CN102181376A - 同时降解玉米赤霉烯酮和纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时降解玉米赤霉烯酮和纤维素的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB01G CGMCC No.4297及其培养方法。本发明还涉及所述菌株的发酵液用于降解玉米赤霉烯酮和纤维素的方法，通过所述方法，枯草芽孢杆菌与玉米赤霉烯酮反应72小时对其的降解率可达到83％；枯草芽孢杆菌的发酵液的纤维素酶活为198.9U/g。本发明的枯草芽孢杆菌降解玉米赤霉烯酮的活性高、特异性强、作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，而且同时还能降解纤维素，提高饲料转化率。

Description

同时降解玉米赤霉烯酮和纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及枯草芽孢杆菌，具体涉及一种能够同时降解玉米赤霉烯酮和纤维素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其培养方法和应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一类对谷物、粮食和饲料污染比较广泛和严重的霉菌毒素。ZEN是一类2，4-二羟基苯甲酸的内酯化合物，具有类雌性激素作用，可与子宫内雌激素受体不可逆结合从而影响动物的生殖生理。动物采食ZEN污染的饲料后会引起体重下降或引发疾病，还可导致畜产品及其加工制品中的毒素及其代谢产物的残留。动物ZEN中毒的临床症状包括饲料转化率降低、器官重量发生变化、动物生育力下降以及行为异常。间接通过食物链进入人体的ZEN也严重威胁人类健康。因此，有效控制和解决霉菌毒素对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能和提高人类食品安全有非常重要的意义。

霉菌毒素传统的物理和化学去毒方法存在效果不稳定、营养成分损失大、影响饲料适口性，且难以规模化生产等缺点而不能被广泛应用到实际生产中。微生物及生物酶解毒因具有解毒效率高、特异性强、对饲料和环境没有污染等特点和优势，备受研究者的关注。研究报道许多真菌包括粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)、米根霉(R.oryzae)、葡枝根霉、少根根霉(R.arrhizus)、黑曲霉(A.section Nigri)、解毒毛孢酵母(Trichosporon mycotoxinivorans)能生物降解ZEN。而关于细菌降解ZEN的报道较少。

纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同时也是地球上数量最大的可再生资源。目前，自然界中纤维素仅有一少部分得到了利用，绝大多数纤维素被白白浪费。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属和漆斑霉属。其中尤以木霉属的产量居多，里氏木霉、康氏木霉(T.koningii)和绿色木霉(T.viride)等是木霉属中酶活性较高的菌种。细菌产生的纤维素酶目前研究较多的是纤维素粘菌属、生孢纤维粘菌属和纤维杆菌。

目前对霉菌毒素或纤维素降解菌的研究多是集中在对菌株的筛选和分离鉴定上，只是针对菌株单一特性或功能的研究，目前还没有发现能同时具有降解玉米赤霉烯酮和纤维素功能、并具有益生性和抗逆性功能的枯草芽孢杆菌的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是筛选出一株同时具有降解玉米赤霉烯酮和纤维素功能的枯草芽孢杆菌，从而同时解决饲料中玉米赤霉烯酮残留危害动物以及人类健康的问题，以及饲料中纤维素降解低的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种同时降解玉米赤霉烯酮和纤维素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB01G，已于2010年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4297。

所述枯草芽孢杆菌是发明人经过筛选得到的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB01G，其细胞形态和理化特征见表1：

表1.细胞形态和理化特征

试验项目	结果	试验项目	结果
				革兰氏染色	+	利用碳水化合物产酸	-
细胞形状	杆状	葡萄糖	+
				细胞直径＞1μm	+	木糖	+
形成芽孢	+	L-阿拉伯糖	+
				芽孢膨大	-	甘露醇	+
芽孢圆形	-	利用葡萄糖产气	-
				接触酶	+	利用柠檬酸盐	+
氧化酶	+	50℃生长	-
				厌氧生长	-	pH5.7生长	+
VP试验	+	7％NaCl生长	+
				VP＜pH6	+	淀粉水解	+
VP＞pH7	-	分解酪素	+
				甲基红试验	-	硝酸盐还原	+

本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌的培养方法，具体为：取活菌浓度为10⁹CFU/ml的所述枯草芽孢杆菌0.5-2.5ml，接种于50-100ml培养基中进行摇瓶发酵培养。

优选地，取活菌浓度为10⁹CFU/ml的所述枯草芽孢杆菌1.5ml，接种于80ml培养基中进行摇瓶发酵培养。

所述发酵培养基由如下组分组成：胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5-4g、七水硫酸镁0.5-1.5g，加蒸馏水至800-1200ml，pH值为7.0-7.4。

优选地，所述发酵培养基由如下组分组成：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g、蒸馏水1000ml，pH值为7.2。

所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度30-40℃，发酵时间20-30h，转速180-220r/min，pH值7.0-7.4。

优选地，所述发酵条件为：发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间24h。

本发明还提供一种降解玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括如下步骤：取按照上述发酵条件得到的枯草芽孢杆菌的发酵液600-800μl，加入500ppb的玉米赤霉烯酮150-200μl，将反应体系的pH值调节为7.0-7.4，在36-38℃反应2-72h。

本发明还提供一种降解玉米赤霉烯酮的活性蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤：取按照上述发酵条件得到的枯草芽孢杆菌的发酵液，离心除菌体后得上清液，向上清液中加入2-4倍量无水乙醇，优选加入3倍量的无水乙醇，进行沉淀0.5-2h，离心(5000r/min，10min)；将得到的沉淀用0.01mol/L PBS缓冲液洗涤，再离心除去残余的乙醇。将得到的沉淀溶于0.01mol/L PBS缓冲液，冻干浓缩得到活性蛋白。

其中，所述0.01mol/L PBS缓冲液的制备步骤为：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.5，加蒸馏水定容至1000ml。

本发明的另一个目的是提供一种降解纤维素的方法，该方法包括如下步骤：取按照上述发酵条件得到的枯草芽孢杆菌的发酵液0.5-2ml，接种到只有纤维素作为碳源的25-100ml碳源培养基中进行发酵，发酵温度为36-38℃，pH值7.0-7.4，转速180-220r/min，发酵时间20-30h。

优选地，取枯草芽孢杆菌的发酵液1ml，接种到只有纤维素作为碳源的50ml碳源培养基中进行发酵，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间24h。

其中，所述碳源培养基由如下组分组成：CMC₂Na 18.0-22.0g，胰蛋白胨1.5-2.5g，(NH₄)₂SO₄ 1.5-2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4g，KH₂PO₄ 3.0-5.0g，加蒸馏水至1000ml，自然pH。

优选地，所述碳源培养基由如下组分组成：CMC₂Na 20.0g，胰蛋白胨2.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，KH₂PO₄ 4.0g，蒸馏水1000ml，自然pH。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌ANSB01G CGMCC No.4297在降解玉米赤霉烯酮和/或纤维素的应用。

优选地，将所述枯草芽孢杆菌用于降解饲料中的玉米赤霉烯酮和/或纤维素。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌ANSB01G CGMCC No.4297在抑制鸡白痢沙门氏菌和/或大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌、以及抵抗胃酸和/或胆盐中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明的枯草芽孢杆菌能够分泌降解玉米赤霉烯酮的活性蛋白，其降解效率高、特异性强，对玉米赤霉烯酮的降解率可达到83％，且本解毒反应为不可逆的生物降解。

2)本发明的枯草芽孢杆菌对玉米赤霉烯酮的解毒活性高，作用专一，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，对饲料的感官品质没有影响。

3)本发明的枯草芽孢杆菌降解玉米赤霉烯酮的方法操作简单，对饲料和环境没有污染，有效地解决了传统去毒方法存在的问题。

4)本发明的枯草芽孢杆菌还能够分泌纤维素酶，可以降解饲料中含所含的纤维素，提高动物对纤维素的利用率。

5)本发明枯草芽孢杆菌具有抑制鸡白痢沙门氏菌和/或大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌等益生功能，并且具有抵抗胃酸和胆盐的能力，有益于动物身体健康。

6)本发明的枯草芽孢杆菌具有同时降解玉米赤霉烯酮和纤维素的功能，解毒效率高，对动物具有益生性和抗逆性能，无毒无害，该株芽孢杆菌可以直接添加在饲料中，非常适用于作为动物饲料添加剂。

附图说明

图1为菌株筛选的流程图；

图2为本发明的菌株对玉米赤霉烯酮的降解率；

图3为本发明的菌株分泌的活性蛋白对玉米赤霉烯酮的降解率；

图4为本发明的菌株对鸡白痢沙门氏菌的抑制效果；

图5为本发明的菌株对大肠杆菌的抑制效果；

图6为本发明的菌株对金黄色葡萄球菌的抑制效果；

图7为四种不同枯草芽孢杆菌对玉米赤霉烯酮的降解率比较；

图8为四种不同枯草芽孢杆菌对纤维素降解酶活的比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 菌株的筛选方法

菌株的筛选流程如图1所示，具体步骤如下：

1)菌株筛选：本研究从动物肠道内容物、霉变饲料、霉变食品和自然环境中进行菌种的筛选。

种子液制备：分别将各肠道内容物样品以及从环境中取得的样品与两倍体积的无菌水混合，置于灭菌18mm×180mm试管中，振荡过夜；吸取上清液0.1ml，分别与0.8ml的筛选培养基混合，于15℃恒温箱震荡培养12h，得种子液。

其中，筛选培养基的配方为：0.25g NaH₂PO₄、1.0g NH₄NO₃、0.25g MgSO₄.·7H₂O、0.001g FeSO₄、17g琼脂、2.0g葡萄糖，加蒸馏水至1000ml，pH 7.0；121℃蒸汽灭菌20min。

样品初筛：分别将100μl玉米赤霉烯酮毒素(500μg/ml)加入各种子液，以不接菌的筛选培养基加玉米赤霉烯酮毒素作为空白对照，漩涡震荡混匀，置于15℃培养箱静置培养96h，使用酶联免疫试剂盒对其进行毒素降解率的分析。

菌株分离：选择毒素降解效率最高的种子液，吸取种子液0.1ml，用发酵培养基梯度稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，分别取0.2ml各稀释样品溶液，涂布于种子培养基的平板，15℃恒温箱培养三天，观察结果，根据不同菌落的形态和特征，将有代表性的菌落逐一挑出，在新鲜的种子培养基平板上划线纯化，分别编号并转接至保存培养基斜面保存。

其中，种子培养基的配方为：牛肉膏3g、胰蛋白胨5g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、10g NaCl，加蒸馏水至1000ml，121℃蒸汽灭菌20min；

发酵培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g，加蒸馏水至1000ml，pH值为7.2，121℃蒸汽灭菌20min；

菌种保存培养基的配方为：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g、琼脂18g，pH值为7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

菌株复筛：将上述分离纯化的菌株接种到发酵培养基中接种后浓度为2％，15℃发酵24h，分别取900μl发酵液，与100μl毒素(500μg/ml)置于18mm×180mm试管中，以不接菌的发酵培养基加毒素作为空白对照，置于15℃培养箱静置培养96h，测定毒素的剩余量，计算毒素降解率。

毒素的提取及代谢产物测定参照Young et al.(2006)的方法。取500μl反应混合液，与等体积甲醇混合，静置2h后在6000g离心10min，上清液用0.2μm滤膜过滤，用于液质联用分析。

2)DGGE图谱的应用：PCR-DGGE是指聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳相结合的方法，在本研究中用来分析样品中微生物菌落构成的多样性，作为菌种筛选的一个重要参考条件。

3)益生性与抗逆性的研究：益生性的研究是通过以大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌为指示菌，观察本发明的菌株对指示菌的抑制作用。

抗逆性研究是将本发明的菌株接种到模拟胃液以及模拟胆盐中，37℃培养24小时，检测菌的存活率，从而判断其对胃肠道环境的抵抗作用。

4)菌种鉴定：采用细菌16S rDNA基因序列测定方法，对降解效率高的菌株进行16S rDNA基因序列测定，对其进行菌种鉴定。

数据处理：测序结果在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得与菌株16SrDNA同源的公认标准序列数据，并将结果提交Genbank数据库。

实施例2 本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB01G CGMCC No.42971.5ml(活菌浓度为10⁹CFU/ml)，接种于80ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间24h。

其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g、蒸馏水1000ml，pH值为7.2。

发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

实施例3 本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB01G CGMCC No.42970.5ml(活菌浓度为10⁹CFU/ml)，接种于50ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为30℃，pH值7.0，转速180r/min，发酵时间20h。

其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：胰蛋白胨8g、酵母浸膏1.5g、葡萄糖1.5g、牛肉膏2g、氯化钠3g、磷酸氢二钠2.5g、七水硫酸镁0.5g、蒸馏水800ml，pH值为7.0。

发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

实施例4 本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB01G CGMCC No.42972.5ml(活菌浓度为10⁹CFU/ml)，接种于100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为40℃，pH值7.4，转速220r/min，发酵时间30h。

其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：胰蛋白胨12g、酵母浸膏3g、葡萄糖4g、牛肉膏5g、氯化钠6g、磷酸氢二钠4g、七水硫酸镁1.5g、蒸馏水1200ml，pH值为7.4。

发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

实施例5 本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB01G CGMCC No.4297 1ml(活菌浓度为10⁹CFU/ml)，接种于60ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为35℃，pH值7.3，转速190r/min，发酵时间28h。

其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：胰蛋白胨9g、酵母浸膏1.5g、葡萄糖1.5g、牛肉膏3.5g、氯化钠4.5g、磷酸氢二钠2.5g、七水硫酸镁1.0g、蒸馏水1000ml，pH值为7.3。

发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

实施例6 本发明的枯草芽孢杆菌用于降解玉米赤霉烯酮

吸取800μl实施例2得到的枯草芽孢杆菌发酵液，与200μl玉米赤霉烯酮(500ppb)反应；对照组为800μl 0.01mol/L PBS缓冲液中加入200μl玉米赤霉烯酮(500ppb)；将反应体系的pH值调节为7.2，处理组和对照组分别在37℃反应2h、12h、24h、48h以及72h。

将反应后得到的各样品离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用酶联免疫试剂盒检测法检测玉米赤霉烯酮的浓度。

检测结果：枯草芽孢杆菌反应2小时对玉米赤霉烯酮的降解率为23％，反应24小时对玉米赤霉烯酮的降解率为54％，反应48小时对玉米赤霉烯酮的降解率为71％，枯草芽孢杆菌反应72小时对玉米赤霉烯酮的降解率为83％(见图2)。

实施例7 本发明枯草芽孢杆菌分泌的降解玉米赤霉烯酮的活性蛋白的制备方法

取实施例2得到的枯草芽孢杆菌发酵液，离心除菌体后得上清液，加3倍量无水乙醇进行沉淀，沉淀1h后离心(5000r/min，10min)。得到的沉淀用0.01mol/L PBS缓冲液洗涤，再离心去除残余的乙醇。得到的沉淀溶于0.01mol/L PBS缓冲液，冻干浓缩得到活性蛋白。

PBS(0.01mol/L)的制备过程：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.5，最后加蒸馏水定容至1000ml即可。

实施例8 利用本发明枯草芽孢杆菌分泌的活性蛋白降解玉米赤霉烯酮

取实施例7制备的活性蛋白0.01g溶于1ml PBS(0.01mol/L)缓冲液制备活性蛋白溶液。取800μl活性蛋白溶液进行热处理(100℃加热10min)后与200μl玉米赤霉烯酮(500ppb)反应；另取800μl活性蛋白溶液加入蛋白酶K(0.01g蛋白酶K)反应两小时后，向混合液中加入200μl玉米赤霉烯酮。

取800μl实施例2得到的枯草芽孢杆菌发酵液和800μl未处理的活性蛋白溶液分别加入200μl玉米赤霉烯酮反应；对照组为800μl PBS(0.01mol/L)缓冲液中加入200μl玉米赤霉烯酮(500ppb)；分别在37℃反应72h后检测。

检测结果表明，经过热处理或蛋白酶K处理后的活性蛋白溶液降解率比未处理的发酵液和活性蛋白溶液降低55-70％(见图3)。

实施例9 本发明的枯草芽孢杆菌用于降解纤维素

1)取实施例2得到的枯草芽孢杆菌发酵液1ml，接种到只有纤维素作为碳源的50ml培养基中进行发酵，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间24h。结果发现本发明的枯草芽孢杆菌能够正常生长，并且发酵液中产生了大量的葡萄糖。

纤维素作为碳源培养基配方：CMC₂Na 20.0g，胰蛋白胨2.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，KH₂PO₄ 4.0g，蒸馏水1000ml，自然pH。

2)取实施例2得到的枯草芽孢杆菌发酵液，离心除菌体后得上清液，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测得到上清液浓度为66μg/ml，然后使用CMC-Na酶活测定方法测定纤维素酶活(详细方法参见：陆文清，刘伟.几种常见饲用酶制剂的酶活测定与分析.饲料工业.2000，21)。

检测结果：使用实施例2得到的发酵液离心除菌体后得上清液的纤维素酶活为198.9U/g

纤维素酶酶活定义：在pH值为5.0，40℃条件下每分钟水解CMC-Na释放出1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位U。

实验例1 本发明的枯草芽孢杆菌的益生性与抗逆性实验

1、益生性实验是通过以大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌为指示菌，观察对指示菌的抑制作用。

采用平板扩散的方法，LB平板在使用前置于37℃下培养24h，除去部分水分以便于抗菌物质在培养基中扩散。将枯草芽孢杆菌ANSB01G用接种棒取少许分别点种到LB平板中央，37℃培养24h，然后将平板倒扣于盛一薄层氯仿的培养皿盖上熏蒸约30min，以杀死活细胞并使菌落固定于平板的表面。移去培养皿盖，让平板里的残余氯仿彻底挥发40min。在平板表面铺一层刚培养好的指示菌培养液(大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌)，均匀涂布倾倒出剩余的菌液，晾干平板，置平板于37℃培养24h，观察点种的芽孢杆菌周围抗菌圈的大小和清晰程度，判断受试菌对指示菌的抗菌能力。

其中，所述LB平板是将121℃高温灭菌后的LB培养基，倒入灭菌后的平板，冷却后形成表面光滑的4mm厚的LB平板。所述LB培养基的配方为：胰蛋白胨12g、酵母浸膏3g、葡萄糖3g、牛肉膏5g、氯化钠6g、磷酸氢二钠3.5g、七水硫酸镁1.5g、蒸馏水1200ml，pH值为7.4。

枯草芽孢杆菌对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈直径为1.17cm(图4)，对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为1.11cm(图5)和1.09cm(图6)。

2、抗逆性实验是将菌种接种到模拟胃液以及模拟胆盐中培养，检测菌的存活率，从而判断其对胃肠道环境的抵抗作用。

1)取4℃保存的5ml实施例2制备得到的发酵液注入到离心管中，采用分级稀释，平板涂布。另取10ml实施例2制备得到的发酵液注入到离心管中，置于80℃水浴锅中加热15min。取加热后的菌液进行逐级稀释，平板涂布。最后将未加热和加热后的平板均在37℃条件下培养24h，分别计算枯草芽孢杆菌的数量。

结果表明，与未加热的菌液相比较，加热后的活菌数为未加热时的83％，即活菌存活率达到了83％。

2)模拟胃液的耐受性试验：将胃蛋白酶溶解在0.5％生理盐水中，使其终浓度为3g/L，并用浓盐酸或者10％的NaOH调整pH值到2.0。取0.5ml实施例2制备得到的发酵液分别加入到4.5ml的模拟胃液中和4.5ml的生理盐水中(即10倍稀释)，并迅速在振荡器上充分混和，然后置于37℃静置培养24h。在处理2h后取出培养液并立即计数残存活菌数。

结果表明，活菌存活率为79％。

模拟胆盐的耐受试验采用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为8.0，配成的溶液用0.45μm微滤膜过滤并除菌。将实施例2制备得到的菌液在生理盐水中与配好的模拟胆盐溶液中进行10倍分级稀释，然后LB平板涂布，置于37℃静置培养24h后取出并立即计数残存的活菌数。

结果表明，活菌存活率为82％。

实验例2 不同枯草芽孢杆菌菌株的对比试验

对四种不同枯草芽孢杆菌菌株同时进行降解玉米赤霉烯酮和纤维素试验，试验方法同实施例6和实施例9-2)，试验结果见表2、图7和图8。

表2 不同枯草芽孢杆菌菌株的对比试验

由表2可知，本发明的菌株ANSB01G对玉米赤霉烯酮的降解率远高于其他三株，且纤维素酶活U也大于其他三株，具有非常显著的差异。由此可见，本发明的菌株能够同时降解玉米赤霉烯酮和纤维素，其降解率和酶活均很高，非常适用于作为动物饲料添加剂。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB01G，其保藏编号为CGMCC No.4297。

2.一种权利要求1所述枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，取活菌浓度为10⁹CFU/ml的所述枯草芽孢杆菌0.5-2.5ml，接种于50-100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，所述发酵培养基由如下组分组成：胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5-4g、七水硫酸镁0.5-1.5g，加蒸馏水至800-1200ml，pH值为7.0-7.4。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度30-40℃，发酵时间20-30h，转速180-220r/min，pH值7.0-7.4。

4.一种降解玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，取权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵液600-800μl，加入500ppb的玉米赤霉烯酮150-200μl，将反应体系的pH值调节为7.0-7.4，在36-38℃反应2-72h。

5.一种降解玉米赤霉烯酮的活性蛋白的制备方法，其特征在于，取权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵液，离心，取上清液，加入2-4倍量无水乙醇进行沉淀0.5-2h，离心，将得到的沉淀用0.01mol/LPBS缓冲液洗涤，离心，将得到的沉淀溶于0.01mol/L PBS缓冲液，冻干浓缩得到活性蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述0.01mol/L PBS缓冲液的制备步骤为：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.5，加蒸馏水定容至1000ml。

7.一种降解纤维素的方法，其特征在于，取权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵液0.5-2ml，接种到只有纤维素作为碳源的25-100ml碳源培养基中进行发酵，发酵温度为36-38℃，pH值7.0-7.4，转速180-220r/min，发酵时间20-30h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述碳源培养基由如下组分组成：CMC₂Na 18.0-22.0g，胰蛋白胨1.5-2.5g，(NH₄)₂SO₄1.5-2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4g，KH₂PO₄ 3.0-5.0g，加蒸馏水至1000ml，自然pH。

9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌ANSB01G CGMCC No.4297在降解玉米赤霉烯酮和/或纤维素的应用。

10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌ANSB01G CGMCC No.4297在抑制鸡白痢沙门氏菌和/或大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌、以及抵抗胃酸和/或胆盐中的应用。

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