CN111440744A - 一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法 - Google Patents
一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，通过从酸性、高温的热泉、火山口或醋厂环境采集土壤、水样品，筛选分离得到一株耐酸、耐高温高效降解黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN的枯草芽孢杆菌，本发明涉及饲料生产技术领域。该利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，为食品和饲料加工过程中玉米黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN的去除提供了菌种资源，具有重要的应用价值，将筛选出的枯草芽孢杆菌降解菌株加入选取的DDGS饲料样品中进行发酵，能够将DDGS饲料的残糖进行利用，同时将水溶性的真菌毒素进行降解，既生产单细胞蛋白，同时也降低真菌毒素提高DDGS的质量。
Description
技术领域
本发明涉及饲料生产技术领域，具体为一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法。
背景技术
饲料霉菌毒素对养殖业危害极大，在玉米加工产品中，特别以陈化玉米为原料加工而成的DDGS，其黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、呕吐毒素、T-2毒素、赭曲霉毒素等霉菌毒素的含量大，危害亦大，严重影响DDGS的品质，霉菌毒素是霉菌生长过程中所产生的有毒次级代谢产物，其具有致突变性、致畸性和细胞毒性，对动物和人类健康有极大危害，并可造成严重的经济损失，其中，危害较大的两种霉菌毒素为黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，AFB1)与玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，黄曲霉毒素毒性最强且分布最广，具有高致病性和较强致癌性，可直接或间接影响人的食品安全，ZEN具有较强的生殖毒性，可造成动物急慢性中毒，并通过食物链严重威胁人类身体健康。研发粮食与饲料中霉菌毒素的脱毒技术，对于改善动物生产性能、提高动物产品品质、保障食品安全有着重要意义。当前，对于霉菌毒素的脱毒方法有物理、化学及生物法。其中物理法包括原料稀释法、高温处理法等；化学法有碱处理、氧化处理等；生物法有酶降解法和微生物脱毒法。物理与化学法对霉菌毒素的降解效率较低且可能降低饲料营养价值，生物脱毒法可生成无毒或低毒降解产物，且多为专一性降解，不会破坏饲料中其他营养物质，是霉菌毒素脱毒的重要方法。
目前针对DDGS的真菌毒素问题，存在酶降解和生物降解两类实用的手段，尤其生物降解，既可以做到降低真菌毒素的目的，又能增加DDGS中的蛋白含量，利用具有降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌可以处理降解部份毒素，现有所获得的AFB1降解菌和ZEN降解菌的培养条件为温度28-37℃、偏碱性，但在食品和饲料加工过程中需要经过酸性和高温环境的处理，因此，降解ZEN的耐酸耐高温菌株的获得显得尤为重要。
本发明采集酸性高温环境下的土壤、水样等，采用富集培养的方式，使用无机盐培养基加入AFB1和ZEN的标准品，筛选出能够降解AFB1和ZEN的耐酸耐高温菌株，通过16SrDNA鉴定及生化特性分析明确菌株种属，并研究该菌株生长和降解特性，同时分析其降解活性物质及降解产物，以及为食品和饲料加工中AFB1和ZEN的脱毒提供菌株资源和应用技术。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，通过得到的菌株从酸性、高温环境中筛选获得，具有良好的耐酸耐高温特性，同时菌株对20μg/mL高浓度饲料霉菌毒素的降解率高达82.40％。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，具体包括以下步骤：
S1、样品的采集：首先从不同地区热泉、火山口或醋厂的酸性、高温环境条件下采集土壤样品或水样品，并于-20℃的温度下保存；
S2、发酵降解处理：首先对步骤S1采集的样品中筛选出枯草芽孢杆菌降解菌株，然后将筛选出的枯草芽孢杆菌降解菌株加入选取的DDGS饲料样品中进行发酵，发酵处理2-3天后，将发酵料取出进行浓缩干燥，能够将DDGS饲料的残糖进行利用，同时将水溶性的真菌毒素进行降解，既生产单细胞蛋白，同时也降低真菌毒素提高DDGS的质量；
S3、毒素的检测：应用高效液相色谱-荧光检测器HPLCFLD检测ZEN浓度：将有显著降解效果的富集液涂布于LB固体培养基上，28℃恒温培养箱培养24h后，挑取不同的单菌落，首先接种于LB培养基中，并于28℃摇床恒温培养24h，再按5％(v/v)的接种量接种到含有2μg*mL-1黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN毒素的MM培养基中，以仅含相同浓度黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN毒素的MM培养基作为对照组，在28℃摇床恒温培养72h后，用氯仿抽提3次，氮吹至干，再用1mL乙腈/水(流动相，7/3，v/v)复溶，HPLC-FLD检测毒素浓度并对比对照组筛选具有高效降解毒素的单一菌株；
S4、降解菌的鉴定：利用细菌16SrDNA通用引物对筛选得到的单一菌株的16SrDNA基因序列进行测定，并将分析测序结果在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得与菌株16SrDNA源的公认标准序列数据B4-31，并利用软件MEGA7.0中的最大似然法分析该单一菌种的16SrDNA基因与相似种属的进化关系；
S5、降解菌最适降解条件的分析：挑取降解菌的单菌落于LB液体培养基活化24h，按5％(v/v)的接种量分别接种于LB、NB和MM培养基(pH值7.0)，28℃、180r/min恒温培养72h，检测其在600nm波长下的光密度值，以分析菌株生长状况，然后每隔9h取样检测一次，绘制不同培养基条件下ZEN降解菌的生长曲线。
优选的，所述步骤S3中摇床的转速为160-180r/min。
优选的，所述步骤S3中利用HPLCFLD检测毒素的具体检测条件为：采用的安捷伦ZorbaxSB-C18柱的尺寸为4.6mmx250mm，5μm，流动相为乙腈/水(v/v)为713，流速为1.0mL*min-1，进样体积为20μL，激发波长为274nm，发射波长为440nm。
优选的，所述步骤S4中细菌16SrDNA的通用引物对为27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。
优选的，所述步骤S2-S4中MM无机盐培养基的配方包括：Na2HPO4 1.6g/L、KH2PO41g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L、NaNO30.5g/L、(NH4)2SO40.5g/L、CaCl2.2H2O0.025g/L、2mL微量金属溶液及1mL维生素溶液，其中微量金属溶液配方为：FeCl2.4H201.5g/L、CoCl2.6H2O0.19g/L、MnCl2.4H2O 0.1g/L、ZnCl20.07g/L、H3BO30.062g/L、Na2MoO4.2H2O0.036g/L、NiCl2.6H2O0.024g/L和CuCl2.2H2O0.017g/L。
优选的，所述维生素配方为：生物素2mg/L、叶酸2mg/L、硫铵素-盐酸盐5mg/L、核黄素5mg/L、吡哆醇盐酸盐10mg/L、维生素B1250mg/L、烟酸5mg/L，泛酸钙5mg/L、对氨基苯甲酸5mg/L和硫辛酸5mg/L。
优选的，所述步骤S5中NB营养肉汤培养基的配方为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L和NaCl5g/L。
(三)有益效果
本发明提供了一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，通过从酸性、高温的热泉、火山口或醋厂环境采集土壤、水样品，筛选分离得到一株耐酸、耐高温高效降解黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN的枯草芽孢杆菌，采用LB培养基在28-50℃、pH值5-7条件下培养的菌株对黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN的降解效果较好，且菌株能够耐受高浓度黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN，同时菌株中对黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN起到降解作用的活性成分是酶，EDTA、Cu2+和Zn2+可强烈抑制菌株发酵上清液中的酶活，Mn2+则显著增强了菌株发酵上清液中的酶活性，Mg2+和Li2+的影响不明显，本发明为食品和饲料加工过程中玉米黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN的去除提供了菌种资源，具有重要的应用价值，同时，将筛选出的枯草芽孢杆菌降解菌株加入选取的DDGS饲料样品中进行发酵，能够将DDGS饲料的残糖进行利用，同时将水溶性的真菌毒素进行降解，既生产单细胞蛋白，同时也降低真菌毒素提高DDGS的质量。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明实验分析中培养温度对菌株生长情况的统计图；
图3为本发明实验分析中培养温度对菌株毒素降解效果的统计图；
图4为本发明实验分析中初始pH值对菌株生长情况的统计图；
图5为本发明实验分析中初始pH值对菌株毒素降解效果的统计图；
图6为本发明实验分析中不同毒素初始浓度对菌株毒素降解效果的统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-6，本发明实施例提供三种技术方案：一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，具体包括以下实施例：
实施例1
S1、样品的采集：首先从不同地区热泉、火山口或醋厂的酸性、高温环境条件下采集土壤样品或水样品，并于-20℃的温度下保存；
S2、发酵降解处理：首先对步骤S1采集的样品中筛选出枯草芽孢杆菌降解菌株，然后将筛选出的枯草芽孢杆菌降解菌株加入选取的DDGS饲料样品中进行发酵，发酵处理2-3天后，将发酵料取出进行浓缩干燥，能够将DDGS饲料的残糖进行利用，同时将水溶性的真菌毒素进行降解，既生产单细胞蛋白，同时也降低真菌毒素提高DDGS的质量；
S3、毒素的检测：应用高效液相色谱-荧光检测器HPLCFLD检测ZEN浓度：将有显著降解效果的富集液涂布于LB固体培养基上，28℃恒温培养箱培养24h后，挑取不同的单菌落，首先接种于LB培养基中，并于28℃摇床恒温培养24h，再按5％(v/v)的接种量接种到含有2μg*mL-1黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN毒素的MM培养基中，以仅含相同浓度黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN毒素的MM培养基作为对照组，在28℃摇床恒温培养72h后，用氯仿抽提3次，氮吹至干，再用1mL乙腈/水(流动相，7/3，v/v)复溶，HPLC-FLD检测毒素浓度并对比对照组筛选具有高效降解毒素的单一菌株，摇床的转速为170r/min，利用HPLCFLD检测毒素的具体检测条件为：采用的安捷伦ZorbaxSB-C18柱的尺寸为4.6mmx250mm，5μm，流动相为乙腈/水(v/v)为713，流速为1.0mL*min-1，进样体积为20μL，激发波长为274nm，发射波长为440nm；
S4、降解菌的鉴定：利用细菌16SrDNA通用引物对筛选得到的单一菌株的16SrDNA基因序列进行测定，并将分析测序结果在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得与菌株16SrDNA源的公认标准序列数据B4-31，并利用软件MEGA7.0中的最大似然法分析该单一菌种的16SrDNA基因与相似种属的进化关系，细菌16SrDNA的通用引物对为27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'；
S5、降解菌最适降解条件的分析：挑取降解菌的单菌落于LB液体培养基活化24h，按5％(v/v)的接种量分别接种于LB、NB和MM培养基(pH值7.0)，28℃、180r/min恒温培养72h，检测其在600nm波长下的光密度值，以分析菌株生长状况，然后每隔9h取样检测一次，绘制不同培养基条件下ZEN降解菌的生长曲线，NB营养肉汤培养基的配方为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L和NaCl5g/L。
本发明步骤S3-S4中MM无机盐培养基的配方包括：Na2HPO4 1.6g/L、KH2PO41g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L、NaNO30.5g/L、(NH4)2SO40.5g/L、CaCl2.2H2O0.025g/L、2mL微量金属溶液及1mL维生素溶液，其中微量金属溶液配方为：FeCl2.4H201.5g/L、CoCl2.6H2O 0.19g/L、MnCl2.4H2O 0.1g/L、ZnCl20.07g/L、H3BO30.062g/L、Na2MoO4.2H2O0.036g/L、NiCl2.6H2O0.024g/L和CuCl2.2H2O0.017g/L，维生素配方为：生物素2mg/L、叶酸2mg/L、硫铵素-盐酸盐5mg/L、核黄素5mg/L、吡哆醇盐酸盐10mg/L、维生素B1250mg/L、烟酸5mg/L，泛酸钙5mg/L、对氨基苯甲酸5mg/L和硫辛酸5mg/L。
实施例2
S1、样品的采集：首先从不同地区热泉、火山口或醋厂的酸性、高温环境条件下采集土壤样品或水样品，并于-20℃的温度下保存；
S2、发酵降解处理：首先对步骤S1采集的样品中筛选出枯草芽孢杆菌降解菌株，然后将筛选出的枯草芽孢杆菌降解菌株加入选取的DDGS饲料样品中进行发酵，发酵处理2-3天后，将发酵料取出进行浓缩干燥，能够将DDGS饲料的残糖进行利用，同时将水溶性的真菌毒素进行降解，既生产单细胞蛋白，同时也降低真菌毒素提高DDGS的质量；
S3、毒素的检测：应用高效液相色谱-荧光检测器HPLCFLD检测ZEN浓度：将有显著降解效果的富集液涂布于LB固体培养基上，28℃恒温培养箱培养24h后，挑取不同的单菌落，首先接种于LB培养基中，并于28℃摇床恒温培养24h，再按5％(v/v)的接种量接种到含有2μg*mL-1黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN毒素的MM培养基中，以仅含相同浓度黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN毒素的MM培养基作为对照组，在28℃摇床恒温培养72h后，用氯仿抽提3次，氮吹至干，再用1mL乙腈/水(流动相，7/3，v/v)复溶，HPLC-FLD检测毒素浓度并对比对照组筛选具有高效降解毒素的单一菌株，摇床的转速为160r/min，利用HPLCFLD检测毒素的具体检测条件为：采用的安捷伦ZorbaxSB-C18柱的尺寸为4.6mmx250mm，5μm，流动相为乙腈/水(v/v)为713，流速为1.0mL*min-1，进样体积为20μL，激发波长为274nm，发射波长为440nm；
S4、降解菌的鉴定：利用细菌16SrDNA通用引物对筛选得到的单一菌株的16SrDNA基因序列进行测定，并将分析测序结果在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得与菌株16SrDNA源的公认标准序列数据B4-31，并利用软件MEGA7.0中的最大似然法分析该单一菌种的16SrDNA基因与相似种属的进化关系，细菌16SrDNA的通用引物对为27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'；
S5、降解菌最适降解条件的分析：挑取降解菌的单菌落于LB液体培养基活化24h，按5％(v/v)的接种量分别接种于LB、NB和MM培养基(pH值7.0)，28℃、180r/min恒温培养72h，检测其在600nm波长下的光密度值，以分析菌株生长状况，然后每隔9h取样检测一次，绘制不同培养基条件下ZEN降解菌的生长曲线，NB营养肉汤培养基的配方为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L和NaCl5g/L。
本发明步骤S3-S4中MM无机盐培养基的配方包括：Na2HPO4 1.6g/L、KH2PO41g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L、NaNO30.5g/L、(NH4)2SO40.5g/L、CaCl2.2H2O0.025g/L、2mL微量金属溶液及1mL维生素溶液，其中微量金属溶液配方为：FeCl2.4H201.5g/L、CoCl2.6H2O 0.19g/L、MnCl2.4H2O 0.1g/L、ZnCl20.07g/L、H3BO30.062g/L、Na2MoO4.2H2O0.036g/L、NiCl2.6H2O0.024g/L和CuCl2.2H2O0.017g/L，维生素配方为：生物素2mg/L、叶酸2mg/L、硫铵素-盐酸盐5mg/L、核黄素5mg/L、吡哆醇盐酸盐10mg/L、维生素B1250mg/L、烟酸5mg/L，泛酸钙5mg/L、对氨基苯甲酸5mg/L和硫辛酸5mg/L。
实施例3
S1、样品的采集：首先从不同地区热泉、火山口或醋厂的酸性、高温环境条件下采集土壤样品或水样品，并于-20℃的温度下保存；
S2、发酵降解处理：首先对步骤S1采集的样品中筛选出枯草芽孢杆菌降解菌株，然后将筛选出的枯草芽孢杆菌降解菌株加入选取的DDGS饲料样品中进行发酵，发酵处理2-3天后，将发酵料取出进行浓缩干燥，能够将DDGS饲料的残糖进行利用，同时将水溶性的真菌毒素进行降解，既生产单细胞蛋白，同时也降低真菌毒素提高DDGS的质量；
S3、毒素的检测：应用高效液相色谱-荧光检测器HPLCFLD检测ZEN浓度：将有显著降解效果的富集液涂布于LB固体培养基上，28℃恒温培养箱培养24h后，挑取不同的单菌落，首先接种于LB培养基中，并于28℃摇床恒温培养24h，再按5％(v/v)的接种量接种到含有2μg*mL-1黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN毒素的MM培养基中，以仅含相同浓度黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN毒素的MM培养基作为对照组，在28℃摇床恒温培养72h后，用氯仿抽提3次，氮吹至干，再用1mL乙腈/水(流动相，7/3，v/v)复溶，HPLC-FLD检测毒素浓度并对比对照组筛选具有高效降解毒素的单一菌株，摇床的转速为180r/min，利用HPLCFLD检测毒素的具体检测条件为：采用的安捷伦ZorbaxSB-C18柱的尺寸为4.6mmx250mm，5μm，流动相为乙腈/水(v/v)为713，流速为1.0mL*min-1，进样体积为20μL，激发波长为274nm，发射波长为440nm；
S4、降解菌的鉴定：利用细菌16SrDNA通用引物对筛选得到的单一菌株的16SrDNA基因序列进行测定，并将分析测序结果在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得与菌株16SrDNA源的公认标准序列数据B4-31，并利用软件MEGA7.0中的最大似然法分析该单一菌种的16SrDNA基因与相似种属的进化关系，细菌16SrDNA的通用引物对为27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'；
S5、降解菌最适降解条件的分析：挑取降解菌的单菌落于LB液体培养基活化24h，按5％(v/v)的接种量分别接种于LB、NB和MM培养基(pH值7.0)，28℃、180r/min恒温培养72h，检测其在600nm波长下的光密度值，以分析菌株生长状况，然后每隔9h取样检测一次，绘制不同培养基条件下ZEN降解菌的生长曲线，NB营养肉汤培养基的配方为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L和NaCl5g/L。
本发明步骤S3-S4中MM无机盐培养基的配方包括：Na2HPO4 1.6g/L、KH2PO41g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L、NaNO30.5g/L、(NH4)2SO40.5g/L、CaCl2.2H2O0.025g/L、2mL微量金属溶液及1mL维生素溶液，其中微量金属溶液配方为：FeCl2.4H201.5g/L、CoCl2.6H2O 0.19g/L、MnCl2.4H2O 0.1g/L、ZnCl20.07g/L、H3BO30.062g/L、Na2MoO4.2H2O0.036g/L、NiCl2.6H2O0.024g/L和CuCl2.2H2O0.017g/L，维生素配方为：生物素2mg/L、叶酸2mg/L、硫铵素-盐酸盐5mg/L、核黄素5mg/L、吡哆醇盐酸盐10mg/L、维生素B1250mg/L、烟酸5mg/L，泛酸钙5mg/L、对氨基苯甲酸5mg/L和硫辛酸5mg/L。
实验分析
1、在确定最适培养基的条件下，按5％(v/v)的接种量接种于液体培养基，选取不同培养温度，选取的不同培养温度分别为28℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃和70℃，并于pH值7.0、180r/min恒温培养24h，比较不同培养温度下降解菌的生长状况，确定降解菌的最适生长温度，在对应的培养温度条件下，按5％(v/v)的接种量接种于LB液体培养基，分别加入玉米赤霉烯酮ZEN标准品至终浓度为2μg*mL-1，对照组按5％的LB液体培养基加入反应体系，孵育36h，用氯仿抽提毒素3次，氮吹至干，1mL乙腈/水(流动相，7/3，v/v)复溶，HPLC-FLD检测ZEN浓度，并计算毒素降解率，实验结果如图2和图3所示。
2、在确定最适培养基、培养温度的条件下，按5％(v/v)的接种量接种于液体培养基，选取不同pH值(3.4、4.5、5、6、7、8、8.5.9和10)，于50℃、180r/min培养24h，比较不同pH值下ZEN降解菌的生长状况，确定降解菌的最适pH值。在对应的pH值条件下，按5％(v/v)的接种量接种于LB液体培养基，分别加入玉米赤霉烯酮ZEN标准品至终浓度为2μg*mL-1，孵育36h后计算此pH值条件下毒素降解率，实验结果如图4和图5所示。
3、在确定最适降解条件(培养基、培养温度、pH值、培养时间)后，按5％(v/v)的接种量于液体培养基，在50℃、pH值5.0培养条件下，分析当毒素标准品的初始浓度分别为2、4.8、12、16、20μg*mL-1时，孵育36h过程中降解菌对高浓度毒素的降解效果，实验结果如图6所示。
综上，本发明通过从酸性、高温的热泉、火山口或醋厂环境采集土壤、水样品，筛选分离得到一株耐酸、耐高温高效降解黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN的枯草芽孢杆菌，采用LB培养基在28-50℃、pH值5-7条件下培养的菌株对黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN的降解效果较好，且菌株能够耐受高浓度黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN，同时菌株中对黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN起到降解作用的活性成分是酶，EDTA、Cu2+和Zn2 +可强烈抑制菌株发酵上清液中的酶活，Mn2+则显著增强了菌株发酵上清液中的酶活性，Mg2+和Li2+的影响不明显，本发明为食品和饲料加工过程中玉米黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN的去除提供了菌种资源，具有重要的应用价值。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、样品的采集：首先从不同地区热泉、火山口或醋厂的酸性、高温环境条件下采集土壤样品或水样品，并于-20℃的温度下保存；
S2、发酵降解处理：首先对步骤S1采集的样品中筛选出枯草芽孢杆菌降解菌株，然后将筛选出的枯草芽孢杆菌降解菌株加入选取的DDGS饲料样品中进行发酵，发酵处理2-3天后，将发酵料取出进行浓缩干燥，能够将DDGS饲料的残糖进行利用，同时将水溶性的真菌毒素进行降解；
S3、毒素的检测：应用高效液相色谱-荧光检测器HPLCFLD检测ZEN浓度：将有显著降解效果的富集液涂布于LB固体培养基上，28℃恒温培养箱培养24h后，挑取不同的单菌落，首先接种于LB培养基中，并于28℃摇床恒温培养24h，再按5％(v/v)的接种量接种到含有2μg*mL-1黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN毒素的MM培养基中，以仅含相同浓度黄曲霉毒素AFB1和玉米赤霉烯酮ZEN毒素的MM培养基作为对照组，在28℃摇床恒温培养72h后，用氯仿抽提3次，氮吹至干，再用1mL乙腈/水复溶，HPLC-FLD检测毒素浓度并对比对照组筛选具有高效降解毒素的单一菌株；
S4、降解菌的鉴定：利用细菌16SrDNA通用引物对筛选得到的单一菌株的16SrDNA基因序列进行测定，并将分析测序结果在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得与菌株16SrDNA源的公认标准序列数据B4-31，并利用软件MEGA7.0中的最大似然法分析该单一菌种的16SrDNA基因与相似种属的进化关系；
S5、降解菌最适降解条件的分析：挑取降解菌的单菌落于LB液体培养基活化24h，按5％(v/v)的接种量分别接种于LB、NB和MM培养基，28℃、180r/min恒温培养72h，检测其在600nm波长下的光密度值，以分析菌株生长状况，然后每隔9h取样检测一次，绘制不同培养基条件下ZEN降解菌的生长曲线。
2.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，其特征在于：所述步骤S3中摇床的转速为160-180r/min。
3.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，其特征在于：所述步骤S3中利用HPLCFLD检测毒素的具体检测条件为：采用的安捷伦ZorbaxSB-C18柱的尺寸为4.6mmx250mm，5μm，流动相为乙腈/水(v/v)为713，流速为1.0mL*min-1，进样体积为20μL，激发波长为274nm，发射波长为440nm。
4.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，其特征在于：所述步骤S4中细菌16SrDNA的通用引物对为27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。
5.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，其特征在于：所述步骤S3-S4中MM无机盐培养基的配方包括：Na2HPO41.6g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L、NaNO30.5g/L、(NH4)2SO40.5g/L、CaCl2.2H2O0.025g/L、2mL微量金属溶液及1mL维生素溶液，其中微量金属溶液配方为：FeCl2.4H201.5g/L、CoCl2.6H2O 0.19g/L、MnCl2.4H2O 0.1g/L、ZnCl20.07g/L、H3BO30.062g/L、Na2MoO4.2H2O0.036g/L、NiCl2.6H2O0.024g/L和CuCl2.2H2O0.017g/L。
6.根据权利要求5所述的一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，其特征在于：所述维生素配方为：生物素2mg/L、叶酸2mg/L、硫铵素-盐酸盐5mg/L、核黄素5mg/L、吡哆醇盐酸盐10mg/L、维生素B1250mg/L、烟酸5mg/L，泛酸钙5mg/L、对氨基苯甲酸5mg/L和硫辛酸5mg/L。
7.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌降解饲料霉菌毒素的试验方法，其特征在于：所述步骤S5中NB营养肉汤培养基的配方为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L和NaCl5g/L。
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