inkubiert. Die entstehende Kultur, welche in mehrere Teile von jeweils 5 ml unterteilt wurde, wird eingefroren und für die weitere Verwendung gelagert.
Ein Teil von 2,5 ml der eingefrorenen Ausgangskultur wird verwendet, um einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, welcher 100 ml vegetatives Medium S/bis enthält, zu beimpfen. Die Kultur wurde bei 28ºC während 48 h auf einer Schüttelvorrichtung bei 200 UpM und 5 cm Auslenkung inkubiert.
Fünf ml dieser Kultur werden verwendet, um 100 ml Kulturmedium C in einem 500 ml-Kolben zu beimpfen, welches Medium die folgende Zusammensetzung aufweist:
Glucose (a) 2 g/l
Hefeextrakt 5 g/l
Asparagin 1,5 g/l
MgSO&sub4; 0,5 g/l
CaCO&sub3; 5 g/l
NaCl 0,1 g/l
CaCl&sub2;.2H&sub2;0 0,1 g/l
mineralische Ergänzung (b) 1ml/l
pH-Wert nach der Sterilisation: 6,9
(a) Die Glucose wurde getrennt sterilisiert
(b) Zusammensetzung der mineralischen Ergänzung:
Borsäure 0,50 g/l
CuSO&sub4;.5H&sub2;O 0,04 g/l
KI 0,10 g/l
FeCl&sub3;.6H&sub2;O 0,20 g/l
MnSO&sub4;.H&sub2;O 0,40 g/l
FeSO&sub4;.7H&sub2;0 0,40 g/l
Ammoniummolybdat 0,20 g/l
Es wurden 30 Kolben gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt.
Nach 48 h wurden 20 mg des Substrates TA2-2 (d.i. Teicoplanin- Komplex-Komponente 2) zu jedem Kolben zugesetzt und die Fermentation wurde aerobisch während 72 h ab dem Zugabezeitpunkt fortgeführt. Die HPLC-Analyse der Fermentationsbrühe zeigt eine 40%ige Umwandlung von TA2-2 zu DM-TA2-2.
Das gesamte Reaktionsmediuin aus allen 30 Kolben wird durch Zugabe von 1N NaOH auf einen pH-Wert von 10,5 gebracht und anschließend in Gegenwart eines Filterhilfsmittels filtriert. Der pH-Wert der filtrierten Brühe wird durch Zugabe von 1N HCl auf 7,5 eingestellt und 150 ml Sepharose-epsilon-amino- capropyl-D-Alanyl-D-Alanin-Affinitätsharz (europaische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 122 969) werden zugesetzt.
Das Gemisch wird über Nacht bei 4ºC gerührt. Das Harz wurde anschließend von der verbrauchten Brühe abgetrennt und in eine Chromatographiesäule geleert. Die Säule wurde mit dem fünfachen Harzvolumen an Tris-HCl-Puffer (0,05M, pH-Wert 7,5) und- anschließend mit dem gleichen Volumen an Tris-Base-Lösung (0,05M) gewaschen. Das Harz wurde mit einer Lösung von 1% Ammoniumhydroxid eluiert, wobei mehrere Fraktionen von jeweils 100 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden mit Ameisensäure neutralisiert und durch HPLC analysiert. Die HPLC-Analyse wird unter den folgenden Bedingungen ausgeführt:
Gerät: Hewlett Packard Modell 1084B mit einem 254 nm-Detektor;
Säule: Erbasil C-18, 5 um, 4,6x150 mm;
Mobile Phasen: A) CH&sub3;CN:NaH&sub2;PO&sub4; (0,02M), 5:95; B) CH&sub3;CN:NaH&sub2;PO&sub4; (0,02M), 75:25;
Das Gradientenprofil ist das folgende:
Durchflußgeschwindigkeit: 1,5 ml/min;
Einspritzung: z.b. 20 ul einer Lösung der Substanz, welche bei etwa 1 mg/ml in H&sub2;O oder H&sub2;O:CH&sub3;CN, 1:1, untersucht wird.
Unter den obigen Bedingungen zeigt TA2-2 eine Retentionszeit (Rt) von 24,71 min, wogegen DM-TA2-2 eine Rt von 26,30 min besitzt.
Die DM-TA2-2 enthaltenden Fraktionen werden vereinigt (etwa 200 ml) und anschließend durch Ultrafiltration konzentriert, wobei ein 90 mm Hi-Flux U-F Cell Millipore-Gerät verwendet wird, das eine PCAC-Pellicon-Ultrafiltrationsmembran mit einem nominalen Molekulargewichtslimit (NMWL) von 1000 Dalton besitzt. Das Volumen der Lösung wird auf etwa 20 ml verringert und der Rest wird lyophilisiert, wobei 268 mg rohes DM-TA2-2 erhalten werden.
Das rohe Produkt wird durch semi-präparative HPLC unter den folgenden Bedingungen weiter gereinigt
Gerät: Waters-Flüssigkeitschromatograph, welcher mit zwei Pumpen Modell 6000A, einem UV-Adsorptionsdetektor Modell 440, welcher auf 254 nm eingestellt ist, und einem Lösungsmittelprogrammgerät Modell 660 ausgerüstet ist.
Säule: HIBAR LiChrosorb RP-18, 7 um, 250x10 mm (Merck);
Mobile Phase:
A) wäßrig (2 g/l) HCOONH&sub4; / CH&sub3;CN (9:1)
B) wäßrig (2 g/l)HCOONH&sub4; / CH&sub3;CN (3:7);
Gradient: linear von 5% B auf 45% B in 45 min;
Durchflußgeschwindigkeit: 6 ml/min
Einspritzung: 10 mg Produkt, gelöst in jeweils 2 ml A.
Die DM-TA2-2 enthaltenden Teile des Eluates, welche durch das Chromatogramm identifiziert werden, werden gesammelt.
Die oben beschriebene semi-präparative Reinigung wird auf das gesamte Rohprodukt angewandt, welches aus der Ultrafiltration gewonnen wird, und die Eluatteile werden vereinigt (insgesamt 180 ml) und das organische Lösungsmittel wird unter Vakuum abgedampft. Die-verbleibende wäßrige Lösung von DM-TA2-2 wird durch Ultrafiltration unter den gleichen Bedingungen auf etwa 5 ml konzentriert und die verbleibende Lösung wird lyophilisiert, um 85 mg an reinem DM-TA2-2 zu erhalten, d.i. die Verbindung der obigen Formel I, worin:
R für N-(8-Methyl-nonanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;
R&sub1; N-Acetyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl darstellt;
R&sub2; Wasserstoff bedeutet.
Das ¹H-NMR-Spektrum des reinen DM-TA2-2 wird unter Verwendung eines Gerätes von Bruker Modell AM-250 mit einem Array-Prozessor, einem Magneten bei 250 MHz und einer computerisierten Konsole Aspect 3000 aufgezeichnet. Die Spektren werden für Protonen in DMSO-d&sub6;-Lösungen bei 25ºC mit TMS als Referenz erhalten.
Die im Vergleich mit jenen des Teicoplanin-Komplexes signifikantesten Signale von DM-TA2-2 sind in der Tabelle II angeführt.
Das Fast Atom Bombardment-Massenspektrum (FAB) des reinen DM-TA2-2 wird mit einem VG-Gerät Modell 70-70 EQ, welches mit einer FAB-Quelle ausgerüstet ist, aufgezeichnet. Die Spektren der positiven Ionen werden aus den Proben erhalten, die in einigen Mikrolitern alpha-Thioglycerin dispergiert und mit einem Strahl von 7 KeV von Ar-Atomen bombardiert werden. Dieser Versuch weist auf ein Molekulargewicht von 1715 hin, welches mit der zugeordneten Struktur übereinstimmt.
In einem Versuch, welcher unter den gleichen Bedingungen wie oben ausgeführt wird, worin aber der Stamm Nocardia orientalis NRRL 2450 durch den Stamm Streptomyces candidus NRRL 3218 ersetzt wird, werden ähnliche Ergebnisse erzielt.

2. Herstellung von De-mannosylteicoplanin-Komplex-Komponente 3 (DM-TA2-3)

Durch Arbeiten mit Nocardia orientalis NRRL 2450, wie es in der Herstellung 1 beschrieben ist, aber Zusetzen (48 h nach dem Beimpfen) von 200 mg TA2-3 anstelle von TA2-2 als Substrat wird eine Fermentationsbrühe erhalten, welche in der gleichen Weise wie unter der obigen Herstellung 1 beschrieben aufgearbeitet wird. Die Gewinnung und Reinigung werden durch Nachvollziehen des gleichen Verfahrens wie in der Herstellung 1 ausgeführt. Die Ausbeute der Umwandlung in der Fermentationsbrühe beträgt 32 %. Die unter den gleichen Bedingungen wie oben ausgeführte HPLC-Analyse zeigt Rt-Werte von 25,60 Minuten für TA2-3 bzw. 27,20 Minuten für DM-TA2-3. Die Ausbeute betrug 28 mg an reinem DM-TA2-3, d.h. der Verbindung der obigen Formel (I), worin:
R für N-Decanoyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;
R&sub1; N-Acetyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl darstellt;
R&sub2; Wasserstoff ist.
Das NMR-Spektrum von reinem DM-TA2-3, welches unter den gleichen Bedingungen wie in der Herstellung 1 aufgezeichnet wurde, zeigt die in Tabelle II angegebenen charakteristischen Signale.
Das FAB-Massenspektrum, welches unter den gleichen Bedingungen aufgezeichnet wurde, wie sie unter Herstellung 1 beschrieben sind, zeigt ein Molekulargewicht von 1715, welches mit der zugeordneten Struktur übereinstimmt.
In einem analogen Versuch, worin Nocardia orientalis NRRL 2450 durch Streptomyces candidus NRRL 3218 ersetzt wird, werden ähnliche Ergebnisse erhalten.

3. Herstellung von De-mannosylteicoplanin-Komplex-Komponente 4 (DM-TA2-4)

Durch Arbeiten mit Nocardia orientalis NRRL 2450, wie es im Beispiel l beschrieben ist, aber Zusetzen (72 h nach dem Beimpfen) von 200 mg TA2-4 anstelle von TA2-2 als Substrat wird eine Fermentationsbrühe erhalten, welche in der gleichen Weise, wie es oben in der Herstellung 1 beschrieben ist, aufgearbeitet wird. Die Ausbeute der Umwandlung in der Fermentationsbrühe beträgt 34%. Die Gewinnung und die Reinigung werden durch Nachvollziehen des gleichen Verfahrens wie in der Herstellung 1 ausgeführt. Die unter den gleichen Bedingungen wie oben ausgeführte HPLC-Analyse zeigt Rt-Werte von 28,66 Minuten für TA2-4 bzw. von 30,19 Minuten für DM-TA2-4. Die Ausbeute beträgt 24 mg an reinem DM-TA2-4, d.h. einer Verbindung der obigen Formel (I), worin:
R für N-(8-Methyl-decanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;
R&sub1; N-Acetyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl darstellt;
R&sub2; Wasserstoff ist.
Das NMR-Spektrum von reinem DM-TA2-4, welches unter den gleichen Bedingungen der Herstellung 1 aufgezeichnet wurde, zeigt die in Tabelle II angeführten charakteristischen Signale.
Das FAB-Massenspektrum wird unter Verwendung eines Kratos-Gerätes Modell MS-9 aufgezeichnet, welches mit einer MS 50TC-Konsole und einer FAB-Quelle ausgerüstet ist. Die Spektren der positiven Ionen werden aus den Proben erhalten, die in einigen Mikrolitern alpha-Thioglycerin:Diglycerin im Verhältnis 1:1 dispergiert und mit einem Strahl von 9 KeV von Xe-Atomen bombardiert werden.
Der Versuch weist auf ein Molekulargewicht von 1891 hin, welches mit der zugeordneten Struktur übereinstimmt.
In einem analogen Versuch, worin Nocardia orientalis NRRL 2450 durch Streptomyces candidus NRRL 3218 ersetzt wird, werden ähnliche Ergebnisse erzielt.

4. Herstellung von De-mannosylteicoplanin-Komplex-Komponente 5 (DM-TA2-5)

Durch Arbeiten mit Nocardia orientalis NRRL 2450, wie es in der Herstellung 1 beschrieben ist, aber Zusetzen (48 h nach der Beimpfung) von 200 mg TA2-5 anstelle von TA2-2 als Substrat, wird eine Fermentationsbrühe erhalten, welche in der gleichen Weise, wie es unter der Herstellung 1 oben beschrieben ist, aufgearbeitet wird. Die Ausbeute der Umwandlung in der Fermentationsbrühe beträgt 36%. Die Gewinnung und die Reinigung werden durch Nachvollziehen des gleichen Verfahrens wie in Herstellung 1 ausgeführt. Die HPLC-Analyse, welche unter den gleichen Bedingungen wie oben durchgeführt wird, zeigt RT-Werte von 29,35 Minuten für TA2-5 bzw. 30,92 Minuten für DM-TA2-5. Die Ausbeute beträgt 30 mg an reinem DM-TA2-5, d.i. eine Verbindung der obigen Formel (I), worin:
R für N-(9-Methyl-decanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;
R&sub1; N-Acetyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl darstellt;
R&sub2; Wasserstoff ist.
Das NMR-Spektrum von reinem DM-TA2-5, welches unter den gleichen Bedingungen der Herstellung 1 aufgezeichnet wurde, zeigt die in Tabelle II angeführten charakteristischen Signale.
Das FAB-Massenspektrum, welches unter den gleichen Bedingungen aufgezeichnet wurde, wie sie unter Herstellung 3 beschrieben sind, zeigt ein Molekulargewicht von 1891, welches mit der zugeordneten Struktur übereinstimmt.
In einem analogen Versuch, worin Nocardia orientalis NRRL 2450 durch Streptomyces candidus NRRL 3218 ersetzt wird, werden ähnliche Ergebnisse erzielt.

5. Herstellung von De-mannosylteicoplanin-Komplex-Komponente 1 (DM-TA2-1)

Durch Arbeiten mit Nocardia orientalis NRRL 2450, wie es in Herstellung 1 beschrieben ist, aber unter Zusetzen (24 h nach der Beimpfung) von 400 mg TA2-1 anstelle von TA2-2 als Substrat, wird eine Fermentationsbrühe erhalten, welche in der gleichen Weise aufgearbeitet wird, wie es unter Herstellung 1 oben beschrieben ist. Die Ausbeute der Umwandlung in der Fermentationsbrühe beträgt 28 %. Die Gewinnung und die Reinigung werden durch Nachvollziehen des gleichen Verfahrens wie in Herstellung 1 ausgeführt. Die unter den gleichen Bedingungen wie oben durchgeführte HPLC-Analyse zeigt Rt-Werte von 22,58 Minuten für TA2-1 bzw. 23,98 Minuten für DM-TA2-1. Die Ausbeute beträgt 55 mg an reinem DM-TA2-1, d.i. eine Verbindung der obigen Formel (I), worin:
R für N-(Z-4-Decenoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;
R&sub1; N-Acetyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl darstellt;
R&sub2; Wasserstoff ist.
Das FAB-Massenspektrum, welches unter den gleichen Bedingungen aufgezeichnet wurde, wie sie unter Herstellung 3 beschrieben sind, zeigt ein Molekulargewicht von 1713, welches mit der zugeordneten Struktur übereinstimmt.

6. Herstellung von De-mannosylteicoplanin-Komplex-Komponente 2 (DM-TA2-2)

Ein lyophilisiertes Rohr, welches Nocardia orientalis NRRL 2450 enthält, wird geöffnet und aseptisch in eine Schicht von Hafermehl-Agar übergeführt. Nach 7-tägiger Inkubation bei 28ºC wird die Kultur in destilliertem Wasser suspendiert und es werden 2 Erlenmeyer-Kolben beimpft, wovon jeder 100 ml vegetatives Medium S/bis enthält, welches die folgende Zusammensetzung besitzt:
Hefeextrakt 4g
Pepton 4g
Glucose 10 g
MgSO&sub4; 0,5 g
KH&sub2;PO&sub4; 2g
K&sub2;HPO&sub4; 4g
destilliertes Wasser auf 1000 ml
pH-Wert nach der Sterilisation: 7
Das beimpfte Medium wird 48 h bei 28ºC auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 UpM inkubiert. Die entstehende Kultur, welche in mehrere Portionen von jeweils 5 ml unterteilt wird, wird eingefroren und für die weitere Verwendung gelagert.
Ein Teil von 2,5 ml der eingefrorenen Ausgangskultur wird verwendet, um einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben zu beimpfen, welcher 100 ml an vegetativem Medium S/bis enthält. Die Kultur wurde bei 28ºC während 48 h auf einer Schüttelvorrichtung bei 200 UpM und einer Auslenkung von 5 cm inkubiert.
Fünf ml dieser Kultur werden verwendet, um 100 ml Kulturmedium C in einem 500 ml-Kolben zu beimpfen, welches Medium die folgende Zusammensetzung besitzt:
Glucose (a) 2 g/l
Hefeextrakt 5 g/l
Asparagin 1,5 g/l
MgSO&sub4; 0,5 g/l
CaCO&sub3; 5 g/l
NaCl 0,1 g/l
CaCl&sub2;.2H&sub2;O 0,1 g/l
mineral. Ergänzung (b) 1 ml/l
pH-Wert nach der Sterilisation: 6,9
(a) Die Glucose wurde getrennt sterilisiert
(b) Zusammensetzung der mineralischen Ergänzung:
Borsäure 0,50 g/l
CuSO&sub4;.5H&sub2;O 0,04 g/l
KI 0,10 g/l
FeCl&sub3;.6H&sub2;O 0,20 g/l
MnSO&sub4;.H&sub2;O 0,40 g/l
FeSO&sub4;.7H&sub2;0 0,40 g/l
Ammoniummolybdat 0,20 g/l
Es werden 30 Kolben gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt.
Nach 24 h wird das Myzel durch Zentrifugieren gewonnen und zweimal in einer isotonischen Salzlösung (wäßrige NaCl-Lösung 1:1000, bezogen auf das Gewicht) gewaschen, anschließend wird (das gleiche Volumen des Kulturmediums) in 3 l physiologischer Lösung resuspendiert, und es werden 200 mg Substrat TA2-2 (d.i. die Teicoplanin-Komplex-Komponente 2) zu jedem Kolben hinzugefügt und die Fermentation wird aerobisch während 96 h ab dem Zugabezeitpunkt fortgesetzt. Die HPLC-Analyse der Fermentationsbrühe zeigt eine 35%ige Umwandlung von TA2-2 zu DM-TA2-2.
Das gesamte Reaktionsmedium aus allen 30 Kolben wird durch Zugabe von 1N NaOH auf einen pH-Wert von 10,5 gebracht und anschließend in Gegenwart eines Filterhilfsmittels filtriert. Der pH-Wert der filtrierten Brühe wird durch Zusetzen von 1N HCl auf 7,5 eingestellt und es werden 500 ml Sepharose- epsilon-aminocapropyl-D-Alanyl-D-Alanin-Affinitätsharz (europaische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 122 969) zugesetzt.
Das Gemisch wird über Nacht bei 4ºC gerührt. Das Harz wurde anschließend von der verbrauchten Brühe abgetrennt und in eine Chromatographiesäule geleert. Die Säule wurde mit dem fünffachen Harzvolumen an Tris-HCl-Puffer (0,05M, pH-Wert 7,5) und anschließend mit dem gleichen Volumen an Tris-Base-Lösung (0,05M) gewaschen. Das Harz wurde mit einer Lösung von 1 % Ammoniumhydroxid eluiert, wobei mehrere Fraktionen von jeweils 100 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden mit Ameisensäure neutralisiert und mit HPLC gemäß den Bedingungen aus Herstellung 1 analysiert.
Unter den obigen Bedingungen zeigt TA2-2 eine Retentionszeit (Rt) von 24,71 min, wogegen DM-TA2-2 eine Rt von 26,30 min zeigt.
Die DM-TA2-2 enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und anschließend durch Ultrafiltration unter Verwendung eines 90 mm Hi-Flux U-F Cell Millipore-Gerätes, welches eine PCAC Pellicon- Ultrafiltrationsmembran mit einem nominalen Molekulargewichtslimit (NMWL) von 1000 Dalton enthält, konzentriert. Das Volumen der Lösung wird verringert und der Rückstand wird lyophilisiert, wobei 2965 mg an rohem DM-TA2-2 erhalten werden
Das Rohprodukt wird ferner gemäß den Bedingungen aus der Herstellung 1 weiter gereinigt, um 880 mg reines DM-TA2-2 zu ergeben.
In einem Versuch, welcher unter den gleichen Bedingungen wie oben ausgeführt wird , aber der Stamm Nocardia orientalis NRRL 2450 durch den Stamm Streptomyces candidus NRRL 3218 ersetzt wird , werden ähnliche Ergebnisse erhalten. TABELLE II Proton *** Multiplizität* Teicoplanin-Komplex (δppm) verschiedene CH&sub3;-Gruppen verschiedene CH&sub2;-Gruppen CH&sub2; beta zu C=O und Isopropyl-CH Acetylgruppe von Glucosamin CH&sub2;-Gruppen alpha zu C=O C&sub2;-H von Acetylglucosamin CH&sub2; von Mannose C&sub2;-H von Acylglucosaminen x5, x7 und anomerer H von Acetyl Glucosamin TABELLE II (Forsetzung) Proton *** Multiplizität* Teicoplanin-Komplex (δppm) anomerer H von Mannose anomerer H von Acylglucosaminen n.d. = nicht bestimmt * = d =Dublet; m = Multiplet; s = Singulet; dd = Dublet von Dublets. ** = vom pH-Wert stark beeinflußt *** = Die Numerierung der Atome und Ringe entspricht der Strukturformel II.
Durch Überprüfung der relevanten Signale, welche in der Tabelle angegeben sind, im Vergleich mit jenen vom Teicoplanin-Komplex kann eindeutig geschlossen werden, daß die Strukturen der Verbindungen DM-TA2-2, DM-TA2-3, DM-TA2-4 und DM-TA2-5 jenen der Teicoplanin-Komplex-Hauptkomponenten entsprechen, welchen die Mannosyleinheit fehlt.
Die springenden Punkte für diese Schlußfolgerung können bei Durchsicht der Tabelle wie folgt veranschaulicht werden. Die charakteristischen Signale bei 3,48 und 5,22 für den Teicoplanin-Komplex fehlen in den De-mannosyl-Verbindungen. Die Änderung der Signale von W6, 7f, 7d und 5b beim Übergang vom Teicoplanin-Komplex zu den De-mannosyl-Verbindungen reflektiert die unterschiedliche Substitution am Ring 7. Alle anderen Signale sind praktisch die gleichen für den Teicoplanin-Komplex und die De-mannosyl-Verbindungen.

Claims

1. De-mannosylteicoplanin-Derivate der Formel

worin

R für N-(Z-4-Decenoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl, N-(8-Methyl-nonanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl, N-Decanoyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl, N-(8-Methyl-decanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl oder N-(9-Methyl-decanoyl)-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl steht;

R&sub1; N-Acetyl-beta-D-2-deoxy-2-amino-glucopyranosyl bedeutet;

R&sub2; Wasserstoff darstellt,

ihre Additionssalze mit Säuren und Basen und jedes beliebige Gemisch hievon in jedem beliebigen Verhältnis.

2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, welches das Unterwerfen eines Substrates, welches unter Teicoplanin-Koinplex, jedem beliebigen Gemisch der einzelnen Komponenten und einer einzelnen Komponente hievon ausgewählt ist, unter eine mikrobiologische Umwandlung mit einem Mikroorganismus, welcher vom Stamm Nocardia orientalis NRRL 2450 (ATCC 53630), Streptomyces candidus NRRL 3218 (ATCC 53629), den natürlichen Varianten und Mutanten hievon, welche fähig sind, die glykosidische Bindung des D-Mannose-Restes zu spalten, oder dem gewaschenen Myzel oder der zellfreien Zubereitung hievon ausgewählt ist, und das Gewinnen des Produktes und im Fall, daß ein Gemisch von Substanzen erhalten wird, das wahlweise Auftrennen dieses Gemisches in seine einzelnen Komponenten umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die mikrobielle Umwandlung durch Inkontaktbringen des Substrates mit einer wachsenden Kultur der obigen Stämme ausgeführt wird, welche unter submersen aeroben Bedingungen in einem assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Medium kultiviert werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Myzel der vorstehend identifizierten de-mannosylierenden Mikroorganismenkultur verwendet wird.

5. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung als Arzneimittel.

6. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 als Tierwachstumsfaktor.

7. Tierfutterzusammensetzung, welche eine wirksame, nicht-toxische Menge einer antibiotischen Verbindung nach Anspruch 1 in Vermischung mit einem herkömmlichen Träger oder herkömmlicher Nahrung umfaßt.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Verbindung nach Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil in Vermischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

9. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Anwendung als Antibiotikum.