JP5801344B2

JP5801344B2 - 反芻動物の反芻胃内のメタン生成抑制能を有する微生物及びその利用

Info

Publication number: JP5801344B2
Application number: JP2013097888A
Authority: JP
Inventors: リー・サンスク; キム・ソノ; グ・ミンジョン; チャ・ブヨン; ジュン・チャンデ
Original assignee: Doosan Feed and Livestock Co Ltd
Current assignee: Doosan Feed and Livestock Co Ltd
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-05-07
Also published as: JP2014217304A

Description

本発明は、還元的酢酸生成菌として、反芻動物の反芻胃内のメタン生成抑制能を有する微生物、これを含む微生物製剤、前記微生物製剤を含む畜産用飼料に関する。また、本発明は、還元的酢酸生成菌を動物に給与して反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制する方法に関する。

最近、大気中の温室ガスが増加するに伴い地球温暖化が加速化している。その結果、地球の平均気温と海水面が上昇し、砂漠化、日照り、洪水、台風等の気象異変が発生している。このような原因の一つがメタンであるが、メタンは二酸化炭素に比べて温室効果能力が約２４倍程度高く地球温暖化に及ぼす影響が非常に大きい。

一方、畜産業は、家畜を繁殖し育てて食肉を供給する農業の一分野で、人々に肉、革等を提供する国家の基幹産業である。しかし、地球温暖化問題等のような環境についての関心が増大するに伴い、畜産業を営む間に発生するメタン及びこの問題点についての憂慮が増大し、それに伴って畜舎で発生するメタンの原因中の大部分を占める反芻動物が食物を消化する過程で発生するメタンを減少させる方案について関心が高まっている。

反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制するための方法は、大きく二つに分けることができる。最初の方法は、メタン生成の前駆物質である水素の発生量を制御するために、水素を利用することができる硝酸塩や亜硝酸塩のような化合物を使用するものであるが、この場合、細胞に必要な酸素の供給が不足するようになるおそれがある。また別の方法は、メタン生成微生物に毒性を与える化合物であるイオノフォアや抗生物質等を使用するものであるが、長期間投与する場合にメタン生成微生物が適応してメタン生成抑制効果が減少するという問題点がある。また、前記の各方法は、化合物を利用するものであるため、このような物質が畜産物に残留する場合、安全性に問題がでることがあり得るし、反芻胃内の有用な微生物の成長を共に低下させるため飼料利用効率が低下し生産性が弱化する問題点がある。

反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制するための方法と係わって、大韓民国公開特許１０−２００６−００１９０６２号は、生姜、にらの抽出物及び複合リノール酸のうちいずれか一つ以上を含む反芻動物の反芻胃内のプロトゾアを選択的に減少させる飼料組成物について開示していて、大韓民国公開特許１０−２００７−００３３９６８号は、反芻胃の発酵に影響を与え反芻動物のエネルギー及びタンパク質維持を改善するための植物抽出物について開示しており、大韓民国公開特許１０−２０１１−０１１９３７０号は、濃厚飼料３５ないし４５重量％、チモシー３５ないし４５重量％、及び稲藁１０ないし３０重量％を含む反芻動物の温室ガス発生量を抑制するための飼料組成物及び反芻動物の飼育方法について開示している。それから、大韓民国公開特許特２００２−００４２８６６号は、多環式キノン及びイオノフォア化合物を含む反芻動物でのメタン生成を減少させるための組成物について開示していて、大韓民国公開特許１０−２０１１−００３６４７０号は、ニンニクを含む反芻動物のメタン生成低減用飼料について開示しており、大韓民国公開特許１０−２０１１−００３９５４０号は、動物起源の全ての脂肪を排除し飽和脂肪酸を含む植物性オイルの外因性摂取を制限する方法等を利用して搾乳用反芻動物によって生成されるメタンの量を減少させ調節するための方法について開示している。また、大韓民国公開特許特１９９５−７００４０６０号は、アントラキノン化合物を利用した反芻動物のメタン生成抑制方法について開示していて、日本公開特許特開２００３−８８３０１号は、乳酸菌、酵母及びオリゴ糖からなる群から一つ以上選択されることを特徴とする反芻動物用のメタン生成抑制用組成物について開示しており、日本公開特許特開２００２−２８１９１２号はユーカリ油、ペパーミント油、わさび油、シネオール、ヨウ素及びサイクロデキストリン包接化合物のうち一つ以上含むことを特徴とする反芻動物用のメタン生成抑制剤及び飼料組成物について開示していて、日本公開特許特開平１１−４６６９４号は、フマル酸を含むことを特徴とする反芻動物のメタン生成抑制剤及び飼料組成物について開示している。しかし、本発明のプロテイニフィルム（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍ）属の微生物を利用して反芻動物の反芻胃内でのメタン生成を抑制するための方法については、開示されていない。

そこで、本発明者らは、根本的に温室ガスの一種であるメタンが反芻動物の反芻胃内で生成されることを抑制して地球温暖化を防ぎ、飼料利用効率を増大させながらもメタン生成を抑制する過程で人体や動物に害を与えない微生物を開発しようと試みてきた。その結果、家畜の反芻胃液から分離した微生物から新規の微生物を発見し、前記微生物がメタン生成微生物と効果的に基質競争をして酢酸を生成することによりメタン生成を抑制することを確認し、本発明を完成することとなった。

本発明の一つの目的は、地球温暖化の原因中の一つであり飼料利用効率を減少させるメタンを根本的に除去したり減少させるために案出されたものであって、還元的酢酸生成菌として反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制する微生物であるプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１を提供することである。

本発明の他の一つの目的は、前記微生物を含むことを特徴とする反芻動物の反芻胃内のメタンの生成を抑制するための微生物製剤を提供することである。

本発明の他の一つの目的は、前記微生物製剤を含むことを特徴とする反芻動物の反芻胃内のメタンの生成を抑制するための畜産用飼料を提供することである。

本発明の他の一つの目的は、還元的酢酸生成菌を動物に給与して反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制する方法を提供することである。

本発明は、前記課題を解決するために、反芻動物の反芻胃内のメタン生成抑制能を有するプロテイニフィルム属の還元的酢酸生成菌及びその用途を提供する。

最も望ましくは、還元的酢酸生成菌として、本発明者が分離同定したプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１（寄託番号ＫＣＣＭ１１２１９Ｐ）を使用するのがよい。

また、本発明は、前記反芻胃内のメタン生成抑制能を有するプロテイニフィルム属の還元的酢酸生成菌の用途の一態様として、プロテイニフィルム属の還元的酢酸生成菌を含む反芻動物の反芻胃内のメタン生成抑制用の微生物製剤を提供する。

そして、他の態様として、前記還元的酢酸生成菌又はこれを含む微生物製剤を含む畜産用飼料を提供する。

また、他の態様として、前記還元的酢酸生成菌又はこれを含む微生物製剤を動物に給与して反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制する方法を提供する。この時、前記給与は、前記還元的酢酸生成菌が含まれた微生物製剤又は前記微生物製剤を含む畜産用飼料を反芻動物に提供する形態からなることができる。

このような前記反芻胃内のメタン生成抑制能を有するプロテイニフィルム属の還元的酢酸生成菌の多様な利用において、最も望ましくはプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１（寄託番号ＫＣＣＭ１１２１９Ｐ）を使用することができる。

本発明のプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１（寄託番号ＫＣＣＭ１１２１９Ｐ）は、在来ヤギの反芻胃から分離したものであるため、化学的な方法を使用してメタン生成を抑制するのに比べて人体や動物に害が少なく安全であり、還元的酢酸生成菌としてメタンを生成する原因を根本的に減少させるので、その効用価値は非常に大きいといえるものである。この他にも、前記微生物を利用して微生物製剤及び家畜用飼料等を製造するなら、付加的な経済的利得を得ることができる。

図1は、還元的酢酸生成菌の特定遺伝子であるＦＴＨＦＳプライマーを利用してアガロースゲル電気泳動の結果を示した写真である。図２は、本発明で選別した還元的酢酸生成菌であるＤＡ０２、ＧＡ０１、ＧＡ０２、及びＧＡ０３の系統学的所属を確認するための系統樹を示したものである。図３及び図４は、それぞれｉｎｖｉｔｒｏ発酵上で澱粉基質の場合とカゼイン基質の場合にアセト酸生成を示したグラフである［Ｅ．ｌｉｍｏｓｕｍ−ＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｍｏｓｕｍＡＴＣＣ４８６（対照群）、ＡＹ４２２６（ＤＡ０２−ＰｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓＴＢ１０７（９９％））、ＡＹ４２２６（ＧＡ０１−ＰｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓＴＢ１０７（９８％））、ＡＦ７４２２２６（ＧＡ０２−ＡｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓｃｒｏｔｏｎａｔｏｘｉｄａｎｓＢ１１−２（９９％））、ＡＹ４２２６（ＧＡ０３−ＰｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓＴＢ１０７（９９％））］。図５は、澱粉を基質として使用した場合の還元的酢酸生成菌であるＤＡ０２、ＧＡ０１、ＧＡ０２及びＧＡ０３の揮発性脂肪酸の含量を示したものである。図６は、カゼインを基質として使用した場合の還元的酢酸生成菌であるＤＡ０２、ＧＡ０１、ＧＡ０２及びＧＡ０３の揮発性脂肪酸の含量を示したものである。図７は、還元的酢酸生成菌であるＧＡ０３を利用してｉｎｖｉｔｒｏ分析方法によるメタン発生量の低減効果を確認したグラフである。図８は、澱粉を基質として使用した場合の還元的酢酸生成菌であるＤＡ０２、ＧＡ０１、ＧＡ０２及びＧＡ０３のメタン生成抑制程度を示したものである。図９は、カゼインを基質として使用した場合の還元的酢酸生成菌であるＤＡ０２、ＧＡ０１、ＧＡ０２及びＧＡ０３のメタン生成抑制程度を示したものである。図１０は、還元的酢酸生成菌ＧＡ３及び呼吸チャンバを活用してのｉｎｖｉｖｏ分析方法によるメタン生成量測定結果のグラフである。図１１は、本発明の一実施例で使用した国立畜産科学院の呼吸チャンバの写真である。

本発明で使用される用語についての定義は、以下の通りである。

本明細書で使用される「動物」又は「実験動物」は、人間以外の任意の哺乳類動物として、特に「反芻動物」を意味する。反芻動物（ｒｕｍｉｎａｎｔｓ）は、哺乳類ウシ科に属する動物で、噛み直し動物ともいう。ラクダ科・シカ科・キリン科・ウシ科の動物でみることができる。このような動物は、第１胃〜第４胃までの複胃を有し、ブタ等の単胃動物とは非常に異なる消化構造を有するが、このような複数個の胃を反芻胃という。反芻胃は、食べた食物を入れておく大きな第１胃（こぶ胃：ｒｕｍｅｎ）と蜂の巣のような模様の壁がある第２胃（蜂巣胃：ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）、粘膜がしわ模様になった第３胃（重弁胃：ｏｍａｓｕｍ）、胃腺が分布した第４胃（皺胃：ａｂｏｍａｓｕｍ）等の４室からなっている。前記動物は、胚芽、胎児、新生児及び成人を含む全ての年齢の動物を含む。

「飼料組成物（ｆｅｅｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、動物飼料として使用するのに適切で、多様な天然又は非天然基礎（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｂａｓｅ）又は加工されていない物質（ｒａｗｍａｔｅｒｉａｌｓ）又はこれを添加物（ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）と混合した組成物を意味する。このような飼料は、目標動物（ｔａｒｇｅｔａｎｉｍａｌ）の特定な必要条件（ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）に応じて剤形化することができる。商業的に製造された混合飼料に使用されている主な成分は、ふすま（ｗｈｅａｔｂｒａｎ）、米ぬか（ｒｉｃｅｂｒａｎ）、とうもろこし粉（ｃｏｒｎｍｅａｌ）、麦（ｂａｒｌｅｙ）、小麦（ｗｈｅａｔ）、ライ麦（ｒｙｅ）及び燕麦（ｏａｔ）のような穀物（ｃｅｒｅａｌｇｒａｉｎｓ）、大豆粕（ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ）、アルファルファ粉（ａｌｆａｌｆａｍｅａｌ）、小麦粉末（ｗｈｅａｔｐｏｗｄｅｒ）等を一般的に含む。商業的な化合物餌（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｆｅｅｄ）は、本発明がこのような側面で特に限定されなくても、消化しやすい全体栄養素（ｄｉｇｅｓｔｉｂｌｅｔｏｔａｌｎｕｔｒｉｅｎｔｓ）を一般的に含むことができる。半固体（ｓｅｍｉ−ｓｏｌｉｄ）だけでなく液体、固体の動物飼料組成物は、本発明の範囲内に含まれる。このような組成物は、つぶした穀物類型（ｍｅａｌｔｙｐｅ）、ペレット（ｐｅｌｌｅｔｓ）又はクランブル（ｃｒｕｍｂｌｅｓ）として一般的に製造されることができる。実際に、家畜に、本発明のこのようなもののような混合飼料のコンビネーション、及びサイレージ（ｓｉｌａｇｅ）又は干し草等を一般的に食べさせることができる。一般的に混合動物飼料は、０．３ないし１０ｋｇ／動物／一日の範囲内の量で供給される。本分野の熟練者は、動物の類型及びこれを保存する環境を考慮して、混合動物飼料に含まれることができるこのような成分の適切な量を決定することができる。

「飼料補充物（ｆｅｅｄｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）」は、予備配合物又は補充物が本発明に合うように、補充された飼料を形成するための動物の餌、又は量（ｒａｔｉｏｎ）を添加することができる、有効成分（ａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）を含む濃縮予備配合添加剤（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄａｄｄｉｔｉｖｅｐｒｅｍｉｘ）を示す。用語「動物飼料予備配合物（ａｎｉｍａｌｆｅｅｄｐｒｅｍｉｘ）」、「動物飼料補充物」及び「動物飼料添加物（ａｎｉｍａｌｆｅｅｄａｄｄｉｔｉｖｅ）」は、類似するか同一の意味を有するものと一般的にみなされ、一般的に入替えて使用することができるものとみなされる。一般的に、本発明の動物飼料補充物は、粉末（ｐｏｗｄｅｒ）又は圧縮型（ｃｏｍｐａｃｔｅｄ）又は顆粒型固体（ｇｒａｎｕｌａｔｅｄｓｏｌｉｄ）の形態である。特に、家畜に配給量（ｒａｔｉｏｎ）にこれを直接的に添加、例えばいわゆる配給量に肥料を振りかけて（ｔｏｐ−ｄｒｅｓｓ）動物飼料補充物を一般的に食べされたり、又はこれを混合動物飼料（ｃｏｍｐｏｕｎｄｅｄａｎｉｍａｌｆｅｅｄｓ）又はリックブロック（ｌｉｃｋｂｌｏｃｋｓ）のような生産物の製造（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）又は物質（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）に使用されることができる。

「胃腸のメタン生成減少（ｒｅｄｕｃｉｎｇｇａｓｔｒｏ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）」は、胃腸管（ｇａｓｔｒｏ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔ）でのメタンガス生産の減少を示すものである。反芻動物の反芻胃及び内臓（ｇｕｔ）での発酵は、いわゆるメタン生成菌によるメタンガスを生産する。本発明は、メタン排出（ｍｅｔｈａｎｅｅｘｃｒｅｔｉｏｎ）されるものを減少させることを目標とする。動物によるメタン排出を評価することは、本分野の熟練者の技量（ｓｋｉｌｌ）及び知識内である。反芻胃及び内臓でのメタン生産は、健康な動物で一般的に発生する過程（ｐｒｏｃｅｓｓ）であり、メタン生成反応を減少させることは、反芻動物の健康又はウェルビーイング（ｗｅｌｌｂｅｉｎｇ）な一般的状態を向上又は弱化させない。メタン形成の減少は、栄養素使用の動物の効率性を増加させ、動物の成長及び／又は生産性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を増進させることができる。

「基質」は、酵素の作用によって他の化合物に転換されるか転換されるようになっている任意の物質又は化合物を指称する。前記用語は、単一化合物だけでなく溶剤、混合物及び最小限一つの基質を含む他の材料のような化合物の組合及びこれらの誘導体を包括する。さらに、用語「基質」はバイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）誘導された砂糖のような出発材料として使用するに適する炭素供給源を提供する化合物だけでなく、本明細書に記載した代謝操作微生物と連関した経路で使用される中間生成物と最終代謝産物を包括する。微生物によって通常的に使用されるのに適した炭素基質を包括する。

「機能」及び「機能性」等は、生物学的又は酵素的機能を意味する。

「増加した」又は「増加」とは、非変型微生物、又は相異に変形した微生物のような対照微生物に比べて与えられた産物又は分子（例えば、汎用化学物質、バイオ燃料又はこれらの中間体産物）をさらに多量に生産することができる一つ以上の組換え微生物の能力を意味する。

「〜から得た」又は「〜由来の」とは、例えば、所定有機体、典型的に微生物のような特定供給源から単離されるか、これから誘導されたポリヌクレオチド抽出物又はポリペプチド抽出物等のようなサンプルを意味する。また、ポリヌクレオチド又はポリペプチド序列が特定有機体又は微生物から単離されるか、これから誘導された状況も意味することができる。

「外来」は、一般的に野生型細胞又は有機体で自然的に発生するものではなく、典型的に分子生物学技術、すなわち、組換え微生物を生成するための工学的処理により細胞に導入されたポリヌクレオチド序列又はポリペプチドを意味する。

「組換え」微生物は、典型的に、例えばプラスミド又はベクターに一つ以上の外来ヌクレオチド序列を含む。

「約」というのは、参照量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量又は長さについて、３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％程度で変わる量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量又は長さを意味する。

本明細書を通じて、文脈で別に必要でなければ、「含む」及び「含む〜」という言葉は、提示された段階又は元素、又は段階又は元素らの群を含むが、任意の他の段階又は元素、又は段階又は元素らの群が排除されないことを内包するものと理解しなければならない。

本発明で使用される全ての技術用語は、別に定義されない以上、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解するところと同じ意味で使用される。また本明細書には望ましい方法や資料が記載されるが、これと類似するか同等なものも本発明の範疇に含まれる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、本発明に導入される。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明者らは、乳牛及び在来ヤギの反芻胃液を収集して培養した後、還元的酢酸生成菌を分離及び確認した結果、新しい菌株を発見した。

本発明は、このような新規の還元的酢酸生成菌株及びその用途に関するもので、反芻動物の反芻胃内のメタン生成抑制能を有するプロテイニフィルム（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍ）属微生物及びその多様な利用に関するものである。

本発明で使用される「反芻動物」は、哺乳類ウシ科に属する動物で、消化形態上一度飲込んだ餌を再び吐き出して噛む特性を持った動物として噛み直し動物とも呼ばれ、ラクダ科、マメジカ科、シカ科、キリン科、ウシ科等の動物がこれに該当する。本発明の反芻動物は、ラクダ科、マメジカ科、シカ科、キリン科、ウシ科に属するウシ、ヤギ、牡ウシ、スイギュウ、ヤギュウ、シカ、ラクダ、ヒツジ等の反芻胃がある動物であればこれに制限されず、望ましくはウシである。

反芻胃には、細菌、原生動物及び真菌等の嫌気性微生物が多数棲息しているが、これらは反芻動物が摂取した飼料を発酵過程を経て消化させる作用をする。

反芻動物が、炭水化物が含まれた飼料を摂取する場合、反芻胃内の微生物によって発酵及び分解され最終分解産物として揮発性脂肪酸、水素、二酸化炭素、アンモニア等が生成されるが、このうち揮発性脂肪酸やアンモニアは、反芻動物又は反芻胃内の微生物が利用するので大きく問題にならない。しかし、二酸化炭素及び水素は、反芻動物内のメタン生成微生物によってメタンに生成されたり、競争的に酢酸生成微生物によって酢酸を生成したりするようになり、特にメタンが生成される場合には、反芻動物の体内で吸収されることができずに１時間に１５ないし２０回程度大気に放出されるので問題になっている。

反芻動物の反芻胃で生成されるメタンは、酸素がない嫌気状態でのみ発生するが、全体の発生するメタンの原因中の約１５％を占め、地球温暖化現象を引き起こす主要物質である。また、反芻動物が飼料から摂取した総エネルギーの３ないし１２％がメタンの生成で消失する結果をもたらすため、飼料利用効率とも深い関連がある。

このように、反芻動物の反芻胃内でメタンが生成される場合、地球温暖化による環境問題が発生し、飼料利用効率が減少するので、この生成を抑制するためのさまざまな方案が研究されている実情である。

本発明は、一観点からは、反芻動物の反芻胃内のメタン生成抑制能を有するプロテイニフィルム属微生物（菌株）である還元的酢酸生成菌に関するものである。

「還元的酢酸生成菌」は、反芻動物が、炭水化物が含まれた飼料を摂取する場合、反芻胃内の微生物によって発酵及び分解された後の最終分解産物のうち水素又は二酸化炭素を利用して酢酸を生成する菌をいう。

反芻動物が炭水化物を含む飼料を摂取する場合、メタン生成微生物によって反芻胃でメタンが生成されるが、これは地球温暖化を起こす主犯中の一つであり、飼料利用効率を落とす原因中の一つであるため、反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制することが重要である。本発明の還元的酢酸生成菌は、メタン生成微生物と効果的に基質競争をして酢酸を生成するため、反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制するのに効果的である。

本発明の還元的酢酸生成菌は、反芻胃内のメタン生成抑制能を有するプロテイニフィルム属微生物として、最も望ましくはプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）菌株である。

本発明の一実施例では、在来ヤギの反芻胃から分離した新規のプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）菌株をプロテイニフィルム・アセタティゲネスＳＲＯＤ１と命名した。

具体的には、本発明者らは乳牛及び在来ヤギの反芻胃液を収集して培養した後、還元的酢酸生成菌を分離及び確認した結果、新しい菌株を発見することになり、そのうちメタン除去能が優秀な菌株であるＧＡ３をプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１と命名し、これを２０１１年１１月９日付けで韓国微生物保存センターに寄託番号ＫＣＣＭ１１２１９Ｐにて寄託した。

一つの具体的実施として、ＡＣ−Ｂ１培地にそれぞれ異なる菌株を接種して培養した後、還元的酢酸生成遺伝子を利用して還元的酢酸生成菌を特異的に検出した結果、総４種の菌株であるＤＡ０２、ＧＡ０１、ＧＡ０２及びＧＡ０３が選別された。また、前記で選別された菌株の発酵特性を詳察した結果、選別された菌株全てで多量の酢酸が検出され、特にＧＡ０３であるプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１（寄託番号ＫＣＣＭ１１２１９Ｐ）で最も多量の酢酸が検出された。

他の一つの具体的実施として、前記で選別された４種の菌株を利用してｉｎｖｉｔｒｏ発酵システムで揮発性脂肪酸の含量を詳察した結果、澱粉及びカゼインを基質として使用した群の全てでアセテートの含量が最も高く現われたが、対照群とは異なりラクテートは検出されなかった。

また、他の一つの具体的実施として、前記で選別された４種の菌株を利用してメタン生成抑制能を詳察した結果、澱粉を基質として使用した場合にメタン生成抑制能が優秀に現われ、特にＧＡ０３であるプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１のメタン生成抑制程度が優秀であった。

したがって、本発明のプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１は、反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制するのに、今まで報告されたいかなる他の微生物に比べても効果的に使用可能であり、特に炭水化物を根源としてメタンが生成されることを抑制するのに効果的に使用することができる。

本発明は、他の観点からは、前記還元的酢酸生成菌を含むメタン生成抑制用微生物製剤に関するものである。

前記還元的酢酸生成菌は、プロテイニフィルム属微生物で、最も望ましくはプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１である。

本発明において、前記微生物製剤は、本発明者によって新たに発見された前記プロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１の単一種で使用されることができ、微生物が２種以上混合された形態でも使用されることができる。微生物が２種以上混合された場合は、プロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１の他にメタン生成抑制能が公知となった微生物からなる群から一つ以上選択された微生物を含むことができるが、必ずしもこれに制限されるものではない。

本発明において、前記微生物製剤は、粉末又は液状の形態であることができる。

前記粉末形態の微生物製剤の場合、前記微生物の特徴上嫌気状態で培養しなければならず、担体に付着させた後、水分含量が０．１ないし１０重量％になるように乾燥し粉碎して製品化する。水分含量が１０重量％を超過する場合、微生物の再活性化効率が落ちたりメタン生成抑制効果の増加がわずかで経済的に望ましくない。本発明の菌株は、嫌気微生物であり、粉末形態や液状形態に微生物製剤を生産時、嫌気状態条件で製造生産しなくてはならない。

前記担体としては、粉末状の粘土類、活性炭、コークス、製鉄所廃スラグ、火山灰及び燃焼灰から構成される群から一つ以上選択されたものが使用されることができ、前記粘土類としてはゼオライト、バーミキュライト、珪藻土、カオリン、甕器土、長石、及び滑石からなる群から一つ以上選択されたものを使用することができるが、必ずしもこれに制限されるものではない。

前記粉末形態の微生物製剤には、付形剤が追加されることができる。前記付形剤の場合、アミノ酸、ビタミンＣ、ビタミンＥ、キトサン及びブドウ糖を単独で使用するか２種以上混合して使用することができるが、必ずしもこれに制限されるものではない。

前記液状形態の微生物製剤の場合、前記微生物の培養液を混合するか希薄し、微生物を安定化させるためにブドウ糖やグリセリンを混合した後、最終濃度が１ないし１０重量％、望ましくは１ないし５重量％になるように製造する。微生物が１重量％未満の場合には微生物製剤のメタン除去効果が微々たることがあり得、１０重量％を超過する場合にはメタン生成抑制効果の増加が微々として経済的に望ましくない。液状形態で微生物製剤を使用する場合、粉末製品に比べて活性が早く取扱いが簡便な長所がある。

本発明は、また他の観点からは、前記メタン生成抑制用微生物製剤を含むことを特徴とする畜産用飼料又は飼料補充物に関するものである。

前記飼料は、必ずしもこれに制限されるものではないが、とうもろこし、小麦、大豆ミール、豆、米等のいずれか一つ又はこれらからなった群から２以上を選択した混合物を粉碎して得られる粉砕物と、これらを加工する過程で得られる米ぬか、ふすま、麦ぬかのような加工副産物が使用されることができる。

前記畜産用飼料には、前記メタン生成抑制用微生物製剤が飼料の総重量に対して０．３ないし０．５重量％含むことを特徴とし、望ましくは０．４重量％である。前記微生物製剤が０．３重量％未満含まれる場合、畜産用飼料のメタン生成抑制効能が微々たることがあり得、０．５重量％を超過する場合、効果がそれ以下である場合とほとんど同一であり効果に比べ非経済的であるためである。

前記畜産用飼料は、必ずしもこれに制限されるものではないが、ラクダ科、マメジカ科、シカ科、キリン科、ウシ科等の反芻胃がある動物に提供するためのものであり、望ましくはウシに提供するためのものである。

本発明の畜産用飼料組成物は、本分野で一般的に使用されるいかなる追加的な飼料添加物（ｆｅｅｄａｄｄｉｔｉｖｅ）をも含むことができる。当業者によって公知になっているように、「飼料添加物」は飼料の質（ｑｕａｌｉｔｙ）及び動物起源（ａｎｉｍａｌｏｒｉｇｉｎ）からの食物の質を増進させたり、例えば飼料物質（ｆｅｅｄｍａｔｅｒｉａｌｓ）の増進した消化性（ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する動物の遂行力（ａｎｉｍａｌｓ’ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を増進させるための目的で動物栄養処理過程（ａｎｉｍａｌｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）に使用された生産物を示す。非制限的に、保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ）、酸化防止剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ）、安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｓｉｎｇａｇｅｎｔｓ）、酸度調節剤（ａｃｉｄｉｔｙｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）及びサイレージ添加剤（ｓｉｌａｇｅａｄｄｉｔｉｖｅｓ）のような技術的な添加剤（ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌａｄｄｉｔｉｖｅｓ）；感覚作用と係わる添加剤（ｓｅｎｓｏｒｙａｄｄｉｔｉｖｅｓ）特に香味剤（ｆｌａｖｏｕｒｓ）及び着色剤（ｃｏｌｏｒａｎｔｓ）；ビタミン、アミノ酸及び微量元素（ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓ）のような（追加の）栄養上の添加剤；及び消化率増進剤及び腸内有益菌安定剤（ｇｕｔｆｌｏｒａｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）のような（追加的な）畜産添加剤を含むことができる。

本発明の動物飼料補充物は、本発明の範囲から外れないいかなる追加的な構成要素（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）をも含むことができる。これは、一般的に目的とする生産物形態（ｐｒｏｄｕｃｔｆｏｒｍ）を製造するのに必要な公知の付形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含むことができ、これは飼料の質（ｑｕａｌｉｔｙ）を改善及び／又は補充物を消費する動物の実行（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を改善することを目標とする添加剤を追加的に含むことができる。このような付形剤の適切な例は、担体（ｃａｒｒｉｅｒ）又はラクトース、スクロース、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、澱粉結晶質セルロース（ｓｔａｒｃｈｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、炭酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎａｔｅ）、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）等のような充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）及び、アラビアゴム（ｇｕｍＡｒａｂｉｃ）、トラガントゴム（ｇｕｍｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅ）、澱粉、ＰＶＰ及びセルロース誘導体等のようなバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）を含む。本分野の熟練者に公知の飼料添加物の例は、ビタミン、アミノ酸及び微量元素（ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓ）、消化率改善剤（ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙｅｎｈａｎｃｅｒｓ）及び腸内有益菌安定剤（ｇｕｔｆｌｏｒａｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）等を含むことができる。

畜産用飼料内の本発明の微生物の場合、無毒性であり、酸、酵素、胆汁に対する耐性を備えていて腸に行く間生き残る特性を有する。また嫌気的環境でも生理活性をみせ、腸内の上皮細胞や粘膜に吸着して着生することができる。

そして、前記畜産用飼料を摂取する場合、反芻動物の反芻胃内のメタンの生成を抑制して地球温暖化効果を防止することができ、飼料利用効率を増大させることができる。

一方、本発明は、前記還元的酢酸生成菌の他の用途として、これを動物に給与して反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制する方法を含む。

本発明において、前記還元的酢酸生成菌は、反芻動物が炭水化物が含まれた飼料を摂取する場合、反芻胃内の微生物によって発酵及び分解された後の産物のうち水素又は二酸化炭素を利用して酢酸を生成する菌をいう。前記還元的酢酸生成菌は、反芻動物の反芻胃内でメタン生成を抑制することができる微生物であれば、その種類がこれに制限されるものではないが、望ましくはプロテイニフィルム属微生物、最も望ましくはプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１である。

前記プロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１は、本発明者らによって在来ヤギの反芻胃から分離した新規の還元的酢酸生成菌として、メタン生成微生物と効果的に基質競争をして酢酸を生成するため反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制するのに効果的である。

本発明の方法において、前記給与は、前記還元的酢酸生成菌が含まれた微生物製剤又は前記微生物製剤を含む畜産用飼料を前記反芻動物に提供することをいうが、反芻動物に前記還元的酢酸生成菌を提供する方法であれば何であっても関係なく、その方法がこれに制限されるものではない。

前記微生物製剤は、粉末又は液状形態に製造されたものにその形態が制限されず、前記還元的酢酸生成菌が１種又は２種以上混合された形態で使用されることができる。前記微生物製剤の特性及び含量は、上述した通りである。

前記畜産用飼料は、反芻動物が成長するために反芻動物に給与する餌であり、本発明の畜産用飼料は、前記還元的酢酸生成菌が含まれた微生物製剤を含んでいるものをいい、その特性及び含量は上述した通りである。

前記還元的酢酸生成菌を動物に給与して反芻動物がこれを摂取する場合、反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制して地球温暖化を防止することができ、飼料利用効率を増大させることができる。

このように、本発明は、還元的酢酸生成菌としてプロテイニフィルム属微生物のメタン生成抑制機能に関するもので、特に、本発明者らが分離同定したプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１菌株は、反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制するのに今まで報告されたいかなる他の微生物に比べても優秀な効果を示すところ、メタン生成を抑制するのに有用に活用することができるものである。

以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明することにする。これらの実施例は、ただ本発明を具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者において自明なことである。

実施例１：乳牛（ニュウギュウ）及び在来ヤギの飼育環境及び胃液の収集と培養
１−１．乳牛及び在来ヤギの飼育環境
乳牛は、順天大学校付設農場で飼育し、在来ヤギは全羅南道求礼で放牧して飼育し、実験には反芻胃瘻管が装着されたホルスタイン・フリーシアン（ｈｏｓｔｅｉｎｆｒｉｅｓｉａｎ）種の乳牛及び在来ヤギを使用した。実験期間の間、乳牛は稲藁と濃厚飼料を６：４の割合で体重の２％水準で１日２回給与し、在来ヤギは稲藁を自由給与し肥育用濃厚飼料を毎日８００ｇ給与した。

１−２．反芻胃液の収集及び培養
反芻胃液は、前記実施例１−１の乳牛及び在来ヤギから収集した。

前記乳牛及び在来ヤギから反芻胃液を採取して４重のチーズ織布（ｃｈｅｅｓｅｃｌｏｔｈ）を利用して飼料粒子を除去した後、保温及び嫌気状態の容器に保管して実験室に運んだ。

血清瓶（Ｓｅｒｕｍｂｏｔｔｌｅ）内のそれぞれ採取された反芻胃液５０ｍＬに、最終濃度が５０ｍＭになるようにＢＥＳ（ｂｒｏｍｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）を添加した後、一時間の間８０％Ｎ_２−２０％ＣＯ_２（ｖｏｌ％）ガスでバブリングした。８０％Ｎ_２−２０％ＣＯ_２（ｖｏｌ％）ガスを注入した培養液を対照区とし、８０％Ｈ_２−２０％ＣＯ_２（ｖｏｌ％）ガスを注入した培養液を実験区としてブチルゴムストリッパーとアルミニウムキャップで封じた。その後、前記対照区及び実験区を、３９℃でシェイキングインキュベーターで１２０ｒｐｍの速度で１週間培養した。

実施例２：菌株の分離及びＤＮＡの抽出
２−１．菌株の分離
前記実施例１−２で収集及び培養した反芻胃液から、メタン生成微生物（ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ）と効果的に基質競争をする還元的酢酸生成菌（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅａｃｅｔｏｇｅｎ）を分離するために、選択培地として使用されている下記表１の成分を有するＡＣ−Ｂ１培地（ＬｅＶａｎ等、１９９８）５ｍＬに、培養された反芻胃液を５％接種した後、３９℃のシェイキングインキュベーターで１２０ｒｐｍの速度で１週間培養した。

その後、１次培養液０．５ｍＬを新鮮なＡＣ−Ｂ１培地で同じ条件で継代培養し、３次継代培養まで実施した。継代培養時には、追加的に８０％Ｈ_２−２０％ＣＯ_２（ｖｏｌ％）ガスを注入した。

還元的酢酸生成菌の純粋分離のために、前記で培養した１ないし３次培養液をＡＣ−Ｂ１培地を使用して１０進希釈法１０^０〜１０^−９まで希薄した後、１０^−２〜１０^−９希薄液をＡＣ−Ｂ１寒天培地に塗抹した後、嫌気チャンバ（Ｖｉｓｉｏｎｂｉｏｎｅｘ、Ｎ_２：９０％、Ｈ_２：５％、ＣＯ_２：５％）内の３９℃インキュベーターで１週間培養した。その後、最終的に還元的酢酸生成菌を分離するために、再塗抹及び培養した後、分離菌株を冷凍保管した。

２−２．ＤＮＡ抽出
前記２−１で分離した菌株を固体培地で培養した後、コロニーをチューブに入れた後１００μＬの５％Ｃｈｅｌｅｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を入れた。その後、９５℃で１０分間置いた後、上澄液からでＤＮＡを抽出した。

実施例３：菌株の同定
３−１．ＰＣＲの遂行及びＤＮＡの確認
前記実施例２−１で分離した菌株の種を確認するために、分離した菌株の１６ＳｒＤＮＡを利用して、重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）実験を遂行した。

ＡＣ−Ｂ１寒天培地から適当量のコロニーを取って１．５ｍＬチューブに移した後、１００μＬ５％Ｃｈｅｌｅｘ１００Ｒｅｓｉｎ（Ｂｉｏｒａｄ、ＵＳＡ）を添加、９５℃で１０分間熱処理した後、これを円心分離して、上澄液１μＬを取ってＰＣＲ反応のＤＮＡ鋳型として使用した。

プライマーとしては、普遍的なプライマーである２７Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’；配列番号１）と、１４９２Ｒ（５’−ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’；配列番号２）を使用した（Ｎｕｂｅｌｅｔａｌ．１９９６．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｉｅｓｏｆｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇ１６ＳｒＲＮＡｓｉｎＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｉｘａｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８、５６３６−５６４３）。

ＰＣＲ条件は、５０μＬのＰＣＲ混合溶液になるよう増幅ＤＮＡ１μＬ、１０μＭｆｏｒｗａｒｄ及びｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓ２μＬと、各２．５ｍＭｄＮＴＰｓ１μＬ、１．２５ｕｎｉｔのＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）０．２５μＬ、ＰＣＲ緩衝溶液（１５ｍＭＭｇＣｌ２、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、５００ｍＭＫＣｌ）５μＬに蒸溜水を加えて９４℃で５分間初期変性（ｐｒｅ−ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させた後、９４℃で４５秒間単一鎖に変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させ、５５℃で４５秒間結合させた（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）後、７２℃で１分間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）する過程を総３２回反復して遂行した。後期延長（Ｐｏｓｔ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）は、７２℃で１０分間遂行した。前記実験は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｓｔｅｍ社のＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２７００ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを利用して遂行した。

最終反応物を１％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌで、４０分間１００Ｖで電気泳動を実施し、ＥｔＢｒで染色して増幅産物を確認した。１６ＳｒＲＮＡＰＣＲ増幅産物に対して制限酵素を処理した後、各菌株の切断様相を観察した。ＨａｅＩＩＩ、及びＨｈａＩ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）を利用して３７℃で５時間処理した後、制限酵素を処理した産物を２．５％Ｍｅｔａｐｈｏｒａｇａｒｏｓｅｇｅｌ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、ＵＳＡ）を使用して１７０Ｖで７０分間電気泳動を実施し、ＥｔＢｒで染色してＵＶ下で確認した。確認されたバンドのパターンをクラスタリングして互いに異なるバンドタイプを調査した後、これらのうち、代表することができる菌株を選別した。

その結果、反芻胃液から分離された還元的酢酸生成菌株は、乳牛で１３種、在来ヤギで３６種であり、二つの制限酵素を処理して同一菌株を分離した。

３−２．ＤＮＡの塩基序列の分析
前記実施例３−１で増幅したＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して分離した。その後、分離したＤＮＡは、マクロゼン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）社（大田、韓国）に送って両方向のＤＮＡの塩基序列を分析した。

３−３．還元的酢酸生成菌関連遺伝子の検出
還元的酢酸生成（Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅａｃｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）微生物の分離のために、還元的酢酸生成（Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅａｃｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）関連遺伝子ＦＴＨＦＳ（Ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）を利用して、分離及び同定された還元的酢酸生成菌を特異的に検出した。

プライマーとしてはＦＴＨＦＳｆ（５’−ＴＴＹＡＣＷＧＧＨＧＡＹＴＴＣＣＡＴＧＣ−３’；配列番号３）とＦＴＨＦＳｒ（５’−ＧＴＡＴＴＧＤＧＴＹＴＴＲＧＣＣＡＴＡＣＡ−３’；配列番号４）を使用した後、前記実施例３−１の方法でＰＣＲを遂行した。

すなわち、用意したＤＮＡ鋳型１μＬをＰＣＲｅｐｐｅｎｄｏｒｆｔｕｂｅに取り、ここにＦＴＨＦＳｐｒｉｍｅｒＦＴＨＦＳｆ、及び、ＦＴＨＦＳｒ、それぞれ１μＬ、各２．５ｍＭｄＮＴＰｓ０．５μＬ、１．２５ｕｎｉｔのＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）０．１２５μＬ、及びＰＣＲ緩衝溶液（１５ｍＭＭｇＣｌ２、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、５００ｍＭＫＣｌ）２．５μＬを加えて、滅菌蒸溜水で総量が２５μＬになるようにしてＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ反応条件は、ｔｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲで付着温度を９ｃｙｃｌｅｓごとに、１℃ずつ下げて６３℃から５５℃までなるようにし、初期変性９４℃で２分、変性は９４℃で３０秒、伸長は７２℃でそれぞれ１分ずつした。最後のｃｙｃｌｅは、２５ｃｙｃｌｅｓ増幅し、７２℃で１０分間伸長した。

最終反応物を１％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌで、４０分間１００Ｖで電気泳動を実施し、ＥｔＢｒで染色して増幅産物を観察して１ｋｂの大きさを持ったＤＮＡを確認した。すなわち、既存の還元性酢酸菌として知られた比較菌株と、乳牛と在来ヤギから分離した還元的酢酸生成菌株からＦＴＨＦｓ遺伝子が検出され、約１ｋｂの大きさの増幅産物を示した（図１）。

実施例４：還元的酢酸生成菌の系統樹の作成
１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ分析結果から分類された菌株を、再ＰＣＲを還元酢酸生成プライマーＦＴＨＦｓｇｅｎｅｐｒｉｍｅｒｓ（ＧＨｅｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．、２０１０）を利用してＡｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓｃｒｏｔｏｎｏｘｉｄａｎｓ及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ菌株を分離同定した。

その結果、ＦＴＨＦＳ遺伝子を有している微生物を、乳牛から１種（ＤＡ０２）及び在来ヤギから３種（ＧＡ０１、ＧＡ０２、ＧＡ０３）で総４種選別し、選別された微生物の塩基序列をＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮｅｔｗｏｒｋＳｅｒｖｉｃｅを利用して比べた結果を下記表２に示し、このうち、ＧＡ０３菌株の分析された塩基序列を配列番号５に示した。
[配列番号５]
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前記実施例４−１で選別した微生物について、１６ＳｒＲＮＡ塩基序列を分析、既存に報告されたＦＴＨＦｓ遺伝子を含む還元的酢酸生成菌株らと比較、系統学的位置を検討した。

系統学的所属を決定するためにＢＬＡＳＴプログラム及びＥｚＴａｘｏｎを利用してＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｅＢａｎｋにある１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の塩基序列と比較した。

塩基序列の整列は、ＣＬＵＳＴＡＬＷｖｅｒｓｉｏｎ１．６を利用して遂行した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．１９９４．ＣＬＵＳＴＡＬＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｉｇｈｔｉｎｇ、ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｇａｐｐｅｎａｌｔｉｅｓａｎｄｗｅｉｇｈｔｍａｔｒｉｘｃｈｏｉｃｅ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２、４６７３−４６８０）。Ｋｉｍｕｒａｔｗｏ−ｐａｒａｍｅｔｅｒｍｏｄｅｌ（Ｋｉｍｕｒａ、Ｍ．、１９８０．Ａｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｏｆｅｓｔｉｍａｔｉｎｇｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｒａｔｅｓｏｆｂａｓｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｔｈｒｏｕｇｈｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１６、１１１−１２０）によって計算されたｄｉｓｔａｎｃｅｍａｔｒｉｘを使用してＮＪ（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ）方法によって系統樹を作成し、ブートストラップ（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）値は１０００回反復して計算した。前記のような方法で作成された系統樹を図２に示した。

検討の結果、ＤＡ０２、ＧＡ０１及びＧＡ０３菌株は、ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓグループのＰｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍ属に属する菌株であることが確認されたが、類似度が９９％と示され他のグループとも連関性が低くて現在まで知られていない新種である可能性が高いということができる。ＧＡ０２菌株は、ＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓグループのＡｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓに属し、９８％の類似性を見せた。

実施例５：還元的酢酸生成菌のｉｎｖｉｔｒｏ発酵特性の測定
５−１．アセト酸等の生成

前記実施例４で選別した、分離された還元的酢酸生成菌株のうちＦＴＨＦｓ遺伝子を有している微生物は総４種であった。比較菌株としては、既存の反芻胃内から分離した還元的酢酸生成菌としてユウバクテリウム・リモサム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｍｏｓｕｍ）ＡＴＣＣ８４８６を使用した。

全ての菌種は、接種前２代継代培養し、発酵特性分析のために表３のような組成を有するＲＭ０２培地（Ｋｅｎｔｅｒｓ等、２００９）を利用して３９℃のシェイキングインキュベーターで１００ｒｐｍの速度で４日間培養した。

培養条件は、８０％Ｎ_２−２０％ＣＯ_２（ｖｏｌ％）ガスを注入した培地で成長した菌株を対照区とし、８０％Ｈ_２−２０％ＣＯ_２（ｖｏｌ％）ガスを注入した培地及び５ｍＭグルコースが添加された培地で成長した菌株を実験区とした。

その後、前記で培養した菌株の培養液を１０，０００ｇで１５分間円心分離し、上澄液を０．４５μｍフィルターで濾過してＨＰＬＣ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１２００Ｓｅｒｉｅｓ、ＵＳＡ）で各菌株の発酵特性を分析した。コラムは、ＭＥＴＡＣＡＲＢ８７Ｈ（Ｖａｒｉａｎ、ＵＳＡ）、ディテクターはＡｇｉｌｅｎｔ１２００Ｓｅｒｉｅｓｄｉｏｄｅ−ａｒｒａｙｄｅｔｅｃｔｏｒ（２１０ｎｍ／２２０ｎｍ）を使用し、３５℃で０．６ｍＬ／ｍｉｎの流速で菌株試料を移動させた。移動相溶媒は０．００８５ＮＨ_２ＳＯ_４を使用し、オートサンプラーを利用して１０μＬをコラムに注入して分析した結果を、下記表４に示した。

そして、ｉｎｖｉｔｒｏ発酵上で澱粉とカゼインを基質として使用した場合、アセト酸生成の場合を観察した。

水溶性澱粉（Ｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈ）とカゼイン基質のｉｎｖｉｔｒｏ発酵時間は、０、３、６、９、１２及び２４時間とした。各基質別発酵時間当りの処理区は、滅菌したＡＣ−Ｂ１培地を添加した対照群（ｃｏｎ）、比較菌株であるＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｍｏｓｕｍを添加したＥ．ｌｉｍｏｓｕｍ、ホルスタイン乳牛から分離したＰｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓを添加したＤＡ０２、韓国在来ヤギから分離したＰｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓを添加したＧＡ０１、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓｃｒｏｔｏｎａｔｏｘｉｄａｎｓを添加したＧＡ０２、ＰｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓであるＧＡ０３を、各基質別発酵時間当り添加して３基質６処理区３反復で遂行した。

その結果を、図３及び図４に示した。

前記結果から分かるように、選別された菌株ＤＡ０２、ＧＡ０１、ＧＡ０２及びＧＡ０３全てで比較菌株に比べて多量のアセト酸（酢酸）を生成し、特に在来ヤギから分離した菌株であるＧＡ０３で最も多い酢酸が検出され、グルコースを添加した処理区では唯一ラクテート（酪産）を生成した。

５−２．追加実験
選別した菌株の揮発性脂肪酸含量を測定するための実験を追加的にさらに遂行した。

嫌気性環境にある濾過した反芻胃液に緩衝液を１：２の割合で混合し、前記緩衝額は水１ｌにＫ_２ＨＰＯ_４５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ、ＮａＣｌ０．５２ｇ、ＭｇＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ７０ｍｇ、ＣａＣｌ_２３５ｍｇ、ＮａＨＣＯ_３５．９ｇ、ｃｙｓｔｅｉｎＨＣｌ１７４ｇを、それぞれ混合した後、ｐＨが６．８になるように滴定して製造した。その後、滅菌したそれぞれの瓶に基質である澱粉とカゼインをそれぞれ０．２５ｇ入れた後、前記反芻胃液と混合した緩衝額を２５ｍＬ添加してから、前記実施例４で選別した４つの菌株をそれぞれ５ｍＬ接種した。その後、前記瓶らをシェイキングインキュベーターに入れた後、１２０ｒｐｍの速度で、３９℃で嫌気培養した後、培養０時間、２４時間及び４８時間後に揮発性脂肪酸数値を測定した。

揮発酸脂肪酸（ブチルレート（ｂｕｔｙｌａｔｅ）、プロピオネート（ｐｒｏｔｉｏｎａｔｅ）及びアセテート（ａｃｅｔａｔｅ））とラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して測定した。溶媒としては、０．００８５ノルマルの硫酸を０．６μＬ／ｍｉｎの速度で流し、コラムの温度は３５℃に維持した。試料は使用前１３，０００ｒｐｍの速度で、４℃で１０分間円心分離後、上澄液を取ってミリフォア（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）社の０．２μｍフィルターでフィルターした後、２０μＬずつ注入した。

澱粉を基質として使用した場合の実験結果は図５に、カゼインを基質として使用した場合の実験結果は図６に示した。

澱粉を基質として使用した場合及びカゼインを基質として使用した場合、全てで培養時間が長くなるほど全て揮発性脂肪酸含量が増加し、全ての群でアセテートの含量が最も高く示された。また、澱粉を基質として使用した場合、対照群及び実験群全てで培養２４時間後からブチルレートが生成された。そして、対照群の場合、培養２４時間後にラクテートが検出された一方、実験群では検出されなかった。

そして、カゼインを基質として使用した場合には、培養０時間にＧＡ０３群を除いた実験群及び対照群でブチルレートが検出されたが、培養が始まって全ての群でブチルレートが検出されなかった。また、対照群の場合、培養２４時間後にラクテートが検出された一方、実験群では検出されなかった。

５−３メタンガス含量の測定
前記実施例４で選別された菌株のメタン生成抑制能を評価するために、前記実施例５−１の方法を使用して各菌株のメタン生成抑制程度を観察した。

基質としてカゼインが添加されたｉｎｖｉｔｒｏ分析試験で、還元的生成菌株であるＰｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ（ＧＡ０３）が添加された処理区（５０，１８５ｐｐｍ）が対照区（８６，５７５ｐｐｍ）よりメタン発生量が減少し、また基質として澱粉が添加されたｉｎｖｉｔｒｏ試験でも還元的生成菌株Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ（ＧＡ０３）が添加された処理区（８，９３４ｐｐｍ）が対照区（２９，７０５ｐｐｍ）よりメタン発生量が減少することを確認することができた。このような結果を図７に図示した。

一方、追加でメタン生成抑制能を評価するために、前記実施例５−２の方法を使用して各菌株のメタン生成抑制程度を観察した結果、澱粉を基質として使用した場合の各菌株のメタン生成抑制程度を下記図８に、カゼインを基質として使用した場合の各菌株のメタン生成抑制程度を観察した結果を下記図９に示した。

追加実験の結果、やはり澱粉を基質として使用した場合、培養４８時間後から全ての実験群でメタンの生成を効果的に抑制するものと示され、ＧＡ０３群のメタン生成抑制能が最も優秀なものと観察された。

そして、カゼインを基質として使用した場合には、培養２４時間後に実験群のメタン濃度が対照群に比べて増加したが、培養４８時間後にはメタン濃度が減少し、特にＧＡ０２及びＧＡ０３の場合、対照群に比べてメタン濃度が減少するものと示された。

実施例６：ｉｎｖｉｖｏ発酵特性
発酵性状試験のために、反芻胃カニューレ（ＢａｒＤｉａｍｏｎｄ、Ｐａｒｍａ、ＩＤ、ＵＳＡ；ｉｎｔｅｒｎａｌｄｉａｍｅｔｅｒ、１２０ｍｍ）が装着された平均体重３７６．７５±６．２５ｋｇの去勢韓牛から発酵性状試験に必要な反芻胃液を採取した。

この供試畜には濃厚飼料５ｋｇ、稲藁１ｋｇを一日２回（０９：００、１７：００）に分けて給与し、配合飼料の原料構成と配合飼料及び稲藁の化学的組成分は下記表５のように構成した。

本実験は、４×４Ｌａｔｉｎｓｑｕａｒｅｄｅｓｉｇｎでし、期間は２１日に構成した。２１日のうち１〜１５日は添加剤給与によるＣＨ_４の発生量測定を隔日間隔で測定し、５日に発酵性状を調査した。１６〜２１日は反芻胃内の微生物及び環境組成が元通りに戻るように回復期間を持った。対照区（ｃｏｎｔｒｏｌ、サッカリン３ｇ、大豆粕３３．６ｇ、脱脂糠３３．６ｇ）；及びＡｃｅｔｏｇｅｎ添加区（Ａｃｅｔｏｇｅｎ混合１２０ｇ、サッカリン３ｇ）で実験を遂行した。

そして、呼吸ガスを測定するために、生後２９ヶ月領の肥育後期の去勢韓牛４頭（３９２±１４ｋｇ）を供試して農村進興庁国立畜産科学院の家畜代謝実験棟で遂行した。供試飼料はとうもろこしを主とした濃厚飼料５ｋｇ、稲藁１ｋｇを一日２回（０９：００、１７：００）に分けて給与した。試験期間は、飼料適応期間６日、呼吸ガス測定１５日とし、１ｐｅｒｉｏｄ当り２１日が所要された。ただし、ガス測定は１５日のうち隔日で総７回測定した。期間別メタン測定及び回復期間を下記表６のように設計した。

国立畜産科学院（ＲＤＡ）で実施した呼吸チャンバ（図１１）を利用して、還元的酢酸生成菌（ＧＡ３）分離菌株のｉｎｖｉｖｏメタン生成量を測定した結果を図に図示した。

その結果、対照区で１７４（ｌ／ｄａｙ／ｈｅａｄ）、Ａｃｅｔｏｇｅｎ処理区で１６３（ｌ／ｄａｙ／ｈｅａｄ）と、還元的酢酸生成菌が添加された処理区で５．８％のメタン低減効果が発生した。

前記実施例で確認したように、本発明者らが在来ヤギから抽出した菌株であるＧＡ０３のメタン生成抑制能が優秀なことを確認したところ、前記菌株をプロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１と命名して韓国微生物保存センターに２０１１年１１月９日付けで、寄託番号ＫＣＣＭ１１２１９Ｐにて寄託した。

Claims

反芻動物の反芻胃内のメタン生成抑制能を有するプロテイニフィルム属還元的酢酸生成菌であって、プロテイニフィルム・アセタティゲネス（Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍａｃｅｔａｔｉｇｅｎｅｓ）ＳＲＯＤ１（寄託番号ＫＣＣＭ１１２１９Ｐ）であることを特徴とする、前記プロテイニフィルム属還元的酢酸生成菌。
請求項１に記載のプロテイニフィルム属還元的酢酸生成菌を含む、反芻動物の反芻胃内のメタン生成抑制用微生物製剤。
請求項１に記載のプロテイニフィルム属還元的酢酸生成菌、又は請求項２に記載の微生物製剤を含むことを特徴とする畜産用飼料。
請求項１に記載のプロテイニフィルム属還元的酢酸生成菌、又は請求項２に記載の微生物製剤を動物に給与して反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制する方法。
前記給与は、前記プロテイニフィルム属還元的酢酸生成菌が含まれた微生物製剤又は前記微生物製剤を含む畜産用飼料を前記反芻動物に提供することを特徴とする、請求項４に記載の反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制する方法。