CN1285869A - 微生物,获取它的方法及饲料添加剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及真杆菌属微生物,其制品及应用。所述微生物适于以纯培养物DSM11798,和/或与铅黄肠球菌DSM11799的混合培养物,或与其它厌氧微生物的混合培养物用于单端孢菌毒素解毒。本发明涉及用于在饲料中或动物消化道中灭活单端孢菌毒素的饲料添加剂,其含有微生物的纯培养物和/或混合培养物(DSM11798或DSM11799),或与其它厌氧微生物的混合培养物,剂量从每1000千克饲料0.2到3千克,特别是0.5到2.5千克。

Description

微生物，获取它的方法及饲料添加剂
本发明涉及一种用于单端孢菌毒素解毒的真杆菌属(Eubacterium)的微生物纯培养物或混合培养物，也涉及其的分离方法、生产和制剂，及其用途和包含该微生物的饲料添加剂。
属于真菌毒素的单端孢菌毒素包含于大量动物饲料中，单端孢菌毒素通常是通过长在谷类或饲草上的真菌霉菌掺入到饲料中。作为真菌毒素，尤其是单端孢菌毒素不希望的施用于动物的结果，动物的生产力和比如动物生长速度受到抑制。除了损害物的健康之外，同时增加饲料消耗和降低饲料利用率。为了消除真菌毒素的负作用，大量结合或吸收这些毒素的方法已经被公开。
这样，例如在WO 91／13555中描述了一种饲料添加剂和一种灭活真菌毒素的方法，其中页硅酸盐矿物颗粒被加入饲料来灭活真菌毒素。为增加这些页硅酸盐矿物的作用，颗粒被覆螯合剂来加速作用。另一种饲料也为公知，例如在WO 92／05706中公开的，其中包含作为饲料添加剂的蒙脱土黏土。这些具有很大内表面积的天然黏土矿物由于其多孔性在其表面结合真菌毒素，并据此使其固定化。
而且，一种饲料添加剂已在奥地利实用新型AT-U 504中公开，其中应用一种酶制剂，它能够形成环氧酶和内酯酶，在饲料和动物胃肠消化道中化学降解真菌毒素。根据AT-U 504，这种酶制剂的作用可以通过加入沸石或类似物来加强。
本发明目的在于得到一种具体的微生物或一种从天然生活环境中分离的确定的混合培养物，可以利用它以可控制的方式，通过生物化学降解，使真菌毒素尤其是单端孢菌毒素转化成为生理上无害的，尤其是对动物饲养无害的物质。
为达到这个目的，分离了真杆菌属的微生物，其纯培养物DSM11798，或与铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)DSM11799或其它厌氧微生物的混合培养物适合用于单端孢菌毒素的解毒。根据本发明的一个新颖的提纯手段，该微生物适于在含有其它厌氧微生物尤其是含有肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)或乳杆菌属(Lactobacillus)的混合培养物中解除单端孢菌毒素的毒性。
由于与真杆菌属相关，该真杆菌属微生物也称为真杆菌属的种。在德意志微生物保藏中心以纯培养物保藏，号码为DSM 11798，或以与铅黄肠球菌的混合培养物形式保藏在德意志微生物保藏中心，号码为DSM11799，该微生物尤其适合于根据本发明来解除以下毒素的毒性，尤其是脱氧瓜蒌镰菌醇(DON)、T-2毒素、HT-2毒素、瓜蒌镰菌醇、monoacetoxyscirpenol、蛇形菌素、木霉菌醇、疣孢菌素、杆孢菌素(rorodin)、乙酰脱氧瓜萎镰菌醇、异木霉菌素、羟基异木霉菌素、calonectrin、T-2四醇、T-2三醇、脱乙酰新茄镰孢菌醇(deacetylneosolaniol)、新茄镰孢菌醇(neosolaniol)、乙酰新茄镰孢菌醇(acetylneosolaniol)、sporotrichiol、trichotriol、接骨木镰菌醇(sambucinol)和大镰刀孢菌素。根据本发明的微生物通过还原性生物转化包含在分子中负责真菌毒素(尤其是单端孢菌毒素)毒性的环氧基团来解除毒性。对于对应下列方程式的单端孢菌毒素，降解环氧基团通过还原性裂解有毒性的12，13-环氧环完成。
Figure 9881284200081
根据本发明的微生物形态优选地表现为它是厌氧、革兰氏阳性、杆状、不产生孢子的细菌，尤其为0.1-3微米长，它以单个、成对或长链状存在，特别地可长达约150微米。对本发明微生物系统发育分析已特别地显示一个16SRNA序列，即：
1      CCTGGCTCAG GATGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATGCAAGTCGAAC GGATAACCCG
61     CCTCCGGGCG GTTATAGAGT GGCGAACGGG TGAGTAACACGTGACCAACC TACCTCCCAC
121    TCCGGGATAA CCCAGGGAAA CCTGCGCTAA TACCGGATACTCCGGGGCCC CCGCATGGGG
181    GCGCCGGGAA AGCCCCGACG GTGGGAGATG GGGTCGCGGCCTATTAGGTA GTCGGCGGGG
241    TAACGGCCCA CCGAGCCCGC GATAGGTAGC CGGGTTGAGAGACCGATCGG CCACATTGGG
301    ACTGAGATAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATTTTGC GCAATGGGGG
361    AAACCCTGAC GCAGCAACGC CGCGTGCGGG ACGAAGGCCTTCGGGTTGTA AACCGCTTTC
421    AGCAGGGAAG AAGTTGACGG TACCTGCAGA AGAAGCTCCGGCTAACTACG TGCCAGCAGC
481    CGCGGTAATA CGTAGGGAGC GAGCGTTATC CGGATTTATTGGGCGTAAAG CGCGCGTAGG
541    CGGGCGCTTA AGCGGAATCT CTAATCTGAG GGCTCAACCCCCAGCCGGAT TCCGAACTGG
601    GCGCCTCGAG TTCGGTAGAG GAAGACGGAA TTCCCAGTGTAGCGGTGAAA TGCGCAGATA
661    TTGGGAAGAA CACCGATGGC GAAGGCAGTC TTCTGGGCCGTAACTGACGC TGAGGTGCGA
721    AAGCTAGGGG AGCGAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCCTAGCCGTAAA CGATGGGCAC
781    TAGGTGTGGG GGGGAATGCC CCTCCGTGCC GCAGCTAACGCATTAAGTGC CCCGCCTGGG
841    GAGTACGGCC GCAAGGCTAA AACTCAAAGG AATTGACGGGGGCCCGCACA AGCAGCGGAG
901    CATGTGGCTT AATTCGAAGC AACGCGAAGA ACCTTACCAGGGCTTGACAT GCAGGTGAAG
961     CGGCGGAAAC GCCGTGGCCG AGAGGAGCCT GCACAGGTGGTGCATGGCTG TCGTCAGCTC
1021    GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCCTGTCGT ATGTTGCCAT
1081    CATTCAGTTG GGGACTCGTA CGAGACTGCC GGCGTCAAGCCGGAGGAAGG TGGGGACGAC
1141    GTCAAGTCAT CATGCCCTTT ATGCCCTGGG CTGCACACGTGCTACAATGG CCGGTACAAC
1201    GGGCTGCGAG CCAGCGATGG CGAGCGAATC CCTCAAAACCGGTCCCAGTT CGGATCGGAG
1261    GCTGCAACCC GCCTCCGTGA AGTCGGAGTT GCTAGTAATCGCGGATCAGC ATGCCGCGGT
1321    GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACCACCCGAGTTG TCTGCACCCG
1381    AAGTCGACGG CCCAACCCGC GAGGGGGGAG TCGCCGAAGGTGTGGGGAGT AAGGGGGGTG
1441    AAGTCGTAAC AAGGTAGCCG TACCGGAAGG TGCGGCT，
该微生物序列数据与已知有代表性的微生物之16S RNA基因序列进行比较，该序列是细菌结构域的一部分。这种比较分析显示与真杆菌属细菌的极大的相关性。然而不可能找到任何与已知微生物有充分相关的基因序列，据此得出本发明的微生物是真杆菌属中一种至今还没有被分离和分类的微生物。生理学的研究，如发酵谱、还原硝酸盐为亚硝酸盐，也清楚地揭示与真杆菌属的关系。
本发明的进一步目标在于提供一种方法，既能得到微生物DSM11798纯培养物，又能得到它与铅黄肠球菌DSM 11799和其它厌氧微生物的混合培养物，一种特别的为达到经济和质量上的最优化的产物的方法。
为达到该目的，根据本发明的方法应这样进行，混合培养物DSM11799从微生物和牛的瘤胃铅黄肠球菌获得，方法是通过在系列稀释物中和厌氧培养条件下，至少培养或发酵两次。为得到本发明微生物的混合培养物和纯培养物，系列稀释物培养和／或发酵至少两次已证实是有利的，因为在这种方式下，可以确保达到所希望产物的纯度，特别是可以去除副产物的干扰或不期望的微生物的污染。为保持厌氧条件，根据本发明的培养和／或发酵优选地在H2和CO2的气氛下进行，该气氛中H2∶CO2比例范围为10∶90到90∶10，特别地大约在80∶20为优选的。对于本发明的微生物生长，具有低氧化还原作用电势的厌氧环境是很重要的，令人惊讶的，只有在H2存在时，才能使微生物生长得足够快。
根据本发明微生物的更快生长可以通过在过压0.2至3巴下培养和／或发酵，特别地在0.5至1巴下培养和／或发酵来实现，该条件对应一个进一步优选的实施方案。要达到进一步提高根据本发明的微生物DSM11798的生长是可能的，优选地可在35至42℃，特别地大约在37℃进行培养和／或发酵。根据本发明培养或发酵方法的最优pH优选地在6到8之间，特别的为7到7.5之间。在这些条件下有可能在尽可能短的时间内使用相对少的系列稀释物来得到如上所述微生物DSM11798纯培养物和它的混合培养物(DSM11799)。可以通过本发明提供的方法得到最佳效果，方法是优选地在含有以下组分培养基制品中进行培养和／或发酵：精氨酸、瓜氨酸、蛋白胨、酵母抽提物、脂肪酸混合物、矿物质(混合)溶液、葡萄糖、氯化血红素溶液、维生素K3、维生素溶液、微量元素和还原剂。
本申请中培养基制品包含的组分是部分可变换的，例如可能通过加入葡萄糖，在混合培养物中使平衡向铅黄肠球菌或其它相应厌氧微生物移动，可能依赖加入葡萄糖的量来特异性控制该过程。根据本发明一个特别优选的方面，在培养和／或发酵的开始加入重量百分比0.1％至0.5％，优选地为2％重量百分比的葡萄糖。铅黄肠球菌的生长在培养和／或发酵的开始通过加入0.1％至0.5％重量百分比的葡萄糖受到促进，导致氧化还原电势的降低。通过降低氧化还原电势，得到本发明微生物的最佳生长条件，这样，在培养基制品中的化学物质，比如半胱氨酸可通过控制加入葡萄糖而省去。
为达到解除真菌毒素，尤其是单端孢菌毒素的毒性，和实现其它微生物和／或混合培养物的有益效果，可根据本发明优选地加入有活性的、可解单端孢菌毒素毒性的微生物和／或其它厌氧微生物。
为获得微生物DSM 11798的纯培养物，本发明的方法优选地可这样进行：微生物DSM 11798的纯培养物从DSM 11799培养或发酵溶液中得到，方法是通过在培养基制品中特别是加入L-精氨酸作为生长促进剂的培养基制品中至少两次系列稀释。通过在培养基制品从培养或发酵溶液进行两次进一步地系列稀释，微生物DSM 11798可从与铅黄肠球菌的混合培养物中得到纯培养物，加入的生长促进剂L-精氨酸有利地使平衡朝微生物纯培养物方向偏移。在这种关联下，L-精氨酸的浓度越高，本发明细菌的生长就越受到促进。
为了进一步降低培养基制品的氧化还原电势，根据本发明优选地应用如下步骤，即在培养基制品中纯培养物的发酵时，加入重量百分比为1至4％的还原剂，特别地为半胱氨酸／硫化钠／碳酸钠溶液。特别地由于经济的原因，本发明加入还原剂应尽可能少，原因已在比较实验中体现出来：还原剂的浓度超过4％重量百分比就不会进一步加速微生物的生长。
为得到可保存的终产物，本发明的方法优选地继续通过浓缩，特别地通过离心或过滤和／或稳定化来加工培养或发酵溶液，更特别地通过冷冻干燥或喷雾干燥或封装。在这方面，例如，培养或发酵溶液在第一步中通过离心或过滤移除液体而浓缩，和／或直接从发酵溶液中进行稳定，优选地通过加入填充剂或载体材料，例如硅酸铝、硅藻土、碳水化合物、糖醇、淀粉、奶和乳清粉、蛋白水解产物、酵母和PVPP。通过加入这些填充剂或载体材料，才可能在下面的稳定步骤中，特别是冷冻干燥、喷雾干燥、封装制粒步骤中，得到微生物DSM11798纯培养物的固体产物，或其与铅黄肠球菌DSM11799或其它厌氧微生物的混合培养物的固体产物，特别是与真杆菌属、链球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属或乳杆菌属的微生物，这些微生物适于单端孢菌毒素的解毒，这些细菌直接沉积在载体上，其结果是得到特别易于管理和储存同时易于代谢的产物。通过在具有很大内表面积的材料上沉积微生物或微生物的混合培养物，例如在粘土、硅酸铝、沸石或类似物，根据本发明对单端孢菌毒素预期的降解作用被进一步促进，因为它们物理上结合于具有很大的内表面积的物质，所以本发明微生物的生化攻击被显著地促进。
根据本发明，该微生物被进一步以纯培养物和／或混合培养物(DSM11798，DSM11799)用来生产饲料添加剂。一个根据本发明的特别优选的用途本质上导致纯培养物和／或混合培养物(DSM11798与DSM11799)被以冷冻干燥、喷雾干燥和／或封装、制粒稳定物的形式利用，在合适情况下还加入载体材料。根据本发明的微生物纯培养物和／或混合培养物以及喷雾干燥稳定物可以被直接用作饲料添加剂，它甚至可以在配制阶段直接把饲料添加剂混入饲料，和／或在饲喂动物时以固体或液体形式混入饲料。
为了得到对单端孢菌毒素尽可能完全的降解或化学转变为生理上可以接受的物质，根据本发明用于在饲料中或动物消化道灭活单端孢菌毒素的饲料添加剂其主要特征在于，该饲料添加剂含有根据本发明的微生物的纯培养物和／或混合培养物，或根据本发明制备的微生物的纯培养物和／或混合培养物，其中每1000千克饲料中含有105到1012个细胞／千克，特别地107到109个细胞／千克的微生物。通过加入105到1012个细胞／Kg，特别是107到109个细胞／千克本发明的微生物，或根据本发明微生物与铅黄肠球菌或其它厌氧微生物的混合培养物，尤其是肠球菌属、链球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属或乳杆菌属这些适于单端孢菌毒素解毒的微生物，才有可能把饲料中高浓度的单端孢菌毒素，特别是脱氧瓜蒌镰菌醇(DON)、T-2毒素、HT-2毒素、瓜蒌镰菌醇、monoacetoxyscirpenol、蛇形菌素、木霉菌醇、疣孢菌素、杆孢菌素、乙酰脱氧瓜蒌镰菌醇、异木霉菌素、羟基异木霉菌素、calonectrin、T-2四醇、T-2三醇、脱乙酰新茄镰孢菌醇、新茄镰孢菌醇、乙酰新茄镰孢菌醇、sporotrichiol、trichotriol、接骨木镰菌醇和大镰刀孢菌素，转化为化学无害的物质，例如脱氧瓜蒌镰菌醇(DOM-1)的脱环氧代谢物，这样，通过利用本发明的饲料添加剂，就增加了动物的生长力，并且由于减小了毒性，而提高了饲料转化率。
为了进一步促进真菌毒素，特别是单端孢菌毒素的生物化学降解，根据本发明一种载体材料和／或填料可优选地被额外包含在饲料添加剂中，剂量为0.5至8千克／1000千克饲料，特别是0.7至4千克／1000千克饲料。通过加入载体材料和／或填料的方式，有可能(如果期望的话)把饲料中含有的真菌毒素和待降解的其它有害物质物理地结合到这些填料或填充物上，其结果是使它们不再可用于代谢。
在本申请中，特别地，硅酸铝、硅藻土、碳水化合物、糖醇、淀粉、奶和乳清粉、蛋白水解物、酵母和／或PVPP被用作载体材料和／或填料，这些载体材料和／或填料已经被证明特别有利于结合毒素，特别是trichotoxin。
一种特别优选的饲料添加剂其特征在于，该饲料添加剂由1至65％重量百分比，特别是5到50％重量百分比的喷雾干燥的或冷冻干燥的微生物稳定物，和99到35％重量百分比，特别是95到50％重量百分比的载体材料和／或填料的混合物组成。这种类型的饲料添加剂适合特别是饲料中和动物消化道中如下毒素的解毒作用：脱氧瓜蒌镰菌醇(DON)、T-2毒素、HT-2毒素、瓜蒌镰菌醇、monoacetoxyscirpenol、蛇形菌素、木霉菌醇、疣孢菌素、杆孢菌素、乙酰脱氧瓜蒌镰菌醇、异木霉菌素、羟基异木霉菌素、calonectrin、T-2四醇、T-2三醇、脱乙酰新茄镰孢菌醇、新茄镰孢菌醇、乙酰新茄镰孢菌醇、sporotrichiol、trichotriol、接骨木镰菌醇和大镰刀孢菌素。
本发明可以根据本发明微生物的表征、它的生长和活性条件和在本发明微生物帮助下单端孢菌毒素的代谢产物的形成，和以下饲喂实验进一步解释如下。
根据本发明的微生物是一种活性的、单端孢菌毒素转化株，特别地是一种脱氧瓜蒌镰菌醇转化株，并是通过在厌氧培养条件下即CO2∶H2气氛(20／80 v／v)中，0.5至1.5巴过压下，优化的营养培养基中反复培养，从牛瘤胃中里获得的。PYG和PY培养基在这里用作培养基制品，在不同的试样中包括加入到PYG培养基中不同浓度的两种不同的矿物质溶液、维生素K3贮存溶液、氯化血红素溶液、酵母抽提物、蛋白胨、葡萄糖。为了降低氧化还原电势，由半胱氨酸／Na2S／Na2CO3溶液组成的2至4％重量百分比的还原溶液被加入到PYG和PY培养基中，通过吹入CO2气体，pH值被调节到7到7.5。在这种培养基制品的帮助下，通过进行几次系列稀释可得到微生物DSM11798的纯培养物，并且，特别地用PYG培养基可得到微生物和铅黄肠球菌(DSM11799)的混合培养物。该微生物的生长仅在严格厌氧环境下，足够低的氧化还原电势和H2存在下可实现。该微生物优选的生长条件可以在约37℃条件下得到，然而也可能在35℃到38℃之间实现微生物的充分生长。对培养微生物DSM11798的纯培养物，在液体培养基中的L-精氨酸具有刺激生长的作用。
利用根据本发明的微生物，对于单端孢菌毒素有可能通过还原性裂解有毒性的12，13-环氧环来消除毒性。
利用一般性的单端孢菌毒素和具体的单端孢菌毒素脱氧瓜蒌镰菌醇，反应图示如下：
Figure 9881284200151
Figure 9881284200152
发酵条件和有用的发酵方法将以举例方式阐述本发明的微生物DSM11798的发酵和与其它兼性的和厌氧的微生物的共培养，以及与铅黄肠球菌(DSM11799)的混合培养物。发酵条件：发酵温度介于35至42℃，特别地在大约37℃左右；发酵的pH范围介于6到8，特别地在7.0到7.5；氧化还原电势：0至-350毫伏，依赖于工艺如何进行；气体环境：H2／CO210∶90到90∶10，特别地80∶20；发酵压力：0.2至3巴，特别地0.5至1巴。
主要培养物组分：精氨酸、瓜氨酸、酵母提取物、蛋白胨、氯化血红素和含氯化血红素的物质、低级脂肪酸、矿物质溶液、碳酸盐缓冲液(碳酸纳+CO2)、任选的葡萄糖、微量元素溶液、维生素溶液和还原剂。
进行发酵的不同方法可以选自如下：1)  DSM11798纯培养物的分批发酵：
程序：培养基在121℃和1.5巴下灭菌，或过滤除菌。冷却培养基至发酵温度35-42℃，特别是37℃，同时吹入无菌的CO2和加入碳酸钠和还原剂。吹入气体直至pH为6-8，特别是7-7.5。随后加入1-10％特别是5％已经预培养24-48小时的接种物。发酵直到稳定期的开始，大约持续20-50小时，这取决于底物浓度，或直到微生物计数范围在1013-1016。
 反应主要通过底物浓度控制。2)  DSM11798纯培养物的分批补料发酵：
程序：培养基灭菌、缓冲、还原和接种均如1)所示。通过分批或连续方式加入底物，如精氨酸、瓜氨酸，增加生物质产量。通过控制底物在一个相对高的水平来保持培养物在指数生长期。通过此方法进行这个过程可使发酵时间达到60小时。
该过程通过加入底物和发酵时间来控制(代谢终产物的积累)。3)  DSM11798纯培养物的连续发酵：
程序：培养基灭菌、缓冲、还原和接种如1)所示。分批发酵至稳定期，然后通过加入灭菌营养溶液转为连续发酵。流出物在储液槽中收集，分批处理或连续喷雾干燥。4)  DSM11798纯培养物与其它兼性和严格厌氧微生物共培养物的发酵或DSM11798共培养物的发酵可应用的共培养物的实例：H2产生菌    DSM11798+丁酸弧菌属的种(Butyrvibrio sp.)
        DSM11798+瘤胃球菌属的种(Ruminococcus sp.)益生菌      DSM11798+铅黄肠球菌=DSM11799
        DSM11798+链球菌属的种(肠球菌、乳酸链球菌、厌氧
        链球菌)
        DSM11798+明串珠菌属的种(Leuconostos sp.)
        DSM11798+片球菌属的种(Pediococcus sp.)
        DSM11798+乳杆菌属的种
        DSM11798+双歧杆菌属的种(Bifidobacterium sp.)
        DSM11798+芽孢杆菌属的种
        DSM11798+巨球形菌属的种(Megasphera sp.)酵母        DSM11798+酵母属的种(Saccharomyce sp.)
        DSM11798+克鲁维酵母属的种(Klyveromycess sp.)
        DSM11798+假丝酵母属的种(Candida sp.)
发酵中应用共生生物一方面用来减小发酵中氧化还原电势，另一方面来为DSM11798产生氢和在处理和稳定化中作为一种保护性的微生物。对微生物DSM11798计数损失发生在此，并在某些情况下在动物生产中作为额外的生长促进剂。4a)共培养物的分批发酵：Ⅰ)  在含碳水化合物的培养基上预培养共生生物。以上所述培养基(不含有还原剂，但含有额外用于此目的的碳水化合物)用于减小氧化还原电势。随后灭活共生生物并接种DSM11799。Ⅱ) 同时接种共生生物和DSM11798，加入0.1-1％的碳水化合物到培养基中。使用以上所述培养基(不合有还原剂，但含有额外用于此目的的碳水化合物)。共生生物的生长被促进-氧化还原电势迅速降低-DSM11798开始由于理想的生长环境而生长。Ⅲ)结合Ⅰ)+Ⅱ)：在发酵末期加入碳水化合物用于共生生物重新发酵。由于增加了的生物质产量，这导致在处理和稳定化中的一种保护性效果(氧)。4b)共培养物的分批补料发酵：*)相应于4aI的分批阶段，随后连续／分批加入相应于2的底物(精氨酸、瓜氨酸)。**)相应于4aI的分批阶段，随后连续／分批加入底物组合物(精氨酸／碳水化合物或瓜氨酸／碳水化合物)。4c)共培养物的连续发酵：
相应于4aI的分批阶段，通过加入含精氨酸／碳水化合物或瓜氨酸／碳水化合物的营养液，随后转变为连续发酵。如3中处理。发酵产物的处理(work-up)：1)  通过膜过滤工艺(超滤、微过滤)或离心浓缩。接着在有或无有机和／或无机载体材料条件下，喷雾干燥或冷冻干燥。2)  直接在有或无有机和／或无机载体材料条件下，喷雾干燥或冷冻干燥。3)  在有或无有机和／或无机载体材料条件下，连续喷雾干燥发酵肉汤。4)  结合1、2或3，封装或制粒。
为在小肠液中检查DON-生物转化株(DSM11798)的活性，开发了利用猪小肠的体外模型。
在这方面，第一个试验中开发了一个在加入冷冻干燥物的缓冲液中的小肠内容物的体外模型。
新屠宰的猪的大肠和小肠保存在CO2环境中。在CO2环境中，将小肠前段、中段和后段以及大肠的内容物挤出到单独的容器中。
20ml厌氧缓冲液+1g小肠内容物(CO2吹入)+DON在CO2或H2／CO2环境下，37℃培养。
这里发现，小肠前段对活性冷冻干燥物的加入有明显的阳性作用。这一事实特别显著，在纯CO2环境下，显著的活性也可以被检测到。
第二个体外试验利用完整的几段猪小肠加入活性悬浮液进行。
几段猪小肠(前段、中段、后段、大肠，每段6-8cm)在厌氧、还原性的、预培养缓冲液(30ml)中37℃下与200ppmmDON培养24小时。
这种修饰的体外试验变体具有几乎不影响小肠生理条件的好处，因为在屠宰后迅速地将整个小肠运送到实验室，在那里剪成期望的长度片段。这些片段然后被分离，在有DON和活性培养物的缓冲溶液中培育。
结果是清楚的。通过活培养物的方式，可以将DON解毒为DOM-1。这种活性可以显著地在小肠的所有各个部分显示出来，强烈的活性特别表现在前段小肠。食物吸收的大部分和真菌毒素等的释放均发生在那里，因此是相当重要的。
根据本发明的微生物在纯培养物(DSM11798)和该微生物与铅黄肠球菌(DSM11799)及其它厌氧微生物，特别是肠球菌属、链球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属或乳杆菌属的混合培养物中的作用，随后借助涉及幼鸡细胞培养物的实验室方法，在饲喂猪和鸡的实施例中显示。
借助利用鸡细胞培养物的实验室方法，显示出该微生物可化学降解真菌毒素，特别是单端孢菌毒素，尤其是脱氧瓜蒌镰菌醇和T-2毒素，特别是可以还原它们并转化它们为生理上可以接受的物质，对脱氧瓜蒌镰菌醇转化为脱环氧代谢物，即DOM-1。
为了培养鸡淋巴细胞，应符合下列条件：
所用细胞数：  2*106个细胞／毫升
促进剂：      ConA5微克／毫升
真菌毒素：    DON，DOM-1和T-2毒素，
浓度范围：    DON：10-0.08微克／毫升
              DOM-1：232-1.81微克／毫升
              T-2毒素：30-0.234纳克／毫升
总培养时间：44小时，其中在培养在40℃，5％CO2，饱和水蒸气环境中标记16小时。
借助利用鸡淋巴细胞培养物的实验室方法，显示出活性培养物可以生物化学降解真菌毒素，特别是单端孢菌毒素，特别是可以还原它们，和转化它们为生理上可以接受的物质。通过DON试验和它的去环氧代谢物DOM-1以举例方式显示如下：显微镜检查细胞培养物：
含有鸡淋巴细胞的细胞培养物在培养期间连续进行显微镜检查。在20小时后检查：
未刺激细胞稠密且不均匀分布，对使用ConA的检查显示出有效刺激和显著的繁殖位点。
DON：繁殖位点可以在各个浓度阶段观察到，然而很明显，在浓度为10微克／毫升-0.625微克／毫升范围内可观察到繁殖位点随毒素浓度增加而显著减少。
DOM：在最高至58微克／毫升的所有浓度阶段与对比组相比，繁殖位点没有明显的改变。
这意味着甚至在20小时后，在毒素分批组中，从0.625微克／毫升开始存在对于细胞活性显著的负作用，然而对于脱环氧代谢物自身，即使浓度为58微克／毫升也没有观察到对细胞培养物的负作用。28小时后和44小时后检查：
对比组(未刺激的和ConA)未改变。
DON对细胞培养物的作用又增加了。在甚至20小时后观察到改变的那些系列中，观察到对细胞明显地损伤。
甚至在这样的培养时间后，还是不能发现对细胞活性的任何负作用，甚至在脱环氧代谢物的浓度为58微克／毫升时。
在第二个试验中，研究了饲料中根据本发明的饲料添加剂的作用，该饲料含有量为450ppb的脱氧瓜蒌镰菌醇真菌毒素，被喂给断奶仔猪。
动物：“长白”和“Land-rasse”的仔猪被分为负比较组、正比较组和试验组。试验直接从断乳后开始(20到22日龄仔猪)；动物的生长力参数在14天后测定。
饲喂：一种商业上可得到的仔猪初始食品(starter)在断乳后7天喂给仔猪，此后仔猪接受商业上可得到的仔猪生长饲料。为了把脱氧瓜蒌镰菌醇真菌毒素引入正比较组和试验组的饲料，脱氧瓜蒌镰菌醇毒枝菌以浓度为450ppb(溶解在乙醇中)与小量饲料样本混合。饲料可为动物随意取食。
饲料添加剂剂量：饲料添加剂以1千克／吨的量加到试验组的饲料中。所用的饲料添加剂是本发明的微生物与铅黄肠球菌(DSM11799)的混合培养物，加入硅酸铝到混合培养物作为载体。
微生物计数：最后饲料中4*108个细胞／千克
结果：结果简要列在表1中，列出了本试验中体重的平均生长率和饲料平均转化率，负比较组饲喂的饲料既不合有真菌毒素也不合本发明的微生物，正比较组饲喂的饲料含有真菌毒素，试验组饲喂的饲料含有真菌毒素和本发明的微生物。
表1
负比较组 正比较组 试验组
动物数量 45  45  45
试验时间(天) 14  14  14
重量增加/动物/天(克) 154.0  126.2  153.2
摄取的饲料/动物/天 247  226  246.5
损失(总计) 0  0  0
 FCR 1.60  1.79  1.61
讨论：从这个试验可知，饲料添加剂可以抵消脱氧瓜蒌镰菌醇污染物对断奶仔猪的负作用，接受真菌毒素和饲料添加剂的仔猪实质上和负比较组消耗同样数量的饲料，同时也显示同样的饲料转化率(FCR)。这些结果使得几乎完全可能通过本发明的混合培养物(DSM11799)来抵消脱氧瓜蒌镰菌醇的负作用。
在进一步的试验中，本发明饲料添加剂对单端孢菌毒素污染的抵抗作用表现在小鸡的饲喂中。所用的参数是最终体重、饲料摄取和饲料转化率以及小鸡损失数量。临床特征也被记录。
动物：Cobb小鸡从生命开始第一天起被研究。试验以三组进行，分别包括10700只、10900只和15700只小鸡。一种特定的小鸡饲料可供小鸡随意取食。
饲料添加剂剂量：小鸡饲料中含有1千克／吨量的饲料添加剂，只有试验组接受饲料添加剂。所用的饲料添加剂是微生物(DSM11798)的纯培养物。
微生物计数：最终饲料中含有1*109个细胞／千克
加入到试验组和正比较组饲料的单端孢菌毒素的总量为750ppb(500 ppb DON和250 ppb T-2毒素)。
结果：下表表示了所有三组的生长力参数。
表2
正比较组 负比较组 试验组
动物数量 10700 10900 15700
平均最终体重(千克) 1.806 1.91 1.92
平均饲料摄取(千克) 3.161 2.729 2.722
饲料转化率(FCR) 1.75 1.43 1.42
损失 205(1.92％) 175(1.61％) 248(1.58％)
临床观察：显著的食欲刺激(oral irritation)在正比较组群的许多动物中表现明显。
讨论：甚至在这种情况下，就生产力参数和临床症状来说饲料添加剂可以完全抵消单端孢菌毒素对于家禽的负作用。甚至对于家禽，可以观察到，除了真菌毒素也接受微生物DSM11798的试验组的小鸡，甚至比负比较组的平均最终体重稍高，并伴随略微较低的平均饲料摄取，结果甚至相对于负比较组有稍提高的生长力参数。应用含有本发明微生物的本发明的饲料添加剂时，表现出不仅真菌毒素的负作用被抵消，而且可使接受微生物DSM11798的动物的生长力得到进一步的增加。

Claims (26)

1．真杆菌属的微生物DSM11798，其为纯培养物、与铅黄肠球菌的株DSM11799的混合培养物，或与其它厌氧微生物的混合培养物，适于单端孢菌毒素的解毒。
2．根据权利要求1的微生物，其特征在于厌氧微生物选自肠球菌属、链球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属或乳杆菌属。
3．根据权利要求1或2的微生物，其特征在于它适于脱氧瓜蒌镰菌醇(DON)、T-2毒素、HT-2毒素、瓜蒌镰菌醇、monoacetoxyscirpenol、蛇形菌素、木霉菌醇、疣孢菌素、杆孢菌素、乙酰脱氧瓜蒌镰菌醇、异木霉菌素、羟基异木霉菌素、calonectrin、T-2醇、T-2三醇、脱乙酰新茄镰孢菌醇、新茄镰孢菌醇、乙酰新茄镰孢菌醇、sporotrichiol、trichotriol、接骨木镰菌醇和大镰刀孢菌素的解毒。
4．根据权利要求1、2或3的微生物，其特征在于该微生物通过还原性生物转化分子上所含的环氧基团解除单端孢菌毒素的毒性。
5．根据权利要求1至4之一的微生物，其特征在于它是一种厌氧、革兰氏阳性、杆状、不形成孢子的细菌，它单独、成对或长链状存在。
6．根据权利要求1至5之一的微生物，其特征在于它含有16 SRNA序列，即
1      CCTGGCTCAG GATGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATGCAAGTCGAAC GGATAACCCG
61     CCTCCGGGCG GTTATAGAGT GGCGAACGGG TGAGTAACACGTGACCAACC TACCTCCCAC
121    TCCGGGATAA CCCAGGGAAA CCTGCGCTAA TACCGGATACTCCGGGGCCC CCGCATGGGG
181    GCGCCGGGAA AGCCCCGACG GTGGGAGATG GGGTCGCGGCCTATTAGGTA GTCGGCGGGG
241     TAACGGCCCA CCGAGCCCGC GATAGGTAGC CGGGTTGAGAGACCGATCGG  CCACATTGGG
301     ACTGAGATAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATTTTGC  GCAATGGGGG
361     AAACCCTGAC GCAGCAACGC CGCGTGCGGG ACGAAGGCCTTCGGGTTGTA  AACCGCTTTC
421     AGCAGGGAAG AAGTTGACGG TACCTGCAGA AGAAGCTCCGGCTAACTACG  TGCCAGCAGC
481     CGCGGTAATA CGTAGGGAGC GAGCGTTATC CGGATTTATTGGGCGTAAAG  CGCGCGTAGG
541     CGGGCGCTTA AGCGGAATCT CTAATCTGAG GGCTCAACCCCCAGCCGGAT  TCCGAACTGG
601     GCGCCTCGAG TTCGGTAGAG GAAGACGGAA TTCCCAGTGTAGCGGTGAAA  TGCGCAGATA
661     TTGGGAAGAA CACCGATGGC GAAGGCAGTC TTCTGGGCCGTAACTGACGC  TGAGGTGCGA
721     AAGCTAGGGG AGCGAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCCTAGCCGTAAA  CGATGGGCAC
781     TAGGTGTGGG GGGGAATGCC CCTCCGTGCC GCAGCTAACGCATTAAGTGC  CCCGCCTGGG
841     GAGTACGGCC GCAAGGCTAA AACTCAAAGG AATTGACGGGGGCCCGCACA  AGCAGCGGAG
901     CATGTGGCTT AATTCGAAGC AACGCGAAGA ACCTTACCAGGGCTTGACAT  GCAGGTGAAG
961     CGGCGGAAAC GCCGTGGCCG AGAGGAGCCT GCACAGGTGGTGCATGGCTG  TCGTCAGCTC
1021    GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCCTGTCGT  ATGTTGCCAT
1081    CATTCAGTTG GGGACTCGTA CGAGACTGCC GGCGTCAAGCCGGAGGAAGG  TGGGGACGAC
1141    GTCAAGTCAT CATGCCCTTT ATGCCCTGGG CTGCACACGTGCTACAATGG  CCGGTACAAC
1201    GGGCTGCGAG CCAGCGATGG CGAGCGAATC CCTCAAAACCGGTCCCAGTT CGGATCGGAG
1261    GCTGCAACCC GCCTCCGTGA AGTCGGAGTT GCTAGTAATCGCGGATCAGC ATGCCGCGGT
1321    GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACCACCCGAGTTG TCTGCACCCG
1381    AAGTCGACGG CCCAACCCGC GAGGGGGGAG TCGCCGAAGGTGTGGGGAGT AAGGGGGGTG
1441    AAGTCGTAAC AAGGTAGCCG TACCGGAAGG TGCGGCT,
7．获取权利要求1-6之一的微生物培养物的方法，其特征在于DSM11799的混合培养物从微生物和牛瘤胃铅黄肠球菌得到，方法是通过厌氧培养条件下培养和／或发酵至少两次系列稀释物。
8．根据权利要求7的方法，其特征在于培养和／或发酵在H2和CO2气氛下进行。
9．根据权利要求8的方法，其特征在于该气体环境选自H2∶CO2的比率为10∶90到90∶10，特别是大约为80∶20。
10．根据权利要求7至9之一的方法，其特征在于培养和／或发酵在过压0.2至3巴下，特别是0.5至1巴下进行。
11．根据权利要求7至10之一的方法，其特征在于培养或发酵在35℃至42℃下进行，特别是37℃。
12．根据权利要求7至11之一的方法，其特征在于培养和／或发酵在pH在6到8之间，特别是7到7.5之间进行。
13．根据权利要求7至12之一的方法，其特征在于培养和／或发酵是在含有选自下列组分的培养基制品中进行：精氨酸、瓜氨酸、蛋白胨、酵母抽提物、脂肪酸混合物、矿物质溶液、葡萄糖、氯化血红素溶液、维生素K3、维生素溶液、微量元素、还原剂。
14．根据权利要求7至13之一的方法，其特征在于0.1到0.5％重量百分比，特别是2％重量百分比的葡萄糖在培养和／或发酵开始时被加入。
15．根据权利要求7至14之一的方法，其特征在于加入活的单端孢菌毒素解毒微生物和／或其它厌氧微生物的酶制剂。
16．根据权利要求7至15之一的方法，其特征在于微生物DSM11798的纯培养物通过从培养和／或发酵溶液，特别是在加入L-精氨酸作为生长促进剂的培养基制品中至少系列稀释两次的溶液中获取。
17．根据权利要求16的方法，其特征在于，对于培养基制品纯培养物的发酵，加入1到4％重量百分比的还原剂，特别是半胱氨酸／硫化钠／碳酸钠溶液混合物。
18．根据权利要求7至17之一的方法，其特征在于通过浓缩处理培养和／或发酵溶液，特别是通过离心或过滤和／或稳定化，特别是通过冷冻干燥、喷雾干燥或封装。
19．根据权利要求18的方法，其特征在于，通过加入填料或载体材料，如硅酸铝、硅藻土、碳水化合物、糖醇、淀粉、奶和乳清粉、蛋白水解物、酵母、PVPP来进行稳定化。
20．微生物纯培养物和／或混合培养物(DSM11798，DSM11799)用于制备饲料添加剂的应用。
21．根据权利要求20的应用，其特征在于纯培养物和／或混合培养物(DSM11798和DSM11799)作为特别是加入载体材料的冷冻干燥或喷雾干燥和／或封装稳定化物被应用。
22．用于在饲料中或动物消化道中灭活单端孢菌毒素的饲料添加剂，其特征在于该饲料添加剂含有根据权利要求1-6之一的微生物纯培养物和／或混合培养物，或根据权利要求7-19之一制备的微生物，剂量为每1000千克饲料105到1012个细胞／千克，特别是107到109个细胞／千克。
23．根据权利要求22的饲料添加剂，其特征在于它还含有一种载体材料和／或填料，剂量为0.5到8千克／1000千克饲料，特别是0.7到4千克／1000千克饲料。
24．根据权利要求23的饲料添加剂，其特征在于含有作为载体材料或填料的硅酸铝、硅藻土、碳水化合物、糖醇、淀粉、奶和乳清粉、蛋白水解物、酵母和／或PVPP。
25．根据权利要求22、23或24的饲料添加剂，其特征在于饲料添加剂由1到65％重量百分比，特别是5到50％重量百分比的喷雾干燥或冷冻干燥的微生物稳定化物和99到35％重量百分比，特别是95到50％重量百分比的载体材料或填料的混合物组成。
26．根据权利要求22到25之一的饲料添加剂用于在饲料中或动物消化道中灭活下列物质的应用：脱氧瓜蒌镰菌醇(DON)、T-2毒素、HT-2毒素、瓜蒌镰菌醇、monoacetoxyscirpenol、蛇形菌素、木霉菌醇、疣孢菌素、杆孢菌素、乙酰脱氧瓜蒌镰菌醇、异木霉菌素、羟基异木霉菌素、calonectrin、T-2四醇、T-2三醇、脱乙酰新茄镶孢菌醇、新茄镰孢菌醇、乙酰新茄镰孢菌醇、sporotrichiol、trichotriol、接骨木镰菌醇和大镰刀孢菌素。
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