HU197941B

HU197941B - Process for producing antibiotic a 42125

Info

Publication number: HU197941B
Application number: HU871616A
Authority: HU
Inventors: Robert L Hamill; Ralph E Kastner
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1987-04-10
Publication date: 1989-06-28
Also published as: PT84628A; US4870021A; ATA257387A; US4764510A; AT389893B; IE59699B1; DE3779946D1; KR920003666B1; DK178387D0; IE870942L; IL82119A0; EP0241285B1; CA1265462A; EG18187A; DK166024C; DE3779946T2; DK166024B; PH24808A; PT84628B; CN87102770A

Description

A találmány tárgya eljárás egy új, A42125 jelzésű antibiotikum fermentációs úton történő előállítására az új Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 törzs tenyésztésével. Az A42125 antibiotikum különlegesen érdekes tulajdonsága, hogy metántermelő mikroorganizmusokkal szemben hat. Minthogy az A42125 antibiotikum a bendőben uralkodó körülményeket modellező kísérletek során csökkentette a metántermelést, az A42125 antibiotikumnak fokoznia kell a kérődzők tápanyaghasznosítását és növekedését.

Az A42125 antibiotikumot a Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 süllyesztett, aerob fermentálásával állítjuk elő. A fermentléből az antibiotikumot gyantán történő megkötéssel vonjuk ki, majd a gyantáról poláris szerves oldószerrel oldjuk le. Az A42125 antibiotikum elválasztására és további tisztítására ismert eljárásokat, például ioncserés kromatográfiát, használunk.

A mellékelt ábrán bemutatjuk az A42125 antibiotikum kálium-bromidban felvett infravörös spektrumát.

Az állatgyógyászatnak állandó igénye van új antibiotikumok iránt. Az antibiotikumok alkalmazásának egyik célja az állatok növekedésének meggyorsítása. A növekedés gyorsítása elérhető a betegségek kivédésével és a tápanyaghasznosítás fokozásával. A kérődzőknél — a szarvasmarháknál és a juhoknál — különösen gazdasági érdek a növekedés gyorsítása.

A kérődzők bendőjében élő mikroorganizmusok metabolizálható termékekké, például propionáttá bontják le a szénhidrátokat. Néhány mikroorganizmus azonban e rendszerrel szemben hat. így például a metanogén vagy metántermelő mikroorganizmusok csökkentik a kérődzők tápanyaghasznosítását. Az A42125 antibiotikum különös előnye, hogy gátolja a metánképző mikroorganizmusokat, és ezáltal serkentheti a kérődzők növekedését.

Noha a kérődzők emésztőrendszerében a metánképző mikroorganizmusok (archaebacterium) nem kívánatosak, a földi környezet jelentős tényezői, minthogy ezek katalizálják a biohulladék lebontásának végső, metán keletkezését eredményező lépését. Minthogy a metán üzemanyagként alkalmazható, hozzájárulnak az energiaforrások kérdésének megoldásához. A metántermelés és a metánképzést fokozó eljárások ezért nagy jelentőséggel bírnak.

A metántermelés fokozásának egyik megközelítése a metanogén rendszer genetikai megváltoztatásának kifejlesztése. Ehhez a munkához elengedhetetlenek a szelektálható tulajdonságok, például antibiotikum rezisztencia megléte. Általában találunk a szelektált mutánsok között olyanokat, melyek rezisztensek arra az antibiotikumra, mely egyébként megöli az illető mikroorganizmust. Sajnos a metanogének rezisztensek legtöbb antibiotikumra. Az a tény, hogy az A42125 antibiotikum gátolja a metánképző mikroorga2 nizmusokat, alkalmas lehet szelektálható tulajdonságú mikroorganizmusok kinyerésére és ezáltal a metánképző rendszer genetikai megváltoztatására irányuló munka meggyorsítására.

Az A42125 antibiotikum a következő fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkezik: Állapota: fehér kristályos anyag (vízből kikristályosítva) ,

Op.: 149— 150°C UV: nincs elnyelés

IR(KBr): lásd az 1. ábrát; széles csúcs, mely magába foglalja a 3423, 3413, 3409, 3403, 3398, és 3386 cm^-1 csúcsokat; 2937, 1720, 1602, 1453, 1408, 1379, 1290, 1192, 1120, 1090, 1064, 971, 870, 830 és 802 cm

Titráció (80%-os vizes dimetil-formamidban); pKa 5,2, 8,7 és 10,5.

Molekulatömeg: 2032 (field-deszorpciós tömegspektrometira alapján).

Tapasztalati képlet: Ci₀₁Hi84N₂O_3gElemanalízis:

mért: C: 59,51, H: 9,05, N: 1,44, O: 30,08%.

Aminosav: nem kimutatott.

Oldhatóság: vízben oldható.

Bioautogáfia: 0,95n nátrium-szulfáttal és 0,05n nátrium-hidrogén-szulfát — vízzel impregnált Whatman No.l papíron 1,5% nátrium-kloridot tartalmazó 80%-os vizes etanollal futtatva és Mícrococcus luteus-szal detektálva, az A42125 antibiotikum Rf értéke: 0,46.

A titrációs értékek alapján úgy tűnik, hogy az A42125 antibiotikum egy karboxilcsoporttal, egy amin funkciós csoporttal, egy fenolos csoporttal rendelkezik, melyek sókat képezhetnek.

A sóképzést felhasználhatjuk az antibiotikum elválasztására, tisztítására, és felszabadítására. Az A42125 antibiotikumok savaddíciós sói ezért a találmány részét képezik. Különösen hasznosak a gyógyászati szempontból alkalmazható savaddíciós sók.

Savaddíciós sókhoz jutunk, ha az antibiotikumot a szokásos reakciókörülmények között szerves vagy szervetlen savakkal, például kénsavval, sósavval, foszforsavval, ecetsavval, borostyánkősavval, citromsavval, tejsávval, maleinsavval, fumársavval, palmitinsavval, kólsavval, pamoinsavval, mucinsavval, D-glutamin-savval, d.-kámforsavval, glutársavval, glikolsavval, ftálsavval, borkősavval, hangyasavval, laurilsavval, sztearinsavval, szalicilsavval, metán-szulfonsavval, benzol-szulfonsavval, szorbinsavval, pikrinsavval benzoesavval, cinnaminsavval, stb. reagáltatjuk.

Az állatgyógyászatban rendszerint nincs túl nagy jelentősége, hogy az antibiotikumot milyen formában alkalmazzuk. A legtöbb esetben a beadás után az állatban megváltozik az antibiotikum állapota, ezért általában mindegy, hogy milyen só formájában alkalmazzuk. Hogy milyen sót választunk, azt a gazdasági, kényelmi és toxikológiai szempontok határozzák meg.

-2197941

Az A42125 antibiotikumot termelő Nocardia aerocolonigenes törzset alkalmas táptalajon, süllyesztett tenyészetben tenyésztünk aerob körülmények között, amíg megfelelő mennyiségű antibiotikum termelődik. Az A42125 antibiotikumot ismert izolálási és tisztítási eljárásokkal nyerjük ki.

Az A42125 antibiotikumot termelő IMocardia aerocolonigenes törzset Brazíliából származó talajmintából izolálták. A N.aerocolonigenes törzset A42125 jelzéssel láttuk el.

A mikroorganizmus rendszertani meghatározását a Lilly Research Laboratories munkatársa, Frederick P. Mertz végezte el. Vizsgálatai alapján a mikroorganizmust a Nocardia aerocolonigenes (Shinubo és Kawato) [Pridham és Lyons 1970 (T.G.Pridham, „New names and new Combinations in the order Actinomycetales Buchanan 1917, USDATech-Bull. 1424:32, Agricultural Research service, USDA, Washington, D.C., 1970)] egyik új törzsének határozta meg. A rendszertani besorolás egyidőben végzett laboratóriumi összehasonlításokon és hasonló fajok irodalmi ismertetésével történő egybevetésen [M.Goodfellow és K.PSchaai, „Identification Methods fór Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus in F.A.Skinner és D.W.Lovelock ed., „Identification methods fór microbiologists 2. kiadás, Society fór Applied Bacteriology Technical Series No. 14., Academic Press Inc., New York, 1979, 261. old.; R.E. Gordon, S.KMishra és D.A.Barnett, „Somé bits and pieces of the genus Nocardia: N.carnea, N.vaccinii, N.transvalenis, N.orientalis and N.aerocolonigenes, J.Gen. Microbiol. 109; 69—78 (1978); S.J.Mishra, R.E.Gordon és D.A.Barnett, „Identification of Nocardie and Streptomycetes of medícal ímportance, J.Clin.Microbiol., 11(6), 728—736 (1980); H.Mordarska és M.Mordarski, „Chemotaxonomatic characters and classification of somé nocardioform bacteria”, J.Gen.Microbiology, 71,77—86 (1972); R.C.Pittenger és R.B.Bring ham, „Streptomyces orientalis, n.sp., the Source of vancomycin”, Antibiotics and Chemoterapy VI (11), 642—647 (1956); és S.A. Walesman, „The Actinomycetes, II. kötet, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961] alapszik.

A rendszertani meghatározásoknál az International Streptomyces Project (ISP) által a Streptomyces fajok jellemzésére ajánlott [E.B.Shirling és D.Gottlieb, „Methods fór characterization of Streptomyces species, Int. J.Syst. Bacteriol., 16(3): 313—340 (1966)] eljárásokat követtük néhány más vizsgálattal kiegészítve (D.J.Blazevic és G.M.Ederer, „Principles of Biochemical test in diagnostic microbiology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975).

A Nocardia fajok jellemzésére Gordon és munkatársai ajánlanak módszereket [R.E.Gordon, D.A.Barnett, J.E.Handerhan és C.H.Pang, „Nocardia coelica, Nocardia autotrophica, and the Nocardia strain, Int.J.Syst, Bacteriol., 24(1): 54—63 (1974)].

A rifampinnal és a lizozimmal szembeni rezisztenciát Gordon és Barnett módszerével határoztuk meg [R.E.Gordon és D.A.Barnett, „Resistance to rifampin and lysozyme of strains of somé species of Mycobacterium and Nocardia as a taxonomical tool, Int.J.Syst. Bacteriol., 27(3): 176—178, (1977)]'.

A színek megnevezését az ICSS-NBS Centroid Color Charts, standard sample No. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, LÍ.S.Department of Commerce, Washington, D.C.) és a Color Harmony Manual (4. kiadás, Color Standard Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) alapján végeztük.

A morfológiai vizsgálatokhoz fénymikroszkópot használtunk. A spórák felszíni rajzolatát scanning elektronmikroszkóppal (SEM) állapítottuk meg.

A melanoid-pigment termelését (kromogenitást) az ISP No.l (tripton/élesztőkivonat), ISP No.6 (pepton/élesztőkivonat/vas/ /agar), ISP No.7 (tirozinos agar) és módosított ISP No.7 (triozin nélküli) táptalajon határoztuk meg.

A teljes-sejt hidrolizáíumban a diaminopimelinsav (DAP) izomereket és a szénhidrátokat Becker és munkatársai [B.Becker, M.P.Lechevalier, R.E.Gordon és H.A.Lechevalier, „Rapid differentiation between Nocarfia and Streptomyces by paper chromatograpiiy of whole-cell hydrolysates”, Appl. Microbiol. 12: 421—423 (1964)] és Lechevalier ÍM.P.Lechevalier, „Identification of aerobic Actinomyces of clinica! ímportance, J.Lab. Clin.Med., 71: 934—944 (1968)] kromatográfiás módszerével határoztuk meg.

A mikolinsavak meghatározására Minnikin által leírt technikán alapuló módszert használtuk [D.E.Minnikin, I.G.Hutchinson és A.B.Caldícott, „Thin-Layer chromatography of mycolic ácid-containing bacteria”, J.Chrom. 188: 221—233 (1980)].

A keményítőhidrolízist ISP No.4 (szervetlen sók/keményítő/agar) táptalajon vizsgáltuk jóddal kimutatva a keményítő jelenlétét (I. Blazevic és Ederer, fentebb).

A nátrium-klorid-tűrés megállapításához kellő mennyiségű sót adtunk az ISP No.2 agaros táptalajhoz, és a lemezeket 30°C hőmérsékleten inkubáltuk 14 napon keresztül.

Az antibiotikumrezisztencia méréséhez antibiotikumot hordozó korongokat helyezünk a beoltott ISP No.2 agarlemezek felületére.

A foszfatáz és ureáz meghatározására Blazevic és Ederer (1. fentebb) által leírt módszereket alkalmaztuk. A proteináz aktivitás kimutatására a zselatinelfolyósítási vizsgálatot használtuk.

Az A42125 törzs komplex és szintetikus táptalajon általában egyaránt jól nő. Élesztő-dextrózos agar kivételével valamennyi táptalajon növeszt légmicéliumokat. A spóratömeg színe szürke-fehér. A Tresner és Bachus

-3197941 rendszerben a legközelebb álló szín a „djight gray (halványszürke) és a „h oyter white (osztriga fehér). A fonák oldal színe sárgásbarnától sárgás-fehérig változik. Halványbarna oldható pigment termelődik az ÍSP No.2 és az élesztő-dextrózos agar táptalajon. A kultúrák tulajdonságait az I. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

Az A42125 törzs, a Nocardia aerocolonigenes és a N. orientalis telepek jellemzői

Táptalaj	Tulajdonság	A42125	N.orientalis	N.aerocolonigenes
ISP-2		erőtelj es	erőteljes	erőteljes
	N	78.d.yBr	68.S.OY	72.d.OY
	F Lm	erőteljes : 5f e 1‘.gy. rBn	erőteljes:2ba pale yellow (fakósárga)	nincs (redőzött felület)
	Op	halvány- barna	nincs	nincs
ISP-3	N	. 1 JO	. 1 JO	eleg jo'
	F	89.p.Y.	89.p.Y.	89.p.Y.
	Lm	eleg jo:b oyster white	jo: b. oyster white	nincs
	op	nincs	nincs	nincs
ISP-4	N	jó	erotelj es	• / JO
	F	77.m.yBr	72.d.OY	90.gy.Y
	Lm	jo: d	erőteljes: d	nincs

lightgray light gray

	op	(halvány- (halványszür-
szürke) nincs	ke) nincs	nincs
ISP-5	N	erőtel·j es	erőtelj es	erőtelj es
	F	77.m. yBr	67.brill.0Y	88.d.Y
	Lm	erőtel-	erőteljes: 2ba	nincs (redőzött
		jes: b	pale yellow	felszín)
		oyster white	(fakó sárga)
	Op	nincs	nincs	nincs
Kalcium-	N	jó -	erőteljes	jó
malát	F	77.m.yBr	67.brill.0Y	88.d.Y
	Lm	jo:b oys-	erőteljes: 2ba.	nincs
		tér white	pale yellow
	Op	nincs	nincs	nincs

-4197941

1. táblázat (folyt.)

Táptalaj	Tulajdonság	A42125	N.orientál is	N.aerocolonigenes
Czapek táp-	N	jó	jó	erőteljes
agar	F	77.m.yBr	89.p.Y.	75.deep yBr
	Lm	jó: d. light gray	jó: i. oyster white	nincs (redőzött
	Op	nagyon halvány barna	nincs	halvány sárgás barna
Glükoz/asz-	N	jó	erőtelj es	jó
paragin	F	89.p.Y	67.brill.OY	88.d.Y
	Lm	gyenge: d liht gray	erotelj es: 2ba pale yellow	nincs
	Op	nincs	nincs	nincs

Csapvizes	N	jó elég jó	gyenge
agar	F	92.y.White 93. y Gray	92 y White
	Lm	elég jó: b gyenge: jb oyster oyster white white	nincs
	Op	nincs nincs	nincs

élesztő-	N	erőteljes	erőtelj es	erőteljes
dextrozis	F	78.d. yBr	68.S.OY	72.d.OY
agar	Lm	nincs (redőzött felület)	erőteljes: 2ba pale yellow	nincs (redőzött felület)
	Op	halvány barna	nincs	nincs

N: növekedés F: fonák felszín Lm: légmicélium Op: oldható pigment

Az A42125 törzs erőteljes szubsztrát-micélium és meglehetősen erős légmicélium növekedést mutat. Fénymikroszkóp alatt a léghifák pókhálószerű megjelenést mutatnak. Ezt a morfológiát a Bergey kézikönyv (R.E. Buchanan és N.E.Gibbons Eds., „Bergey’s manual of determinative bacteriology”, 8. kiadás, The Williams and WiHkins Co., Baltimore, 1974) a nem-streptonTycetes csoportba sorolja.

Az ISP No.4 táptalajon nőtt léghifákon scanning elektromikroszkóppal konídiumokat figyelhetünk meg. A spórák szabálytalan alakúak. A spórafelszín sima [T.G.Pridham, C.W.Hesseltine és R.C.Benedict, „A quide fór the classification of Streptomycetes according to selected groups”, Appl. Microbiol. 6: 52—79 (1975)].

A spóra alak megnyújtottól hengeresig változik, a spórák füzért alkotnak, a füzérben több mint 50 spóra található. A spórák mérete: 1,2—0,9X0,5—0,4 pm, átlagosan 1,1 X0,5 pm.

Süllyesztett, rázott tenyészetben a hifák fragmentálódnak.

Az A42125 tenyészet elbontja a kazeint, elasztint, guanint, hipoxantint és a tirozint, hidrolizálja a kálcium-malátot, DNS-t, eszkulint és a keményítőt: savat képez az arabinózból, céllobiózból, fruktózból, galaktózból, α-metil-D-glükozidból, glükózból, glicerinből, inozitolból, laktózból, maltózból, manni5

-5197941 tóiból, mannózból, melibiózból, raffinózból, ramnózból, trehalózból és a xilózból; hasznosítja az acetátot, benzoátot, citrátot, malátot, oxalátot, propionátot, piruvátot, szukcinátot és tartarátot.

Az A42125 tenyészet katalózt, foszfatázt, proteinázt, ureázt és melanoid pigmenteket termel, nem rezisztens a rifampinnel szemben, rezisztens viszont a lizozimmel, cefalo10 tinnel, gentamicinnel, linkomicinnel, penicillinnel és tobramicinnel szemben.

Az A42125 tenyészet 6%-os nátrium-klorid koncentrációt még elvisel; 15—37°C kö5 zötti hőmérsékleten nő, nem éli túl, ha 8 órán keresztül 50°C hőmérsékletnek tesszük ki; hidrolizálja a lefölözött tejet, a nitrátot nitritté redukálja. Ezeket a fiziológiai tulajdonságait a II. és III. táblázatban foglaljuk össze.

2. tábla'zat

Az A42125 törzs, és ezzel rokon Nocardia törzsek morfológiai es fiziológiai tulajdonságai

tulajdonság	A42125	N.aerocolonigenes	N.orientális	N.brasiliensis
leghifa	+	-	+	-
konidiu.n		-	+	-
savrnegkötes	-	-	-	-
mikolinsavak a sejtfalban	-	-	-	-
u reá z	+	+	+	+
lebontás
adenin	-	-	-	-
kazein	+	+	+	+
elasztin	+	-	-	+
hipoxantin	+	+		+
tirozin	+	+	+	+
xantin	-	-	-	-
rezisztenc ia
1izozim		-i-	-	+
ripamf in	-	-	+	+
Hídrólízis
kalcium-maiát	+		+	nv,
eszkulin	+	+	+	+
hippurat	-	-	+	-
keményítő	+	+	+	+
Hasznosítás
benzoát	+	-	-	-
citrát	+	+	+	+
mukát	-	-	-	-
szukcinat	+	+	+	+
ta rtarát	+	-	-	-
Nitrát redukció	-	-	+	+
Túlélés 50°C, 8 óra	-	-	+	-
Savképzés
adonitból	-	-		-
1-( + )-arab i nozból	+	+	+	-
céllobiozbúl	+	+	+	+
i-eritritolból	-	-	+	-
glükózból	+	+	+	+
glicerinből	+	+	+	+
inozitolból	+	+	+	+
a-laktozból	+		+	-
maitozból	+	+	+	-
D-mannitból	+	+	+	+
D-mannőzből	+	+	+	+
melezitozból	-	-	-	-

-6197941

12 2. táblázat (folytatás) _: A42125 törzs.es ezzel rokon Nocardia törzsek morfológiai es fiziológiai tulajdonságai

melibízbo'l	+	+	-	—
a-metil-glükozidból	+	-	+	-
raffinozból	+	+	-	-
ramnozból	+	+	+	—
szorbitból	-	-	-	—
trehalozból	+	+	+	+
xilozból	+	+	+	—
Növekedés
10°C	-	+	+	+
45°C	-	-	-
50°C	-	-	-	-

+ = a tulajdonság megvan = a tulajdonság hiányzik nv = nem vizsgált

III. TÁBLÁZAT

Az A42125 törzs további tulajdonságai foszfatáz 4* fölözött tej hidrolízis — melanoid-pigment-termelés + zselatinelfolyósítás +

NaCl tűrés 6% kataláz + leborltás:

kitin —

DNS (dezoxiribonukleinsav) + guanidin ,-|keratin — tesztoszteron — hasznosítás;

acetát + malát + oxalát + propionát + piruvát + savképzés;

dulcitból — etanolból — fruktózból + á-( + )-galaktózból -finulinból — szalicinből — szukrózból —

Az A42125 törzs tehát a következő meghatározó tulajdonságokkal rendelkezik: IV típusú sejtfal; A típusú cukorösszetétel a tel30 jes sejt hidrolizátumban; mikolinsavak hiánya. Ezek a kemotaXonómiai tulajdonságok, valamint a tenyészet általános jellemzői az A42125 törzset a Nocardia Trevisan 1889 nemzetségbe sorolják [V.B.D.Skerman, V.McGo35 wan és P.H.A.Sneath Eds., „Approved list of bacterial names, Int.J.Syst. Bacteriol., 30: 225—420 (1980)].

A Nocardia fajok közölt leírásait összehasonlítva az A42125 törzs tulajdonságaival, az alábbi fajokkal mutat hasonlóságot: Nocardia aerocolonigenes-’ Nocardia brasiliensis^’ —

Nocardia orientalis-’ -’ 50 növekedési hőmérséklettartomány 15—37°C

A teljes sejt falának hidrolizátumában a diamino-pimelinsav mezo-izomer. A teljes sejt hidrolizátumban arabinóz, galaktóz, mannóz és ribóz cukrok találhatók. Becker szerint (l. fent) a sejtfal-típus a IV típusba tartozik, a cukorösszetétel szerint A típusú (Lechevalier, 1. fent). Az A42125 törzs mikolinsavakat (LCN-A) nem termel. A sejtek Gram-pozitíven festődnek, de a savat nem kötik meg.

“rGoodfellow és Schaal (l. fentebb) — Gordon, Mishra és Barnett (1. fentebb) — Pittenger és Brigham (1. fentebb).

Ezeket a fajokat egy időben tenyésztettük az A42125 törzzsel. A közölt és a kapott adatokat összegyűjtöttük és kiértékeltük.

A hasonlósági mutatót Kurylowicz és munkatársai (W.Kurylowicz, A.Paszkiewicz, W.Woznicka, W.Kurzatkowki és T.Szulga, „Numerical taxonomy of Streptomycetes”, Polish Medical Publishers, Warsaw, 1975. 37. oldal) alapján számítottuk ki, a következő képlet segítségével:

Ssm =

Ns⁺+Ns~

Ns⁺-i-Ns~+Nd

X100 ahol Ns⁺ a pozitív hasonlóságok száma, Ns a negatív hasonlóságok száma és Nd az eltérések száma.

-7197941

Az Ssm kiszámításához felhasznált tulajdonságok fiziológiaiak és nem morfológiaiak vagy a tenyészetre vonatkozóak. A felhasznált tulajdonságok száma 44.

A hasonlósági mutatók:

Mikroorganizmus Ssm

A42125 100

N.aerocolonigenes 88

N.orientalis 70

N.brasiliensis 65

Minthogy a N.brasiliensis tenyészet kevés hasonlóságot mutat az A42125 tenyészetével és az Ssm értéke is alacsony, elhagytuk az összehasonlításból. 15

Az N.orientalis tenyészet hasonló az A42125 tenyészetéhez. Ez a hasonlóság különösen feltűnő az ISP 3. és 4. táptalajon. Amint azonban az alacsony Ssm érték tanúsítja, a fiziológiai tulajdonságokat illetően nem hasonlóak.

A N.aerocolonigenesnek nincsenek léghifái, ezért a tenyészetek összehasonlítását csak a növekedést, fonák oldal színét és az oldha14 tó pigmentet illetően tehettük meg. A N.aerocolonigenes első leírásában [E.B.Shirling és D.Gottlieb, „Cooperative description of type cultures of Streptomyces Ili, It.J.Syst.Bac5 teriol., 18(4): 279—392 (1968)] az szerepel, hogy az ISP No 5. táptalajon fehér léghifák jelennek meg. Ez a leírás megegyezik a mi összehasonlítási vizsgálatainkkal (1. I. táblázat, ISP No 5.). Az A42125 törzs és a N.aero10 colonigenes növekedése a fonák oldalának színe elfogadhatóan megegyezik. Ez a megegyezés különösen jól megnyilvánul a Czapek táptalajon és a glükózos-aszparaginos agaron.

Gordon (l. fent) a törzset N.aerocolonigenesnek határozta meg a léghifákon kívüli tulajdonságok alapján. Az A42125 törzs és a N.aerocolonigenes fiziológiai és kemotaxonómiai hasonlóságai messze ellensúlyozzák a 20 léghifák hiányából adódó különbözőségeket. Gordon a N.orientalis és a N.aerocolonigenes megkülönböztetésére három alapvető tulajdonságot használ fel, amiket a IV. táblázatban tüntettünk fel.

IV. táblázat

A42125 törzs, a N.aercolonigenes és N. orientálás megkülönböztető tulajdonságai tulajdonság N. orientálás N. aerocolinigenes A42125 eritritol + Ct-metil -glükozid + lizozin rezisztencia - +

A tárgyalt tulajdonságok szerint az A42125 törzs a N.aerocolonigeneshez áll a legközelebb.

Az A42125 törzs és a N.aerocolonigenes a szénforráshasznosítást illetően csak egy szénhidrát felhasználást illetően különböznek egymástól (növekedés és savtermelés alapján megállapítva).

Mishra (I. fentebb) Nocardia fajokra öszszeállított meghatározó kulcsát alkalmazva, az A42125 törzs közvetlenül kapcsolatba hozható a N.aerocolonigenes-szef. Ezek az összehasonlítások azt mutatják, hogy az A42125 törzs a tenyészet jellegzetességeit illetően korlátozottan, fiziológiai tulajdonságokra vonatkozólag jól megegyezik a N.aerocolonigenes tulajdoságaival. A leglényegesebb különbség az, hogy az A42125 törzsnek vannak léghifái. Minthogy a N.aerocolonigenesről leírták, hogy léghifákat fejleszt, ez a különbség nem olyan nagy ahhoz, hogy az A42125 törzset elkülönítsük ettől a rendszertani egységtől. Ezek szerint az A42125 törzset a Nocardia aerocolonigenes (Shinobu és Kawato) Pridham és Lyons 1970 egyik törzsének határoztuk meg. Minthogy a N.aerocolonigenes nem szerepel a „Bakteriumnevek elfogadott 8 jegyzéké-ben („Approved lists of bacterial names, 1. fent), így nem tekinthető egy ténylegesen közölt fajnak.

Hasonlóan más mikroorganizmusokhoz az A42125 antibiotikumot termelő Nocardia aero45 colonigenes NRRL 18049 is változékony. Ismert módon rekombinánsok, mutánsok és variánsok állíthatók elő vegy különíthetők el. így például mutánsokhoz juthatunk, ha a mikroorganizmust ismert fizikai és kémiai mutagén hatásoknak — ultraibolya besugárzás, Röntgen besugárzás, gamma besugárzás, N-metil-N’-nitro-N-nitro-guanidin kezelés — tesszük ki. A találmány oltalmi köre kiterjed mindazokra a természetes vagy mes55 terségesen előállított Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 változatokra és mutánsokra, melyek A42125 antibiotikumokat termelnek

Számos táptalaj bármelyikét használhat50 juk a Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 tenyésztésére. Gazdasági szempontokból, az optimális termelés és a termék könnyű elválasztása szempontjából azonban bizonyos táptalajok előnyösebbek. Például a nagyméretű fermentálásoknál a N.aerocolonigenes számára előnyös szénhidrátforrás a glükóz és a

-8197941 dextrin, bár más cukrok, cukor-polimerek, stb. is használhatók.

A N.aerocolonigenes előnyös nitrogéníorrása a szójaliszt és a kukoricalekvár, de más nitrogénforrás, például desztillációs maradékok, élesztőkivonat, húskivonat, stb. is alkalmazható.

A táptalajban felhasználható szervetlen tápsók a cink-, nátrium-, magnézium-, kalcium-, ammónium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrát-, stb. ionokat szolgáltató, vízoldékony sók.

Ugyancsak tartalmazza a táptalaj a mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges elengedhetetlen nyomelemeket. Ezek a nyomelemek a táptalaj komponenseiben szennyezésként általában a növekedéshez szükséges mennyiségben előfodulnak. A habzás általában nem szokott problémát okozni, de nagyméretű fermentálásnál, ha szükséges, a tenyészethez hozzáadhatunk kevés (pl. 0,2 ml/liter) habzásgátlót, például polipropilén-glikolt.

Nagy mennyiségű A42125 antibiotikum előállításához tank-fermentorban végzett, süllyesztett, aerob fermentációt előnyös végezni. Kis mennyiségű A42125 antibiotikumot rázott lombikos tenyészetben is készíthetünk. Amennyiben a nagy fermentort spórákkal oltjuk be, számolni kell a lag-fázissal, ezért előnyösebb vegetatív oltóanyagot használni az oltáshoz. A vegetatív oltóanyag előállításához kis téríogatú táptalajt spórákkal vagy micélium fragmensekkel oltunk be, így friss, aktívan növekvő tenyészethez jutunk. Ezt a vegetatív oltóanyagot visszük át a nagy fermentorba. A vegetatív oltóanyag tápközege megegyezik a nagy fermentoréval, ‘da lehet attól eltérő is.

A Nocardia aerocolonigenes 25—37°C hőmérséklettartományban termeli az A42125 antibiotikumot. Az antibiotikumtermeléshez optimális hőmérséklet a 30°C.

Amint az a süllyesztett tenyészeteknél szokásos, a fermentor aljáról steril levegőt nyomunk keresztül a táptalajon, miközben lapátos keverővei kevertetünk. Az eddig alkalmazott körülmények között a maximális oxigénfelvétel nem haladja túl a 0,2 mmólt literenként és percenként. Egy terelőkkel ellátott, 115 liter táptalajt tartalmazó, 160 literes fermentornál percenként 200—250 fordulatszámú keverés mellett percenként 0,125 térfogatnyi levegőt kell átvezetni, hogy az oldott oxigén elérje vagy meghaladja a levegőtelítettség 30%-át.

A fermentálás folyamán vett mintákban az A42125 antibiotikum termelését biológiai értékméréssel határozzuk meg az antibiotikumra érzékeny ismert mikroorganizmus segítségével. Az egyik ilyen teszt-mikroorganizmus segítségével. Az egyik ilyen teszt-mikroorganizmus a Micrococcus luteus. A biológiai értékmérésre legalkalmasabb a lyukasztott agarlemezes eljárást használni.

Az A42125 antibiotikumot a fermentációs iparban alkalmazott eljárásokkal nyerhetjük ki a tenyészléből. A termelt antibiotikum főként a fermentlé folyékony fázisában található. Az A42125 antibiotikum maximális kinyeréséhez ezért először a fermentlé folyékony fázisát elválasztjuk a micélium tömegétől. A fermentlészűrletet aztán tisztíthatjuk az antibiotikum elválasztása céljából. Erre számos eljárást alkalmazhatunk.

Az A42125 antibiotikum elválasztására előnyös eljárás, hogy a szűrlet kémhatását pH=7-re állítjuk be és alkalmas adszorbenst, például Diaion HP-20 gyantát adunk hozzá. A gyantát szűréssel elválasztjuk és megíeieiő oldószerrel, például acetonitril/víz, 1:1 eleggyel extraháljuk. Az extraktumból az oldószert csökkentett nyomáson elpárolva, hozzájutunk az A42125 antibiotikumhoz.

Az így kapott A42125 antibiotikumot ismert módszerekkel tovább tisztíthatjuk. Előnyös eljárás erre az ioncserélő gyantákon végzett kromatografálás.

Az A42125 antibiotikus elválasztást vékonyréteg kromatográfíával követjük nyomon. A szilikagélréteg alkalmas futtató rendszere az acetonitril/metanol/víz/ammónium-hidroxid, 4:2:2:1 összetételű elegy. Ebben a rendszerben az A42125 antibiotikum kb. R/=0,43 értékkel mozdul el. Az antibiotikum kimutatására használhatunk bioautográfiát, például Micrococcus luteust használva erre a célra, vagy más módszert például vanilines kénsavas előhivóreagenst.

Eljárhatunk úgy is, hogy A42125 antibiotikumforrásként a fermentlé, micéliumot is tartalmazó szárazanyag tartalmát használjuk fel extrakció és elválasztás nélkül, de előnyösen a víz eltávolítása után. így például az antibiotikum megtermelése után, a teljes fermentlevet beszárítjuk fagyasztva szárítással, dobszűréssel vagy azeotropos desztillálással és szárítással. A beszárított fermentlevet közvetlenül hozzákeverjük a takarmány premixhez.

Az A42125 antibiotikum állati és növényi patogén baktériumok növekedését gátolja. Az V. táblázatban összefoglaltuk a különféle baktériumoknál kapott minimális gátlási koncentrációkat (MIC). A MIC értéket a szokásos agar-hígitásos vizsgálattal határoztuk meg.

V. TÁBLÁZAT

Az A42125 antibakteriális aktivitása

Vizsgálati mikroorganizmus MIC (mcl/ml)

Staphylococcus aureus VI.1 1

Staphylococcus aureus V41 1

Staphylococcus aureus X400 1

Staphylococcus aureus S13E 1

Staphylococcus epidermidis Epi 1 1

Staphylococcus epidermidis 222 0,5

Streptococcus pyogenes C203 2

Streptococcus sp. group D X66 1

Streptococcus sp. group D 2041 4

Haemophilis influenzáé 76 8

-9197941

Az A42125 antibiotikus antimikrobális hatásának egyik fontos jellemzője az anaerob baktériumokkal szembeni MIC értékeket a VI. táblázatban foglaltuk össze. A MIC értékeket ez esetben is az agar-hígításos módszerrel határoztuk meg. A végpontokat 24 órás inkubálás után olvastuk le.

VI. TÁBLÁZAT

Anaerob baktériumok A42125 antibiotikummal szembeni érzékenysége

Anaerob baktériumok_MIC (mcg/rnl)

Clostridium difficile 2994 4

Clostridium perfringens 81 4

Clostridium speticum 1128 4

Eubacterium aeroíaciens 1235 4

Peptococcus asaccharolyticus 1302 64

Peptőcoccus prevoti 1281 4

Peptrostreptococcus anaerobius 1428 8

Peptrostreptococcus intermedius 1624 4

PRopionibacterium acnes 79 8

Bacteroides fragilis 111 >128

Bacteroides fragilis 1877 >128

Bacteriodes fragilis 1936B >128

Bacteriodes thetaiotaomicron 1438 128

Bacteroides melaninogennicus 1856/28 64

Bacteroides melaninogennicus 2736 128

Bacteroides vulgatis 1211 128

Bacteroides corrodens 1874 >128

Fusobacterium symbiosum 1470 >128

Fusobacterium necrophorum 6054A 73=0,5

Egy további fontos antimikrobiális tulajdonsága az A42125 antibiotikumnak, hogy gátolja a metánképző baktériumok növekedését. így például az A42125 antibiotikum milliliterenként 0,1 meg koncentrációnál gátolja a Methanococcus vanniellit; a vizsgálatban egy A42125 antibiotikum kristályt helyezünk a minimál táptalajon kinőtt 24 órás egyenletes tenyészetre, és a gátlást a harmadik napon mértük.

Az A42125 antibiotikum további fontos tulajdonsága, hogy javítja az állatok tápanyaghasznosítását. így például fokozza a kérődzők tápanyaghasznosítását.

A tápanyaghasznosítást a bendőben történő propionát termeléssel és a propíonátok koncentrációjával fejezhetjük ki. A bendőnedvet egy sebészeti úton elhelyezett fisztulán keresztül kaphatunk egy ökörből. Az ökröt az alábbi összetételű, magas rosttartalmú takarmányon tartottuk:

69,95% durván őrölt kukorica

10% őrölt kukoricacsutka

8% szójalisít (50% protein)

5% lucernaiiiszt

5% melasz

0,6% karbamid

0,5% dikálcium-foszfát

0,5% kalcium-karbonát

0,3% só

0,07% A és D₂ vitamin premix

0,05% E vitamin premix

0,03% nyomelem premix

A bendőnedvmintát négyszeres rétegű sajtborító vásznon szűrjük át, és a szűrletet vákuumedénybe gyűjtjük. A szűrőrétegen viszszamaradt szilárd részecskéket annyi fiziológiás pufferben szuszpendáljuk fel, mint amennyi az eredeti térfogata volt, majd a szuszpenziót újra leszűrjük. Az alkalmazott puffer összetétele a következő [Cheng és munkatársai, J.Dairy Sci., 38: 1225 (1955)]: 0,316 g dinátrium-hidrogén-foszfát

0,152 g kálium-dihidrogén-foszfát

2,260 g nátrium-hidrogén-karbonát

0,375 g kálium-klorid

0,375 g nátrium-klorid

0,112 g magnézium-szulfát

0,038 g kálcium-klorid

0,008 g vas (II)-szulfát-7-víz

0,004 g mangán(II)-szulfát

0,004 g cink-szulfát-7-víz

0,002 g réz-szulfát-5-víz

0,001 g kobalt klorid liter bízben oldva.

A két szürletet választótölcsérbe öntjük és állni hagyjuk, amíg a lebegő részecskék a folyadék tetején össze nem gyűlnek. A tiszta fázist elválasztjuk, ugyanazzal a pufferrel 1:1 arányban hígítjuk, és a kémhatást pH=7 értékre állítjuk be.

mg fent ismertetett takarmányra egy 25 milliliteres lombikban rámérünk 10 ml hígított bendőnedvet. Az edénybe bemérünk 5 mg szójabab proteint is. A vizsgálandó vegyületet négy párhuzamosban mérjük be az edényekbe. Ugyancsak beállítunk kétszer négy kontrolledényt is. Az egyik kontroll a nullidős, a másik a tizenhatórás. Valamennyi vizsgálati edényt 38°C hőmérsékleten 16 órán keresztül inkubáljuk. Az inkubációs idő végén megmérjük a kémhatást, és 2 ml 25°C-os metafoszforsavat adunk mindegyik edénybe, a keveréket hagyjuk leülepedni, és a felülúszó illékony zsírsavait gázkromatográfiával elemezzük.

A mintákban az acetát, propionát és a butirát tartalmat határozzuk meg. Az eredményeket statisztikusan hasonlítjuk össze a kontrollok értékeivel. A kezelések közül azokat tekintjük aktívaknak, melyeknél a propionát keletkezése lényegesen magasabb, mint a kontrolledényben. A VII. táblázatban összefoglaljuk az A42125 antibiotikummal kezelt edények és a kontrolijaik illékony-zsírsavkoncentrácíóinak arányait.

-10197941

VII. táblázat

Az A42125 antibiotikum hatása a kérődzők tápanyaghasznosítására (öt kísérlet)

dózis	mól%	mol%	nól%	összes zsírsav/kontroll
meg/ml	propionat	acetat	butirat	zsírsav: mmol/liter
20	1,283	0,914	0,608	0,921
5	1,237	0,877	1,019	0,988
5	0,959	0,992	1,075	0,921
1	1,122	1,015	0,795	1,237
5	1,118	0,915	0,867	1,041
1	1,105	0,881	1,111	0,997
5	1,778	0,896	0,654	0,921
1	1,458	0,915	0,823	0,858

A metánképzés gátlása ugyancsak hozzájárul a jobb tápanyaghasznosításhoz, minthogy az acetát hasznosítható energiává alakul és nem metánná, ami elvész. Ezt az aktivitást in vitro vizsgálatokban mérhetjük, melyek a bendőben lezajló folyamatokat utánozzák. A vizsgálatokat edényekben végzett folyamatos fermentációval végezzük, melyek a bendőben hosszú időtartam alatt lejátszódó folyamatokat modellezik. A légmentesen lezárható edények folyadék- és szilárdanyag-bevezetővel, mintavevő nyílással és gumiballonba vezető gázelvezetővel vannak ellátva. A gumiballonban fogjuk fel a fermentáció alatt keletkező gázokat. Az edények folyadéktartalmát 500 ml-en tartjuk egy folyadékgyűjtőedénybe vezető függőleges túlfolyócsővel. Az edényeket 38—40°C hőmérsékleten tartjuk. Mindegyik edényt lassan kevertetjük mágneses keverővei.

A kísérleteket azzal kezdjük, hogy a teszteknél alkalmazott táplálékkal etetett ökrökből a fisztulán át nyert szűrt bendőnedvből 500 ml-t mérünk az egyes edényekbe. Előzetesen 50 ml hígított metafoszforsavat töltünk a kifolyóedénybe, hogy a fermentációs edényből túlfolyó folyadékban ezzel leállítsuk a fermentációt. A fermentációs edényt lezárjuk, és hozzácsatlakoztatjuk a gázgyűjtőballont.

Mindegyik edénybe napi egy liter, alábbi összetételű puffért csepegtetünk folyamatosan:

nátrium-hidrogén-foszfát 2,2 g magnézium-klorid 0,036 g

nátrium-hidrogén-karbonát	5,9
kálium-klorid	0,34
nátrium-klorid	0,28
karbamid	1,0
kálcium-kiorid	0,024
víz	1 lit
pH=6,8—7,0

Mindegyik edénybe naponta kétszer 10 g 40 táplálékot adunk az adagolónyíláson keresztül. Az adagolások után a gázelvezetőt elzárjuk és az edényt széndioxiddal kiöblítjük. Naponta összegyűjtjük és analizáljuk az elfolyó folyadékot és az eltávozó gázt.

Általában az edényeket négy napig inkubáljuk, mielőtt a vizsgálandó vegyületet hozzáadnánk. Négynapos ekvilibrálás után megkezdjük az elmenő folyadék és gáz analízi50 sét, anélkül, hogy hozzáadnánk a kísérleti vegyületet. Az inkubálást addig folytatjuk, amíg az analitikai eredmények viszonylag állandóvá nem válnak. Ekkor megkezdjük a kezelt táplálék adagolását, és a fermentá55 ciót a kezelt táplálékkal folytatjuk 7 napon keresztül.

A vegyületet olyan mennyiségben adjuk a táplálékhoz, hogy az edényben lévő 500 ml folyadékban a vegyület koncentrációja a VIII. táblázatban megadott értékeket érje el. Legtöbb esetben két párhuzamos vizsgálatot futtatunk, és az egyes fermentációs edényeknél kapott eredményeket átlagoljuk. A VIII. táblázatban összefoglaljuk az A42125 antibio65 tikum metánképződést gátló aktivitását.

-11Γ97941

VIII. TÁBLÁZAT

Az A42125 antibiotikum hatása'a kérődzők metántermelésére (három kísérlet)

dózis mcg/ml	metán; mmól/nap
	23,0
5	2,3
	4,1
5	1,8
1	2,3
	7,2
5	0,3
1	0,8

Egyszeri A32125 antibiotikum adagolásánál megállapított LD₅₀ értékek egereknél:

LD₅₀ (intraperitoneális)=< 9,375 mg/kg

LD₅₀ (orális) 89 mg/kg

Az A42125 antibiotikumnak tipikus pozitív hatása van a propionátok növekedésére és ezáltal a tápanyaghasznosításra, ha naponként és testtömeg-kilogrammonként 0,05— 6,75 mg-ot adunk be szájon keresztül a kérődzőknek. Előnyös adag a naponkénti és kilogrammonkénti 0,2—3,5 mg.

Az antibiotikum adagolásának előnyös módja, hogy belekeverjük az állatok takarmányába, de beadhatjuk más formában is, például tablettaként, ivóiéként vagy kapszulában. Ezeket a dozírozási formákat az állatgyógyászatban ismert eljárásokkal készítjük el. Az egyes dózisegységek annyi hatóanyagot tartalmaznak, melyek az állatok napi adagjával egyszerű arányban állnak.

A találmány foglalkozik a fokozott tápanyaghasznosításhoz módosított takarmányösszetétellel, ahol a takarmány tonnánként

6—60 g A42125 antibiotikumot tartalmaz.

Az A42125 antibiotikumot adagolhatjuk az állatoknak szájon keresztül vagy parenterálisan. A legalkalmasabb beviteli mód, ha az A42125 antibiotikumot a táplálékhoz adjuk. Ehhez különféle állapotban lévő táplálékot alkalmazhatunk, lehet a szokásos száraztakarmány, folyékony vagy granulált eleség. Noha a legelőnyösebb az eleséghez történő keverés, más formában is beadhatjuk a hatóanyagot az állatoknak, például tabletta, ivóié alakjában vagy kapszulába zárva. Az egyes adagolási egységek annyi A42125 antibiotikumot tartalmaznak, melyek egyszerű arányban állnak a kezelendő állat napi adagjával.

A takarmányhoz adandó hatóanyag megformálása jól ismert módszerek szerint történik. Előnyös egy koncentrált hatóanyag-premixet alkalmazni. A tipikus premix kilogrammonként 2—400 g antibiotikumot tartalmaz. A premix lehet folyékony vagy szilárd készítmény.

Az eleség végső megformálása a beviendő hatóanyagmennyiségtől függ. Az A42125 antibiotikumot tartalmazó takarmány elkészítéséhez a szokásos eljárásokat — keverés, granulálás — használhatjuk.

A parenterális bevitelhez az A42125 antibiotikumot tartalmazó készítményt az állatgyógyászatban alkalmazott, ismert módszerekkel készíthetjük el. Az A42125 antibiotikumot tartalmazó injektálható készítmény lehet szuszpenzió vagy oldat. Az oldat elkészítésekor az antibiotikumot fiziológiai szempontokból alkalmazható közegben oldjuk. Ez a hordozóközeg megfelelő oldószerből, ha szükséges konzerváló anyagból — például benzilalkohol — és pufferből áll. Alkalmas oldószerek például a víz, az alkoholok, glikolok vagy a közömbös olajok, mint amilyenek a növényi olajok vagy erősen tisztított ásványi olajok.

Az injektálható szuszpenziók hordozóközege valamilyen, a vegyületet nem oldó folyékony anyag és adalékanyagok. Ilyen közeg lehet a víz vagy egy glikol, például polietilén-gl ikol.

Az adalékanyag valamilyen, fiziológiai szempontból alkalmazható szuszpendáló anyag, mint amilyenek a közeg sűrűségét növelő karboxi-metil-cellulóz, polivinil-pirrolidon, zselatin vagy az alginátok. Sok felületaktív anyag ugyancsak alkalmazható a vegyületek szuszpenzióban tartására. Alkalmas szuszpendáló anyag a lecitin, alkil-fenol, polietilén-oxid adduktok, naftalin-szulfonsavak, alkil-benzolszulfonátok és a polioxi-etilén-szorbitán-észterek.

Egyedi esetben sok olyan anyag felhasználható az injektálható szuszpenzíók elkészítésénél, melyek a folyékony közeg hidrofilitását, sűrűségét és felületi feszültségét befolyásolják. Szuszpendálószerként alkalmazhatunk például szilikon habzásgátlókat, glikolokat, szorbitot és cukrokat.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg.

1. példa

Az A42125 antibiotikum előállítását végezhetjük rázott lombikos fermentálással vagy tankíermentorban.

A) A rázott lombikos fermentáláshoz az alábbi összetételű ferde agart liofilizált pelletként vagy folyékony nitrogén alatt szuszpenzióként tartott Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 kultúrával oltjuk be:

burgonya dextrin 10 g élesztőkivonat 1 g enzimmel hidrolizált kazein* 2 g marhahúskivonat 1 g kobalt-klorid-6 víz 0,01 g agar 20 g ionmentes víz 1 liter *N-2 Amine A, Humko Sheffield Chemical Co., Lyndhurst, NJ., USA.

A kémhatást nátrium-hidroxid-oldattal pH=6,2—7,0 értékre állítjuk be.

A beoltott agarokat 30°C hőmérsékleten inkubáljuk 7 napon keresztül. A kifejlődött tenyészetet steril eszközzel kaparjuk le, összegyűjtve a spórákat és a micéliumfonadékot.

-12197941

Az összegyűjtött telepek egynegyedével oltunk be 50 ml alábbi összetételű vegetatív tápközeget:

glükóz 15 g tápióka dextrin* 20 g szója őrlemény 15 g kukoricalekvár 10 g élesztőkivonat 1 g kálcium-karbonát 2 g csapvíz 1 liter *Stadex 11, A.E.Staley Co., Decatur, IL., USA. Az oldat kémhatását nátrium-hidroxiddal pH=5,5—6,5 értékre állítjuk be.

A beoltott vegetatív táptalajt 250 ml-es

Erlenmeyer lombikban inkubáljuk 30°C hőmérsékleten, 5,08 cm kitérésű, 250 percenkénti fordulatszámú körkörös rázógépen, 72 órán keresztül.

1,25 ml vegetatív tenyészettel oltunk be 50 ml alábbi összetételű termelő táptalajt:

glükóz 25 g kukorica keményítő 10 g oldható húspepton* 10 g enzimmel hidrolizált kazein** 4 g melasz 5 g magnézium-szulfát-7 víz 0,5 g kálcium-karbonát 2,0 g

Czapek-féle sóoldat*** 2 ml ionmentes víz 1 liter

O.M.Peptone, Amber Laboratories, Juneau, Wi„ USA.

**N-2 Amine A.

***A Czapek sóoldat az alábbi összetételű:

liter ionmentes vízben 100 g kálium-klorid,

100 g magnézium-szulfát-7víz, g vas(II)-szulfát-7víz.

A beoltott termelő táptalajt széles szájú, 250 ml-es Erlenmeyer lombikban rázatjuk 5,08 cm kitérésű körkörös rázógépen 250 percenkénti fordulatszámmal 30°C hőmérsékleten, 5 napon keresztül.

B) A tankfermentáláshoz nagyobb menynyiségű oltóanyagra van szükség ezért 10 ml, az előzőekben ismertetett módon kinövesztett vegetatív tenyészettel beoltunk 250 ml második lépcsős növekedési táptalajt, melynek összetétele megegyezik a vegetatív táptalajéval. Ezt a második lépcsős tenyészetet kétliteres, széles szájú Erlenmeyer lombikban rázatjuk, 5,08 cm kitérésű körkörös rázógépen 250 percenkénti fordulatszámmal 30°C hőmérsékleten, 70 órán keresztül.

400 ml második lépcsős tenyészettel beoltunk 100 liter steril termelő táptalajt, melynek összetétele azonos a rázott lombikos fermentálás termelő táptalajéval. A fermentálást 165 literes tankfermentorban végezzük 30°C hőmérsékleten, 3—5 napon keresztül. Lassú levegőárammal—0,12—0,25 térf./ /térf/perc — és közepes kevertetéssel — percenként 200—250-es fordulatszám — az oldott oxigén koncentrációját a levegőtelítettségi érték 30%-ánál tartjuk.

2. példa

Az A42125 antibiotikum kinyeréséhez a teljes — 92 liter — fermentléhez hozzáadunk 3% Hyflo Supercelt és szűrőprésen leszűrjük. A 74 liter szürlet kémhatását nátrium-hidroxiddal pH=7 értékre állítjuk be. Hozzáadunk 9,4 1 Diaion HP-20 gyantát, a keveréket 45 percen keresztül kevertetjük és szűrjük. A szűrletet eldobjuk, a gyantát 3X10 liter vízben és 3X10 liter acetonitril/víz, 3:17 elegyben mossuk szuszpenzálással és szűréssel. A mosólevet eldobjuk. A gyantát acetonitril/víz, 1:1 elegyében szuszpendálva, kevertetve és szűrve, leoldjuk az A42125 antibiotikumot. Egymást követően négy elúciós műveletet végzünk, mindegyik eluátumot megvizsgálva. Papírkorongos teszttel, Micrococcus luteus teszt-organizmust használva. Az első két eluátumot egyesítjük, az acetonitrilt csökkentett nyomáson elpároljuk, és a vizes maradékot fagyasztva szárítjuk 94,9 g nyers A42125 antibiotikumhoz jutva. A harmadik eluátumból még 20,8 g nyers A42125 antibiotikumot kapunk.

3. példa

A 2. példában leírt módon nyert nyers A42125 preparátumokat egyesítjük, a 115,2 g anyagot 3 liter vízben oldjuk. Az oldatból szűréssel eltávolítjuk a csapadékot, és a szűrletet 3 liter Dowax 50X2 (NH⁺ formában lévő 0,075—0,15 mm szemcseméretű gyantából készült oszlopra visszük. Az oszlopot 5 oszloptérfogatnyi vízzel, majd 0,ln ammónium-hidroxiddal mossuk. A 2n ammónium-hidroxiddal végzett elúció legtöbb A42125 antibiotikumot tartalmazó frakcióit egyesítjük és 3 liter térfogatra töményítjük. Az A42125 antibiotikum kicsapódik és szűréssel eltávolítjuk. A csapadékot 300 ml metanolban oldjuk, az oldathoz 6 liter étert adva, az A42125 antibiotikumot kicsapjuk. A csapadékot kiszűrve és megszárítva 16,6 g A42125 antibiotikumot nyerünk amorf por alakjában. A vizes anyalúgot tovább bepárolva, és a kicsapódó anyagot az előzőek szerint feldolgozva, 20,7 g kevésbé tiszta A42125 antibiotikumhoz jutunk.

A 16,6 g első antibiotikum preparátumot 800 ml meleg vízben oldjuk, az oldatot hagyjuk szobahőmérsékleten állni egy éjszakán át. A kikristályosodó A42125 antibiotikumot szűréssel összegyűjtjük, csökkentett nyomáson szárítjuk, 10,6 g és 2,3 g (második generáció) kristályos A42125 antibiotikumhoz jutva.

Op.: 149—150°C.

4. példa

A szarvasmarhák számára módosított, kiegyensúlyozott, magas szemestakarmány tartalmú eleséget az alábbiak szerint állítjuk össze:

kukorica 50,25% kukoricatorzsa 34,927%

-13197941 lucernaliszt, dehidrált, 17%-os 4,00% szójaliszt, oldózerrel extrahált 4,00% karbamid, takarmány minőségű 0,35% melasz, cukornádból 5,00% dikálcium-foszfát 0,65%

NaCl 0,35% kálcium-karbonát 0,30% nyomelem premix¹ 0,03%

A-vitamin +D3-vitamin premix² 0,07% E-vitamin premix³ 0,07%

A42125 antibiotikum 0,003%

Ά nyomelem premix tartalmaz: 2,50% mangánt mangán(II)-oxid alakjában, 0,07% jódot kálium-jodid alakjában, 0,30% kobaltot kobalt-karbonát alakjában, 0,50% rezet réz10

-oxid alakjában és 20,00% cinket cink-szulfát alakjában.

²1 kg A-vitamin és D3-vitamin premix 4000000 USP egység A-vitamint és 451500 USP D3-vitamint tartalmaz.

³ 1 kg E-vitamin premix 40000 UI E-vitamint tartalmaz.

5. példa

100 mg A42125 antibiotikumot adunk 5 ml vízhez. Az elegyet az alábbi sókat képező savakkal addig savanyítjuk, míg az antibiotikum feloldódik. Ezután az oldatot liofilizálva a kívánt sót kapjuk. így az alábbi sókat állítjuk elő:

alkalmazott só	számított PH	képzett só	kitermelés (mg)	Op.: (°C)
2n sósav	2,0	hidroklorid	96	140-145
0,In sósav	3,6	hidroklorid	91	150-155
0,1n kénsav	1,6^X	szulfát	142	220
hig ecetsav	3,5	acetát	80	145-150
hig foszforsav	3,2	foszfát	92	140-145
citromsav	3,5	citrát	80	130-135
^X = 5 ni dioxant	adagoltunk	az antibiotikum oldására.

SZABADALMI IGÉNYPONT

Claims

Eljárás az A42125 jelű antibiotikum — — mely az alábbi tulajdonságokkal jellemzett: állapot: fehér kristályos anyag (vízből); op.: 149—150°C;

UV: nem abszorbeál;

IR (KBr): az 1. ábrán látható;

titráció (80%-os vizes dimetil-formamid): pK.3 5)2, 8,7 és 10,5;

molekulatömeg: 2032 (field deszorpciós tömegspektrometria alapján); tapasztalati képlet: C,₀₁H₁₈₄N₂O₃₈;

aminosav: nem található;

oldhatóság: vízoldékony;

— és savaddíciós sói előállítására, azzal jellemezve, hogy a Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 mikroorganizmust vagy annak A42125 antibiotikumot termelő változatát, vagy mutánsát asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett tenyészetben, aerob körülmények között tenyésztjük, és kívánt esetben a terméket ismert módon kinyerjük a fermentléből, és/vagy kívánt esetben savaddíciós sóvá alakítjuk.