CN106036377B - 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis） CAMT22361在降解T-2毒素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于毒素生物处理技术领域，具体公开了乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）CAMT22361在降解T‑2毒素中的应用，所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO.M2015295。所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361的发酵液与T‑2毒素反应72小时后对T‑2毒素降解率可以达到61％。将其应用在饲料中T‑2毒素的去除，降解率达到50%以上。本发明的乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361具有高效快速降解T‑2毒素的能力，在生物降解饲料等中T‑2毒素具有很好的应用前景。

Description

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis） CAMT22361在降解T-2毒 素中的应用

技术领域

本发明属于毒素生物处理技术领域，更具体地，涉及乳酸乳球 (Lactococcuslactis)CAMT22361在降解T-2毒素中的应用。

背景技术

T-2毒素即4，15-二乙酰氧基-8-(异戊酰氧基)-12，13-环氧单端孢霉-9- 烯-3醇，属倍半萜烯类化合物，为单端孢霉族毒素中的典型代表。主要由拟枝孢镰孢菌(Fusariumsporotricoides)、木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)、梨孢镰孢菌(Fusariumpose)、串珠镰孢菌(Fusariumacuminatum)等真菌产生的毒性次级代谢产物。T-2毒素可以通过不同途径对人畜的各种组织和器官产生毒害作用，尤其对增殖活跃细胞如骨髓、肝脏、淋巴细胞和粘膜上皮细胞等危害严重，最终可导致致畸，甚至致癌等。1973年，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织 (WHO)把T-2毒素划为自然界存在的最危险的食品污染源。T-2毒素不仅毒性强，而且污染率较高。随着国际贸易的发展和国际粮食运输日渐频繁，加速了产毒真菌在世界范围内的传播，导致人类食用粮与动物饲料被污染的机率加大。因此，预防产毒真菌的污染、T-2毒素的检测以及T-2毒素的有效降解等方面的研究引起广泛的关注。目前用于去除T-2毒素的物理法、化学法及生物法。

用于去除T-2毒素的物理法，如利用蒙脱石、铝硅酸盐、硅藻土、环湖精和凹凸棒石等，虽然对粮食或饲料中的T-2毒素有较高的脱除效率，但仍达不到完全清除的效果，甚至有的吸附剂还能将一定量的营养物质吸附掉。加热法利用热降解机制破坏毒素，操作简单，但需要设备且需要消耗能源。紫外与γ射线光辐照照射破坏毒素的化学结构，使之降解，该技术具备高效、快速和避免二次污染的优点，但需要投入辐照设备，且辐照对操作人员健康有一定的影响。

用于去除T-2毒素的化学法，如氢氧化钠、氨、次氯酸钠、臭氧、阿魏酸等，化学试剂可与毒素发生一定的化学反应，起到转化降解的作用，从而达到降低或去除的目的。总的来说，这类方法较物理法效果好，但化学试剂可能会有一定的残留，引起二次污染。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了乳酸乳球菌 (Lactococcuslactis)CAMT22361在降解T-2毒素中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种降解T-2毒素的方法。

本发明的再一个目的是提供一种降解饲料中T-2毒素的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361在降解T-2毒素中的应用，所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M2015295。

所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361在MRS平板上菌落呈圆形、不透明、菌落为白色突起、有光泽、边缘整齐，菌株革兰氏染色在显微镜下菌体形态为球形，革兰氏染色呈阳性。

本发明同时提供一种降解T-2毒素的方法，包括如下步骤：

S1.将乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361接种于培养基中，发酵得到培养液；

S2.将S1得到培养液加入到含T-2毒素的物质中，进行T-2毒素的降解；

所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015295。

优选地，S1中所述培养液的菌体浓度为(1～9)×10⁸CFU/mL。

优选地，S2中培养液按照6～8％的接种量加入到含T-2毒素的物质中。

优选地，所述含T-2毒素的物质为含T-2毒素的饲料。

本发明同时再提供一种降解饲料中T-2毒素的方法，包括如下步骤：

S1.将乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361接种于培养基中，发酵得到菌体浓度为(1～9)×10⁸CFU/mL培养液；

S2.将S1得到培养液按照6～8％的接种量加到饲料中，同时添加水分使发酵混料终水分含量达45～50％，35～38℃发酵，进行T-2毒素的降解；

所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015295。

将所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361的发酵液对T-2毒素进行降解，在72小时后其降解率可达到61％，将其应用在饲料中T-2毒素的去除，降解率达到50％以上。显示了其较强的降解效果。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一株具有降解T-2毒素的乳酸乳球菌CAMT22361，所述菌株能够显著降解T-2毒素，其发酵液与T-2毒素反应72小时后对T-2毒素降解率可以达到61％。将其应用在饲料中T-2毒素的去除，降解率达到50％以上。本发明的乳酸乳球菌CAMT22361具有高效快速降解T-2毒素的能力，在生物降解饲料等中T-2毒素具有很好的应用前景。

附图说明

图1为乳酸乳球菌CAMT22361形态特征图，A为菌落图，B为显微图。

图2为基于乳酸乳球菌CAMT22361的16S rRNA与相关菌种的系统发育树。SHAPE\*MERGEFORMAT。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1：菌株的分离与鉴定

乳酸菌分离：用灭菌海水冲洗沙虫表面，晾干，称取25g肠道样品并剪碎。采用10倍稀释法进行稀释，并涂布于含有1.5％钙的MRS固体培养基上，在25℃下培养3～5d后观察，挑取有溶钙圈的菌落纯化，然后进行革兰氏染色及过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株确认为乳酸菌，并进行斜面保存。

具有降解T-2毒素乳酸菌的筛选：将分离到的乳酸菌接种加到每毫升含有 50ngT-2毒素的改良的MRS液体培养基中，(改良的MRS培养基配方g/L：蛋白胨10g，牛肉膏10gK₂HPO₄ 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温-80l mL，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·4H₂O 0.25g，蒸馏水1000mL， pH 6.2～6.4)，使菌的浓度达到10⁸CFU/mL，与不接菌的做对照。将其放在37℃下150r/min摇床培养72h。再吸取发酵液2mL于一玻璃管中，并加入2mL乙酸乙酯，超声萃取10min，旋涡混合5min，4000r/min离心10min，取上层液于另一玻璃管中，反复提取3次，合并提取液。将提取液在60℃氮吹仪下吹干。吸取2mL 30％甲醇水溶解，旋涡5min，用一次性无菌注射器吸取，并经过0.22 uL滤膜过滤于样品瓶中，通过LC-MS/MS检测。结果发现，接种菌株CAMT22361 的与对照的(即没有接种CAMT22361)相比，其T-2毒素的降解率为61％。由此筛选到降解T-2毒素能力较强的菌株CAMT22361。

乳酸乳球菌CAMT22361形态学和生化鉴定：在MRS平板上菌落凸起、圆形、边缘整齐、乳白色、不透明的光滑型菌落(见图1，A)；细胞为球形，革兰氏染色呈阳性(见图1，B)；其生长温度范围为10℃～45℃，最适生长温度是30℃；其生长pH范围为3～10，最适pH为6～7；不运动，能发酵麦芽糖、半乳糖、核糖、乳糖产酸，水解精氨酸，不发酵蜜二糖、棉籽糖和松三糖，不产生硫化氢，还原0.1％的美兰牛乳，可忍受4.5％的NaCl。

乳酸乳球菌CAMT22361基因水平鉴定:通过16S rDNA特异性引物(27F 与1492R)进行PCR扩增，27F的序列见SEQ ID NO：2所示，1492R的序列见 SEQ ID NO：3所示，并经生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并将所测基因序列与GenBank相关数据进行BLAST相似性分析，下载相似性高的相关菌株的模式菌株序列，利用MEGA 5.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joiningmethod)进行聚类分析和系统进化树构建，乳酸乳球菌 CAMT22361系统发育树见图2。

乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M2015295。

实施例2：

1、乳酸乳球菌CAMT22361活化

在超洁净操作台中，挑取上述乳酸乳球菌CAMT22361接种在实施例1中改良的 MRS液体培养基中(pH为6.2～6.4)，37℃摇床培养24h，得到活化菌液。

2、接种发酵液

在超洁净操作台中，取一定量活化菌液，10000r/min离心2min，弃上清，用无菌生理盐水洗两次沉淀后重悬到原来体积，以无菌水为空白对照，测OD₆₀₀nm，并用无菌生理盐水稀释至吸光值为0.3，制成菌悬液，并按1％的接种量将菌悬液接种在改良的MRS液体培养基中上，使肉汤培养基的初始菌数大约为 10⁸CFU/mL。

3、T-2毒素的添加

添加T-2毒素到初始菌数大约为10⁸CFU/mL的改良的MRS液体培养基中，T-2 毒素初始浓度为50.0ng/mL。以含有50.0ng/mL的T-2毒素的无菌PBS作为对照。悬浮液于37℃摇床培养72h(150r/min)。

4、T-2毒素提取与检测

菌株的发酵液取三管，每管2mL，加入2mL乙酸乙酯，超声萃取10min，旋涡混合5min，4000r/min离心10min，取上层液于另一试管中，反复提取3次，合并提取液。将提取液在60℃氮吹仪下吹干。吸取2mL 30％甲醇水溶解，旋涡5 min，用一次性无菌注射器吸取，并经过0.22uL滤膜过滤于样品瓶中，通过 LC-MS/MS检测，记录实验数据。

其中，LC-MS/MS方法检测条件如下：

液相色谱质谱联用仪：TSQ Quantum Access，美国THERMO Fisher；

4.1色谱条件

色谱柱：Hypersil Gold(100mm×2.1mm,5μL)；流动相：甲醇-5mmol/L乙酸铵溶液(含0.1％甲酸)。进样量：10μL；针头到瓶底距离：1.0mm；进样速度：10.0 μL/s；淋洗体积：1500μL；淋洗速度：100.00μL/s；

冲洗体积：1500μL；进样速度：250.0μL/min。梯度洗脱条件见表1。流动相： A：甲醇B：5mmol/L乙酸铵溶液(含0.1％甲酸)

表1

时间(min)	A(％)	B(％)
			0.00	30.0	70.0
3.00	90.0	10.0
			5.00	90.0	10.0
5.10	30.0	70.0
			8.00	30.0	70.0

4.2质谱条件

喷雾电压：4500V；鞘气压力：35au；辅助气压：15au；毛细管温度：270℃；碰撞压：1.5mTorr。离子化模式电喷雾电离正离子(ESI+)模式，选择二级质谱中响应值较高的两个子离子作为定性离子，响应值最高的作为定量离子进行选择离子扫描模式质谱条件优化，结果如表2所示。

表2

5、数据处理

T-2毒素的去除率计算：

T-2去除率/％＝(1-样品中T-2含量/空白对照中T-2含量)×100

计算得到本发明CAMT22361发酵72h后其发酵液T-2降解率为61％。(样品中添加毒素初始浓度为50ng/mL)。

实施例3：乳酸乳球菌CAMT22361对南美白对虾饲料中T-2毒素的降解作用1、乳酸乳球菌CAMT22361菌悬液制备

在超洁净操作台中，挑取斜面保存的乳酸乳球菌CAMT22361接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养24～28h，使菌悬液终浓度达到10⁸CFU/mL。

2、T-2毒素毒液配制

精确称取T-2毒素标准品(Enzo，USA，纯度≥98％)1mg溶解在乙腈，定容至1mL，配制成1mg/mL T-2毒素毒液。

3、南美白对虾带毒饵料的制备

将对虾基础饲料(进口鱼粉33％，乌贼粉4％，豆粕18％，花生粕8％，虾糠4％，矿物质预混料1％，高筋面粉22％，鱼油1％，大豆磷脂3％，预混料5.7％，复合维生素0.3％，粉碎至全部饲料通过40目筛。将2mL T-2毒素毒液均匀喷洒在1Kg粉碎后的对虾基础饲料中，即每Kg饲料中含2mg T-2毒素。

4、接种发酵液降解T-2毒素

将浓度为10⁸CFU/mL菌悬液按8％的接种量以喷洒的方式均匀接种到含T-2毒素的南美白对虾饵料中，同时仍以喷洒方式补加水份，使发酵混料的水分含量达 45～50％，37℃静止发酵4天，取出晾干。

5、南美白对虾中T-2毒素降解率检测

称取接种发酵后对虾带毒饵料2.0g，加入15mL乙酸乙酯，10,000r/min均质均匀，超声并振荡10min，4 000r/min，离心10min，取上清，残渣再加入15mL 乙酸乙酯，同样操作，重复2次，合并上清液。将上述上清提取液用氮吹仪浓缩吹干，用1mL 30％甲醇复溶，采用实施例2中LC-MS/MS方法检测条件检测 T-2毒素含量。

测定后，乳酸乳球菌CAMT22361发酵后的每Kg饲料含T-2毒素0.88mg，按T-2去除率/％＝(1-样品中T-2含量/空白对照中T-2含量)×100计算，T-2去除率为56％。

实施例4：乳酸乳球菌CAMT22361对罗非鱼饲料中T-2毒素的降解作用

1、乳酸乳球菌CAMT22361菌悬液制备

在超洁净操作台中，挑取斜面保存的乳酸乳球菌CAMT22361接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养24-28h，使菌悬液终浓度达到10⁸CFU/mL。

2、T-2毒素毒液配制

精确称取T-2毒素标准品(Enzo，USA，纯度≥98％)1mg溶解在乙腈，定容至1mL，配制成1mg/mL T-2毒素毒液。

3、罗非鱼带毒饵料的制备

将罗非鱼基础饲料(麦皮10％，次粉20％，进口鱼粉12％，豆粕30％，米糠5％， Ca(H₂PO₄)2 1％，菜籽粕20％，预混料2％)混匀并粉碎，粉碎至全部饲料通过 40目筛。将2mLT-2毒素毒液均匀喷洒在1Kg粉碎后的对虾基础饲料中，即每 Kg饲料中含2mg T-2毒素。

4、接种发酵液降解T-2毒素

将浓度为10⁸CFU/mL菌悬液按8％的接种量以喷洒的方式均匀接种到含T-2毒素的罗非鱼饵料中，仍以喷洒方式补加水份，使发酵混料终水分含量达45～50％，37℃静止发酵4天，取出晾干。

5、罗非鱼饲料中T-2毒素降解率检测

称取接种发酵后罗非鱼饵料2.0g，加入15mL乙酸乙酯，10,000r/min均质均匀，超声并振荡10min，4 000r/min，离心10min，取上清，残渣再加入15mL乙酸乙酯，同样操作，重复2次，合并上清液。将上述上清提取液用氮吹浓缩吹干，用1mL 30％甲醇复溶，采用实施例2中LC-MS/MS方法条件检测T-2毒素含量。

测定后，乳酸乳球菌CAMT22361发酵后的每Kg饲料含T-2毒素0.94mg，按T-2去除率/％＝(1-样品中T-2含量/空白对照中T-2含量)×100计算，T-2去除率为53％。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东海洋大学

<120> 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis） CAMT22361在降解T-2毒素中的应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 898

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

ctaatacatg caagttgagc gctgaaggtt ggtacttgta ccgactggat gagcagcgaa 60

cgggtgagta acgcgtgggg aatctgcctt tgagcggggg acaacatttg gaaacgaatg 120

ctaataccgc ataaaaactt taaacacaag ttttaagttt gaaagatgca attgcatcac 180

tcaaagatga tcccgcgttg tattagctag ttggtgaggt aaaggctcac caaggcgatg 240

atacatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc 300

ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg caatggacga aagtctgacc gagcaacgcc 360

gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg gtagagaaga acgttggtga 420

gagtggaaag ctcatcaagt gacggtaact acccagaaag ggacggctaa ctacgtgcca 480

gcagccgcgg taatacgtag gtcccgagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc 540

gcaggtggtt tattaagtct ggtgtaaaag gcagtggctc aaccattgta tgcattggaa 600

actggtagac ttgagtgcag gagaggagag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 660

agatatatgg aggaacaccg gtggcgaaag cggctctctg gcctgtaact gacactgagg 720

ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780

agtgctagat gtagggagct ataagttctc tgtatcgcag ctaacgcaat aagcactccg 840

cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaag 898

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

1.乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)CAMT22361在降解T-2毒素中的应用，其特征在于，所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015295。

2.一种降解T-2毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361接种于培养基中，发酵得到培养液；

S2.将S1得到培养液加入到含T-2毒素的物质中，进行T-2毒素的降解；所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015295。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1中所述培养液的菌体浓度为(1～9)×10⁸CFU/mL。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，S2中培养液按照6～8％的接种量加入到含T-2毒素的物质中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含T-2毒素的物质为含T-2毒素的饲料。

6.一种降解饲料中T-2毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361接种于培养基中，发酵得到菌体浓度为(1～9)×10⁸CFU/mL培养液；

S2.将S1得到培养液按照6～8％的接种量加到饲料中，同时添加水分使发酵混料终水分含量达45～50％，35～38℃发酵，进行T-2毒素的降解；

所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT 22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015295。