AT390802B - Glykopeptidantibiotika - Google Patents

Description

Nr. 390 802

Diese Erfindung bezieht sich auf neue Glykopeptidantibiotika der Vancomycingruppe. Insbesondere bezieht sie sich auf Antibiotikum A82846, auf dessen Einzelkomponenten A82846A, A82846B und A82846C und auf deren Herstellung durch Züchtung von neuen Mikroorganismenstämmen.

Obgleich heute viele vorteilhafte Antibiotika verfügbar sind, hält der Bedarf, verbesserte Antibiotika für die Humanmedizin zu finden, an. Beispielsweise ist Vancomycin ein kommerziell erfolgreiches Antibiotikum, welches viele Leben gerettet hat. Vancomycin kann jedoch Probleme verursachen, beispielsweise kann es Ototoxizität und Nephrotoxizität bewirken. Somit sind Antibiotika gesucht, die eine ähnliche Wirksamkeit wie Vancomycin, jedoch verbesserte Pharmakokinetik oder geringere Nebenwirkungen haben.

Gemäß der Erfindung ist nunmehr entdeckt worden, daß Glykopeptidantibiotika von großem Wert durch submerse, aerobe Fermentation von Nocardia orientalis NRRL18098, NRRL18099 oder NRRL 18100 in einem Kulturmedium erzeugt werden können, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält. Wir haben diese Glykopeptidantibiotika willkürlich als A82846 und dessen Komponenten bezeichnet.

Antibiotikum A82846 ist dem Vancomycin strukturell ähnlich, hat aber in vitro und in vivo verbesserte Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien sowie eine verbesserte Pharmakokinetik, die zu einer viel längeren Halbwertszeit als jener von Vancomycin führt.

Die A82846-Komponenten haben im wesentlichen die folgenden physikalischen und Spektral-Eigenschaften:

Kennmerkmale von A82846A

Molekulargewicht: 1556 Empirische Formel: C^HggNjQC^Cl FAB-MS (Thioglycerin): (M+l)

Gefunden: 1557,5803;

Berechnet CyjHjjQNjQO^Cl = 1557,5716 (siehe Fig. 4) UV (H2O) λ max: 281 nm (ε 5.052), Verschiebungen nach 300 nm mit Base IR (KBr): 1716,1655,1611,1586,1552,1504,1410,1340,1310,1230,1212,1132,1066,1028 und 1015 cm'1 (siehe Fig. 1) NMR [(CDj^SOj: siehe Fig. 7 pKa (H20): 4,7, 9,5 (66 % DMF): 5,5, 6,8, 7,9, 9,4, 12,3 (scheinbares Molekulargewicht 1542)

Kennmerkmale von A82846B

Molekulargewicht: 1590 Empirische Formel: £73^88^10^26¾ FAB-MS (Thioglycerin): (M+l)

Gefunden: 1591,5315;

Berechnet C-73HggNjQ026Cl2= 1591,5327 (siehe Fig. 5) UV (H20) λ max : 280 nm (ε 5.192), Verschiebungen nach 300 nm mit Base · IR (KBr): 1656,1586,1562,1504,1403,1264,1230,1135,1105,1065,1023 und 1018 cm'1 (siehe Fig. 2) NMR [(CD3)2SO]: siehe Fig. 8 pKa (H20): 4,65, 9,5

Kennmerkmale von A82846C ,

Molekulargewicht: 1522 Empirische Formel: C73H90N10O26 FAB-MS (Thioglycerin): (M+Na)

Gefunden: 1545,5998;

Berechnet Cy3H^QNjQ02gNa = 1545,5925 (siehe Fig. 6) UV (Η20) λ maJ[: 280 nm (ε 5.198), Verschiebungen nach 300 nm mit Base IR (KBr): 3600 —> 3004 (breit), 2999, 2991,2950,1687 —> 1650 (breit), 1585,1570,1509,1503,1453, 1449,1402,1212,1130,1102,1060,1032 und 1014 cm'1 (siehe Fig. 3) NMR [(CD3)2SO]: siehe Fig. 9 pKa (H20): 4,6, 9,4 -2-

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Aminosäureanalysen von A82846A, A82846B und A82846C nach Hydrolyse mit 6N HCl ergaben das Vorliegen von Asparaginsäure und zwei breite Peaks mit einer Spur von Glycin.

Die zwei Peaks scheinen Actinoidin- und Vancomycin-Amino-Säure zu entsprechen, welche beide in Glykopeptiden der Vancomycinklasse vorliegen.

Vergleichs-NMR-Studien zeigen, daß A82846A, A82846B und A82846C jeweils den neuen Aminozucker 4-epi-Vancosamin (3-Methyl-acosamin):

enthalten.

Die Molekularformel von A82846A entspricht jener von Vancomycin minus einem

Chloratom plus den Elementen eines zusätzlichen Aminozuckers des Vancosamintypus (CyH^NC^).

Die Molekularformel von A82846B entspricht jener von A82846A, worin ein Wasserstoffatom durch ein Chloratom ersetzt ist.

Die Molekularformel von A82846C entspricht jener von A82846A, worin ein Chloratom durch Wasserstoff ersetzt worden ist.

Die A82846-Komponenten scheinen eine neue Familie von Glykopeptiden darzustellen, die in der allgemeinen Zusammensetzung dem Vancomycinmolekül ähneln und sich hauptsächlich durch den Chlorgehalt und durch das Vorliegen einer zusätzlichen Untereinheit, die eine Vancosaminzusammensetzung hat, unterscheiden.

Die A82846-Komponenten weisen die folgenden Strukturformeln auf:

Ο).

A82846A: X = H Y = C1 A82846B : X = CI Y = C1 A82846C: X = Η Y = H -3-

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Die absolute Konfiguration der Zuckergruppen in den A82846-Verbindungen ist noch nicht bestimmt worden. A82846 und seine Einzelkomponenten A82846A, A82846B und A82846C können unter Bildung verschiedener Salze reagieren. Alle solchen Formen dieser Antibiotika sind Teil dieser Erfindung. A82846-Salze sind zum Beispiel zur Trennung und Reinigung von A82846 nützlich. Außerdem haben die Salze eine verbesserte Löslichkeit in Wasser. A82846-Salze werden unter Anwendung von Standardverfahrensweisen für die Salzherstellung zubereitet. Beispielsweise kann A82846 mit einer entsprechenden Säure unter Bildung eines Säureadditionssalzes neutralisiert werden.

Die Säureadditionssalze sind besonders nützlich. Repräsentative geeignete Salze umfassen jene Salze, die durch Standardumsetzungen mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren, wie z. B. Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bemsteinsäure, Citronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Cholsäure, Embonsäure, Schleimsäure, D-Glutaminsäure, d-Camphersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Ameisensäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäuie, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und ähnlichen Säuren, gebildet werden.

Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze sind eine besonders bevorzugte Gruppe von Salzen dieser Erfindung.

Antibiotikum A82846 kann durch Züchtung eines A82846-erzeugenden Stammes von Nocardia orientalis unter submersen, aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium, bis eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit erzeugt ist, produziert werden. Das Antibiotikum kann unter Anwendung verschiedener Isolierungsund Reinigungsverfahrensweisen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gewonnen werden.

Diese Erfindung bezieht sich auch auf eine biologisch gereinigte Kultur eines Mikroorganismus, der aus Nocardia orientalis NRRL 18098, Nocardia orientalis NRRL 18099, Nocardia orientalis NRRL 18100 oder einer(m) A82846-erzeugenden Mutante, Variante, oder Rekombinationsprodukt dieser Stämme, ausgewählt ist. Diese Mikroorganismen sind nützlich, weil sie Antibiotikum A82846 erzeugen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen ist in der folgenden Erörterung der NRRL 18098-Stamm mit Kultur A82846, der NRRL 18099-Stamm mit Kultur A82846.1 und der NRRL 18100-Stamm mit Kultur A82846.2 bezeichnet worden. Kultur A82846 wurde aus einer Bodenprobe von Haiti isoliert. Kultur A82846.1 wurde aus Kultur A82846 durch chemische Mutagenese erhalten, und Kultur A82846.2 ist eine natürliche Variante, die aus Kultur A82846 isoliert worden ist.

Die Kulturen A82846, A82846.1 und A82846.2 wurden am 8. August 1986 hinterlegt und stellen einen Teil des Bestandes der Kultursammlung des Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, dar. Die Kulturen sind der Öffentlichkeit unter den Registrierungsnummem NRRL 18098 (A82846, Mutterstamm), NRRL 18099 (A82846.1, Mutantenstamm) und NRRL 18100 (A82846.2, Variantenstamm) verfügbar.

Taxonomische Studien der Kulturen A82846, A82846.1 und A82846.2 wurden von Frederick P. Mertz der Lilly Research Laboratories ausgeführt. Aufgrund dieser Studien wurden die neuen Organismen als Stämme von Nocardia orientalis (Pittenger und Brigham, 1956), Pridham und Lyons 1969, Stammtypus: ATCC 19795 [R.C. Pittenger und R.B. Brigham, "Streptomyces orientalis n. sp., the Source of Vancomycin", Antibiotics and Chemotherapy 6, 642-647 (1956)] klassifiziert. Diese Klassifizierung beruht auf unmittelbaren Laboratoriumsvergleichen und Prüfungen veröffentlichter Beschreibungen [Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auf., R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, Herausgeber, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974; M. Goodfellow und K.P. Schaal, "Identification Methods for Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus", in Identification Methods for Microbiologists, 2. Aufl., F.A. Skinner und D.W. Lovelock, Herausgeber, Society for Applied Bacteriology Technical Series No. 14, Academic Press, Inc., New York, 1979, S. 261; R.E. Gordon, D.A. Bamett, J.E. Handerhan und C.H. Pang, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the Nocardin Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. 24 (1), 54-63 (1974); R.E. Gordon, S.K. Mishra und D.A. Bamett, "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. camea, N. vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis, and N. aerocolonigenes", J. Gen. Microbiol. 109, 69-78 (1978); S.J. Mishra, R.E. Gordon und D.A. Bamett, "Identification of Nocardiae and Streptomyces of Medical Importance", J.Clin.Microbiol. 11 (6), 728-736 (1980); H. Mordarska und M. Mordarski] "Chemotaxonomic Characters and Classification of Some Nocardioform Bacteria", J. Gen. Microbiology 71, 77-86 (1972); und R. Shinobu und M. Kawato, "On Streptomyces aerocolonigenes nov. sp., Forming the Secondary Colonies on the Aerial Mycelia", Bot. Mag. Tokyo 73, 213-216(1960)].

Angewendete Methoden

Die angewendeten Methoden waren jene, die vom International Streptomyces Project (ISP) für die Charakterisierung von Streptomyces-Spezies [E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340 (1966)] empfohlen wurden, und jene, die für die Charakterisierung von Nocardia-Spezies von Gordon, Bamett, Handerhan und Pang, l.c., empfohlen wurden.

Die Morphologie würde unter Verwendung eines optischen Lichtmikroskops untersucht. Zum Studium der Omamentierung der Sporenoberfläche wurde ein Raster -Elektronenmikroskop (SEM) verwendet.

Die Resistenz gegen Rifampin und Lysozym wurde nach Methoden gemessen, die von Gordon [R.E. Gordon -4-

Nr. 390 802 und D.A. Barnett, "Resistance to Rifampin and Lysozyme of Strains of Some Species of Mycobacterium and Nocardia as a Taxonomie Tool”, Int. J. Syst. Bacteriol. 27 (3), 176-178 (1977)] empfohlen worden sind.

Zur Bestimmung der Farbnamen wurden ISCC-NBS Centroid Color Charts, Standardmuster Nr. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C.) und das Color Harmony Manual (4. Aufl., Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) verwendet.

Melanoidpigmentproduktion (Chromogenizität) wurde mit ISP No. l-(Trypton-Hefeextrakt-Brühe)-, ISP No. 6-(Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar)- und ISP No. 7-(Tyrosin-Agar)-Medien bestimmt.

Die Isomeren von Diaminopimelinsäure (DAP) und die Kohlenhydrate in Hydrolysaten von ganzen Zellen wurden durch die chromatographischen Methoden von Becker und Mitarbeitern [B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon und H.A. Lechevalier, "Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 12,421-423 (1964)] und von Lechevalier [M.P. Lechevalier, "Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinical Importance", J. Lab. Clin. Med. 71, 934-944 (1968)] ermittelt

Mycolinsäuren wurden nach einer Methode bestimmt, die auf von Minnikin [D.E. Minnikin, I.G. Hutchinson und A.B. Caldicott, "Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bacteria", J. Chromatography 188,221-233 (1980)] beschriebenen Arbeitsverfahren beruht.

Phosphatase und Urease wurden nach Methoden bestimmt, die von Blazevic (DJ. Blazevic und G.M. Ederer, Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975, S. 136) beschrieben worden sind. Zur Bestimmung von Proteinaseaktivität wurde Gelatineverflüssigung angewendet.

Die Resistenz gegenüber Antibiotika wurde durch Aufdrücken von Antibiotikum-empfindlichen Scheiben auf die Oberfläche von beimpften ISP No. 2-Agaiplatten gemessen.

Stärkehydrolyse wurde durch Prüfung auf das Vorliegen von Stärke mit Iod auf ISP No. 4-(anorganische Salze-Stärke)-Agarplatten bestimmt (siehe Blazevic und Ederer, l.c.).

Hippurathydrolyse wurde unter Verwendung von Bacto Differentiation Disks, mit welchen die Hydrolyse von Hippurat rasch festgestellt wird, gemessen.

Kulturkennmerkmale A82846- und A82846.2-Kulturen wuchsen auf all den verwendeten komplexen und definierten Medien gut. Diese Kulturen entwickelten auf den meisten Medien Luftmyzelien. Die Farbe der Luftsporenmasse war in Abhängigkeit vom Medium weiß oder grau. Auf vielen Medien wurde ein unterscheidbares braunes, lösliches Pigment erzeugt; die Rückseite war braun bis gelblich-weiß.

Die Kultur A82846.1 wuchs auch auf all den verwendeten Medien, doch war ihr Wuchs weniger reichlich als jener der Mutterkultur. A82846.1 produzierte nur selten Luftmyzelien. Falls vorhanden, war die Myzelfarbe weiß. Auf einigen wenigen Medien wurde ein gelegentliches, nicht-charakteristisches, hellbraunes, lösliches Pigment produziert; die Rückseite war braun bis gelblich-weiß.

Die Kulturkennmerkmale der Kulturen A82846, A82846.1 und A82846.2 sind in Tabelle I zusammengefaßt. Die Kulturen A82846 und A82846.2 waren sehr ähnlich und unterschieden sich nur in wenigen Kultureigenschaften. Wegen ihrer Ähnlichkeit, und da A82846.2 eine natürliche Variante von A82846 ist, wurden keine weiteren Vergleiche angestellt.

Tabelle I:

Kulturkennmerkmale von A82846, A82846.1 und A82846.2 auf verschiedenen Agarmedien a> ^

Agarmedien A82846 A82846.1 A82846.2 W: Reichlich Reichlich (Oberfläche schält ab) Reichlich ISP R:59.d.Br. 57.1.Br 58.m.Br. No. 2 Lm: Reichlich: g Medium grau Keines Spur Lp: Dunkelbraunes Pigment -keine pH-Änderung Keines Hellbraun W: Gut Dürftig Gut ISP R: 92.y Weiß 92.y Weiß 92.y Weiß No. 3 Lm: Gut: a Weiß Dürftig: a Weiß Annehmbar: a.weiß Lp: Keines Keines Keines -5-

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Tabelle I (Fortsetzung) 5 Agaimedien A82846 A82846.1 A82846.2 W: Reichlich Dürftig Gut 10 ISP R: 56 tief Br 92.y Weiß 77.m.y Br No. 4 Lm: Reichlich: a Weiß Dürftig: a Weiß Gut: g weiß Lp: Keines Keines Keines 15 W: Reichlich Reichlich Reichlich ISP R: 47.d.gyj Br 47.d.gy.r Br 47.d.gyjBr No. 5 Lm: Gut: d Hellgrau Keines Gut: d hellgrau Lp: Hellbraun Hellbraun Hellbraun 20 W: Reichlich Gut Reichlich ISP R: 59.d.Br 78.d.y Br 59.d.Br No. 7 Lm: Reichlich: g Medium grau Lp: Dunkelbraunes Pigment - Spur Reichlich: d Hellgrau 25 keine pH-Änderung Hellbraunes Pigment Dunklbraunes Pigment W: Reichlich Gut Reichlich Czapek's R: 56.tief Br 47.d.gy. Br 5b. tief Br 30 Lm: Reichlich: a Weiß Keines Reichlich: a Weiß Lp: Keines Rötlich-orange Hellrötlich-orange W: Gut Gut Gut 35 Glucose- R: 58.rn.Br (nur Flecken) 77.m.y Br 58.m.Br Asparagin Lm: Annehmbar: A Weiß Keines Keines Lp: Keines Keines Keines 40 W: Reichlich (Oberfläche Gut (gerunzelt, feuchte Gut (gerunzelt, feuchte Glucose- schält ab) Oberfläche) Oberfläche) Hefe- R: 21. schwärzlich rot 77.m.y Br 77.m.y Br Extrakt Lm: Keines Keines Keines Lp: tief rötlich-braun Keines Hellbraun 45 W: Gut Gut Annehmbar Nähragar R: 45.1.gy.r E|r 76.1.y Br 79.1.9y.y Br Lm: Keines Keines Dürftig 50 Lp: Hellbraun Keines Keines W: Reichlich Reichlich Reichlich Tomatenpaste- R: 47.d.gy.r Br 57.1.Br 47.d,9y.r Br 55 Hafermehl Lm: Reichlich: d Hellgrau Spur: a Weiß Gut: d Hellbraun Lp: Dunkel rötlich-braun Keines Rötlich-braun -6- 60

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Tabelle I (Fortsetzung!

Agarmedien A82846 A82846.1 A82846.2 W: Annehmbar Annehmbar Gut Leitungswasser- R: 92.y Weiß 92.y Weiß 92.y Weiß Agar Lm: Annehmbar: a Weiß Annehmbar b Austemweiß Gut a Weiß Lp: Keines Keines Keines W: Annehmbar (keine Hydrolyse) Gut (Hydrolyse) Annehmbar (keine Hydrolyse) Calcium- R: 57.1.Br 58.m.Br 57.1.Br malat Lm: Spur Keines Spur Lp: Hellbraun Hellbraun Hellbraun a W = Wuchs; R = Rückseite; Lm = Luftmyzel; Lp - lösliches Pigment k 21 Tage lang bei 30 °C bebrütet

Morphologische Kennmerkmale

Die Kulturen A82846, A82846.1 und A82846.2 produzierten ein ausgedehntes Substratmyzel. Lufthyphae bildeten lange Ketten von Conidien mit einem Aussehen von Spinnengewebe, welches in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, l.c., als Charakteristikum von Nichtstreptomyceten klassifiziert ist.

Bei allen Kulturen war die Omamentierung der Sporenoberfläche glatt, und die Sporenform war zylindrisch. Die Sporengröße lag bei A82846 im Bereich von 1,2-1,3 x 0,4-0,5 pm, und bei A82846.1 im Bereich von 1,4-2,2 x 0,3-0,4 pm.

Wenn der Wuchs unter submersen Bedingungen und unter Schütteln erfolgte, zeigte A82846 eine minimale Zerstückelung, A82846.1 zeigte extensive Zerstückelung und A82846.2 zeigte mäßige Zerstückelung.

Physiologische Kennmerkmale

Sowohl Kultur A82846 als auch Kultur A82846.1 produzierten Säure aus: Arabinose, Cellobiose, Dextran, Fructose, Galactose, Glucose, α-Methyl-D-glucosid, Glycerin, Inosit, Lactose, Maltose, Mannit, Mannose, Melibiose, Rhamnose, Ribose, Saccharose, Trehalose und Xylose, produzierten aber keine Säure aus Adonit, Cellulose, Dulcit, Erythrit, Inulin, Sorbit und Xylit. A82846 produzierte auch Säure aus: Ethanol, Glycogen, Melezitose, Raffinose und Salicin, was aber bei A82846.1 nicht der Fall war. Beide Kulturen verwerteten Acetat, Citrat, Lactat, Malat, Oxalat, Propionat, Pyruvat und Succinat, verwerteten aber nicht Benzoat, Mucat und Tartrat. Kultur A82846.1 verwertete Butyrat, was aber bei Kultur A82846 nicht der Fall war. A82846 und A82846.1 zersetzten Casein, Hypoxanthin, Tyrosin, Harnstoff und DNS, zersetzten aber nicht Adenin, Calciummalat oder Xanthin. Beide Kulturen hydrolysierten Stärke, hydrolysierten aber Esculin oder Hippurat nicht, reduzierten Nitrat, verflüssigten Gelatine, überlebten eine Temperatur von 50 °C 8 Stunden lang und produzierten Catalase, ^S und Phosphatase.

Die A82846- und A82846.1-Kulturen hatten identische Antibiotikaresistenzmuster. Sie waren gegen Bacitracin (10 Einheiten), Cephalothin (30 pg), Gentamicin (10 pg), Lincomycin (2 pg), Oleandomycin (15 pg), Penicillin G (10 Einheiten), Streptomycin (10 pg), Vancomycin (30 pg), Tobramycin (10 pg), Erythromycin (15 pg), Nalidixinsäure (30 pg), Polymixin B (300 Einheiten), Trimethoprim (5 pg) und Sulfadiazin (300 pg) resistent und waren gegen Neomycin (30 pg), Rifampin (5 pg), Tetracyclin (30 pg), Chloramphenicol (30 pg), Novobiocin (30 pg) und Mandelamin (3 pg) empfindlich.

Jeder der Stämme A82846 und A82846.1 verfärbte sich grampositiv, die Färbung war aber im sauren Medium nicht beständig. A82846 produzierte melanoide Pigmente, wohingegen dies bei A82846.1 nicht der Fall war.

Zellwandanalvse

Hydrolysierte, ganze Zellen von A82846 enthielten das meso-isomer von Diaminopimelinsäure und die Zucker Arabinose und Galactose. Die Kulturen haben eine Zellwand vom Typus IV gemäß Becker und Mitarbeitern, Lc. Das Zuckerschema ist ein solches vom Typus A ( Lechavalier, l.c.). Die Kulturen produzierten -7-

Nr. 390 802 keine Mycolinsäuren (LCN-A).

Identität von Stamm A82846

Die chemotaxonomischen und allgemeinen Kulturkennmerkmale von Stamm A82846 stimmen mit seiner Zuordnung zur Gattung Nocardia Trevisan 1889 [V.B.D. Skerman, V. McGowan und P.H.A. Sneath, Hsgb., "ApprovedLists of Bacterial Names", IntJ.Syst.Bacteriol. 30,225420 (1980)] überein.

Aus den Eigenschaften von vierzehn Nocardia-Arten, die von Gordon, Mishra und Bamett, l.c„ veröffentlicht worden sind, und von fünf Stämmen aus der Lilly-Kultursammlung wurden Ähnlichkeitskoeffizienten errechnet. Es wurden der Koeffizient von Jaccard [siehe P.H.A. Sneath, "The Application of Computers to Taxonomy", J.Gen.Microbiol. 17, 201 (1957)] und der einfache Übereinstimmungskoeffizient [siehe RJR. Sokal und C.D. Michener, "A Statistical Method for Evaluating Systematic Relationships", Kan. Univ. Sei. Bull. 38, 1409 (1958)] benutzt. Die Ergebnisse dieser Vergleiche sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle Π Ähnlichkeitskoeffizienten für A82846 und 19 andere Nocardia-Arten

Kultur Ähnlichkeitskoeffizient Ssm Sj A82846 N. aerocolonipenes N. aerocolonieenes (A42125)1 N. orientalis (M43-05865) N. orientalis (A51568.1) N. orientalis N. orientalis (M5-18215) N. orientalis (M5-18260) N. madurae N, hirsuta N. autotrophica N. dassonvillei N.amarae N. brasiliensis N. vaccinci N. transvalensis N. caviae N. pelletieri N. asteroides N. camea 100 100 84 76 83 78 78 72 78 72 75 68 73 66 73 66 73 63 62 60 62 53 62 50 62 46 56 43 56 43 48 38 48 32 48 24 46 23 43 25 -8- 1

In Klammer gesetzte Zahlen geben Stämme, aus der Kultursammlung von Lilly an.

Da N. madurae in die Gattung Actmomadura übertragen worden ist, wurde sie nicht in die Betrachtungen einbezogen. Zwei Arten, nämlich N. aerocolonigenes und N. orientalis, hatten gute Ähnlichkeitskoeffizienten. Es wurden Laboratoriumsvergleiche zwischen A82846 und diesen zwei Arten durchgeführt. Die Tabelle III gibt die Ergebnisse dieser Vergleiche an.

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Tabelle ΤΠ

Vergleich von Eigenschaften von A82846. N. orientalis und N. aerocolonigenes _Kultur a_ N. N. aeorocolon- 82846_orientalis_i genes

Eigenschaft

Bildet Lufthyphen + + + Farbe im Luftbereich weiß + + + Bildet Conidien + + + Sporenoberfläche glatt + + + Sporenform zylindrisch + + - Bildet lösliches Pigment + - - Gram + + + ' + Säurebeständig - - - Zeigt Fragmentierung + + + Bildet Catalase + + + Hydrolysiert: Esculin - + + Hippurat - - - Stärke + + + Calciummalat - + + Reduziert Nitrat + + - Zersetzt: Adenin - - - Casein + + + Hypoxanthin + + + Tyrosin + + + Harnstoff + + + Xanthin - - - Verflüssigt Gelatine + + - Bildet Phosphatase + + + Überlebt 8 h lang bei 50° C + + - Bildet Säure aus: Adonit - + - Arabinose + + + Cellobiose + + + Erythrit - + - Glucose + + + a-Me-glucosid + + - Glycerin + + + Inosit + + + Lactose + + + Maltose + + + Mannit + + + Mannose + + + Melezitose + - - Melibiose + - + Raffinose + - - Rhamnose + + + Sorbit - - - Trehalose + + + Xylose + + + Kontrolle - - - -9-

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Tabelle ΠΙ (Fortsetzung!

Kultur a Eigenschaft 82846 N. orientalis N. aeorocolon· ieenes Verwertet; Benzoat - - - Citrat + + + Mucat - - T Succinat + + + Tartrat - - - Kontrolle - - - Resistenz gegenüber: Bacitracin (10 Einheiten) + - - Cephalothin (30 μg) + + + Gentamicin (10 μg) + - - Lincomycin (2 pg) + + + Neomycin (30 μg) - - - Oleandomycin (15 μg) + - - Penicillin G (10 Einheiten) + + + Rifampin (5 μg) - - - Streptomycin (10 μg) + + - Tetracyclin (30 pg) - - - Tobramycin (10 pg) + + - Vancomycin (30 pg) + + - Chloramphenicol (30 pg) - - - Erythromycin (15 pg) + - - Nalidixinsäure (30 pg) + + - Novobiocin (30 pg) - + - Polymixin B (300 Einheiten) + + + Trimethoprim (5 pg) + + + a+ = Stamm besitzt die Eigenschaft; - = Stamm hat die Eigenschaft nicht

Unter Verwendung einer großen Zahl von vererbten Eigenschaften wurden Ähnlichkeitskoeffizienten erneut errechnet Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV Ähnlichkeitskoeffizient für A82846. Nocardia orientalis und Nocardia aerocolonigenes

Kultur _Ähnlichkeitskoeffizient _;_Ssm_Si A82846 100 100 N. orientalis 81 76 N. aerocolonigenes 73 65

Weder N. orientalis noch N. aerocolonigenes hat in ihren Zellwänden Mycolinsäuren. Gordon, l.c., beschreibt drei Schlüsseleigenschaften, um N. orientalis von N. aerocolonigenes unterscheiden zu helfen. Ein Vergleich von A82846 mit den Nocardia-Arten unter Benützung von Gordon's Schlüsseleigenschaften ist in Tabelle V angegeben. -10-

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Tabelle V

Vergleich von Schlflsseleigenschaften von A82846. Nocardia orientalis und Nocardia aerocolonigenes

Eigenschaft

Bildet Säure aus Resistenz gegenüber

Kultur Me-a- _Erythrit glucosid Lysozym A82846 - + + N. orientalis + + N. aerocolonigenes +

Obgleich A82846 den Schlüsseleigenschaften von irgendeinem der zwei Nocardia-Stämme nicht identisch gleicht, hat sie in den Kulturkennmerkmalen eine größere Verwandtschaft zu N. orientalis und einen höheren Ähnlichkeitskoeffizienten mit N. orientalis. Sie gleicht auch N. orientalis insofern, als sie ein Glykopeptidantibiotikum produziert. A82846 wird daher als ein Stamm von Nocardia orientalis (Pittenger und Brigham, 1956) Pridham und Lyons 1969, klassifiziert. Weil N. orientalis in den Approved Lists of Bacterial Names, l.c., anerkannt ist, handelt es sich um eine gültig veröffentlichte Spezies.

Kultur A82846.1 ist eine chemisch induzierte Mutante der A82846-Kultur. Die Merkmale, in welchen sich A82846.1 von A82846 unterscheidet, sind in Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Vergleich von Unterschieden zwischen A82846 und A82846.1

Eigenschaft A82846 A82846.1 Fragmentierung minimal reichlich Größe der Kolonie 7 mm 5 mm Oberfläche der Kolonie hart weich Lufthyphen reichlich Spur Farbe der Rückseite dunkelbraun hellbraun Lösliches Pigment + - Bildet Säure aus: Ethanol + - Glycogen + - Melezitose + - Raffmose + - Salicin Verwertet: + “ a-Me-glucosid + - Glycogen 1 + - Melezitose + - Sorbose + - Butyrat - + Melanoide Pigmente + - A82846.1 unterscheidet sich von A82846 auch in dem Ausmaß an gebildeter antibiotischer Aktivität. Die anderen augenscheinlichsten Unterschiede zwischen den Stämmen sind die, daß A82846.1 zum Unterschied von A82846 kein Luftmyzel und kein unterscheidbares lösliches Pigment produziert

Kultur A82846.2 ist eine natürliche Variante von Kultur A82846. Damit sind die Identifizierungskennmerkmale von A82846.2 im wesentlichen die gleichen wie jene von A82846. Der Hauptunterschied zwischen A82846 und A82846.2 besteht darin, daß die A82846.2-Kultur, wenn sie in -11-

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Schüttelkolben gezüchtet wird, signifikant größere Mengen an Antibiotikum A82846 produziert, als dies bei der A82846-Kultur der Fall ist.

Wie dies bei anderen Organismen der Fall ist, unterliegen auch die Kennmerkmale der A82846-produzierenden Kulturen dieser Erfindung, Nocardia orientalis Stämme NRRL 18098, NRRL 18099 und NRRL 18100, der Variation. Somit kann Nachkommenschaft dieser Stämme, z. B. Rekombinanten, Mutanten und Varianten, nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden erhalten werden. Beispielsweise können Varianten durch natürliche Selektion erhalten werden, und Mutanten können durch Behandlung mit verschiedenen bekannten physikalischen und chemischen Mutagenen, wie Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, und Chemikalien, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, erhalten werden.

Rekombinantenstämme können durch Transformation der Nocardia orientalis-Stämme unter Anwendung von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahrensweisen entwickelt werden. Wegen der Ähnlichkeit zwischen Nocardia und Streptomyces können Transformationsmethoden und Rekombinationsvektoren, die für die Verwendung bei Streptomyces entwickelt worden sind, auch zur Transformation von Nocardia-Stämmen verwendet werden. Durch die Anwendung von Rekombinationstechnologie können die Nocardia orientalis-Stämme transformiert werden, um zusätzlich zu den Antibiotika, die diese Stämme produzieren, eine Vielfalt von Genprodukten zur Expression zu bringen. Beispielsweise kann man die Stämme mit einem Rekombinationsvektor transformieren, der gegenüber einem Antibiotikum, gegen welches die Stämme normalerweise empfindlich sind, Resistenz verleiht. So erhaltene Transformanten werden nicht nur die A82846-Antibiotika produzieren, sondern auch das Resistenz verleihende Enzym, das die Selektion der transformierten Zellen von Zellen des Wildtypus ermöglicht.

Ferner kann man unter Anwendung ähnlicher Methoden die vorliegenden Stämme modifizieren, um Mehrfachkopien der endogenen Antibiotikumbiosynthesegene einzuführen, und dadurch eine höhere Antibiotikumausbeute zu erzielen. Nachkommenschaft, nämlich natürliche und induzierte Varianten, Mutanten und Rekombinanten, der Nocardia orientalis Stämme NRRL 18098, NRRL 18099 undNRRL 18100, welche das Kennmerkmal der A82846-Produktion beibehalten, sind ein Teil dieser Erfindung.

Das zum Züchten der Nocardia orientalis-Kulturen verwendete Medium kann irgendeines aus einer Anzahl von Medien sein. Für eine wirtschaftliche Produktion, optimale Ausbeute und Leichtigkeit der Produktisolierung werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt So sind beispielsweise bevorzugte Kohlenhydratquellen für die Fermentation in großem Maßstabe Glucose und Kartoffeldextrin, obgleich Ribose, Xylose, Fructose, Galactose, Mannose, Mannit, lösliche Stärke u. dgl. auch verwendet werden können.

Bevorzugte Stickstoffquellen sind enzymhydrolysiertes Casein und Fleischpeptone, obgleich Hefeextrakt, säurehydrolysiertes Casein, Rindfleischextrakt, Fischmehl, Lebermehl u. dgl. auch verwendet werden können.

Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien einverleibt werden können, gehören die üblichen löslichen Salze, die zur Lieferung von Zink-, Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat- u. dgl. -Ionen geeignet sind.

Wesentliche Spurenelemente, die für den Wuchs und die Entwicklung des Organismus notwendig sind, sollten dem Kulturmedium auch ein verleibt werden. Solche Spurenelemente kommen üblicherweise als Verunreinigungen in anderen Substanzen des Mediums in ausreichenden Mengen vor, um die Wuchserfordemisse des Organismus zu befriedigen. Falls Schäumen ein Problem darstellt, können geringe Mengen (nämlich 0,2 ml/1) eines Antischaummittels, wie Polypropylenglykol, den Fermentationsmedien für das Arbeiten in großem Maßstabe zugesetzt werden.

Zur Erzeugung wesentlicher Mengen der A82846-Antibiotika wird eine submerse, aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt Kleine Mengen der Antibiotika können durch Schüttelkolbenkultur erhalten werden. Wegen der Lagzeit bei der Antibiotikaerzeugung, die üblicherweise mit der Beimpfung großer Tanks mit der Sporenform des Organismus verbunden ist, wird es bevorzugt, ein vegetatives Impfmaterial zu verwenden. Das vegetative Impfmaterial wird durch Beimpfung eines kleinen Volumens von Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Myzelfragmenten des Organismus hergestellt, um eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus zu erhalten. Das vegetative Impfmaterial wird dann in einen größeren Tank überführt. Das vegetative Impfmedium kann das gleiche sein wie jenes, das für größere Fermentationen verwendet wird, doch sind andere Medien auch geeignet.

Die A82846-Antibiotika werden von den A82846-produzierenden Organismen beim Wuchs bei Temperaturen zwischen etwa 23° und etwa 37 °C erzeugt. Optimale Temperaturen für die A82846-Produktion scheinen etwa 30 - 31 °C zu sein.

Bei submersen, aeroben Kulturverfahren ist es üblich, in den Kessel vom Boden her sterile Luft zu blasen, während das Medium mit üblichen Turbinenschaufeln gerührt wird. Die maximale Sauerstoffaufnahme der Fermentation unter den bisher angewendeten Bedingungen hat etwa 0,2 mM/l/min nicht überschritten. Im allgemeinen soll die Belüftungsgeschwindigkeit und die Rührgeschwindigkeit ausreichend sein, um die Menge an gelöstem Sauerstoff bei oder über 50 % der Sättigung zu halten.

Die Erzeugung der A82846-Antibiotika kann während der Fermentation durch Prüfung von Proben der Brühe auf antibiotische Wirksamkeit gegen Organismen verfolgt werden, die bekanntermaßen für das Antibiotikum empfindlich sind. Ein nützlicher Testorganismus ist Bacillus subtilis ATCC 6633. Der Bioassay wird üblicherweise mit Hilfe des Agar-Lochplattentests ausgeführt. -12-

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Nach ihrer Erzeugung unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen können die A82846-Antibiotika aus dem Fermentationsmedium nach auf dem Fachgebiet angewendeten Methoden gewonnen werden. Die während der Fermentation der A82846-produzierenden Organismen produzierte antibiotische Aktivität tritt sowohl in den Myzelien als auch in der Brühe auf. Maximale Gewinnung von A82846 wird daher erzielt, indem anfänglich der pH zur Freisetzung von A82846 aus den Myzelien auf 10,5 eingestellt und dann das Medium zur Trennung der Brühe von der Myzelienmasse filtriert wird. A82846 kann aus der filtrierten Brühe durch eine Vielfalt von Methoden gewonnen werden. Eine bevorzugte Methode umfaßt die Einstellung der filtrierten Brühe auf einen pH-Wert von etwa 7 und Adsorption von A82846 auf einem Kationenaustauscherharz, z. B. Dowex XF5-43278, Dowex-50 oder Amberlite IR-120. Das Wirkmaterial wird aus dem Harz mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. verdünnter NH^OH-Lösung, eluiert. Die wirksamen Fraktionen werden dann unter Vakuum eingeengt, an einem makroretikulären Harz, z. B. Diaion HP-20 und Amberlite XAD-4, adsorbiert und mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wassenlsopropanol (95:5), das 1 % Essigsäure enthält, unter Gewinnung von A82846 eluiert. Das wirksame Material kann auch mit Wasser:Acetonitril- oder WassenMethanol-Gemischen, die kleine Mengen an Säure enthalten, eluiert werden. A82846 kann in Einzelkomponenten A82846A, A82846B und A82846C durch gleiche Verfahrensweisen getrennt werden. Eine bevorzugte Trennungsverfahrensweise umfaßt eine Umkehrphasen-Kieselsäuregel-(C ig oder Cg) Chromatographie.

Alternativ können die Kulturfeststoffe, darunter Mediumbestandteile und Myzel, ohne Extraktion oder Separation, jedoch vorzugsweise nach Entfernung von Wasser, als eine Quelle für A82846 benützt werden. Beispielsweise kann nach Erzeugung von A82846 die gesamte Fermentationsbrühe getrocknet werden, indem Lyophilisierung, Trommeltrocknen oder azeotrope Destillation und Trocknen vorgenommen werden. Die getrocknete Brühe wird dann unmittelbar in Futtervorgemische eingemischt.

Die A82846-Antibiotika haben gegen grampositive pathogene Bakterien ausgezeichnete in vitro- und in vivo-Wirksamkeit.

Eine besonders unerwartete Eigenschaft dieser Antibiotika ist ihre lange Serumhalbwertszeit. Beispielsweise hatte Vancomycin nach intravenöser Verabreichung an Ratten eine Serumhalbwertszeit von 45 Minuten, während A82846A und A82846B jeweils eine Halbwertszeit von 2,2 Stunden hatten.

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC's), bei welchen die A82846-Antibiotika bestimmte Bakterien hemmen, sind in den Tabellen VII und VIII angegeben. Die in den Tabellen Vü und VIII enthaltenen MIC-Werte wurden durch Standardagar-Verdünnungstests bestimmt.

Tabelle Vn

Antibakterielle Wirksamkeit der A82846-Antibiotika in vitro _MIC fng/m!)_

Testorganismus A82846A A82846B A82846C 0,125 0,125 1 0,125 0,125 1 0,125 0,125 1 0,125 0,125 1 0,25 0,25 1 0,25 0,25 1 0,125 0,125 1 0,125 0,125 2 0,25 0,25 2 0,5 0,5 4 e

Staphylococcus aureus Xl.l Staphvlococcus aureus V41a

Staphylococcus aureus X400b Staphylococcus aureus S13E Staphvlococcus epidermidis 270 Staphvlococcus eoidermidis 222 Streptococcus pyogenes 0203 Streptococcus pneumoniae Park I Streptococcus GruopeD X66 Streptococcus GruppeD 2041

Haemophilus influenzae C.L.c Haemophilus influenzae 76^ Escherichia coli EC14 Klebsiella pneumoniae X26 Pseudomonas aeruginosa X239 13-

Nr. 390 802 a Penicillin-resistenter Stamm; k Methicillin-resistenter Stamm; c Ampicillin-empfindlicher Stamm; ^ Ampicillin-resistenter Stamm; e = bei 128 μ^ιηΐ, der höchsten geprüften Menge, nicht wirksam

Tahelle VITT

Wirksamkeiten von A82846A. A82846B und Vancomvcin in vitro Anzahl

Organismus der ge- MIC (pg/ml) prüften __ . Stämme A82846A A82846B Vancomycin

Stanhvlococcus aureus 20 0,125-1,0 0,25-1,0 0,5-2,0 Stanhvlococcus enidermidis 20 0,25-2,0 0,5-1,0 1,0-2,0 Streptococcus pvogenes 12 0,125-0,25 0,125-0,25 0,5 Strentococcus nneumoniae 20 <0,015-0,25 0,125-0,25 <0,015-4,0 Strentococcus sn. eroun. D 20 0,25-1,0 0,25-1,0 1,0-2,0 Streptococcus salivaris 1 1,0 0,25 0,5 Strentococcus sanguis 4 0,25-0.5 0,25 0,5-1,0 Strentococcus mutans 2 0,125-0.5 0,125-1,0 0,125-2,0

Ein wichtiger Aspekt der antimikrobiellen Wirksamkeit von A82846-Verbindungen ist deren Wirksamkeit gegen anaerobe Bakterien. Diese Wirksamkeit wird in Tabelle IX veranschaulicht, welche die Wirksamkeit von A82846A und A82846B gegen verschiedene anaerobe Bakterien, bestimmt durch Standardagar-Verdünnungstest, zusammenfaßt. Die Endwerte wurden nach 24-stündiger Bebrütung abgelesen.

Tabelle IX

Wirksamkeit von A82846A und B gegen anaerobe Bakterien

Anzahl der ge- MIC (pg/ml)

Anaerobe Bakterien prüften _

Stämme A82846A A82846B Vancomycin

Gram-positive Stämme:

Clostridium difficile 19 0,125-1 <0,06-0,125 0,54 Clostridium perfringens 1 <0,25 0,5 2 Clostridium septicum 1 0,5 0,5 2 Eubacterium aerofaciens 1 <0,25 0,5 2 Peptococcus asaccharolvticus 3 <0,25 0,06-0,5 1 Pentococcus prevoti 4 1-2 14 14 Peptococcus variäbilis 1 0,5 1 1 Peptococcus constellatus 1 0,25 0,25 1 Pentococcu? magnus 3 0,06-0,125 0,125-0,25 0,25-1 Peptostrentococcus anaerobius 8 0,06-2 0,06-8 0,25-2 Peptostrentococcns intermedius 3 <0,25 0,25-0,5 0,5-1 Pronionibacterium acnes 19 <0,25 <0,25 2-16 -14-

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Tabelle IX (Fortsetzung)

Anaerobe Bakterien Anzahl da-geprüften Stämme MIC (pg/ml) A82846A A82846B Vancomycin Gram-negative Stämme: Bacteroides fragilis 3 >128 >128 32-64 Bacteroides thetaiotaomicron 1 128 128 64 Bacteroides melaninogenicus 2 >128 >128 >128 Bacteroides vuleatis 1 128 >128 64 Bacteroides corrodens 1 >128 >128 64 Fusobacterium svmbiosum 1 128 128 4 Fusobacterium necroDhonim 1 128 128 1 Die A82846-Antibiotika haben auch in vivo gegen experimentell induzierte Infektionen in Laboratoriumstieren antimikrobielle Wirksamkeit gezeigt. Wenn zwei Dosierungen der Testverbindung an Mäuse verabreicht wurden, die experimentell mit dem Testorganismus infiziert worden waren, wurde die beobachtete Wirksamkeit als ein ED^Q-Wert [wirksame Dosis in mg/kg, um 50 % der Versuchstiere zu schützen: siehe Warren Wiek und Mitarbeiter, J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961)] gemessen. ED^Q-Werte, die bei veranschaulichenden Verbindungen beobachtet wurden, sind in Tabelle X angegeben.

Tabelle X

In vivo-Aktivität von A82846-Antibiotika ED5Q-Werta

Verbindung Stanhvlococcus aureus Streptococcus ovoeenes Streotococcus Dneumoniae A82846A 0,19 0,19 0,17 A82846B 0,19 0,20 0,18 A82846C 2,18 2,71 5,87 Vancomycin 1,3 0,72 1,52 a mg/kg x 2; die Dosen wurden subkutan an Mäuse 1 und 4 Stunden nach der Infektion verabreicht

Gemäß einem wichtigen Gesichtspunkt ihrer antibakteriellen Wirksamkeit sind die A82846-Antibiotika zur Behandlung von Pyelonephritis nützlich. Beispielsweise waren A82846A und A82846B wirksamer als Vancomycin beim Schutz gegen eine experimentelle, absteigende Pyelonephritis-Infektion in Ratten. Dieser Test wurde unter Anwendung einer Verfahrensweise ausgeführt, die jener ähnlich ist, welche in der US-PS 4,208.403 beschrieben ist Die beobachteten Ergebnisse sind in Tabelle XI zusammengefaßt. -15-

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Tabelle. XI

Wirksamkeit von A82846A und B im Rattentest betreffend absteigende Pvelonenhritis

Prozentsatz Prozentsatz von Ratten Dosierung von geheil- mit einer 4-Log-Reduk- Verbindung (mg/kg x 12)a ten Ratten tion des Titers A82846A 10 88 100 5 75 88 2 63 100 A82846B 10 100 100 5 100 100 2 50 88 Vancomycin 10 63 100 5 38 88 2 38 75 a Zwei Dosen täglich subkutan während 6 Tagen

Die A82846-Antibiotika sind auch bei der Behandlung von Endocarditis nützlich. Beispielsweise waren A82846A und B bei der Behandlung einer experimentellen katheterinduzierten Endocarditisinfektion in Ratten ebenso wirksam wie Vancomycin. Bei diesem Test wurden die Ratten durch Einsetzen eines Kunststoffkatheters in die rechte Karotisarterie, Herabführen desselben in das rechte Ventrikel des Herzens und sicheres Festlegen desselben vorbereitet. Die Tiere wurden 2 Tage ruhen gelassen, und dann wurde der Testorganismus, Streptococcus faecalis X-66, intravenös verabreicht Der Titer des Organismus betrug annähernd 5 x lofyml; es wurden 0,5 ml verabreicht.

Die Verbindungen wurden subkutan 15 Minuten vor der Infektion und in 12-stündigen Intervallen 14 Tage lang verabreicht, so daß insgesamt 28 Behandlungen vorgenommen wurden. Die Tiere wurden 2 Tage nach der Therapie am Leben erhalten; dann wurden die Herzen entnommen, homogenisiert, verdünnt und auf Trypticase-Sojaagar-Platten aufgebracht. Die Platten wurden 48 Stunden vor dem Zählen bebrütet.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle ΧΠ zusammengefaßt

Tabelle ΧΠ

Wirksamkeit von A82846A und B im Ratten-Endocarditis-Test^ 16 Tage

Verbindung Dosierung*5 (mg/kg x 28) » Prozentsatz geheilter Tiere Prozentsatz der Tiere mit 4Log-Abfallc A82846A 20 100 100 A82846B 20 100 100 Vancomycin 20 100 100 a Katheter-induzierte Endocarditis unter Verwendung von Streptococcus faecalis X-66 k Subkutane Dosen in 12-stündigen Intervallen während 14 Tagen c Prozentsatz von getöteten Tieren mit 4 Log-Abfall -16-

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Pharmazeutische Formulierungen der A82846-Antibiotika sind auch Teil dieser Erfindung. So können die Antibiotika, vorzugsweise in der Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, für orale oder parenterale Verabreichung zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung bakterieller Infektionen formuliert werden. Beispielsweise können die Verbindungen mit üblichen pharmazeutischen Trägem und Exzipienzien vermischt und in der Form von Tabletten, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Oblaten u. dgl. benützt werden.

Die ein A82846-Antibiotikum enthaltenden Zusammensetzungen werden etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 90 Gew.- % der Wirkverbindung, und allgemeiner etwa 10 bis etwa 30 %, enthalten. Die Zusammensetzungen können übliche Träger und Exzipienzien, wie Maisstärke oder Gelatine, Lactose, Saccharose, mikrokristalline Cellulose, Kaolin, Mannit, Dicalciumphosphat, Natriumchlorid und Alginsäure, enthalten. Sprengmittel, wie sie üblicherweise in den Formulierungen dieser Erfindung verwendet werden, umfassen Croscarmellose-Natrium, mikrokristalline Cellulose, Maisstärke, Natriumstärkeglykolat und Alginsäure.

Tablettenbindemittel, die einverleibt werden können, sind Akazia, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon (Povidon), Hydroxypropylmethylcellulose, Saccharose, Stärke und Ethylcellulose.

Schmiermittel, die verwendet werden können, umfassen Magnesiumstearat oder andere Metallstearate, Stearinsäure, Silikonflüssigkeit, Talk, Wachse, Öle und kolloidale Kieselsäure.

Aromatisierungsmittel, wie Pfefferminz, Wintergrünöl, Kirscharoma od. dgl., können auch verwendet werden.

Es kann wünschenswert sein, ein Färbemittel zuzusetzen, um der Dosierungsform ein ästhetischeres Aussehen zu verleihen, oder um die Identifizierung des Produktes zu unterstützen. Für intravenösen (i.v.) Gebrauch kann eine wasserlösliche Form des Antibiotikums in einer der üblicherweise verwendeten intravenösen Flüssigkeiten aufgelöst und durch Infusion verabreicht werden. Solche Flüssigkeiten, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung, Ringer'sche Lösung oder 5 %-ige Dextroselösung, können verwendet werden. Für intramuskuläre Zubereitungen kann eine sterile Formulierung einer geeigneten löslichen Salzform der Verbindung, z. B. des Hydrochloridsalzes, aufgelöst und in einem pharmazeutischen Verdünnungsmittel, wie Wasser für Injektionszwecke, physiologische Kochsalzlösung oder 5 %-ige Glucoselösung, verabreicht werden. Eine geeignete unlösliche Form der Verbindung kann hergestellt und als eine Suspension in einer wässerigen Basis oder einer pharmazeutisch annehmbaren Ölbasis, z. B. einem Ester einer langkettigen Fettsäure, wie Ethyloleat, verabreicht werden. Für orale Verwendung ist eine sterile Formulierung einer geeigneten Salzform des Antibiotikums, z. B. das Hydrochloridsalz, formuliert in einem Verdünnungsmittel, wie destilliertem oder entionisiertem Wasser, besonders nützlich.

Alternativ kann die Einheitsdosierungsform des Antibiotikums eine Lösung des Antibiotikums, vorzugsweise in dessen Salzform, in einem geeigneten Verdünnungsmittel in sterilen, hermetisch verschlossenen Ampullen sein.

Die Konzentration des Antibiotikums in der Einheitsdosierung kann variieren, beispielsweise von etwa 1 % bis etwa 50 % in Abhängigkeit von der besonderen Form des Antibiotikums und seiner Löslichkeit und der vom Arzt gewünschten Dosierung.

Nach einem weiteren Aspekt wird durch diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Infektionskrankheiten, insbesondere jener, die durch grampositive Mikroorganismen hervorgerufen werden, in Tieren geschaffen. Das Tier kann entweder für den Mikroorganismus empfänglich oder mit diesem infiziert sein. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer Menge eines A82846-Antibiotikums, die für diesen Zweck wirksam ist, an das Tier. Im allgemeinen ist eine wirksame Menge von A82846-Antibiotikum eine Dosis zwischen etwa 0,5 und etwa 100 mg/kg. Eine bevorzugte Dosis beträgt etwa 1 bis etwa 60 mg/kg Wirkverbindung. Eine typische Tagesdosis für einen erwachsenen Menschen beträgt etwa 50 mg bis etwa 1,0 g.

Bei der praktischen Ausführung dieses Verfahrens kann das Antibiotikum in einer einzigen Tagesdosis oder in Mehrfachdosen pro Tag verabreicht werden. Die Behandlungsvorschreibung kann die Verabreichung während ausgedehnter Zeiträume, z. B. während mehrerer Tage oder während 1 bis 6 Wochen, erfordern. Die Menge je verabreichter Dosis oder die gesamte verabreichte Menge wird von solchen Faktoren, wie der Art und der Schwere der Infektion, dem Alter und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten, der Toleranz des Patienten für das Antibiotikum und dem Mikroorganismus oder den Mikroorganismen, die in die Infektion einbezogen sind, abhängen.

Ein zweckmäßiges Verfahren zur Ausübung der Behandlungsmethode ist die Verabreichung des Antibiotikums durch i.v.-Infusion. Bei dieser Verfahrensweise wird eine sterile Formulierung eines geeigneten löslichen Salzes des Antibiotikums einer physiologischen Flüssigkeit, wie einer 5 %-igen Dextroselösung, einverleibt, und die entstandene Lösung wird langsam i.v. als Infusion gegeben. Alternativ kann auch die "Piggy-back"-Methode der i.v.-Infusion benützt werden.

Gemäß anderer Ausführungsformen bezieht sich diese Erfindung auf 1) Verfahren zur Erhöhung des Futterverwertungsgrades in Tieren, wie Geflügel, Schweinen, Schafen und Rindern, 2) Verfahren zur Wachstumsförderung bei Tieren, wie Geflügel, Schweinen, Schafen und Rindern, die zur Fieischproduktion gehalten werden, und 3) Verfahren zur Erhöhung der Milchproduktion bei laktierenden Wiederkäuern. Zur Erhöhung des Futterverwertungsgrades und zur Wachstumsförderung wird ein A82846-Antibiotikum oral in -17-

Nr. 390 802 einem geeigneten Futter in einer Menge von etwa 2 bis etwa 200 g pro Tonne des Gesamtfutters verabreicht. Für Rindvieh ist beispielsweise ein Bereich von etwa 12 bis 3000 mg/Tier/Tag geeignet. Zur Erhöhung der Milchproduktion bei laktierenden Wiederkäuern wird die orale Verabreichung einer täglichen Menge von etwa 0,04 bis etwa 16 mg/kg Körpergewicht (oder etwa 25 bis etwa 5000 mg/Tier/Tag) vorgeschlagen.

Unter solchen Aspekten würden die Verbindungen der Erfindung normalerweise in der Form eines Tierfuttervorgemisches vertrieben werden, wobei solche Vorgemische einen oder mehrere, vom landwirtschaftlichen Gesichtspunkt aus annehmbare Träger dafür enthalten.

Zur ausführlicheren Veranschaulichung der Arbeitsweise dieser Erfindung werden die folgenden Beispiele gegeben:

Beispiel 1 A82846-HPLC-Testmethode

Die folgenden analytischen HPLC-Systeme sind für die A82846-Komponenten nützlich: 1. Kationenaustauscherharzsäule Säulenträger: Zorbax* SCX (stark kationisches Austauscherharz) (4,6 x 150 mm)

System: Gradienteneluierung A:B (4:1) bis A:B (1:9) in 5 min, Aufrechterhaten während 15 min. A = MeOH:0,lM NaH2P04 (1:9) B = MeOH:0,9M NaH2P04 (1:9)

Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min Detektion: UV bei 225 nm

Retentionszeiten: diese sind konzentrationsabhängig, betragen aber annähernd für: A82846C = 6,6 min A82846B = 8,9 min A82846A = 9,5 min 2. Umkehrnhasensäule Säulenträger: Zorbax* ODS (silyliertes Silicagel) (4,6 x 150 mm)

System: Gradienteneluierung 1 % (NH4)H2P04:CH3CN (95:5) bis (1:1) in 20 min.

Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min Detektion: UV bei 225 nm Retentionszeiten: A82846A = 7,3 min A82846C = 7,6 min A82846B = 8,0 min * Zorbax-Säulen sind Produkte der Firma E.I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington,

Delaware 19898.

Beispiel 2

Herstellung von Antibiotikum A82846 unter Verwendung von Kultur A82846 · A. Schflttelkolbenfermentation von Kultur A82846

Zur Beimpfung eines Impfmediums mit der folgenden Zusammensetzung wird die Kultur Nocardia orientalis NRRL 18098 entweder als ein lyophilisiertes Kügelchen oder als eine in flüssigem Stickstoff gehaltene Suspension verwendet:

IMPFMEDIUM

Bestandteil Menee (%) Glucose 1,0 Lösliche Stärke 2,0 Hefeextrakt 0,5 . Enzymatisches Hydrolysat von Casein* 0,5 CaCC>3 0,1 Entionisiertes Wasser Restmenge auf 11 -18-

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Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert des Mediums mit NaOH auf etwa 7,5 eingestellt.

* NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, NY

Schrägnährmedien oder -platten werden durch Zugabe von 2,5 % Agar zum Impfmedium hergestellt. Der beimpfte Schragnährboden wird bei 30 °C etwa 10 bis etwa 14 Tage lang bebrütet. Die reife Schrägkultur wird mit einem sterilen Werkzeug abgekratzt, um die Sporen zu lockern und die Myzelienmatte zu entfernen und zu mazerieren. Zur Beimpfung von 50 ml eines Impfmediums für die erste Stufe wird etwa ein Viertel der so erhaltenen gelockerten Sporen und des so erhaltenen Kulturwuchses verwendet

Das beimpfte Medium für die erste Stufe wird in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben bei 30 °C etwa 24 - 48 Stunden lang auf einer Schüttelmaschine, die auf einer Kreisbahn mit einem Durchmesser von 2 Zoll (5,08 cm) bei 250 UpM arbeitet bebrütet.

Dieses bebrütete Medium der ersten Stufe (0,5 ml) wird zur Beimpfung von 50 ml eines Produktionsmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet

Bestandteil

Menge f%1 2.5 1.5 3,0 0,25 0,3 0,5 Restmenge auf 11

Glucose

Sojabohnenmehl

Kartoffeldextrin

CaCOj "Blackstrap“-Melasse Säurehydrolysiertes Casein* Entionisiertes Wasser (Der pH-Wert wurde vor der Sterilisierung mit NaOH auf 7,5 eingestellt) *Hy-Case, Sheffield Chemical Co.

Das beimpfte Produktionsmedium wird in einem 250 ml-Weithals-Erlenmeyerkolben bei 30 °C 4 bis 5 Tage lang auf einer Schüttelmaschine, die in einer Kreisbahn mit einem Durchmesser von 2 Zoll bei 250 UpM arbeitet, bebrütet. B. Tankfermentation von Kultur A82846

Um ein größeres Volumen von Impfmaterial zu schaffen, werden 10 ml des bebrüteten Mediums der ersten Stufe, das wie unter Abschnitt A beschrieben hergestellt worden ist, zur Beimpfung von 400 ml eines Wuchsmediums für eine zweite Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das Medium für die erste Stufe hat, verwendet. Dieses vegetative Medium für die zweite Stufe wird in einem 21-Weithals-Erlenmeyerkolben etwa 48 Stunden bei 30 °C auf einer Schüttelmaschine bebrütet, die in einer Kreisbahn mit einem Durchmesser von 2 Zoll bei 250 UpM arbeitet.

Das so hergestellte, bebrütete, vegetative Medium für die zweite Stufe (1000 ml) wird zur Beimpfung von 100 1 sterilem Produktionsmedium verwendet, welch letzteres wie unter Abschnitt A beschrieben mit der Ausnahme hergestellt worden ist, daß P-2000-Antischaummittel (0,3 g/1) zugesetzt worden ist. Das beimpfte Produktionsmedium wird in einem 165 1-Rührfermentationstank 90 bis 100 h lang bei einer Temperatur von 30 °C fermentieren gelassen. Der Luftstrom in dem Rührgefäß (80 UpM) wird so eingestellt, daß eine gelöste Sauerstoffmenge aufrechterhalten wird, die mehr als 50 % der Luftsättigung beträgt. f C. Alternative Tankfermentation von Kultur A82846

Es wird nach der Verfahrensweise von Abschnitt B vorgegangen mit der Ausnahme, daß eine entsprechende Menge von vegetativem Medium zur Beimpfung von annähernd 1200 Gallonen Produktionsmedium in einem 1600-Gallonen (45361) Fermentationstank verwendet wird.

Beispiel 3

Herstellung von Antibiotikum A82846 unter Verwendung von Kultur A82846.1

Die Kultur Nocardia orientalis NRRL 18099 wird entweder als ein lyophilisiertes Kügelchen oder als eine in flüssigem Stickstoff gehaltene Suspension unter Anwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensweise mit der Ausnahme gezüchtet, daß das Produküonsmedium die folgende Zusammensetzung hat: -19-

Nr. 390 802

Bestandteil

Menge f%~)

Glucose Kartoffeldextrin

Pepton* CaCOg 1,02,01.0 0,2 "Blackstrap"-Melasse Entionisiertes Wasser 2,0

Restmenge auf 11

Keine pH-Wert-Einstellung * Bacto-peptone (Difco Laboratories)

Beispiel 4

Herstellung von Antibiotikum A82846 unter Verwendung von Kultur A82846.2 Die Kultur Nocardia orientalis NRRL 18100 wird entweder als ein lyophilisiertes Kügelchen oder als eine in flüssigem Stickstoff gehaltene Suspension unter Anwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensweise mit der Ausnahme gezüchtet, daß das verwendete säurehydrolysierte Casein Amicase (Sheffield Chemical Co.) ist

Beispiel 5

Herstellung von rohem A82846

Die Fermentationsbrühe (4200 1) aus einem 1600 Gallonen-Fermenter, hergestellt wie in Beispiel 2, Abschnitt C, beschrieben, wurde mit 5N NaOH auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und mit 3 % Celite 545 (Filterhilfsmittel) versetzt. Das Gemisch wurde durch eine Filterpresse filtriert, und die Presse wurde mit Wasser gewaschen. Die vereinigte Flüssigkeit aus Filtrat und Waschwasser (42001) wurde mit 5NHC1 (oder H2SO4) auf pH 7 eingestellt und auf eine Säule aus Dowex-XFS-43278 (NH4+)-Harz (200 1 Filtrat/10 1 Harz) aufgebracht. Die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 750 ml/min eluiert. Die Fraktionen wurden entweder mittels Bioassay unter Verwendung von Bacillus subtilis oder mittels HPLC getestet.

Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina Wasser gewaschen, wobei aliquote Anteile zu 100 1 gesammelt wurden.

Das Wirkmaterial wurde aus dem Harz mit 5 Säulenvolumina von 0,05N NH4OH eluiert, wobei 25 1-Fraktionen gesammelt wurden. A82846 enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 30 1 eingeengt. Diese Lösung wurde auf eine 101-Säule aus Diaion HP-20-Harz in Wasser aufgebracht. Die Säule wurde mit 3 Säulenvolumina Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von 300 ml/min gewaschen. Das Waschwasser wurde verworfen. Das Wirkmaterial wurde mit einer Lösung von ^OiiPrOH (95:5), enthaltend 1,0 % Essigsäure, bei einer Geschwindigkeit von 100 ml/min aus der Säule eluiert, wobei 41-Fraktionen gesammelt und durch Bioassay und HPLC getestet wurden. A82846 enthaltende Fraktionen (Nr. 6-14) wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 356 g rohes A82846 erhalten wurden.

Beispiel 6

Isolierung von A82846A und A82846B

A. Abtrennung von angereichertem A82846A und A82846B

Wie in Beispiel 5 beschrieben hergestelltes A82846 (30 g) wurde in Wasser (500 ml) aufgelöst und auf eine unter Druck stehende 30 1-Edelstahlsäule von Kieselsäuregel LP-l/Cjg, die in 1 %-igem NH4H2PO4 ins

Gleichgewicht gebracht worden ist, aufgebracht. Die Säule wurde unter Anwendung eines Gradienten von 1 % NH4H2PO4 (60 1) bis WassenAcetonitril (88:12), enthaltend 1 % NH4H2PO4 (60 1), bei einer Fließgeschwindigkeit von 250-300 ml/min (Maximaldruck 600 psi), entwickelt, wobei 4 1-Fraktionen gesammelt wurden und die Eluierung unter Verwendung eines UV-Detektors bei 254 nm überwacht wurde. Einzelfraktionen wurden durch analytische HPLC getestet. An A82846A reiche Fraktionen (Nr. 6-9) und an A82846B reiche Fraktionen (Nr. 10-17) wurden jeweils vereinigt und im Vakuum eingeengt.

B. Reinigung von A82846A

An A82846A reiche Konzentrate aus zwei 30 g-Ansätzen, die wie in Abschnitt A beschrieben ausgeführt worden waren, wurden auf einer 1750 ml-Säule aus Diaion HP-20 SS entsalzt, wobei mit Wasser gewaschen, mit H20:iPrOH (95:5), enthaltend 0,5 % Essigsäure, eluiert und unter Anwendung analytischer HPLC getestet wurde. Fraktionen, die A82846A enthielten, wurden vereinigt, eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 7,4 g an A82846A angeieicherte Zubereitung erhalten wurden.

Die an A82846A angereicherte Zubereitung (7,2 g) wurde in Wasser aufgelöst und auf eine präparative -20-

Nr. 390 802 HPLC-Säule aus Kieselsäuregel LP-l/C^g in 1 % (NH^HjPC^ aufgebracht. Die Säule wurde mit einem Gradienten von 1 % (NH^HjPC^ bis 1 % (NH^^PC^:Acetonitril (9:1) entwickelt, wobei die Eluierung durch analytische HPLC bei 254 nm überwacht und das Eluieren mit einer Fließgeschwindigkeit von 48 ml/min vorgenommen wurde. Nachdem die ersten 101 eluiert waren, wurden 500 ml-Fraktionen gesammelt. A82846A enthaltende Fraktionen (Nr. 4-10) und A82846B enthaltende Fraktionen (Nr. 12-20) wurden jeweils vereinigt und im Vakuum eingeengt. Konzentrate von A82846A aus 3 Ansätzen wurden vereinigt und auf eine 1750 ml-Säule aus Diaion HP-20 SS aufgebracht, um die Lösung zu entsalzen. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, und A82846A wurde mit HjOiiPrOH (95:5), enthaltend 0,5 % Essigsäure, eluiert. Die Eluierung wurde mittels HPLC überwacht. Fraktionen, die A82846A enthielten, wurden vereinigt, eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 7,9 g gereinigtes A82846A erhalten wurden.

Das IR-Spektrum von A82846A in einer KBr-Scheibe ist in Fig. 1 dargestellt; das FAB-MS von A82846A in Thioglycerin ist in Fig. 4 dargestellt; und das NMR-Spektrum von A82846A-Hydrochlorid in (Methylsulfoxid)-dg, gemessen mit einem Bruker AM500 Spektrometer (HDO-unterdriickt) bei 60 °C, ist in Fig. 7 dargestellt.

C. Reinigung von A82846B

An A82846B angereicherte Fraktionen aus 3 präparativen HPLC-Ansätzen, unter Trennung von A82846A und A82846B, erhalten wie in Abschnitt B beschrieben, wurden vereinigt und auf einer 1750 ml-Säule aus Diaion HP-20 SS entsalzt, wobei mit Wasser gewaschen und mit ^OiiPrOH (95:5), enthaltend 0,5 % Essigsäure, eluiert wurde. Die Eluierung wurde mittels HPLC überwacht, und die A82846B-Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 8,8 g gereinigtes A82846B erhalten wurden.

Das IR-Spektrum von A82846B in einer KBr-Scheibe ist in Fig. 2 dargestellt; das FAB-MS von A82846B in Thioglycerin ist in Fig. 5 dargestellt; und das NMR-Spektrum von A82846B-Acetat in (Methylsulfoxid)-dg, gemessen mit einem Bruker AM500 Spektrometer bei 60 °C, ist in Fig. 8 dargestellt. D. Entsalzung

Die Entsalzung kann auch unter Verwendung von Diaion HP-20-Harz und Eluieren mit MeOH^O (4:1), enthaltend 0,1 % Essigsäure, bewirkt werden.

Beispiel 7

Isolierung von A82846C A. Abtrennung von A82846

Die Fermentationsbrühe (4611), die aus vier 165 1 Fermentationen, welche wie in Beispiel 2, Abschnitt B, beschrieben ausgeführt worden sind, erhalten worden ist, wurde mit 5N NaOH auf pH 10,5 eingestellt und mit 3 % Hyflo Supercel-Filtrierhilfsmittel (Diatomeenerde) filtriert. Das Filtrat (4301) wurde mit 5N HCl auf pH 7 eingestellt und auf eine Säule aufgebracht, die 10 1 Dowex-XFS-43278 (NH^-Harz enthielt. Die Säule wurde mit 501 Wasser gewaschen, und das Wirkmaterial wurde mit 0,05N NH4OH (501) eluiert, wobei 41-Fraktionen gesammelt wurden. Die Eluierung wurde durch Bioassay überwacht. Wirksame Fraktionen (Nr. 1-7) wurden vereinigt, im Vakuum auf ein Volumen von etwa 1700 ml eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 283,9 g rohes A82846 erhalten wurden.

B. Abtrennung von A82846A. B und C

Rohes A82846 (2 g), das wie in Abschnitt A beschrieben erhalten worden ist, wurde in Wasser gelöst und auf eine präparative HPLC-Säule aus Edelstahl mit den Abmessungen 2 Inch mal 45 Inch, enthaltend 2110 ml Kieselsäuregel LP-l/Cjg-Harz,in 1 % (NH^^PC^, aufgebracht. Die Säule wurde unter Anwendung eines Gradienten von 1 % (NH^^PC^ bis 1 % (NH^^PC^: Acetonitril (92:8) bei einer Rießgeschwindigkeit von 70 ml/min entwickelt, wobei 400 ml-Fraktionen gesammelt und mittels UV bei 254 nm überwacht wurden.

Fraktionen, die A82846A enthielten (Nr. 11-14), wurden als Sammelmenge 1 vereinigt; Fraktionen, die A82846C enthielten (Nr. 16-20), wurden als Sammelmenge 2 vereinigt, und Fraktionen, die A82846B enthielten (Nr. 21-25), wurden als Sammelmenge 3 vereinigt.

C. Reinigung von A82846C

Sammelmenge 2 wurde auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt und auf eine 7 x 45 cm-Glassäule, die 1800 ml Diaion HP-20-Harz enthielt, zum Entsalzen aufgebracht. Das Wirkmaterial wurde mit MeOH^O (4:1), enthaltend 0,1 % Essigsäure, eluiert, wobei bei einer Rießgeschwindigkeit von 25 ml/min 11-Fraktionen gesammelt wurden. Fraktionen, die C enthielten (Nr. 9-12), wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 662,2 mg halb-gereinigtes A82846C erhalten wurden. -21 -

Nr. 390 802

Das halb-gereinigte A82846C (500 mg) wurde durch Wiederholung der Umkehrphasen-HPLC-Stufen weiter gereinigt, wobei eine 1 Inch x 48 Inch Stahlsäule, enthaltend 450 ml Kieselsäuregel LP-l/C^g, ein Gradient von 1 % (NH4)H2P04 bis 1 % (N^K^PC^Acetonitril (92:8), eine Fließgeschwindigkeit von 11 ml/min, ein

Sammeln von 25 ml-Fraktionen und eine Überwachung bei 254 nm angewendet wurden. Fraktionen, die A82846C enthielten (Nr. 169-210), wurden vereinigt und auf einer 5 x 45 cm-Glassäule, die HP-20-Harz (hochporöses Polymer) enthielt, entsalzt. Die Säule wurde mit MeOH^O (4:1), enthaltend 0,1 % Essigsäure, eluiert, wobei 100 ml-Fraktionen gesammelt wurden, und die Eluierung durch analytische HPLC mit UV bei 225 nm verfolgt wurde. Fraktionen, die A82846C enthielten (Nr. 5-11), wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 127,3 mg A82846C erhalten wurden.

Sammelmenge 1, die A82846A enthielt, und Sammelmenge 3, die A82846B enthielt, wurden in der gleichen Weise wie für A82846C beschrieben gereinigt, wobei zusätzliches gereinigtes A82846A und A82846B erhalten wurden.

D. Weitere Reinigung von A82846C A82846C (70 mg) wurde unter Anwendung der folgenden präparativen chromatographischen Verfahrensweise weiter gereinigt: Säule: Zorbax SCX (9,2 x 250 mm) Kationenaustauscher (siehe Beispiel 1)

Mobile Phase: Ein linearer Gradient, ausgehend von 0,15M NaKy^-Puffer, enthaltend 10 % MeOH, bis 0,9M NaHjPC^-Puffer, enthaltend 10 % MeOH, in 6 min, und Aufrechterhaltung während 5 min (beim Puffer wurde keine Einstellung vorgenommen).

Fließgeschwindigkeit: 6,0 ml/min Detektion: UV bei 280 nm Beschickung: 6,0 mg/Injektion in H2O A82846C wurde unter Verwendung eines automatisierten Fraktionssammlers (Gilson 201C), der mit einem Peak-Feststellungsmechanismus ausgestattet ist, gesammelt. Die mobile Phase wurde mit einem Millipore Waters M600 Gradient HPLC-System freigesetzt, und die Lösung der Probe wurde über einen Hitachi "Autosampler" injiziert.

Fraktionen, die A82846C enthielten, wurden vereinigt, auf ein Volumen von 30 ml eingeengt und auf eine HP-20-Säule (50 ml) aufgebracht. Die Säule wurde mit H2O gewaschen und mit ^Orisopropanol (95:5), enthaltend 0,5 % HOAc, eluiert, wobei Fraktionen zu 25 ml gesammelt wurden. Die A82846C enthaltenden Fraktionen (Nr. 9-14) wurden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert, wobei 37 mg gereinigtes A82846C erhalten wurden.

Das IR-Spektrum von A82846C in einer KBr-Scheibe ist in Fig. 3 dargestellt; das FAB-MS von A82846C in Thioglycerin ist in Fig. 6 dargestellt; und das NMR-Spektrum von A82846C-Acetat in (Methylsulfoxid)-dg, aufgenommen mit einem Bruker AM500 Spektrometer (HDO-unterdrückt) bei 60 °C ist in Fig. 9 dargestellt.

Beispiel 8

Herstellung von A82846-Salzen Verfahrensweise:

In jedem Falle wurde die A82846-Komponente (100 mg) in entionisiertem Wasser (10 ml) aufgelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wurde auf etwa pH 3 eingestellt, wobei 0,5N Säure (HCl, H2SO4 und H3PO4) verwendet wurde. Die Lösung wurde lyophilisiert, wobei die entsprechende Salzform erhalten wurde. Es ist wichtig festzustellen, daß, falls der pH-Wert signifikant unter pH 3 erniedrigt wird (nämlich pH 2), die Komponente abgebaut wird. Es wurden die folgenden Ausbeuten erhalten:

Ausbeute fmg')

Salz A82846A A82846B HCl 93,8 88,1 h2so4 92,5 75,4 H3PO4 110,8 105,7 -22-

Nr. 390 802

Beispiel 9 A82846A-Tablettenformulierung

Unter Verwendung der folgenden Bestandteile und Mengen können A82846A enthaltende Tabletten hergestellt werden:

Bestandteil Gewicht A82846A-Phosphat 282,9 mg Mikrokristalline Cellulose 101,1 mg Natrium-Croscaramellose 12,0 mg Povidon 12,0 mg Magnesiumstearat 3,0 mg Stearinsäure 4,0 mg Gereinigtes Wasser 0,16 ml

In einen geeigneten Behälter gibt man A82846A-Phosphat, einen Teil der mikrokristallinen Cellulose und einen Teil der Natrium-Croscarmellose und mischt bis zur Homogenität. Von Povidon wird eine Lösung in Wasser hergestellt, und die Povidon-Lösung wird zu den gemischten Pulvern hinzugegeben. Die entstandene Mischung wird granuliert, gegebenenfalls klassiert und getrocknet. Die restliche mikrokristalline Cellulose und die Natrium-Croscarmellose werden dem trockenen Gemisch zugesetzt und eingemischt. Man setzt Magnesiumstearat und Stearinsäure zu und vermischt das Gemisch. Das entstandene Pulvergemisch wird zu Tabletten verpießL

Beispiel 10 A82846B-Kapselformulierung A82846B enthaltende Kapseln können unter Verwendung der folgenden Bestandteile und Mengen hergestellt werden:

Bestandteil Gewicht A82846B-Hydrochlorid 262,2 mg Fließfähiges Maisstärkepulver 137,7 mg Silikonflüssigkeit, 350 cSt. 2,7 mg Maisstärke 147,1 mg

In einem geeigneten Mischer werden A82846B-Hydrochlorid, fließfähiges Stärkepulver, Silikonflüssigkeit mit 350 cSt. und Stärkepulver bis zur Homogenität gemischt. Es erfolgt ein Abfüllen in Hartgelatinekapseln entsprechender Größe.

Beispiel 11 A82846A-Suspensionsformulierung

Man stellt eine sterile, unlösliche Form von A82846A durch Kristallisation oder Fällung her. Es erfolgt ein Mahlen oder Sieben auf eine Teilchengröße, welche zu Suspensionszwecken geeignet ist. Das A82846A wird in dem folgenden Träger suspendiert.

Menge

Bestandteil

Lecithin 1 %

Natriumcitrat 2 %

Propylparaben 0,015 %

Wasser für Injektionszwecke Restmenge auf das gewünschte Volumen

Die Suspension kann in großer Menge hergestellt und in Fläschchen abgefüllt werden, oder sie kann improvisiert durch Zugabe des Trägers zu dem A82846A in dem Fläschchen hergestellt werden. -23-

Claims (12)

1. Nr. 390 802 PATENTANSPRÜCHE 1. Antibiotikum A82846A, welches die folgende Strukturformel und die folgenden Kennmerkmale hat:

   A82846A Molekulargewicht: 1556 Empirische Formel: C^Hg^NjoC^gCl FAB-MS (Thioglycerin): siehe Fig. 4 UV (H20) Xmax: 281 nm (ε 5.052) IR (KBr): siehe Fig. 1 NMR [(CDß)2SO]: siehe Fig. 7 pKa (H20): 4,7, 9,5 (66 % DMF): 5,5, 6,8, 7,9, 9,4, 12,3 enthält: Asparaginsäure und 4-epi-Vancosamin; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
2. 2. Antibiotikum A82846B, welches die folgende Strukturformel und die folgenden Kennmerkmale hat: -24- Nr. 390 802

   HO A82846B Molekulargewicht: 1590 Empirische Formel: C73H88N10°26C12 FAB-MS (Thioglycerin): siehe Fig. 5 UV (H20) Xmax: 280 nm (ε 5.192) IR (KBr): siehe Fig. 2 NMR [(CD^SO]: siehe Fig. 8 pKa (H20): 4,65, 9,5 enthält: Asparaginsäure und 4-epi-Vancosamin; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
3. 3. Antibiotikum A82846C, welches die folgende Strukturformel und die folgenden Kennmerkmale hat: OH

   A82846C -25- Nr. 390 802 Molekulargewicht (FABMS): 1522 Empirische Formel: ^73^9()^10^26 FAB-MS (Thioglycerin): siehe Fig. 6 UV (H20) Xmax: 280 nm (ε 5.198) IR (KBr): siehe Fig. 3 NMR [(CDß^SO]: siehe Fig. 9 pKa (H20): 4,6, 9,4 enthält: Asparaginsäure und 4-epi-Vancosamin; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
4. 4. Antibiotikum A82846, enthaltend Antibiotikum A82846A, wie in Anspruch 1 definiert, und Antibiotikum A82846B, wie in Anspruch 2 definiert, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
5. 5. Das Glykopeptid-Antibiotikum A82846, enthaltend Antibiotikum A82846A, wie in Anspruch 1 definiert, und Antibiotikum A82846B, wie in Anspruch 2 definiert, welches durch Züchten von Nocardia orientalis NRRL 18098,18099 oder 18100, oder einer A82846-erzeugenden Nachkommenschaft davon, unter submersen, aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium bis zur Bildung eines wesentlichen Betrages an antibiotischer Wirksamkeit erzeugt worden ist.
6. 6. Antibiotikum A82846A, wie in Anspruch 1 definiert, welches durch Züchten von Nocardia orientalis NRRL 18098,18099 oder 18100, oder einer A82846A-erzeugenden Nachkommenschaft davon, unter submersen, aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium bis zur Bildung eines wesentlichen Betrages an antibiotischer Wirksamkeit erzeugt worden ist.
7. 7. Antibiotikum A82846B, wie in Anspruch 2 definiert, welches durch Züchten von Nocardia orientalis NRRL 18098,18099 oder 18100, oder einer A82846B-erzeugenden Nachkommenschaft davon, unter submersen, aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium bis zur Bildung eines wesentlichen Betrages an antibiotischer Wirksamkeit erzeugt worden ist.
8. 8. Verfahren zur Erzeugung von Antibiotikum A82846, wie in Anspruch 4 definiert, von Antibiotikum A82846A, wie in Anspruch 1 definiert, von Antibiotikum A82846B, wie in Anspruch 2 definiert, oder von Antibiotikum A82846C, wie in Anspruch 3 definiert, gekennzeichnet durch das Züchten von Nocardia orientalis NRRL 18098, NRRL 18099 oder NRRL 18100, oder einer A82846-erzeugenden Nachkommenschaft davon, in einem assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthaltenden Kulturmedium unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen, sowie gegebenenfalls durch die anschließende Abtrennung des Antibiotikums aus dem Fermentationsmedium und/oder die Bildung eines Salzes des Antibiotikums, falls dieses nicht in Salzform vorliegt.
9. 9. Biologisch gereinigte Kultur, ausgewählt aus Nocardia orientalis-Stämmen NRRL 18098, NRRL 18099 und NRRL 18100, oder einer A82846-erzeugenden Nachkommenschaft davon.
10. 10. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als einen Wirkbestandteil eine Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, gemeinsam mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Träger(n) dafür.
11. 11. Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, zur Verwendung in der Therapie bakterieller Infektionen.
12. 12. Tierfuttervorgemisch, enthaltend als Wirkbestandteil eine Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, gemeinsam mit einem oder mehreren, in der Landwirtschaft annehmbaren Träger(n) dafür. Hiezu 9 Blatt Zeichnungen -26-