AT389893B - Antibiotikum a42125 und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

Nr. 389893

Diese Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, A42125, und einen neuen Stamm von Nocardia aerocolonigenes, NRRL 18049, welcher dieses Antibiotikum produziert. A42125 ist ein antibakterielles Mittel, welches eine besonders interessante Wirkung gegen Methan-produzierende Mikroorganismen ausübt. Da A42125 die Methanproduktion in Tests, bei denen im Pansen vorherrschende Bedingungen simuliert werden, auf ein 5 Minimum herabsetzt, sollte A42125 die Futterverwertung bei Wiederkäuern erhöhen und demzufolge auch das Wachstum dieser Tiere fördern.

Ein anderer Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung von A42125 durch Züchten eines neuen Stammes von Nocardia aerocolonigenes, NRRL 18049, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums »zeugt worden ist A42125 wird aus der Fermentationsbrühe durch 10 Adsorbieren desselben auf einem Harz und Eluieren des Harzes mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert. A42125 wird nach anerkannten Methoden, wie Ionenaustauschchromatographie, abgetrennt und weiter gereinigt

Da Nocardia aerocolonigenes, NRRL 18049, ein neu entdeckter Stamm ist betrifft diese Erfindung weiterhin eine biologisch gereinigte Kultur dieses Mikroorganismus. IS Die angeschlossene Zeichnung zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von A42125 in KBr.

Es besteht ein fortgesetzter Bedarf nach verbesserten Antibiotika auf dem Veterinärgebiet Die Förderung des Wachstums von Tieren ist ein Ziel solcher Antibiotika. Die Wachstumsförderung wird durch Verminderung von Krankheit und durch Erhöhung der Futterverwertung erreicht Die Förderung des Wachstums von Wiederkäuern, wie Rindern und Schafen, ist von besonderem wirtschaftlichem Interesse. 20 Bei Wiederkäuern bauen Mikroorganismen im Pansen des Tieres Kohlenhydrate unter Bildung von

Verbindungen, wie Propionaten, ab, welche metabolisiert werden können. Gewisse Mikroorganismen beeinträchtigen jedoch die Wirksamkeit dieses Systems. Beispielsweise verringern methanogene oder Methanproduzierende Mikroorganismen die Futterverwertung bei Wiederkäuern. Ein besonder»* Vorteil von A42125 ist darin gelegen, daß es Methan-erzeugende Mikroorganismen hemmt und daher zur Förderung des Wachstums von 25 Wiederkäuern verwendet werden kann.

Obgleich Methan-erzeugende Mikroorganismen (Archaebakterien) im Verdauungssystem von Wiederkäuern unerwünscht sind, leisten sie einen wichtigen Beitrag zur weltweiten Umwelt, weil sie die Endstufe katalysieren, in welcher biologische Abfallmasse zu Methan abgebaut wird. Außerdem kann Methan als Brennstoff nützlich werden und auf diese Weise einen Beitrag zur Lösung des Problems der Energiebeschaffung leisten. Somit sind 30 methanogene Mikroorganismen und Verfahren zur Erhöhung der Methanproduktion wichtig.

Eine Methode zur Erhöhung der Methanproduktion besteht darin, in methanogenen Mikroorganismen genetische Austauschsysteme zu entwickeln. Um dies zu erreichen, sind wählbare Merkmale, wie Antibiotikaresistenz, wesentlich. Solche Merkmale werden gewöhnlich dadurch gefunden, daß man Mutanten auswählt, welche gegenüber einem Antibiotikum resistent sind, welches Antibiotikum den Mikroorganismus 35 normalerweise tötet. Leider sind methanogene Mikroorganismen von Natur aus gegenüber den meisten Antibiotika resistent. Somit sollte die Tatsache, daß A42125 methanogene Mikroorganismen hemmt, dieses Antibiotikum zum Ausfindigmachen eines wählbaren Merkmales zur Erleichterung des genetischen Austausches in methanogenen Mikroorganismen geeignet machen. 40 Kennmerkmale von A42125

Antibiotikum A42125 hat die folgenden physiko-chemischen Kennmerkmale:

Zustand: Weiße Kristalle (aus Wasser) F.: 149-150 °C UV: Keine Absorption 45 IR (KBr): zeigt Absorption bei den folgenden Wellenzahlen (cm'*): Breiter Peak, welcher 3423,3413,3409, 3403, 3398 und 3386 umfaßt; 2937,1720,1602,1453,1408,1379,1290,1192,1120,1090, 1064,971,870, 830 und 802.

Titration (80 %-iges wässeriges Dimethylformamid): pKa-Werte 5,2,8,7 und 10,5.

Molekulargewicht* 2032 (Felddesorptionsmassenspektrometrie) 50 Empirische Formel: ^101^184^2^38

Elementaranalyse:

Element Gefunden %

Kohlenstoff 59,51 55 Wasserstoff 9,05

Stickstoff 1,44

Sauerstoff 30,08

Aminosäuren: Nicht gefunden 60 Löslichkeit* In Wasser löslich -2-

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Bioautographie: Unter Verwendung von Whatman-Papier Nr. 1, das mit 0,95 N Na2SC>4 und 0,05 NaHSO^H^O imprägniert ist, von einem Lösungsmittelsystem aus 80 %igem wässerigem Ethanol, das 1,5 % NaCl enthält, und unter Detektion mit Micrococcus luteus, hat A42125 einen Rf-Wert von annähernd 0,46.

Auf der Grundlage seiner Titrationskennmerkmale scheint es, daß A42125 eine Carboxylgruppe, eine 5 Aminfunktion und eine phenolische Gruppe, die Salze bilden könnte, haben kann.

Solche Salze würden zur Abtrennung, Reinigung und Freisetzung des Antibiotikums nützlich sein. A42125-Salze sind daher ein Teil dieser Erfindung. Die pharmazeutisch annehmbaren Salze sind besonders nützlich. Beispiele für nützliche Salze sind die Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Amin- und Säureadditionssalze.

Zu repräsentativen und geeigneten Alkalimetall·· und Erdalkalimetallsalzen gehören die Natrium-, Kalium-, 10 Lithium-, Cäsium-, Rubidium-, Barium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Zu geeigneten Aminsalzen gehören die Ammonium- und die primären, sekundären und tertiären Cj-C^-Alkylammonium- und Hydroxy-C^-C^ alkylammoniumsalze. Zu veranschaulichenden Aminsalzen gehören jene, die durch Umsetzung von A42125 mit Ammoniumhydroxid, Methylamin, sek.Butylamin, Isopropylamin, Diethylamin, Diisopropylamin, Ethanolamin, Triethylamin, 3-Amino-l-propanol u. dgl. gebildet werden. 15 Repräsentative Säureadditionssalze umfassen jene Salze, die durch Standardumsetzungen mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren, wie z. B. Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bemsteinsäure, Citronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Chlorsäure, Embonsäure, Schleimsäure, D-Glutaminsäure, d-Camphersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Ameisensäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, 20 Soibinsäuie, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und ähnlichen Säuren, gebildet werden.

Auf dem Gebiet der Vetermärpharmazie ist die Form eines Antibiotikums bei der Behandlung eines Tiers mit dem Antibiotikum gewöhnlich nicht von großer Signifikanz. In den meisten Fällen erfolgt aufgrund der in dem Tier vorliegenden Bedingungen eine Änderung des Arzneimittels in eine Form, die von der, in welcher es verabreicht wurde, verschieden ist. Die Salzform, in der es verabreicht werden kann, ist daher im allgemeinen 25 nicht von großer Bedeutung. Die Salzform kann jedoch aus Gründen der Wirtschaftlichkeit, Zweckmäßigkeit und Toxizität gewählt werden.

Antibiotikum A42125 kann durch Züchtung eines A42125-erzeugenden Stammes von Nocardia aerocolonigenes unter submersen, aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium, bis eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit erzeugt ist, produziert werden. A42125 kann unter Anwendung verschiedener 30 Isolierungs- und Reinigungsverfahrensweisen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gewonnen werden.

Der neue Nocardia aerocolonigenes-Stamm, welcher für die Herstellung von Antibiotikum A42125 nützlich ist, wurde aus einer aus Brasilien stammenden Bodenprobe isoliert Aus Zweckmäßigkeitsgründen bei der Beschreibung des N. aerocolonigenes-Stammes wird er die A42125-Kultur genannt

Taxonomische Studien dieses Organismus wurden von Frederick P. Mertz der Lilly Research Laboratories 35 ausgeführt. Aufgrund dieser Studien wurde der Organismus als ein neuer Stamm von Nocardia aerocolonigenes (Shinobu und Kawato), Pridham und Lyons 1970 (T.G. Pridham, "New Names and New Combinations in the Order Actinomycetales Buchanan 1917", USDA Tech. Bull. No. 1424:32, Agricultural Research Service, USDA, Washington, D.C., 1970), klassifiziert. Diese Klassifizierung beruht auf gleichzeitigen Laboratoriumsvergleichen sowie auf einer Prüfung veröffentlichter Beschreibungen ähnlicher Spezies [.M. Goodfellow und K.P. Schaal, 40 "Identification Methods for Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus", in "Identification Methods for Microbiologists", 2. Aufl., F.A. Skinner und D.W. Lovelock, Herausgeber, Society for Applied Bacteriology Technical Series No. 14, Academic Press, Inc., New York, 1979, S. 261; R.E. Gordon, S.K. Mishra und D.A. Bamett, "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. camea, N. vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis, and N. aerocolonigenes", J. Gen. Microbiol. 109, 69-78 (1978); SJ. Mishra, R.E. Gordon und D.A. Bamett, 45 "Identification of Nocardiae and Streptomycetes of Medical Importance", J.Clin.Microbiol. 11 (6), 728-736 (1980); H. Mordarska und M. Mordarski, "Chemotaxonomic Characters and Classification of Some Nocardioform Bacteria", J. Gen. Microbiology 71, 77-86 (1972); R.C. Pittenger und R.B. Brigham, "Streptomyces orientalis, n.sp., the Source of Vancomycin", Antibiotics and Chemotherapy VI (11); 642-647 (1956); und S.A. Waksman, "The Actinomycetes, Bd. Π", The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961]. 50

Angewendete Methoden

Es wurden die vom International Streptomyces Project (ISP) für die Charakterisierung von Streptomyces-Spezies [E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", InU.Syst.Bacteriol.16 (3), 313-340 (1966)] empfohlenen Methoden zusammen mit bestimmten ergänzenden 55 Tests (DJ. Blazevic und G.M. Edeier, "Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology", John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975) benützt.

Methoden, die für die Kennzeichnung von Nocardia-Spezies von Gordon und Mitarbeitern [R.E. Gordon, DA. Bamett, J.E. Handerhan und C.H. Pang, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the Nocardin Strain”, InL J. Syst Bacteriol. 24 (1), 54-63 (1974)] empfohlen worden sind, sind benützt worden. 60 Die Resistenz gegen Rifampin und Lysozym wurde nach Methoden gemessen, die von Gordon und Bamett [R.E. Gordon und DA. Bamett, "Resistance to Rifampin and Lysozyme of Strains of Some Species of -3-

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Mycobacterium and Nocardia as a Taxonomie Tool", Int. J. Syst. Bacteriol. 27 (3), 176-178 (1977)] empfohlen worden sind.

Zur Bestimmung der Farbnamen wurden ICSS-NBS Centroid Color Charts, Standardmuster Nr. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C.) und das Color Harmony Manual (4. Auf!., Color Standards Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) verwendet

Die Morphologie wurde unter Verwendung eines optischen Lichtmikroskops untersucht. Zum Studium der Omamentienmg der Sporenoberfläche wurde ein Raster-Elektronenmikroskop (SEM) verwendet

Melanoidpigmentproduktion (Chromogenizität) wurde mit ISP No. l-(Trypton-Hefeexträkt-Brühe), ISP No. 6-(Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar), ISP No. 7-(Tyrosin-Agar) und modifiziertem ISP No. 7, der Tyrosin-frei gemacht worden ist, bestimmt.

Die Isomeren von Diaminopimelinsäure (DAP) und die Kohlenhydrate in Hydrolysaten von ganzen Zellen wurden durch die chromatographischen Methoden von Becker und Mitarbeitern [B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon und H.A. Lechevalier, "Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 12,421-423 (1964)] und von Lechevalier [M.P· Lechevalier, "Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinical Importance", J. Lab. Clin. Med. 71,934-944 (1968)] ermittelt

Mycolinsäuren wurden nach einer Methode bestimmt, die auf von Minnikin [D.E. Minnikin, I.G. Hutchinson und A.B. Caldicott, "Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bacteria", J. Chromatography 188,221-233 (1980)] beschriebenenAibeitsverfahren beruht

Stärkehydrolyse wurde durch Prüfung auf das Vorliegen von Stärke mit Iod auf ISP No. 4-(anorganische Salze-Stärke)-Agaiplatten bestimmt (siehe Blazevic und Ederer, l.c.).

NaCl-Toleranz wurde durch Zugabe von NaCl zu ISP No. 2-Agar zur Einstellung der gewünschten Konzentration und Bebrütung der Platten bei 30° während 14 Tagen gemessen.

Die Resistenz gegen Antibiotika wurde durch Auflegen Antibiotikum-empfindlicher Scheiben auf die Oberfläche von beimpften ISP No. 2-Agaiplatten gemessen.

Phosphatase und Urease wurden nach Methoden bestimmt, die von Blazevic und Ederer, l.c., beschrieben worden sind. Zur Bestimmung von Proteinaseaktivität wurde die Gelatineverflüssigung angewendet.

Kulturkennmerkmale

Das Wachstum von A42125 war im allgemeinen sowohl auf komplexen als auch auf definierten Agarmedien gut. Auf allen Agarmedien, ausgenommen Hefe-Dextrose-Agar, wurden Luftmyzelien produziert. Die Farbe der Sporenmasse lag in der Reihe der grau-bis-weißen Farben. Die nächstliegenden Farbvergleichsmuster in dem System von Tresner und Bachus waren d hellgrau und b Austern-weiß. Die Farbe an der Rückseite war gelblich braun bis gelblich weiß. In ISP No. 2-Agar und Hefe-Dextrose-Agar wurde ein hellbraunes, lösliches Pigment produziert In Tabelle I sind diese Kulturkennmerkmale zusammengefaßt. -4-

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Wachstum; R = Rückseite; Lm = Lufimyccl; LP = lösliches Pigment. II £ Ό «n o cs io cs

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Morphologische Kennmerkmale

Die Kultur Λ42125 produziert ein ausgedehntes Substrat und ein annehmbar gut entwickeltes Luftmyzel. Beim Betrachten unter einem Lichtmikroskop haben die Lufthyphen ein Spinnenweben-artiges Aussehen. Diese Morphologie wird in den in Bergey's Manual (R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, Hsg., "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Aufl., The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974) beschriebenen Nicht-Streptomycetenabschnitt eingeordnet.

Wenn Lufthyphen vom ISP No. 4-Agarmedium durch Rasterelektronenmikroskopie geprüft wurden, wurden Conidien beobachtet.

Sporen waren dürftig und unregelmäßig gebildet. Die Omamentierung der Sporenoberfläche war glatt [T.G. Pridham, C.W. Hesseltine und R.C. Benedict, "A Guide for the Classification of Streptomycetes According to Selected Groups", Appl. Microbiol. 6; 52-79 (1957)].

Die Sporenform war rechteckig bis zylindrisch, und die Sporen bildeten Ketten von mehr als 50 an der Zahl. Die Sporengröße lag im Bereich von 1,2-0,9 x 0,5-0,4 |im und betrug im Mittel 1,1 x 0,5 |im.

Beim Wachstum unter submersen Schüttelbedingungen trennten sich die Hyphen in Fragmente auf.

Physiologische Kennmeikmale

Kultur A42125 zersetzte Casein, Elastin, Guanin, Hypoxanthin und Tyrosin; hydrolysierte Calciummalat, DNS, Esculin und Stärke; bildete Säure aus Arabinose, Cellobiose, Fructose, Galactose, Alpha-Methyl-D-glykosid, Glucose, Glycerin, Inosit, Lactose, Maltose, Mannit, Mannose, Melibiose, Raffinose, Rhamnose, Trehalose und Xylose; und verwertete Acetat, Benzoat, Citrat, Malat, Oxalat, Propionat, Pyruvat, Succinat und TartraL

Die Kultur A42125 produzierte Katalase, Phosphatase, Proteinase, Urease und Melanoid-Pigmente; sie war gegen Rifampin nicht resistent; war aber resistent gegen Lysozym, Cephalothin, Gentamicin, Lincomycin, Penicillin undTobramycin.

Die Kultur A42125 tolerierte bis zu 6 % NaCl und wuchs bei Temperaturen zwischen 15 und 37 °C; sie war nicht dazu befähigt, eine 8-stündige Exposition bei 50 °C zu überleben, Magermilch zu hydrolysieren oder Nitrate zu Nitriten zu reduzieren. Diese physiologischen Eigenschaften sind in den Tabellen Π und ΙΠ dargestellt.

Tabellen

Einige morphologische und physiologische Eigenschaften von A42125 und verwandten Nocardia-Stämmen3

Eigenschaft A42125 N. aero- colonigenes N. orien-talis N. brasi-liensis Lufthyphen + . + _ Conidien + - + - Säurebeständigkeit - - - - Mycolinsäuren in Zellwänden . . + Urease + + + + Zersetzt: Adenin Casein + + + + Elastin + - - + Hypoxanthin + + + + Tyrosin + + + + Xanthin - - - - Resistent gegenüber Lysozym + + + Rifampin - - + + Hydrolysiert Calciummalat + + + ND Esculin + + + + Hippurat - - + - Stärke + + + + Verwertet Benzoat + m . Citrat + + + + Mucat • • • -7-

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Tabelle Π (Fortsetzung)

Eigenschaft A42125 N.aero- colonigenes N. orien-talis N. brasi-liensis Succinat + + + + Tartrat + - - - Reduziert Nitrat - - + + Überlebt 8h lang bei 50°C + Bildet Säure aus: Adonit + l-(+>Arabinose + + + - Cellobiose + + + + iso-Erythrit - - + - Glucose + + + + Glycerin + + + + Inosit + + + + Alpha-Lactose + + + - Maltose + + + - D-Mannit + + + + D-Mannose + + + + Melezitose - - - - Melibiose + + - - Alpha-Methyl- glucosid + + Rafftnose + + - - Rhamnose + + + - Sorbit - - - - Trehalose + + + + Xylose + + + - Wäscht bei: 10° + + + 45° - - - - 50° “ - - - a + = zeigt die genannte Eigenschaft; - = zeigt die genannte Eigenschaft nicht

Tabeiiem

Weitere Eigenschaften von A42125 Eigenschaft_Kennmerkmala

Phosphatase + Hydrolysiert Magermilch - Produktion von Melanoidpigment + Gelatinverflüssigung + NaCl-Toleranz in % 6 Katalase + Zersetzt: Chitin DNS + Guanin + Keratin - Testosteron - Verwertet: Acetat + -8-

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Tabelle ΠΙ (Fortsetzung)

Eigenschaft Kennmerkmal3

Malat +

Oxalat +

Propionat +

Pyruvat +

Bildet Säure aus:

Dulcetol

Ethanol

Fructose + d-(+)-Galactose +

Inulin

Salicin

Saccharose

Temperaturbereich für das Wachstum 15-37°C. a+ = Stamm hat die angegebene Eigenschaft; - = Stamm hat die angegebene Eigenschaft nicht

Zellwandanalvse

Hydrolysierte, ganze Zellen enthielten das meso-isomer von Diaminopimelinsäure. Die in Gesamtzellhydrolysaten vorliegenden Zucker waren Arabinose, Galactose, Mannose und Ribose. Der Zellwandtypus gemäß Becker und Mitarbeitern, l.c„ war Typus IV, und das Zuckerschema ist ein solches vom Typus A (Lechavalier, l.c.). Mycolinsäuren (LCN-A) wurden von A42125 nicht produziert Die Zellen färbten grampositiv, waren aber nicht säurefest

Identität von Stamm A42125

Der Stamm A42125 hatte eine Zellwand vom Typus IV, ein Gesamtzellzuckermuster vom Typus A und enthielt keine Mycolinsäuren (LCN-A). Diese chemotaxonomische Information und die allgemeinen Kulturkennmerkmale stimmen mit der Zuordnung von Stamm A42125 zur Gattung Nocardia Trevisan 1889 [V.B.D. Skerman, V. McGowan und P.H.A. Sneath, Hsgb., "Approved Lists of Bacterial Names", IntJ.Syst.Bacteriol. 30,225420 (1980)] überein.

Ein Vergleich der Kennmerkmale von Stamm A42125 mit veröffentlichten Beschreibungen von Nocardia-Spezies zeigte Ähnlichkeit mit den folgenden Spezies:

Nocardia brasiliensis3^

Nocardia orientaIisa,^,c a Goodfellow und Schaal, I.c. ^ Gordon, Mishra und Bamett, l.c. c Pittenger und Brigham, l.c.

Diese Kulturen wurden gleichzeitig mit Stamm A42125 gezüchtet Die veröffentlichten Daten und die experimentell erhaltenen Daten wurden vereinigt und die Ergebnisse wurden ausgewertet. Es wurden Ähnlichkeitskoeffizienten berechnet wie sie von Kurylowicz und Mitarbeitern (W. Kurylowicz, A. Paszkiewicz, W. Woznicka, W. Kurzatkowski und T. Szulga, "Numerical Taxonomy of Streptomycetes", Polish Medical Publisheis, Warschau, 1975, S. 37) erörtert worden sind, wobei die folgende Gleichung benützt wurde:

Ns+ + Ns" SSM =-x 100

Ns+ + Ns" + Nd worin Ns+ die Anzahl von positiven Ähnlichkeiten ist, Ns" die Anzahl von negativen Ähnlichkeiten ist, und Nd die Anzahl von Unähnlichkeiten (Differenzen) ist -9-

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Die zur Berechnung des Sg^-Wertes benützten Eigenschaften waren physiologische und Nichtkultur- oder morphologische Eigenschaften. Die Gesamtzahl von Eigenschaften ensprach 44.

Die Ähnlichkeitskoeffizienten sind nachstehend angegeben:

Kultur-S-sm_ A42125 100 N. aerocolonigenes 88 N. orientalis 70 N. brasiliensis 65

Da N. brasiliensis, was die Kultur betrifft, wenig Ähnlichkeit mit A42125 hatte, und einen niedrigen Sg^j-

Wert hatte, wurde diese Kultur aus den Betrachtungen ausgeschieden. N. orientalis hatte Kulturkennmeikmale, die jenen von A42125 ähnlich sind. Diese Ähnlichkeit ist besonders auf ISP-Medien No. 3 und 4 deutlich. Diese Kultur wurde jedoch aus der Betrachtung ausgeschieden, weil die physiologischen Kennmerkmale, wie durch den niedrigen Sg^-Wert angezeigt wird, nicht ähnlich waren. N. aerocolonigenes hat keine Lufthyphen. Daher könnte ein Kulturvergleich mit A42125 nur auf der Basis von Wachstum, Farbe der Rückseite und löslichen Pigmenten vorgenommen werden. Als N. aerocolonigenes zum ersten Mal beschrieben wurde [E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces 111", IntJ.Syst. Bacteriol. 18 (4); 279-392 (1968)], wurde berichtet, daß sie auf ISP No. 5 weiße Lufthyphen hat. Dieser Bericht stimmt mit Beobachtungen aus der laufenden Simultanvergleichsstudie (siehe Tabelle I, ISP No. 5) überein. Das Wachstum und die Farbe der Rückseite von A42125 einerseits und N. aerocolonigenes anderseits passen in annehmbarer Weise zusammen. Dieses Zusammenpassen zeigt sich besonders gut auf Czapek's Lösungsagar und Glucose-Asparagin-Agar.

Gordon, l.c., klassifizierte Stämme als N. aerocolonigenes unter Benützung von Eigenschaften, die von Lufthyphen verschieden sind. Die physiologischen und chemotaxonomischen Ähnlichkeiten zwischen A42125 und N. aerocolonigenes überwiegen bei weitem die Unterschiede aufgrund des Fehlens von Lufthyphen. Von Gordon wurden drei Schlüsseleigenschaften angegeben, um N. orientalis von N. aerocolonigenes zu unterscheiden. Ein Vergleich dieser Eigenschaften mit jenen von A42125 ist in Tabelle IV angegeben:

Tabelle IV

Vergleich von unterscheidenden Eigenschaften von A42125, N. orientalis und N. aerocolonigenes

Eigenschaft? N. orientalis N. aerocolonigenes A42125 Erythrit + Alpha-Methylglucosid + - + Resistenz gegen Lysozym - + + a + = Stamm hat die angegebene Eigenschaft - = Stamm hat die angegebene Eigenschaft nicht

Eine Betrachtung dieser Indikatoren zeigt, daß A42125 am engsten mitN. aerocolonigenes verwandt ist. A42125 und N. aerocolonigenes unterscheiden sich bei der Kohlenstoffverwertung (gemessen anhand des Wachstums und der Säureproduktion) bei nur einer Kohlenhydratquelle.

Unter Benützung des von Mishra, l.c., ersonnenen Schlüssels für die versuchsweise Identifizierung von Nocardiae-Spezies paßt die Kultur A42125 unmittelbar zu N. aerocolonigenes. Diese Vergleiche zeigen, daß A42125 eine beschränkte Kulturähnlichkeit und gute physiologische Ähnlichkeit mit N. aerocolonigenes hat. Der signifikanteste Unterschied ist das Vorliegen von Lufthyphen bei A42125. Da N. aerocolonigenes dafür bekannt ist, daß sie Lufthyphen produziert, ist dieser Unterschied nicht als ausreichend angesehen worden, um A42125 von dieser Klassifizierung auszuschließen. Die Kultur A42125 wird daher als ein Stamm von Nocardia aerocolonigenes (Shinobu und Kawato), Pridham und Lyons 1970, klassifiziert Weil N. aerocolonigenes in den Approved Lists of Bacterial Names, l.c., nicht enthalten ist, handelt es sich aber nicht um eine gültig veröffentlichte Spezies.

Wie dies bei anderen Organismen der Fall ist unterliegen auch die Kennmeikmale der A42125-produzierenden Kultur, Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049, der Variation. Rekombinanten, Mutanten oder Varianten des Stammes können nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden erhalten werden. Beispielsweise können Mutanten durch Behandlung mit verschiedenen bekannten physikalischen und chemischen Mutagenen, wie Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, und Chemikalien, wie N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin, -10-

Nr. 389893 erhalten werden. Alle natürlichen und induzierten Varianten, Mutanten und Rekombinanten von Nocardia aerocolonigenes, die das Kennmerkmal der A42125-Produktion beibehalten, sind Teil dieser Erfindung.

Das zum Züchten der Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 verwendete Kulturmedium kann irgendeines aus einer Anzahl von Medien sein. Für eine wirtschaftliche Produktion, optimale Ausbeute und Leichtigkeit der S Produktisolierung werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. So sind beispielsweise für N. aerocolonigenes bevorzugte Kohlenhydratquellen für die Fermentation in großem Maßstabe Glucose und Dextrine, obgleich andere Zucker oder Zuckeipolymere u. dgl. auch verwendet weiden können.

Bevorzugte Stickstoffquellen für N. aerocolonigenes sind Sojabohnenschrote und Maisquellwasser, obgleich andere Stickstoffquellen, wie lösliche Rückstände der Branntweindestillation, Hefeextrakt, Rindfleischextrakt u. 10 dgl., auch verwendet werden können.

Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien vorteilhaft einverleibt werden können, gehören die üblichen löslichen Salze, die zur Lieferung von Zink-, Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat- u. dgl. -Ionen geeignet sind.

Wesentliche Spurenelemente, die für den Wuchs und die Entwicklung des Organismus notwendig sind, 15 sollten dem Kulturmedium auch einverleibt werden. Solche Spurenelemente kommen üblicherweise als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in ausreichenden Mengen vor, um die Wuchserfordemisse des Organismus zu befriedigen. Schäumen ist gewöhnlich kein Problem, doch können geringe Mengen (nämlich 0,2 ml/1) eines Antischaummittels, wie Polypropylenglykol, den Fermentationsmedien für das Arbeiten in großem Maßstabe zugesetzt werden, falls dies nötig ist. 20 Zur Erzeugung wesentlicher Mengen des A42125-Antibiotikums wird eine submerse, aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen von A42125 können durch Schüttelkolbenkultur erhalten werden. Wegen der Lagzeit bei der Antibiotikaeizeugung, die üblicherweise bei der Beimpfung großer Tanks mit der Sporenform des Organismus auftritt, wird es bevorzugt, ein vegetatives Impfmaterial zu verwenden. Das vegetative Impfmaterial wird durch Beimpfung eines kleinen Volumens von Kulturmedium mit der Sporenform oder mit 25 Myzelfragmenten des Organismus hergestellt, um eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus zu erhalten. Das vegetative Impfmaterial wird dann in einen größeren Tank überführt Das vegetative Impfmedium kann das gleiche sein wie jenes, das für größere Fermentationen verwendet wird, doch sind andere Medien auch geeignet. A42125 wird von N. aerocolonigenes beim Züchten bei Temperaturen zwischen etwa 25° und etwa 37° C 30 eizeugt Eine gute Temperatur für die A42125-Pioduktion scheint etwa 30° C zu sein.

Wie bei submersen, aeroben Kulturverfahren üblich, wird in das Gefäß vom Boden her sterile Luft geblasen, während das Medium mit üblichen Turbinenschaufeln gerührt wird. Unter den bisher angewendeten Bedingungen hat die maximale Sauerstoffaufnahme der Fermentation etwa 0,2 mM/l/min nicht überschritten. In einem vollständig mit Prallflächen ausgestatteten 1651-Fermentationsgefäß, das annähernd 1151 Brühe enthält, ist eine 35 Belüftungsgeschwindigkeit von 0,125 Vol./Vol./min bei einer Rührgeschwindigkeit von 200 bis 250 UpM ausreichend, um den Spiegel an gelöstem Sauerstoff bei oder über 30 % der Luftsättigung zu halten.

Die Erzeugung von Antibiotikum A42125 kann während der Fermentation durch Prüfung von Proben der Brühe auf antibiotische Wirksamkeit gegen Organismen, die bekanntermaßen für das Antibiotikum empfindlich sind, verfolgt werden. Ein Testorganismus, der bei der Prüfung auf das Vorliegen von A42125 nützlich ist, ist 40 Micrococcus luteus. Der Bioassay wird üblicherweise mit Hilfe des Agar-Lochplattentests ausgeführt.

Nach seiner Erzeugung unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen kann A42125 aus dem Fermentationsmedium nach auf dem Fachgebiet angewendeten Methoden gewonnen werden. Die während der Fermentation des A42125-produzierenden Organismus produzierte antibiotische Aktivität tritt hauptsächlich in der Brühe auf. Maximale Gewinnung von A42125 wird daher eizielt, indem anfänglich das Medium filtriert wird, 45 um die Brühe von der Myzelmasse zu trennen. Die filtrierte Brühe kann dann gereinigt weiden, um das A42125 abzutrennen. Eine Vielfalt von Methoden kann bei dieser Reinigung angewendet werden.

Eine bevorzugte Methode zur Abtrennung von A42125 aus der filtrierten Brühe umfaßt das Einstellen der Brühe auf einen pH-Wert von etwa 7 und das Zugeben eines geeigneten Adsorptionsmittels, wie z. B. eines hochpoiösen Polymerharzes. Das Harz wird durch Filtration abgetrennt und mit einem geeigneten Lösungsmittel, 50 wie AcetonitrilrWasser (1:1), extrahiert. Das Extraktionslösungsmittel kann dann unter Vakuum abgedampft werden, wobei A42125 erhalten wird.

Das in dieser Weise erhaltene A42125 kann durch anerkannte Verfahrensweisen weiter gereinigt werden. Eine bevorzugte Verfahrensweise umfaßt die Ionenaustauschchromatographie.

Die Abtrennung von Antibiotikum A42125 kann durch Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt werden. 55 Ein zweckmäßiges Kieselsäuregel-Dünnschichtchromatographie-Lösungsmittelsystem ist Acetonitril:Methanol:Wasser: Ammoniumhydroxid (4:2:2:1). In diesem System hat A42125 einen Rf-Wert von annähernd 0,43. Das Antibiotikum kann durch Bioautographie unter Anwendung von beispielsweise Micrococcus luteus oder durch andere Methoden, wie z. B. mittels VaniUin-Schwefelsäure-Sprayreagens, festgestellt werden.

Alternativ können die Kulturfeststoffe, darunter Mediumbestandteile und Myzel, ohne Extraktion oder 60 Separation, jedoch vorzugsweise nach Entfernung von Wasser, als eine Quelle für A42125 benützt werden. Beispielsweise kann nach Erzeugung von A42125 die gesamte Fermentationsbrühe getrocknet werden, indem Lyophilisierung, Trommeltrocknen oder azeotrope Destillation und Trocknen vorgenommen werden. Die -11- 5

Nr. 389893 getrocknete Brühe wird dann unmittelbar in ein Futtervorgemisch eingemischt. A42125 hemmt das Wachstum von Bakterien, die für das Tier- und Pflanzenleben pathogene Wirksamkeit zeigen. In Tabelle V sind die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC's) zusammengefaßt, bei welchen A42125 verschiedene Bakterien, gemessen nach der üblichen Agar-Verdünnungsmethode, hemmt

Tabelle.Y

Antibakterielle Wirksamkeit von A42125 10 Testorganismus MIC (ue/ml) Staphylococcus aureus VI. 1 1 Staphylococcus aureus V41 1 Staphylococcus aureus X400 1 15 Staphylococcus aureus S13E 1 Staphylococcus epidermidis Epi 1 1 Staphylococcus epidermidis 222 0,5 Streptococcus pyogenes C203 2 Streptococcus sp. group D X66 1 20 Streptococcus sp. group D 2041 4 Haemophilus influenzae 76 8

Ein wichtiger Aspekt der antimikrobiellen Wirksamkeit von A42125 bezieht sich auf dessen Wirksamkeit gegen anaerobe Bakterien. In Tabelle VI sind MIC-Werte, bei welchen A42125 verschiedene anaerobe Bakterien, 25 bestimmt durch Standardagar-Verdünnungstest hemmt, zusammengefaßt Die Endwerte wurden nach 24-stündiger

Bebrütung äbgelesen.

Tabelle VI 30 Empfindlichkeit anaerober bakterieller Isolate für A42125

Anaerobe Bakterien MIC(u.g/ml)

Clostridium difficile 2994 4 35 Clostridium perfringens 81 4 Clostridium septicum 1128 4 Eubacterium aerofaciens 1235 4 Peptococcus asaccharolyticus 1302 64 Peptococcusprevoti 1281 4 40 Peptostreptococcus anaerobius 1428 8 Peptostieptococcus intermedius 1624 4 Propionibacterium acnes 79 8 Bacteroides fragilis 111 >128 Bacteroides fragilis 1877 >128 45 Bacteroides fragilis 1936B >128 Bacteroides thetaiotaomicron 1438 128 Bacteroides melaninogenicus 1856/28 64 Bacteroides melaninogenicus 2736 128 Bacteroides vulgaris 1211 128 50 Bacteroides corrodens 1874 >128 Fusobacterium symbiosum 1470 >128 Fusobacterium necrophorum 6054A >0,5

Gemäß einem anderen wichtigen Aspekt seiner antimikrobiellen Wirksamkeit hemmt A42125 Methan-55 produzierende Bakterien. Beispielsweise hemmt A42125 Methanococcus vannielli in Konzentrationen, die so niedrig sind wie 0,1 pg/ml in einem Test bei welchem ein Kristall von A42125 auf einen 24 h alten Rasen (Minimalmedium) aufgebracht wurde und die Hemmung nach 3 Tagen gemessen wurde.

Eine andere wichtige Eigenschaft von A42125 ist dessen Fähigkeit zur Verbesserung des Futterverwertungsgrades bei Tieren. Beispielsweise verbessert A42125 den Futterverwertungsgrad bei 60 Wiederkäuern, die eine entwickelte Pansenfunktion aufweisen.

Die Wirksamkeit der Futterverwertung kann durch Beobachtung dm1 Produktion und Konzentration von -12-

Nr. 389893

Propionatverbindungen im Pansen überwacht werden. Von einem Ochsen, der eine chirurgisch angebrachte Fistelöffnung im Pansen aufweist, wurde Pansenflüssigkeit erhalten. Der Ochse wurde mit einem einen hohen Kömeranteil enthaltenden Futter gehalten, wobei die Zusammensetzung des Futters wie folgt war: 69,95 % grob gemahlener Mais 10 % gemahlene Maiskolben 8 % Sojabohnenmehl (50 % Protein) 5 % Alfalfamehl 5 % Melasse 0,6 % Harnstoff 0,5 % Dicalciumphosphat 0,5 % Calciumcarbonat 0,3 % Kochsalz 0,07 % Vitamin A- und D4-Vorgemisch 0,05 % Vitamin E-Vorgemisch 0,03 % Spurenelementevoigemisch

Eine Probe der Phasenflüssigkeit wurde durch 4 Schichten von Mull filtriert, und das Filtrat wurde in einem Vakuumkolben gesammelt. Das teilchenförmige Material, das durch den Mull zurückgehalten wurde, wurde in genügend physiologischem Puffer resuspendiert, um es auf das ursprüngliche Volumen der Pansenflüssigkeit zurückzuführen, und die Suspension wurde erneut durch Mull filtriert. Der verwendete Puffer ist nachstehend beschrieben: 0,316 g/I Na2HP04 0,152 g/I KH2P04 2,260 g/1 NaHC03 0,375 g/1 KCl 0,375 g/1 NaCl 0,112 g/1 MgS04 0,038 g/1 CaCl2 0,008 g/I FeS04.7H20 0,004 g/I MnS04 0,004 g/1 ZnS04.7H20 0,002 g/1 CuS04.5H20 0,001 g/1 CoCl2

Cheng und Mitarbeiter, J. Dairy Sei. 38,1225 (1955).

Die zwei Filtrate wurden in einem Scheidetrichter vereinigt und stehengelassen, bis das teilchenförmige Material an die Oberfläche aufgestiegen war. Die klare Schicht wurde dann abgetrennt und mit dem gleichen Puffer im Verhältnis 1:1 verdünnt, worauf auf pH 7,0 eingestellt wurde. 10 ml der verdünnten Pansenflüssigkeit wurden in einen 25 ml-Kolben mit 40 mg des oben angegebenen Futters eingebracht. Je Kolben wurden 5 mg Sojabohnenprotein zugesetzt Die zu behandelnde Verbindung wurde in jeden Testkolben eingewogen. Je Behandlung wurden via Wiederholungskolben benützt Es wurden auch zwei Sätze von jeweils vier Kontrollkolben angewendet Es wurde eine Kontrolle im Zeitpunkt Null durchgeführt, sowie eine Kontrolle nach 16-stündiger Bebrütung. Alle Testkolben wurden 16 Stunden bei 38 °C bebrütet Am Ende da Bebrütung wurde der pH-Wert gemessen, und jedem Kolben wurden 2 ml 25 %-ige Metaphosphorsäure zugesetzt. Die Proben wurden absetzen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch gaschromatographische Methoden auf flüchtige Fettsäuren analysiert

Es wurden Analysen auf Acetat Propionat- und Butyratverbindungen vorgenommen. Die Ergebnisse wurden statistisch mit den Ergebnissen der Analysen der Kontrollkolben verglichen. Behandlungen mit einer Propionatproduktion, die signifikant höher war als jene der Kontrollen, wurden als wirksame Behandlungen angesehen. Die Tabelle VH zeigt die Verhältnisse der Konzentrationen an flüchtiger Fettsäure (VFA) in A42125 behandelten Kolben zu den Konzentrationen in den Kontrollkolben dieser Tests. -13-

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Tabelle VH

Wiiksamkeit von A42125 auf den Futterverwertungsgrad a bei Wiederkäuern

Dosierung Hg/ml Mol-% Propionat Mol-% Acetat Mol-% Butyiat Summe der flüchtigen Fettsäuren/flüchtige Fettsäuren bei der Kontrolle mM/1 20 1,283 0,914 0,608 0.921 5 1,237 0,877 1.019 0.988 5 0,959 0,992 1,075 0,921 1 1.122 1,015 0.795 1,237 5 1,118 0,915 0,867 1,041 1 1,105 0.881 1,111 0,997 5 1,778 0,896 0,654 0,921 1 1,458 0.915 0.823 0,858 a Fünf Versuche

Die Hemmung der Methanbildung trägt auch zu wirksamerer Futterverwertung bei Wiederkäuern bei, indem das Acetat statt Methan, das ausgestoßen wird, in verwertbare Energie übergefiihrt wird. Diese Wirksamkeit kann unter Anwendung eines in vitro-Tests gemessen werden, der die Wirkung des Pansens nachahmt. Dieser Test wurde in kontinuierlichen Fermentationskolben ausgeführt, welche die Wirkung des Pansens über einen langen Zeitraum hin nachahmen. Jeder Kolben war ein gasdichter Behälter, der Flüssigkeitseinlaßöffnungen, Feststoffeinlaßöffnungen, Probenentnahmeöffnungen und Gasauslaßrohre, welche zu Gummiblasen zur Aufnahme der bei der Fermentation produzierten Gase führten, aufwies. Das Flüssigkeitsvolumen in jedem Kolben wurde durch ein Standrohr, das zu einem Flüssigkeitssammelgefäß führte, auf 500 ml eingeregelt Die Temperatur der Kolben wurde auf 38° - 40 °C geregelt. Jeder Kolben wurde mittels eines Mapetrührers mäßig gerührt Jeder Versuch wurde damit begonnen, daß einem Kolben 500 ml filtrierter Pansenflüssigkeit zugeführt wurden, die aus einem mit Fistel versehenen Ochsen, welcher mit dem gleichen Futter, wie es beim Test verwendet wurde, gefuttert wurde, erhalten worden ist Der Sammelkolben für das ausfließende Material wurde mit 50 ml verdünnter Metaphosphorsäure vorbeschickt um die Fermentation in der Flüssigkeit, die aus dem Kolben überfließt, abzubrechen. Der Kolben wurde verschlossen, und die Gassammelblasen wurden angeschlossen. Jedem Kolben wurde kontinuierlich Flüssigkeit zugeführt, indem in denselben täglich 11 eines Puffers vom pH 6,8-7,0 mit der folgenden Zusammensetzung eingetropft wurde:

Natriumhydrogenphosphat 2,2 gß Magnesiumchlorid 0,036 Natriumbicarbonat 5,9 Kaliumchlorid 0,34 Natriumchlorid 0,28 Harnstoff 1,0 Calciumchlorid 0,024 Durch die Einlaßöffnung jedes Kolbens erfolgte zweimal täglich ein 10 g-Zusatz des entsprechenden Futters.

Nach jeder Futterzufuhr wurde die Gasauslaßöffnung abgeschlossen, und der Kolben wurde mit Kohlendioxid gespült.

An jedem Tag wurde die ausfließende Flüssigkeit gesammelt und analysiert, und das Gas, welches aus dem Kolben austrat wurde gesammelt und analysiert

Die übliche Praxis bestand darin, mit jedem Kolben 4 Tage lang zu arbeiten, ohne daß irgendeine Behandlungsverbindung dem Futter zugesetzt wurde. Nach dem 4 Tage-Zeitraum der Gleichgewichtseinstellung wurde mit der Analyse der flüssigen und gasförmigen austretenden Materialien begonnen, und der Kolben wurde ohne irgendeinen Zusatz von Behandlungsverbindung betrieben, bis die analytischen Daten relativ konstante Werte annahmen. Mit dem Zusatz des behandelten Futters zu dem Kolben wurde in diesem Zeitpunkt begonnen, und der Kolben wurde mit dem behandelten Futter wenigstens 7 Tage lang betrieben. -14-

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Die Verbindung wurde dem Futter in Mengen zugesetzt, die geeignet sind, um die Konzentration an Verbindung in dem 500 ml-Flüssigkeitsvolumen des Kolbens einzustellen, die in der nachstehenden Tabelle Vm angegeben ist. Bei den meisten Versuchen wurden 2 Kolben für jeden Behandlungsspiegel jeder Verbindung verwendet, und die Daten von beiden Kolben aus allen Behandlungstagen wurden gesammelt und gemittelt. In Tabelle VHI ist die Methanbildungshemmwirksamkeit von A42125 zusammengefaßt.

Tabelle Vin

Wirkung von A42125 auf die Methanbildung a bei Wiederkäuern

Dosierung Methan ttg/ml_mM/Tag 23,0 5 2.3 4,1 5 1,8 1 2.3 7,2 5 0,3 _1_ 0.8 a Drei Versuche

Die ermittelten LD^-Werte nach einer Einzeldosisverabreichung von A42125 bei Mäusen waren: LD^o (intraperitoneal) = < 9,375 mg/kg LD50 (oral) = 89 mg/kg A42125 ist typischerweise bei der Erhöhung der Propionatwerte wirksam und erhöht dabei den Wirkungsgrad der Futterverwertung, wenn es an Wiederkäuer oral in Mengen von etwa 0,05 mg/kg/Tag bis etwa 6,75 mg/kg/Tag verabreicht wird. Bevorzugte Verabreichungsmengen sind etwa 0,2 mg/kg/Tag bis etwa 3,5 mg/kg/Tag.

Ein bevorzugtes Verabreichungsverfahren besteht darin, die Verbindung mit dem Tierfutter zu vermischen; die Verbindung kann jedoch auch in anderer Weise verabreicht werden, beispielsweise in Form von Tabletten, Tränken, Bolussen oder Kapseln. Die Formulierung dieser verschiedenen Dosierungsformen kann nach Methoden vorgenommen werden, die auf dem Gebiet der Veterinärpharmazie wohlbekannt sind. Jede Einzeldosiseinheit sollte eine Menge einer Verbindung dieser Erfindung enthalten, die in direkter Beziehung zu der richtigen Tagesdosis für das zu behandelnde Tier steht.

Diese Erfindung bezieht sich ferner auf Futterzusammensetzungen, die zur Erhöhung der Futterverwertung geeignet sind, enthaltend eine Futterration und 6 bis 60 g pro Tonne A42125-Verbindung. A42125 kann den Tieren oral oder parenteral verabreicht werden. Der praktischeste Weg der Verabreichung von A42125 besteht in der Einverleibung in den Futtervorrat Eine Vielfalt von Futtermitteln, darunter die üblichen Trockenfutter, flüssigen Futter und pelletierten Futter, kann verwendet werden. Obgleich die bevorzugte Verabreichungsmethode das Vermischen von A42125 mit dem Tierfutter ist, kann es auch auf andere Weise, z. B. als Tabletten, Tränke, Bolusse oder Kapseln, verabreicht werden. Jede einzelne Dosierungseinheit soll eine Menge von A42125 enthalten, die direkt mit der richtigen Tagesdosis für das zu behandelnde Tier in Beziehung steht

Die Methoden zur Einverleibung von Arzneimitteln in Tierfutter sind wohlbekannt. Eine bevorzugte Methode besteht darin, ein konzentriertes Arzneimittelvorgemisch herzustellen, das dann zur Herstellung von arzneimittelhältigen Futtermitteln verwendet wird. Typische Vorgemische können etwa 1 bis etwa 200 g Arzneimittel pro 454 g (Pfund) Vorgemisch enthalten. Vorgemische können entweder flüssige oder feste Zubereitungen sein.

Die Endformulierung von Futtermitteln für Tiere wird von der Menge des zu verabreichenden Arzneimittels abhängig sein. Die üblichen Methoden zur Formulierung, Vermischung und Pelletierung von Futtermitteln können zur Herstellung von A42125-enthaltenden Futtermitteln angewendet werden. A42125 kann für parenterale Verabreichung nach Methoden formuliert werden, die auf dem Gebiet der Veterinärpharmazie anerkannt sind. Wirksame injizierbare A42125-enthaltende Zusammensetzungen können entweder in Suspensions- oder Lösungsform vorliegen. Für die Form von Lösungen wird A42125 in einem -15-

Nr. 389893 physiologisch annehmbaren Träger aufgelöst. Solche Träger enthalten ein geeignetes Lösungsmittel, erforderlichenfalls Konservierungsmittel, wie Benzylalkohol, und Puffer. Zu brauchbaren Lösungsmitteln gehören beispielsweise Wasser, Alkohole, Glykole oder inerte Öle, wie Pflanzenöle oder hoch raffinierte Mineralöle.

Injizierbare Suspensionszusammensetzungen werden unter Verwendung eines Nichtlösungsmittels für die Verbindung, zusammen mit Adjuvanzien, als Träger, hergestellt. Das Nichtlösungsmittel kann beispielsweise Wasser oder ein Glykol, wie Polyethylenglykol, sein.

Geeignete physiologisch annehmbare Adjuvanzien sind notwendig, um die Verbindung in Suspensionszusammensetzungen suspendiert zu halten. Die Adjuvanzien können aus Verdickungsmitteln, wie Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und den Alginaten ausgewählt werden. Viele grenzflächenaktive Mittel sind auch zur Suspendierung der Verbindungen nützlich. Lecithin, Alkylphenolpolyethylenoxidaddukte, Naphthalinsulfonate, Alkylbenzolsulfonate und die Polyoxyethylensorbitanester sind in flüssigen Nichtlösungsmitteln nützliche Suspendiermittel.

Viele Substanzen, welche die hydrophilen Eigenschaften, die Dichte und die Oberflächenspannung des flüssigen Nichtlösungsmittels beeinflussen, können in Einzelfällen bei der Herstellung injizierbarer Suspensionen hilfreich sein. Beispielsweise können Silikonantischaummittel, Glykole, Sorbit und Zucker nützliche Suspendiermittel sein.

Zur vollständigeren Veranschaulichung der Arbeitsweise dieser Erfindung werden die folgenden Beispiele gegeben:

Beispiel 1

Herstellung von Antibiotikum A42125 A. Schüttelkolbenfermentation

Die Kultur Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 wird entweder als ein lyophilisiertes Kügelchen oder als eine in flüssigem Stickstoff gehaltene Suspension zur Beimpfung eines Schrägmediums mit der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Schrägmedium

Bestandteil

Menge fg/ll

Kartoffeldextrin 10

Hefeextrakt 1

Enzym-hydrolysiertes Casein* 2

Rindfleischextrakt 1

CoCl2.6H20 0,01

Agar 20

Entionisiertes Wasser Rest auf 11 * N-Z Amine A, Humko Sheffield Chemical Co., Lyndhurst NJ Der pH-Wert wird von annähernd 6,2 mit NaOH auf 7,0 eingestellt.

Das beimpfte Schrägmedium wird bei 30° C etwa 7 Tage lang bebrütet. Die reife Schrägkultur wird mit einem sterilen Werkzeug gekratzt, um die Sporen zu lockern und zu entfernen und die Myzelienmatte zu mazerieren. Etwa ein Viertel der so erhaltenen gelockerten Sporen und des so erhaltenen Kulturwuchses werden zur Beimpfung von 50 ml eines vegetativen Mediums mit der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Vegetatives Medium

Bestandteil_ Glucose Tapioca-Dextrin* Sojabohnenschrot Maisquellwasser Hefeextrakt CaCOj Leitungswasser Rest auf

Menge fg/11 15 20 15 10 1 2 11 * Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur IL Der pH wurde von annähernd 5,5 mit NaOH auf 6,5 eingestellt -16-

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Das beimpfte vegetative Medium wird in einen 250 ml Erlenmeyerkolben bei 30° C etwa 72 Stunden auf einer Schüttelmaschine bebrütet, die mit 250 UpM bei einer Exzentrizität von 5,08 cm arbeitet.

Dieses bebrütete vegetative Medium (1,25 ml) wird zur Beimpfiing von 50 ml eines Produktionsmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil_Menge Cp/D

Glucose 25

Maisstärke 10 Lösliches Fleischpepton* 10

Enzym-hydrolysiertes Casein** 4

Blackstrap Melasse 5

MgS04.7H20 0,5

CaC03 2,0

Czapek's Mineral Stock*** 2 ml

Entionisiertes Wasser Rest auf 11

* O.M. Peptone, Amber Laboratories, JuneauWI

** N-Z Amine A *** Czapek's Mineral Stock hat die folgende Zusammensetzung: 100 g KCl; 100 g MgS04.7H20; 2 g FeS04.7H20; mit entionisiertem Wasser auf 11 ergänzt

Das beimpfte Produktionsmedium wird in einem 250 ml Weithals-Erlenmeyerkolben bei 30 °C 3 bis 5 Tage auf einer Schüttelmaschine mit einer Exzentrizität von 5,08 cm bei 250 UpM bebrütet. B. Tankfermentation

Zur Schaffung eines großen Volumens an Inokulat werden 10 ml bebrütetes vegetatives Medium, hergestellt wie in Abschnitt A beschrieben, verwendet, um 250 ml eines Wachstumsmediums der zweiten Stufe zu beimpfen, welches die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium hat Diese Medium der zweiten Stufe wird in einem 21-Weithals-Erlenmeyerkolben etwa 70 Stunden bei 30 °C auf einer Schüttelmaschine bebrütet, die bei einer Exzentrizität von 5,08 cm mit 250 UpM arbeitet.

Das so hergestellte, bebrütete Medium der zweiten Stufe (400 ml) wird zur Beimpfiing von 1001 sterilem Produktionsmedium verwendet, das wie in Abschnitt A beschrieben hergestellt worden ist. Das beimpfte Produktionsmedium wird in einem 165 l-Rührfermentationstank 3 bis 5 Tage bei einer Temperatur von 30 °C fermentieren gelassen. Durch geringen Luftstrom (0,12-0,25 Vol./Vol./min) und mäßiges Rühren (200-250 UpM) wird in dem Rührbehälter ein Spiegel an gelöstem Sauerstoff von über 30 % der Luftsättigung aufrechterhalten.

BfiispM2

Isolierung von A42125

Eine Gesamtfermentationsbrühe (921), enthaltend 3 % Filterhilfsmitel, wurde durch eineFilteipresse filtriert. Das Brühenfiltrat (74 1) wurde mit NaOH auf pH 7 eingestellt. Es wurde hochporöses Polymerharz (9,4 1) zugegeben. Das Gemisch wurde 45 Minuten lang gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde verworfen, und das Harz wurde dreimal mit Wasser (jeweils 10 1) und dreimal mit AcetonitrikWasser (3:17, jeweils 10 1) durch Resuspendieren, Rühren und Filtrieren gewaschen. Die Waschflüssigkeiten wurden verworfen. A42125 wurde eluiert, indem das Harz in AcetonitrikWasser (1:1,101) suspendiert sowie gerührt und filtriert wurde. Es wurden vier aufeinanderfolgende Eluierungen vorgenommen, und jede Eluatfraktion wurde unter Anwendung eines Micrococcus luteus-Scheibenplattentests geprüft. Die ersten zwei Eluate wurden vereinigt, im Vakuum zur Entfernung des Acetonitrils eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 94,9 g an rohem A42125 erhalten wurden. Das dritte Eluat ergab 20,8 g an rohem A42125.

Beispiel 3

Reinigung und Kristallisation von A42125

Die rohen A42125-Zubereitungen, die in Beispiel 2 erhalten wurden, wurden vereinigt (115,2 g) und in Wasser (3 1) aufgelöst. Die Lösung wurde zur Entfernung einer Fällung filtriert, und das Filtrat wurde auf eine Säule aufgebracht, die 3 1 Dowex 50 x 2 (NH4+), 100-200-Maschen-Harz enthielt. Die Säule wurde aufeinanderfolgend mit 5 Säulenvolumina Wasser und 0,1 N NH4OH gewaschen. Die Fraktionen aus der 2N NH4OH-Eluierung, welche die größten Mengen an A42125 enthielten, wurden vereinigt und auf ein Volumen von etwa 31 eingeengt. A42125 fiel aus und wurde durch Filtration abgetrennt. Die Fällung wurde in Methanol -17-

Nr. 389893 (300 ml) aufgelöst, und diese Lösung wurde zu Ether (61) zugesetzt, um das Λ42125 auszufällen. Diese Fällung wurde filtriert und getrocknet, wobei 16,6 g A42125 als ein amorphes Pulver erhalten wurden. Eine zweite Fällung wurde durch weiteres Einengen der wässerigen Lösung und Behandlung derselben in der gleichen Weise erhalten, wobei eine Ausbeute von 20,7 g an weniger reinem A42125 gewonnen wurde.

Das erste erhaltene A42125 (16,6 g) wurde in warmem Wasser (800 ml) aufgelöst Diese Lösung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen, und es kristallisierte A42125 aus. Die Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt und im Vakuum getrocknet, wobei 10,6 g und 2,3 g (zweite Ausbeute) an kristallinem A42125 (F. 149-150 °C) erhalten wurden.

Beispiel 4

Mit A42125 verstärkte Rinderfutterration

Eine ausgeglichene Futterration mit hohem Kömerfutteranteil, die als Endfutter für Rindvieh abgestimmt ist, wird nach dem folgenden Rezept hergestellt;

Bestandteil_%_Pfund/t kg/t

Mais, gelb 50,25 1005,0 455,8 Maiskolben 34,927 698,54 316,8 Alfalfamehl, dehydratisiert, 17 %ig 4,00 80,0 36,3 Sojabohnenölmehl, Lösungsmittelextrahiert 4.00 80,0 36,3 Harnstoff, Futterqualität 0,35 7,0 3,2 Zuckenohrmelasse 5,00 100,0 45,6 Dicalciumphosphat 0,65 13,0 5,9 Kochsalz 0,35 7,0 3,2 Calciumcarbonat 0,30 6,0 2,7 Spurenelementevorgemisch^ 0,03 0,6 0,3 Vitamin A + D3-Vorgemisch^ 0,07 1,4 0,6 Vitamin E-Vorgemisch^ 0,07 1,4 0,6 A42125 0,003 0,06 0,03 100,00 2000,0 1 Das Spurenelementevorgemisch enthält: 2,50 % Mangan als Mangan(H)-oxid, 0,07 % Jod als Kaliumiodid, 0,30 % Kobalt als Kobaltcarbonat, 0,50 % Kupfer als Kupferoxid und 20,00 % Zink als Zinksulfat ^ Jedes Pfund (454 g) des Vitamin A- und Vitamin D3-Vorgemisches enthält 2,000.000 USP-Einheiten Vitamin A und 225.750 USP-Einheiten Vitamin D3

Jedes Pfund (454 g) Vitamin E-Vorgemisch enthält 20.000 IE Vitamin E -18-

Claims (6)

1. Nr. 389893 PATENTANSPRÜCHE 1. Antibiotikum A42125, welches die folgenden Kennmerkmale hat: Zustand: Weiße Kristalle (aus Wasser) F.: 149-150° C UV: Keine Absorption IR (KBr): Zeigt Absorption bei den folgenden Wellenzahlen (cm'*): Breiter Peak, welcher 3423, 3413, 3409, 3403, 3398 und 3386 umfaßt; 2937,1720,1602,1453,1408,1379, 1290,1192,1120,1090,1064, 971,870, 830 und 802 Titration (80 %iges wässeriges Dimethylformamid): pKa-Werte 5,2,8,7 und 10,5 Molekulargewicht: 2032 (Felddesorptionsmassenspektroskopie) Empirische Formel: CioiHj^NjOgg Aminosäuren: Keine gefunden Löslichkeit: ln Wasser löslich; und Salze von A42125.
2. 2. Verfahren zur Erzeugung von Antibiotikum A42125, dadurch gekennzeichnet, daß man Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049, oder eine A42125-erzeugende Variante, Mutante oder Rekombinante davon, in einem assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthaltenden Kulturmedium unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen züchtet, bis Antibiotikum A42125 gebildet ist
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die zusätzliche Stufe der Abtrennung von A42125 aus dem Kulturmedium.
4. 4. Futterzusammensetzung zur Erhöhung des Futterverwertungsgrades in wiederkäuenden Tieren, enthaltend Tierfutter und eine wirksame Menge von Antibiotikum A42125 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.
5. 5. Eine biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049, oder einer A42125 erzeugenden Variante, Mutante oder Rekombinante davon.
6. 6. Verfahren zur Entwicklung genetischer Austauschsysteme in Methanogenen, dadurch gekennzeichnet, daß man gegen Antibiotikum A42125 von Anspruch 1 resistente Mutanten selektiert und diese Mutanten in genetischen Rekombinationsversuchen verwendet. -19-