CN115305213A - 一株枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。本发明提供的枯草芽孢杆菌G‑3，保藏编号为CGMCC No.21708。本发明提供的枯草芽孢杆菌G‑3具有良好的降解禾谷镰刀菌毒素和/或黄曲霉毒素的作用。实施例的结果表明，本发明的枯草芽孢杆菌G‑3降解毒素的活性物质为胞外酶，该菌在液体培养条件下对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的降解率分别为92.03％、95.93％和85.25％；小鼠饲喂试验显示本发明所述枯草芽孢杆菌G‑3菌株对于3种毒素的降解产物为无毒的代谢产物，具有实际应用价值。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用。

背景技术

全球约四分之一的粮食或农副产品因受到霉菌毒素的污染而影响使用，霉菌毒素经饲料等进入人和动物体内，严重危害人和动物的生命健康。其中禾谷镰刀菌毒素、黄曲霉毒素(AFb1)等是最为常见的霉菌毒素，具有很强的生物毒性，性质稳定，难以去除。禾谷镰刀菌毒素包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，能够抑制DNA、蛋白质等的生物合成，人畜长期食用被污染的食物，会产生严重的毒性效应，导致肠道损伤和免疫功能的下降等。目前对于霉菌毒素的去除，主要有物理法、化学法和生物法。物理法去除霉菌毒素主要以吸附为主，并不能完全去除霉菌毒素，同时还会吸附营养物质，降低营养水平。化学法去除霉菌毒素不仅效果差，还会严重影响饲粮等的营养水平，降低适口性等。生物降解法作为生物法中最主要的毒素去除方式被广泛研究，菌株生长代谢过程中产生的活性物质对霉菌毒素的结构发生作用，将其降解为低毒或无毒产物，从而达到去除或降低霉菌毒素危害的目的。但是，目前的菌株降解毒素的效果不佳，迫切需要提供一株具有高效降解禾谷镰刀菌毒素和/或黄曲霉毒素的菌株。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌能够高效降解禾谷镰刀菌毒素和/或黄曲霉毒素。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G-3，保藏编号为CGMCCNo.21708。

本发明提供了上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-3的培养方法，包括如下步骤：将前述技术方案所述的枯草芽孢杆菌G-3接种至发酵培养基，得到枯草芽孢杆菌G-3菌液；

所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：8.0～10.0g/L葡萄糖，1.0～1.5g/L酵母膏，0.4～0.6g/L蛋白胨，0.04～0.06g/LMgSO₄和4.5～6.5g/LCaCO₃；所述发酵培养基的pH为7.2～7.4。

优选的，所述发酵培养的条件为：温度20～40℃，时间12～36h，转速150～200rpm。

优选的，所述枯草芽孢杆菌G-3以种子液的形式接种至发酵培养基；所述种子液的接种量为5.0％～6.0％。

优选的，所述种子液的培养方法为：将枯草芽孢杆菌G-3接种至种子培养基进行种子培养，得到种子液；

所述种子培养基包括如下质量浓度的组分：9.0～12.0g/L蛋白胨，2.0～3.0g/L牛肉膏和4.0～5.0g/L氯化钠；所述种子培养基的pH为7.4～7.6。

优选的，所述种子培养的条件为：温度20～40℃，时间8～16h，转速150～200rpm。

本发明提供了上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-3在降解禾谷镰刀菌毒素中的应用。

优选的，所述禾谷镰刀菌毒素包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇和/或玉米赤霉烯酮。

本发明提供了上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-3在降解黄曲霉毒素中的应用。

本发明提供了一种降解禾谷镰刀菌毒素和/或黄曲霉毒素的菌剂，包括上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-3。

有益效果：

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌G-3，保藏编号为CGMCC No.21708。本发明提供的枯草芽孢杆菌G-3具有良好的降解禾谷镰刀菌毒素和/或黄曲霉毒素的作用。实施例的结果表明，本发明的枯草芽孢杆菌G-3降解毒素的活性物质为胞外酶，该菌在液体培养条件下对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的降解率分别为92.03％、95.93％和85.25％；小鼠饲喂试验显示本发明所述枯草芽孢杆菌G-3菌株对于3种毒素的降解产物为无毒的代谢产物，具有实际应用价值。

生物保藏说明

枯草芽孢杆菌G-3，拉丁文为Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.21708，保藏日期2021年01月25日，保藏地址北京市朝阳区北辰路西路1号院3号。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌G-3的系统发育树；

图2为扫描电镜下黄曲霉和禾谷镰刀菌菌丝状态图；其中A1为正常的黄曲霉；B1为经枯草芽孢杆菌G-3处理过的黄曲霉；A2为正常的禾谷镰刀菌；B2为经枯草芽孢杆菌G-3处理过的禾谷镰刀菌；

图3为透射电镜下禾谷镰刀菌细胞结构；其中A1和A2为正常的禾谷镰刀菌；B1和B2为经枯草芽孢杆菌G-3处理过的禾谷镰刀菌；

图4为不同处理对小鼠肝脏形态学的影响，其中1、2为处理组T1，3、4为处理组T2，5、6为处理组T3；

图5为不同处理对小鼠肾脏形态学的影响，其中1、2为处理组T1，3、4为处理组T2，5、6为处理组T3；

图6为不同处理对小鼠脾脏形态学的影响，其中1、2为处理组T1，3、4为处理组T2，5、6为处理组T3。

具体实施方式

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G-3，保藏编号为CGMCCNo.21708。本发明提供的枯草芽孢杆菌G-3是从河北省保定市莲池区饲料厂的全株玉米青贮中分离得到。本发明所述的枯草芽孢杆菌G-3的菌落外形不规则，乳白色，不透明，有较小褶皱，中间微有褶皱凸起；革兰氏染色为紫色，是革兰氏阳性菌；芽孢染色显示有芽孢；厌氧生长-；V-P反应+；硝酸盐还原+；淀粉水解+；明胶液化+；利用丙酸盐-；D-甘露醇+；D-木糖+；L-阿拉伯糖+。

使用基因组提取试剂盒提取该菌株基因组DNA，并利用PCR技术测定16SrDNA基因序列全长为1500bp，通过使用Blast进行比对，根据GenBank提供的最高相似性序列构建系统发育树，结合生理生化特征，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明的枯草芽孢杆菌G-3能够高效降解禾谷镰刀菌毒素和/或黄曲霉毒素，在液体培养条件下对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的降解率分别为92.03％、95.93％和85.25％。本发明枯草芽孢杆菌G-3降解毒素的活性物质是胞外酶，小鼠饲喂试验显示3种毒素的降解产物均无毒。

本发明提供了上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-3的培养方法，包括如下步骤：将前述技术方案所述的枯草芽孢杆菌G-3接种至发酵培养基，得到枯草芽孢杆菌G-3菌液；

所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：8.0～10.0g/L葡萄糖，1.0～1.5g/L酵母膏，0.4～0.6g/L蛋白胨，0.04～0.06g/LMgSO₄和4.5～6.5g/LCaCO₃；所述发酵培养基的pH为7.2～7.4。

本发明所述枯草芽孢杆菌G-3优选以种子液的形式接种至发酵培养基。在本发明中，所述种子液的培养方法优选为：将枯草芽孢杆菌G-3接种至种子培养基进行种子培养，得到种子液。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌G-3接种至种子培养基前，优选对枯草芽孢杆菌G-3进行活化，以利于种子培养。

在本发明中，所述种子培养基优选包括如下质量浓度的组分：9.0～12.0g/L蛋白胨，2.0～3.0g/L牛肉膏和4.0～5.0g/L氯化钠；进一步优选包括10g/L蛋白胨，3.0g/L牛肉膏和5.0g/L氯化钠。在本发明中，所述种子培养基的pH优选为7.4～7.6；进一步优选为7.2～7.4；更进一步优选为7.2。在本发明中，所述种子培养的温度优选为20～40℃；进一步优选为35～40℃；更进一步优选为37℃。在本发明中，所述种子培养的时间优选为8～16h；更进一步优选为12～16h；更进一步优选为12h。在本发明中，所述种子培养的转速优选为150～200rpm；进一步优选为180～200rpm；更进一步优选为180rpm。本发明所述种子液的OD值优选为0.6～0.8；进一步优选为0.7。在本发明种子液限定的OD值的范围内，菌株处于生长的对数期，利于发酵培养的进行。

得到种子液后，本发明优选将种子液接种到发酵培养基进行发酵培养。在本发明中，所述种子液的接种量优选为5.0％～6.0％；进一步优选为5.5％～6.0％；更进一步优选为6％。在本发明中，所述发酵培养基优选包括如下质量浓度的组分：8.0～10.0g/L葡萄糖，1.0～1.5g/L酵母膏，0.4～0.6g/L蛋白胨，0.04～0.06g/LMgSO₄和4.5～6.5g/LCaCO₃；进一步优选包括如下质量浓度的组分：10g/L葡萄糖，1.5g/L酵母膏，0.5g/L蛋白胨，0.05g/LMgSO₄和6.0g/LCaCO₃。在本发明中，所述发酵培养基的pH优选为7.2～7.4；进一步优选为7.2～7.4；更进一步优选为7.2。在本发明中，所述发酵培养的温度优选为20～40℃；进一步优选为35～37℃；更进一步优选为37℃。在本发明中，所述发酵培养的时间优选为12～36h；更进一步优选为24～36h；更进一步优选为24h。在本发明中，所述种子发酵的转速优选为150～200rpm；进一步优选为180～200rpm；更进一步优选为180rpm。本发明特定的发酵条件更有利于发酵进行，使枯草芽孢杆菌G-3降解毒素的能力最强。

本发明提供的枯草芽孢杆菌G-3的培养方法，过程简单，可使枯草芽孢杆菌G-3得到扩大培养，以满足工艺生产的需要。

本发明提供了上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-3在降解禾谷镰刀菌毒素中的应用。在本发明中，所述禾谷镰刀菌毒素优选包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇和/或玉米赤霉烯酮。本发明所述枯草芽孢杆菌G-3具有良好的降解禾谷镰刀菌毒素的作用。本发明优选将所述枯草芽孢杆菌G-3与禾谷镰刀菌毒素共培养来达到降解禾谷镰刀菌毒素的目的；还优选利用所述枯草芽孢杆菌G-3的发酵液的上清液处理禾谷镰刀菌毒素，以达到降解禾谷镰刀菌毒素的目的。在本发明中，所述发酵液的上清液用于处理禾谷镰刀菌毒素时，优选将发酵液的上清液制备成冻干粉，然后将制备得到的冻干粉加入禾谷镰刀菌毒素溶液中进行处理。本发明对冻干粉的添加量没有特殊要求，当处理后毒素的残存量>0.1μg/mL时，继续添加冻干粉进行处理，直至毒素的残存量不足0.1μg/mL。

本发明提供了上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-3在降解黄曲霉毒素中的应用。本发明所述枯草芽孢杆菌G-3具有良好的降解黄曲霉毒素的作用。本发明优选将所述枯草芽孢杆菌G-3与黄曲霉毒素共培养来达到降解禾谷镰刀菌毒素的目的；还优选利用所述枯草芽孢杆菌G-3的发酵液的上清液处理黄曲霉毒素，以达到降解黄曲霉毒素的目的。在本发明中，所述发酵液的上清液用于处理黄曲霉毒素时，优选将发酵液的上清液制备成冻干粉，然后将制备得到的冻干粉加入黄曲霉毒素溶液中进行处理。本发明对冻干粉的添加量没有特殊要求，当处理后毒素的残存量>0.1μg/mL时，继续添加冻干粉进行处理，直至毒素的残存量不足0.1μg/mL。

本发明提供了一种降解禾谷镰刀菌毒素和/或黄曲霉毒素的菌剂，包括上述技术方案中所述的枯草芽孢杆菌G-3。在本发明中，所述菌剂中枯草芽孢杆菌G-3的活菌数优选为1×10⁷～1×10⁸CFU/mL。本发明提供的菌剂具有高效降解禾谷镰刀菌毒素和/或黄曲霉毒素的作用，对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的降解率分别为92.03％、95.93％和85.25％，得到的毒素降解产物为无毒代谢产物，无污染，具有实际应用价值。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一株枯草芽孢杆菌及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

枯草芽孢杆菌G-3的分离和鉴定

本发明的枯草芽孢杆菌G-3是从河北省保定市莲池区饲料厂的全株玉米青贮中分离得到。本发明所述的枯草芽孢杆菌G-3在NA培养基上生长，其中，NA培养基的制备方法为：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0～20.0g，蒸馏水溶解至1000mL，调节pH7.2～7.4。得到的菌落外形不规则，乳白色，不透明，有较小褶皱，中间微有褶皱凸起；革兰氏染色为紫色，是革兰氏阳性菌；芽孢染色显示有芽孢；厌氧生长-；V-P反应+；硝酸盐还原+；淀粉水解+；明胶液化+；利用丙酸盐-；D-甘露醇+；D-木糖+；L-阿拉伯糖+。

使用基因组提取试剂盒提取该菌株基因组DNA，并利用PCR技术测定16SrDNA基因序列全长为1500bp，通过使用Blast进行比对，根据GenBank提供的最高相似性序列构建系统发育树，结合生理生化特征，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，系统发育树的结果如图1。

实施例2

枯草芽孢杆菌G-3的培养方法

枯草芽孢杆菌G-3在NA固体培养基上活化，将活化的单菌落接种于100mL种子培养基中，在37℃的条件下培养12h，此时，培养物的OD值为0.6～0.8，为菌株对数生长期，即为种子液。其中，NA固体培养基由如下浓度的组分组成：10g/L蛋白胨、3.0g/L牛肉膏、5.0g/L氯化钠和20.0g/L琼脂，pH为7.2～7.4；种子培养基由如下浓度的组分组成：10g/L蛋白胨，3.0g/L牛肉膏和5.0g/L氯化钠，pH为7.2～7.4。

将种子液以6％的接种量接种于发酵培养基中，在37℃条件下培养1d，培养至稳定期，此时培养物的OD值为1.0～1.2，得到发酵液。其中，发酵培养基由如下浓度的组分组成：10g/L葡萄糖，1.5g/L酵母膏，0.5g/L蛋白胨，0.05g/LMgSO₄和6.0g/LCaCO₃，pH为7.2～7.4。

实施例3

枯草芽孢杆菌G-3消除毒素的活性物质鉴定

将实施例2得到的发酵液分成5份，并作如下处理：1)不作处理，作为发酵液组；2)将发酵液离心分离，取上清液，作为发酵液上清液组；3)将发酵液离心分离，取菌体，作为发酵液菌体组；4)将发酵液离心分离，取上清液，得到的上清液在沸水中处理10min，作为发酵液上清液+热处理组；5)将发酵液离心分离，取上清液，加入蛋白酶K(购自江苏康为世纪有限公司)在37℃处理1h，蛋白酶K在发酵液上清液中的浓度为80μg/mL，作为发酵液上清液+蛋白酶K组。将上述处理组分别与3种毒素(终浓度为10μg/mL)在37℃、180rpm培养72h，测定上述处理方式对3种毒素的降解率，初步鉴定枯草芽孢杆菌G-3消除毒素的活性物质性质。其中，3种毒素溶液的配制方法如下：用甲醇溶解毒素标准品，分别制成1.0mg/mL的AFB1、ZEN、DON溶液，微孔滤膜过滤，添加到已灭菌的发酵培养基中，使各毒素的终浓度为10μg/mL。使用酶联免疫试剂盒(北京华安麦科生物科技有限公司)测定各毒素的残存量，以不接种菌仅添加毒素的发酵培养基为空白对照。降解率＝(空白值-试验菌株残存值)/空白值×100％。其中，发酵培养基以及种子液的制备方法同实施例2；AFB1、ZEN、DON标准品均购自Sigma公司。检测结果见表1。

表1不同处理方式对3种毒素的降解率

由表1可知，本发明枯草芽孢杆菌G-3的发酵液离心上清液对各毒素的降解率与发酵液相比略有降低，但没有显著差异；而菌体对各毒素的降解率均不足10％，表明G-3对毒素的消除是通过代谢产物来分解的，而不是菌体细胞壁的吸附作用。发酵液离心上清液经热处理和蛋白酶K处理后对各毒素的降解率显著降低，表明降解3种毒素的代谢产物不耐高温和蛋白酶K。综合推测G-3菌株对3种毒素的降解方式是通过代谢产生的分解酶而起的作用。

实施例4

培养温度对枯草芽孢杆菌G-3消除毒素作用的影响

用甲醇溶解毒素标准品，分别制成1.0mg/mL的AFB1、ZEN、DON溶液，微孔滤膜过滤，分别添加到已灭菌的发酵培养基中，使各毒素的终浓度为10μg/mL。接种枯草芽孢杆菌G-3的种子液，接种量6.0％，在摇床转速为180r/min，发酵温度分别为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的条件下培养72h，测定不同发酵温度下各毒素的降解率。检测结果见表2。

表2枯草芽孢杆菌G-3在不同温度下对毒素的降解率

由表2的结果可知，随着培养温度的降低，菌株G-3对各毒素的降解率有所下降，但是在20～40℃之间差异不显著，15℃时尽管显著降低，但降解率仍维持在60％以上，在10℃时降解率降到30％左右。证明G-3菌株能够在较低温度下生长，并代谢产生毒素分解酶。

实施例5

枯草芽孢杆菌G-3对霉菌状态及细胞结构的影响

通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察枯草芽孢杆菌G-3对黄曲霉和禾谷镰刀菌菌丝状态以及细胞结构的影响。黄曲霉和禾谷镰刀菌平板的制备方法为：分别将7.0mL无菌水加入到黄曲霉和禾谷镰刀菌的斜面上，冲洗孢子制成孢子悬液，然后分别倒入PDA培养基中，制作两种霉菌平板。具体方法为：1)将枯草芽孢杆菌G-3分别在黄曲霉平板和禾谷镰刀菌平板上划十字，培养得到病原菌平板抑菌圈。2)制作扫描电子显微镜样品和透射电子显微镜样品，进行观察。

扫描电子显微镜样品处理步骤：

取材：在病原菌平板抑菌圈边缘位置切8mm³的菌块，快速放入浓度为1.0％的戊二醛溶液中。正常生长病原菌菌块作为空白对照。

清洗：pH7.4的0.1M磷酸缓冲液清洗2～3次。

固定：用2.5％的戊二醛固定2h后，0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗3次，每次15min。

脱水：不同梯度的乙醇和叔丁醇进行逐级脱水：50％乙醇脱水10min，70％乙醇脱水10min，80％乙醇脱水10min，90％乙醇脱水10min，100％乙醇脱水10min，75％叔丁醇脱水2次，每次10min；100％叔丁醇脱水2次，每次10min。

将脱水后的样品块加入适量100％叔丁醇(没过样品即可)置于-20℃冷冻10min。

将冷冻后样品真空冷冻干燥，置于IB-3离子镀膜仪喷金镀膜，S-3500N日本日立扫描电子显微镜观察。

透射电子显微镜样品处理：

取材：在病原菌平板抑菌圈边缘位置切小于1mm³的菌块。正常生长病原菌菌块作为空白对照，试验组和空白对照组各取2块置于4.0％的戊二醛中固定2h以上。

清洗：0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)浸洗2次，每次15min。

固定：1.0％锇酸固定2h后，0.1mol/L磷酸缓冲液浸洗2次，每次20min。

脱水：不同梯度的丙酮进行逐级脱水：50％丙酮脱水30min(4℃)，70％丙酮脱水30min(4℃)，80％丙酮脱水30min(4℃)，90％丙酮脱水30min(4℃)，100％丙酮脱水30min，共进行2次，第1次在4℃下操作，第2次在室温下进行。

包埋：纯丙酮和包埋剂以1:1的比例室温处理样品1h，纯丙酮和包埋剂以1:3的比例室温处理样品2h以上或过夜，最后用纯包埋剂浸透样品室温处理5h以上。

聚合：37℃温箱处理样品12h，温度升至60℃处理36～48h。

超薄切片和染色：EM UC7超薄切片机切片。醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色法进行染色。在H-7650透射电子显微镜观察。

图2为扫描电镜下黄曲霉和禾谷镰刀菌菌丝状态图；其中A1为正常的黄曲霉；B1为经枯草芽孢杆菌G-3处理过的黄曲霉；A2为正常的禾谷镰刀菌；B2为经枯草芽孢杆菌G-3处理过的禾谷镰刀菌。由图2的结果可知，正常生长的菌丝细胞壁完整；与G-3菌落接近的菌丝严重皱缩，折叠缠绕成团状；有些菌丝异常膨大，有些异常纤细；部分菌丝末端钝圆，部分菌丝成环；细胞壁部分消解使部分菌丝断裂。

图3为透射电镜下禾谷镰刀菌细胞结构；其中A1为正常黄曲霉；A2为正常的禾谷镰刀菌；B1和B2分别为经枯草芽孢杆菌G-3处理过的黄曲霉和禾谷镰刀菌。由图3的结果可知，正常的禾谷镰刀菌切面规则，细胞壁厚度一致、细胞膜完整，细胞核中核膜核仁清晰可见，线粒体、液泡等细胞器完整，细胞质分布均匀，隔膜完整清晰可见；而经菌株G-3处理过的禾谷镰刀菌细胞切面不规则；细胞壁质地疏松变薄轮廓线不清晰，细胞膜部分出现变形或退化；细胞质消解，细胞器解体，并形成大量空白区。

实施例6

毒素降解产物的安全性评价

(1)毒素溶液的制备

配制AFB1、ZEN和DON的终浓度分别为10μg/mL的毒素水溶液，微孔滤膜过滤除菌，一分为二。一份分装冷冻保存，后续灌胃备用；另一份用于毒素降解产物溶液的制备。

(2)毒素降解产物溶液的制备

按照实施例2的方法制备枯草芽孢杆菌G-3种子液，6.0％接种量接种于不含毒素的发酵培养基中，37℃、180r/min条件下摇床培养48h，4℃、8000r/min离心20min。取发酵上清液低温真空冷冻干燥至干粉。

在制备的毒素溶液(10mL)中加入枯草芽孢杆菌G-3的发酵上清液冻干粉1.0g，37℃条件下共培养6h，然后测定各毒素残存量，如有毒素残存量>0.1μg/mL，再加入1.0g冻干粉，37℃条件下共培养6h测定各毒素残存量，直至各毒素的残存量不足0.1μg/mL，作为毒素降解产物溶液，后续灌胃备用。

(3)小鼠试验

试验设计：选取3周龄昆明小鼠60只，称量初始体重，根据体重随机将小鼠分为3个处理组。处理组1(T1)灌胃超纯灭菌水，处理组2(T2)灌胃步骤(1)制备的毒素溶液，处理组3(T3)灌胃步骤(2)制备的毒素降解产物溶液。

每组20只小鼠，雌雄各半，自由采食和饮水(纯净水)，每天灌胃2次，试验期21d。所有试验操作均按照动物福利的相关程序和要求执行。

试验小鼠的处理与样品采集：试验小鼠模型试验中，饲喂21d后，禁食12h，眼球取血，室温静置2h，4℃冰箱放置12h，3000r/min离心15min，收集血清，用于生化指标检测。同时解剖小鼠，取肝脏、肾脏、脾脏称重，用于计算脏器指数，检测结果见表3。

免疫指标测定：血清指标分别为天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酐(Cr)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、血清免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白A(IgA)。采用比色法，通过全自动生化分析仪测定。白介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF-α)采用试剂盒测定，检测结果见表4～6。

脏器病理切片分析：解剖小鼠，各脏器称重后，用解剖刀将各组织切0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，放入组织包埋盒中，立即将其放入中性10％的甲醛固定液中固定保存。采用苏木精-伊红染色制作组织切片。用双目正置显微镜观察切片，检测结果见图4～图6。

表3为不同处理对小鼠免疫器官指数的影响

由表3的结果可知，灌胃毒素溶液的小鼠肝脏、脾脏和肾脏器官指数均显著升高，说明灌胃3种毒素后小鼠的各器官有肿大症状。而灌胃毒素降解产物溶液的小鼠肝脏、脾脏、和肾脏器官指数与对照组相比没有显著变化，证明各毒素降解产物不会引起器官肿大症状。

表4不同处理对小鼠血清生化指标的影响

由表4的结果可知，灌胃毒素溶液的小鼠CRE指标较对照组显著升高(P<0.05)，表明毒素引起了肾脏的损伤，而灌胃毒素降解产物溶的小鼠CRE与对照组无显著性差异。

灌胃毒素溶液的小鼠ALT指标较对照组显著升高(P<0.05)，表明毒素在机体内积累到一定程度就会对机体造成损伤。而灌胃毒素降解产物溶液的小鼠ALT与对照组无显著性差异。

灌胃小鼠毒素溶液组的小鼠AST显著高于对照组(P<0.05)，表明心脏、肝脏受损伤，3种毒素在机体内积累到一定程度就会对机体造成损伤。而毒素降解产物溶液组的AST与对照组无显著性差异。

灌胃毒素溶液的小鼠ALP指标较对照组显著升高(P<0.05)，表明ZEN在机体内积累到一定程度就会对肝脏细胞造成损伤，而灌胃毒素降解产物溶液的小鼠ALP与对照组无显著性差异。

表5不同处理对小鼠免疫指标的影响

由表5的结果可知，灌胃毒素溶液的小鼠较对照组显著升高了IgG、IgA、IL-2和TNF-α的含量(P<0.05)，表明体内出现了炎症反应，而灌胃毒素降解产物溶液的小鼠与对照组之间无显著性差异。

表6不同处理对小鼠血清抗氧化指标的变化

由表6的结果可知，灌胃毒素溶液的小鼠SOD显著降低(P<0.05)，而其它组并没有显著差异。SOD是机体内固有的超氧自由基清除因子，可减少机体过氧化伤害，当SOD含量降低时，说明机体内发生过氧化损伤。

LDH是反应心脏功能的重要指标，灌胃毒素溶液小鼠显著高于其它组(P<0.05)，说明小白鼠的心脏功能已经受到了一定程度的伤害，而其它组并没有显著差异。

图4为不同处理对小鼠肝脏形态学的影响，其中1、2为处理组T1，3、4为处理组T2，5、6为处理组T3；1、3、5为200倍数下的，2、4、6是200倍数下的。由图4的结果可知，处理组T1的肝索结构清晰，肝细胞排列紧密，界限清晰，胞质丰富，着色均匀，胞核圆形，大小一致，未见明显异常。处理组T2的较多肝细胞轻度肿胀，胞质疏松淡染，多见肝细胞点状坏死，胞核固缩深染或溶解，并可见嗜酸性小体，坏死处少量炎性细胞浸润。处理组T3的肝索结构清晰，肝细胞排列紧密，界限清晰，胞质丰富，着色均匀，胞核圆形，大小一致；胆管周围偶见少量炎性细胞造血浸润，未见其它明显异常，表明灌胃3种毒素对肝脏有较明显的损伤，而灌胃毒素降解产物与对照组相比没有出现明显的损伤。

图5为不同处理对小鼠肾脏形态学的影响，其中1、2为处理组T1，3、4为处理组T2，5、6为处理组T3；1、3、5为200倍数下的，2、4、6是200倍数下的。由图5的结果可知，处理组T1的肾脏皮髓质分界清晰，肾小管排列紧密，界限清晰，肾小管上皮细胞着色均匀，形态正常，肾小球毛细血管丛清晰，形态正常，未见明显异常。处理组T2的皮髓质分界清晰，肾小管排列紧密，界限清晰，肾小管上皮细胞着色均匀，形态正常，小管间质多见少量毛细血管淤血，肾小球毛细血管丛清晰，形态正常，未见其它明显异常。处理组T3的皮髓质分界清晰，肾小管排列紧密，界限清晰，肾小管上皮细胞着色均匀，形态正常，小管间质少量毛细血管淤血，肾小球毛细血管丛清晰，形态正常，未见其它明显异常，表明灌胃3种毒素对肾脏没有明显的损伤。

图6为不同处理对小鼠脾脏形态学的影响，其中1、2为处理组T1，3、4为处理组T2，5、6为处理组T3；1、3、5为200倍数下的，2、4、6是200倍数下的。由图6的结果可知，处理组T1的脾脏红白髓分界清晰，白髓数量丰富，淋巴细胞丰富，排列紧密，并可见中央动脉，红髓内可见大量红细胞、淋巴细胞、少量多核巨细胞，还可见脾小梁，形态均正常，未见明显异常。处理组T2的白髓减少，体积变小，红髓中可见大量弥漫性分布的“单核样细胞”，核型不规则，相比淋巴细胞淡染，疑似淋巴瘤，红髓内还可见少量中性粒细胞浸润，较多髓外造血细胞。处理组T3的红白髓分界清晰，白髓数量丰富，淋巴细胞丰富，排列紧密，并可见中央动脉，红髓中可见较多髓外造血细胞，未见其他明显异常，表明灌胃3种毒素对脾脏有较明显的损伤，而灌胃毒素降解产物与对照组相比没有出现明显的损伤。

上述实施例的结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌G-3能够高效降解禾谷镰刀菌毒素和/或黄曲霉毒素，对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的降解率分别为92.03％、95.93％和85.25％；对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素这3种毒素进行降解后，得到的降解产物无毒代谢产物，具有实际应用价值。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围内。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G-3，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.21708。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G-3的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G-3接种至发酵培养基，得到枯草芽孢杆菌G-3菌液；

所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：8.0～10.0g/L葡萄糖，1.0～1.5g/L酵母膏，0.4～0.6g/L蛋白胨，0.04～0.06g/LMgSO₄和4.5～6.5g/LCaCO₃；所述发酵培养基的pH为7.2～7.4。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：温度20～40℃，时间12～36h，转速150～200rpm。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌G-3以种子液的形式接种至发酵培养基；所述种子液的接种量为5.0％～6.0％。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述种子液的培养方法为：将枯草芽孢杆菌G-3接种至种子培养基进行种子培养，得到种子液；

所述种子培养基包括如下质量浓度的组分：9.0～12.0g/L蛋白胨，2.0～3.0g/L牛肉膏和4.0～5.0g/L氯化钠；所述种子培养基的pH为7.4～7.6。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述种子培养的条件为：温度20～40℃，时间8～16h，转速150～200rpm。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G-3在降解禾谷镰刀菌毒素中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述禾谷镰刀菌毒素包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇和/或玉米赤霉烯酮。

9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G-3在降解黄曲霉毒素中的应用。

10.一种降解禾谷镰刀菌毒素和/或黄曲霉毒素的菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G-3。

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