CN112577930A - 玉米赤霉烯酮浓度及其降解酶酶活力的测定方法以及玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程领域，公开了玉米赤霉烯酮浓度及其降解酶酶活力的测定方法以及玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法。本发明中采用荧光法直接、准确地测定玉米赤霉烯酮的浓度，进而用于测定玉米赤霉烯酮降解酶的活力，进而用于玉米赤霉烯酮降解菌的筛选。在本发明优选的条件下，能够实现高通量测定和筛选，提高检测和筛选的效率，缩短研发周期，降低研发成本。

Description

玉米赤霉烯酮浓度及其降解酶酶活力的测定方法以及玉米赤 霉烯酮降解菌的筛选方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，公开了一种玉米赤霉烯酮浓度的测定方法，一种玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的测定方法以及一种玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，简称ZEN)，又称F-2毒素，最初从有赤霉病的玉米中分离得到，主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，在食品及饲料加工过程中均不易被破坏，是全球污染范围最广的镰刀菌毒素之一。玉米赤霉烯酮可通过污染谷类等农作物，进入人或动物体内，危害人和动物的健康，造成巨大经济损失。同时，ZEN本身具有分布广、耐高温、毒性大、残留时间长等问题，已经引起了全世界的关注。目前大部分国家对粮油及饲料中的ZEN含量都作了严格的规定，例如，澳大利亚规定谷物中ZEN的含量不能超过50ng/g；意大利规定谷物和谷类产品当中ZEN的含量不能超过100ng/g；法国规定植物油和谷类当中ZEN含量须低于200ng/g。根据我国国家限量标准，谷物及其制品中ZEN含量应低于60μg/kg。
玉米赤霉烯酮等真菌毒素检测方法目前主要以快速、半定量的胶体金试纸条、酶联免疫试剂盒法，以及精确度更高的免疫亲和柱-高效液相色谱法、液质联用法为主，其中前者操作便捷且检测成本较低，但无法实现真菌毒素的精准定量检测，而后者虽然可以对真菌毒素进行精确定量，但因为其操作复杂、成本较高的特点，无法应用于高通量检测及一线生产单位的检测工作。因此，开发一种快速、操作简单的低成本的高通量检测方法，对于下游菌株筛选及真菌毒素脱除技术开发具有重要的意义。
目前，去除ZEN的方法主要有：物理法、化学法和生物法。物理法包括机械分离处理、高温、放射处理或吸附剂等；化学法是通过酸碱溶液或其他化合物对毒素进行处理。传统的物理和化学方法虽能清除部分真菌毒素，但存在诸多缺点，如降低粮食及饲料的营养价值，存在二次污染风险，在大批量的粮食和饲料加工工艺中应用难度大等。与上述方法相比，生物法主要是利用微生物或其代谢产物进行毒素降解的过程，具有对原料的感官性状、适口性、营养物质影响较小等优点，同时，还具有安全、环保、高效的特点，因此，利用生物法去除粮油或/饲料中ZEN的研究具有良好的应用前景。目前，研究报道表明多种真菌(例如，粉红粘帚霉、米根霉、匍枝根霉、少根根霉、黑曲霉、解毒毛孢酵母等)能够生物降解ZEN，但是关于细菌降解ZEN的报道仍较少。
CN103937681A公开了一株食品级黑曲霉及其在玉米赤霉烯酮降解中的应用，将该黑曲霉在适宜的条件(28℃，菌液接种量2％)与终浓度为2ppm的ZEN共培养48h，ZEN的降解率为89.56％。CN103981134A公开了一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用，将该枯草芽孢杆菌在适宜的条件(28℃)下与终浓度为2ppm的ZEN共培养72h，ZEN的降解率为92.75％。CN103981133A公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用，将该株解淀粉芽孢杆菌在适宜的条件(28℃)下与终浓度为5ppm的ZEN共培养72h，ZEN的降解率为95.99％。可见，现有的微生物降解ZEN的方法降解时间均较长，且降解率尚有待提高。
另外，现有的降解ZEN的微生物大多是在温和的条件(如28℃，pH为7左右)下进行，然而，在较高的温度负荷下(如在容器中进行运输期间或在饲料粒化期间的情况下)或苛刻的酸碱性条件下尚无较好的解决办法，这就限制了生物法在降解ZEN中的应用范围。近年来，蛋白质定向进化技术如饱和突变、易错PCR、DNA改组等，对生物酶的已有性能改造提升及新功能开发应用起到了巨大推动作用。定向进化技术通过在实验室条件下模拟自然进化过程，从构建的突变体文库中筛选到满足特定需求的目标突变体，大大拓展了酶的应用范围。
综上所述，有必要寻找一种高效并且在较高的温度负荷或苛刻的酸碱条件下可以快速降解ZEN毒素的微生物或生物酶，而大量的筛选工作需要建立在高效、低成本的高通量筛选方法基础上。
发明内容
本发明的目的是为了克服玉米赤霉烯酮检测及生物降解过程中存在的上述缺陷，提供一种玉米赤霉烯酮浓度的测定方法，一种玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的测定方法以及一种玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法。所述玉米赤霉烯酮浓度的测定方法能够简单且准确地检测玉米赤霉烯酮的浓度，玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法能够定向筛选玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力高的玉米赤霉烯酮降解菌。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种玉米赤霉烯酮浓度的测定方法，该方法包括：
a.使用第一有机溶剂将玉米赤霉烯酮标准样品配置成不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第一标准溶液；
b.在激发波长250-850nm、发射波长300-600nm的条件下，分别以荧光法测定不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第一标准溶液的荧光吸收值，并绘制标准曲线；
c.使用第一有机溶剂将待测样品配制成待测样品溶液，在与步骤b相同的条件下，荧光法检测待测样品溶液的荧光吸收值，并根据标准曲线计算待测样品中玉米赤霉烯酮的浓度。
优选地，所述荧光法为高通量荧光检测法。
本发明第二方面提供一种玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的测定方法，该方法包括：
(1)使用第二有机溶剂将玉米赤霉烯酮标准样品配置成不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第二标准溶液；
(2)取玉米赤霉烯酮降解酶待测液和第二有机溶剂混合后，与步骤(1)中得到的不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第二标准溶液混合，得到不同浓度的玉米赤霉烯酮的待测标准体系；
(3)在激发波长250-850nm、发射波长300-600nm的条件下，分别以荧光法测定不同浓度的玉米赤霉烯酮的待测标准体系的荧光吸收值，并绘制标准曲线；
(4)按照步骤(2)中相同的添加量，将待酶解的玉米赤霉烯酮溶液和玉米赤霉烯酮降解酶待测液混合并反应，然后将反应后的物料和第二有机溶剂混合后得到待测样品体系；
(5)在与步骤(3)相同的条件下，荧光法检测待测样品体系的荧光吸收值，并根据标准曲线计算反应后的溶液中玉米赤霉烯酮的浓度，并进一步计算玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力。
本发明第三方面提供一种玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法，该方法包括：
取不同待测菌株在液体培养基中培养以进行初筛，得到出筛菌株；取获自初筛菌株的粗酶液，采用如上所述的方法检测初筛得到的菌株的粗酶液中玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力以进行复筛，得到目标玉米赤霉烯酮降解菌；
优选地，该方法还包括：将复筛得到的菌株进行发酵验证，利用理化检测方法验证目标玉米赤霉烯酮降解菌的性能。
本发明中所述玉米赤霉烯酮浓度的测定方法能够简单且准确地检测玉米赤霉烯酮的浓度，玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法能够定向筛选玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力高的玉米赤霉烯酮降解菌。
在优选的情况下，基于96孔板的玉米赤霉烯酮高通量检测方法可实现每天103-104数量级检测，大大提高菌株筛选效率并降低研发成本10倍以上。
在优选的情况下，通过高通量检测方法及高通量筛选系统结合定向进化技术(如饱和突变、易错PCR、DNA改组等)，大大缩短了定向进化的时间，并在降低成本的同时提高了筛选效率，提高获得正突变株的几率。
附图说明
图1是本发明实施例1中以甲醇为溶剂时玉米赤霉烯酮的标准曲线。
图2是本发明实施例2中以甲醇为溶剂时，酶解体系下玉米赤霉烯酮(ZEN)的标准曲线。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种玉米赤霉烯酮浓度的测定方法，该方法包括：
a.使用第一有机溶剂将玉米赤霉烯酮标准样品配置成不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第一标准溶液；
b.在激发波长250-850nm、发射波长300-600nm的条件下，分别以荧光法测定不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第一标准溶液的荧光吸收值，并绘制标准曲线；
c.使用第一有机溶剂将待测样品配制成待测样品溶液，在与步骤b相同的条件下，荧光法检测待测样品溶液的荧光吸收值，并根据标准曲线计算待测样品中玉米赤霉烯酮的浓度。
玉米赤霉烯酮标准样品可以通过商购获得，比如可以为购自Sigma公司的玉米赤霉烯酮标准样品。
优选地，所述第一有机溶剂选自甲醇、乙腈和乙酸乙酯中的至少一种；更优选地，所述第一有机溶剂为甲醇，在所述优选的情况下，降低噪音，增强检测信号，提高检测的精确度。
优选地，所述第一有机溶剂的纯度为色谱纯。
优选地，以重量计，所述不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第一标准溶液中玉米赤霉烯酮的浓度范围为0.01-100ppm，更优选为0.1-10ppm，比如0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、8、10ppm以及任意两个值之间组成的任意范围。
优选地，以重量计，待测样品溶液中玉米赤霉烯酮的含量为0.01-100ppm，优选为0.1-10ppm，比如0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、8、10ppm以及任意两个值之间组成的任意范围。
优选地，所述荧光法为高通量荧光检测法。
优选地，所述荧光法在配置有荧光检测器的酶标仪和荧光检测用酶标板中进行。所述酶标仪可以通过商购获得，比如可以为购自Molecular Devices公司的SpectraMaxM2/M2e。
优选地，酶标板的每个孔中样品的添加量为50-250μL，更优选为100-200μL，比如100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200μL以及任意两个值之间组成的任意范围。
综合上述优选的第一有机溶剂、玉米赤霉烯酮第一标准溶液中玉米赤霉烯酮的浓度范围、待测样品溶液中玉米赤霉烯酮的含量以及优选的设备和加样量，能够进一步提高标准曲线的R2，提高检测方法的精度。
本发明第二方面提供一种玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的测定方法，该方法包括：
(1)使用第二有机溶剂将玉米赤霉烯酮标准样品配置成不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第二标准溶液；
(2)取玉米赤霉烯酮降解酶待测液和第二有机溶剂混合后，与步骤(1)中得到的不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第二标准溶液混合，得到不同浓度的玉米赤霉烯酮的待测标准体系；
(3)在激发波长250-850nm、发射波长300-600nm的条件下，分别以荧光法测定不同浓度的玉米赤霉烯酮的待测标准体系的荧光吸收值，并绘制标准曲线；
(4)按照步骤(2)中相同的添加量，将待酶解的玉米赤霉烯酮溶液和玉米赤霉烯酮降解酶待测液混合并反应，然后将反应后的物料和第二有机溶剂混合后得到待测样品体系；
(5)在与步骤(3)相同的条件下，荧光法检测待测样品体系的荧光吸收值，并根据标准曲线计算反应后的溶液中玉米赤霉烯酮的含量，并进一步计算玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力。
玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力可以以一定条件下玉米赤霉烯酮的降解率来表示。比如可以以ZEN(％)表征玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力，并按照下式计算：
ZEN的降解率(％)＝(处理前样品中ZEN的质量-处理后样品中ZEN的质量)/处理后样品中ZEN的质量×100％。
测定玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的条件可以包括：pH为3-8，温度为37-50℃。应当理解的是，不同玉米赤霉烯酮降解酶其最适的反应温度和pH不同，本领域技术人员可以根据酶的种类，对酶活力测定的条件进行调整。
优选地，测定玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的反应时间为10-60min。
其中，玉米赤霉烯酮的含量可以按照GBT 28716-2012进行测定。
在本发明中，所述第二有机溶剂选自甲醇、乙腈和乙酸乙酯中的至少一种；更优选地，所述第二有机溶剂为甲醇，在所述优选的情况下，增大底物信号，提高检测的精确度。
优选地，所述第二有机溶剂的纯度为色谱纯。
在本发明中，所述玉米赤霉烯酮降解酶待测液中的玉米赤霉烯酮降解酶可以是任意来源的、任意浓度的，比如可以是获自玉米赤霉烯酮降解菌的裂解产物或粗酶液，也可以是经过纯化的玉米赤霉烯酮降解酶。
所述玉米赤霉烯酮降解酶待测液的pH可以在较宽的范围内选择，可以根据对玉米赤霉烯酮降解酶的工作pH的期望至进行调整，优选地，所述玉米赤霉烯酮降解酶待测液的pH为3-8。
优选地，所述玉米赤霉烯酮降解酶待测液包含玉米赤霉烯酮降解酶以及缓冲液和/或NaCl溶液。具体的，所述玉米赤霉烯酮降解酶待测液可以是包含玉米赤霉烯酮降解酶和缓冲液，可以是包含玉米赤霉烯酮降解酶和NaCl溶液，也可以是同时包含玉米赤霉烯酮降解酶、缓冲液和NaCl溶液。
优选地，所述缓冲液选自柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液和乙酸缓冲液中的至少一种；更优选为柠檬酸缓冲液；在所述优选的情况下，能够提高检测结果的精确度。
其中，所述缓冲液可以为钠盐体系或钾盐体系。
其中，所述柠檬酸缓冲液的pH优选为5-6，用于测定酸性条件下玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力，便于筛选具有耐酸性的玉米赤霉烯酮降解酶。
所述缓冲液和/或NaCl溶液可以与粗酶液混合，得到所述玉米赤霉烯酮降解酶待测液。优选的情况下，粗酶液与缓冲液和/或NaCl溶液的体积比为1:10-20，比如可以为1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20以及任意两个值之间组成的任意范围。
优选地，所述玉米赤霉烯酮降解酶待测液中溶质的浓度为10-100mM。此处的溶质是指缓冲液和/或NaCl溶液带来的部分。
玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的测定方法中涉及的各组分的含量可以按照本领域通常使用的剂量，优选地，相比于100重量份的待测标准体系，玉米赤霉烯酮降解酶待测液的含量为30-50重量份，玉米赤霉烯酮第二标准溶液的含量为1-5重量份，余量为第二有机溶剂。
优选地，以重量计，所述不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第二标准溶液中玉米赤霉烯酮的浓度范围使得所述待测标准体系中玉米赤霉烯酮的浓度范围为0.01-100ppm，更优选为0.1-10ppm，比如0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、8、10ppm以及任意两个值之间组成的任意范围。
优选地，以重量计，待酶解的玉米赤霉烯酮溶液中玉米赤霉烯酮的浓度使得所述待测样品体系中玉米赤霉烯酮的含量为0.01-100ppm，更优选为0.1-10ppm，比如0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、8、10ppm以及任意两个值之间组成的任意范围。应当理解的是，所述待酶解的玉米赤霉烯酮溶液是已知浓度的玉米赤霉烯酮溶液。
荧光法的操作方法和第一方面的相同，在此不再赘述。
综合上述优选的第二有机溶剂、玉米赤霉烯酮降解酶待测液、各组分的用量以及优选的设备和加样量，能够进一步提高标准曲线的R2，提高检测方法的精度。
本发明所述的方法还可以进一步用于筛选具有不同性能的玉米赤霉烯酮降解酶，比如耐高温性、耐酸性和耐碱性等，只需要将酶解过程的温度或pH调节至期望的温度或pH即可。
本发明第三方面提供一种玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法，该方法包括：
取不同待测菌株在液体培养基中培养以进行初筛，得到出筛菌株；取获自初筛菌株的粗酶液，采用如上所述的方法检测初筛得到的菌株的粗酶液中玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力以进行复筛，得到目标玉米赤霉烯酮降解菌。
优选地，该方法还包括：将复筛得到的菌株进行发酵验证，利用理化检测方法验证目标玉米赤霉烯酮降解菌的性能。
本发明所述的玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法可以用于任意来源的菌株的筛选，比如待测菌株来源自自然界或人工处理后的菌株。
优选地，所述待测菌株为人工处理后的菌株。
优选地，所述人工处理的方法为诱变育种和/或基因工程育种。
在本发明中，所述诱变育种的方法可以是本领域常规使用的方法，比如可以为化学诱变和物理诱变(如紫外诱变和ARTP诱变等)。
在本发明中，所述基因工程育种包括但不限于易错PCR、饱和突变和DNA改组。
上述人工处理的方法的具体操作均是本领域常规的操作。
在本发明中，所述筛选优选为高通量筛选。应当理解的是，进行高通量筛选时，可以采用高通量筛选设备进行筛选，比如微生物克隆筛选系统Qpix、多孔板、酶标仪等。
本发明中，初筛的目的是筛选出能够正常生长的菌株，比如可以通过检测培养一段时间后培养液的OD600nm值来判断，比如培养12h或24h后OD600nm值大于0.1即可；也可以比较相同时间不同菌株培养的OD值的大小来实现，比如，当待测菌株为人工处理后的菌株时，可以通过比较出发菌株与待测菌株的OD600nm值，以高于出发菌株的OD600nm值的待测菌株为初筛得到的菌株；当在所述待测菌株来源自自然界的情况下，所述初筛的方法可以包括：以待测菌株的OD600nm值由高到低的顺序，以总数0.1-10％的比例选取OD600nm值高的待测菌株作为复筛菌株。
所述液体培养基的种类可以根据待测菌株的种类的不同而进行选择，比如，当菌株为大肠杆菌时，可以使用LB培养基作为液体培养基用于菌株的培养。
培养的条件随菌株的不同而不同，比如，为大肠杆菌时，温度可以为35-38℃。
本发明中，复筛的目的是筛选出玉米赤霉烯酮酶活力较高的菌株，比如可以通过比较源自不同菌株的玉米赤霉烯酮酶的酶活力，选择酶活力较高的菌株。
当待测菌株为人工处理后的菌株时，可以通过比较出发菌株与待测菌株的玉米赤霉烯酮酶活力，以高于出发菌株的玉米赤霉烯酮酶活力的初筛菌株为复筛得到的菌株。
当在所述待测菌株来源自自然界的情况下，所述复筛的方法可以包括：以玉米赤霉烯酮酶活力由高到低的顺序，选取玉米赤霉烯酮酶活力高的初筛菌株总数0.1-10％的菌株作为复筛菌株。
检测玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的方法如第二方面所述，在此不再赘述。
在本发明中，发酵验证的方法根据菌株的种类进行选择，比如，当菌株为重组大肠杆菌时，所述发酵验证的方法包括：将菌株活化，并接种于LB培养基中，36-38℃培养3-5h，加入IPTG使得其浓度为0.5-1.5mM，降温至22-28℃诱导16-18h，得到发酵液。
在本发明中，LB培养基的组成可以为：0.8-1重量％蛋白胨，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化钠；pH为6.8-7.2。
优选地，所述理化检测方法包括：对发酵液中的菌体进行裂解和提取，得到粗酶液，使用HPLC法测定粗酶液的玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力。
其中，裂解的方式可以为本领域常规的方式，比如可以通过超声破碎和、或添加溶菌酶(溶菌酶的浓度可以为1-10mg/mL)的方法进行处理。
其中，提取的方式可以包括离心、超滤和硫酸铵沉淀法中的至少一种，得到粗酶液。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述粗酶液的制备方法包括：取菌株的发酵液于3000-5000rpm离心10-30min，去上清后加入含溶菌酶(溶菌酶含量为1-10mg/mL)的裂解液，重悬后于25-35℃、800-1200rpm震荡裂解1-4h后获得粗酶液。所述方式适用于多孔板的情况。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述粗酶液的制备方法包括：取菌株的发酵液于3000-5000rpm离心10-30min，去上清后加入Tris-HCl缓冲液(浓度为10-100mM)重悬，超声破碎后获得粗酶液。所述方式适用于比如摇瓶发酵的情况。
其中，通过HPLC法测定粗酶液的玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的方法优选包括：将粗酶液和已知浓度的的玉米赤霉烯酮溶液混合并反应，然后将反应后的物料和第二有机溶剂混合以终止反应，将得到的物料过膜处理后HPLC法测定的玉米赤霉烯酮残余量，进一步根据的玉米赤霉烯酮残余量计算玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力。
应当理解的是，检测玉米赤霉烯酮酶活力的过程(包括绘制标准曲线和检测待测样品)中各组分的用量和操作条件(比如温度、pH和反应时间)保持一致。
通过比较玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力大小，选取活力较高的菌株作为目标玉米赤霉烯酮降解菌。
本发明所述的方法还可以进一步用于筛选具有不同性能的玉米赤霉烯酮降解菌，比如耐高温性、耐酸性和耐碱性等，只需要将酶解过程的温度或pH调节至期望的温度或pH即可。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，在没有特殊说明的情况下，使用的试剂和物料均可通过商购获得。
有机溶剂均为色谱纯。
ZEN母液为购自Sigma公司的ZEN标准品产品，纯度为99％。
LB培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，去离子水定容至1L，调节pH至7。
玉米赤霉烯酮的含量按照GBT 28716-2012进行测定，其中，以ZEN的降解率(％)表征玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力按照下式计算：
ZEN的降解率(％)＝(处理前样品中ZEN的质量-处理后样品中ZEN的质量)/处理后样品中ZEN的质量×100％。
酶标仪为购自Molecular Devices公司的SpectraMax M2/M2e酶标仪，酶标板中每个孔的体积为300μL。
以下实施例中，每组实验重复10次，用Excel对得到的数据进行处理。
实施例1
本实施例用于说明玉米赤霉烯酮浓度的测定方法
取ZEN母液用色谱级甲醇分别稀释至0.1ppm、0.5ppm、1ppm、2.5ppm、5ppm和10ppm，分别取200μL加入荧光检测专用酶标板，每组三个平行，于激发波274nm，发射波440nm读取酶标仪测定的数值，制作标准曲线。
绘制的标准曲线见图1，y＝87.403x+11.498。其中，x为ZEN浓度(单位ppm)，y为OD值。
本发明所述的方法获得的标准曲线显示ZEN浓度与酶标仪读数有着良好的相关性，R2值达0.9964。说明，本发明所述的方法能够用于检测玉米赤霉烯酮。
实施例2
本实施例用于说明玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的测定方法
(1)标准曲线的绘制
取5μL粗酶液(按照实施例3的方法制备重组菌株Transetta/pET30a-rmzhd，并按照本实施例2(2)制备其粗酶液)及100μL色谱级甲醇加入到每孔装有90μL柠檬酸缓冲液(pH5.5)的荧光检测专用酶标板中混合。然后，加入5μL不同浓度的ZEN母液，使体系中ZEN终浓度分别为0.1ppm、0.5ppm、1ppm、2.5ppm、5ppm和10ppm，在50℃水浴30min后，于激发波274nm，发射波440nm读取数值，制作标准曲线。
绘制的标准曲线见图1，y＝48.77x+99.304。其中，x为ZEN浓度(单位ppm)，y为OD值。
本发明所述的方法获得的标准曲线显示ZEN浓度与酶标仪读数有着良好的相关性，R2值达0.9985。采用此方法能够用于测定玉米赤霉烯酮降解酶在酸性条件(pH为5.5)的酶活力。
(2)重组菌株Transetta/pET30a-rmzhd中玉米赤霉烯酮降解酶酶活力的测定
取甘油保存的重组菌株Transetta/pET30a-rmzhd在LB培养基中，37℃过夜活化，接种至预先分装LB培养基的24孔深孔板中，封透气膜后于37℃、200rpm摇床培养4h培养，加入IPTG至终浓度1mM，降温至25℃诱导18h。取菌液400rpm离心20min去上清后，加入500μL裂解液(含溶菌酶5mg/mL)，重悬后于30℃、1000rpm裂解2h获得粗酶液。
取5μL粗酶液及5μL 200ppm ZEN母液加入到每孔装有90μL柠檬酸缓冲液(pH5.5)的荧光检测专用酶标板中，于50℃水浴反应30min后加入100μL色谱级甲醇终止反应。在酶标仪中，读取激发波274nm，发射波440nm时的OD值。计算得到ZEN的降解率为10.47±3.07％。HPLC法检测结果为12.58±2.33％。
实施例3
本实施例用于说明玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的测定方法
按照实施例2所述的方法绘制标准曲线并进行酶活力的测定，不同的是采用PBS缓冲液替换柠檬酸缓冲液。
绘制的标准曲线为y＝45.36x+105.426，其相关性稍差，R2值为0.9801。
计算得到重组菌株Transetta/pET30a-rmzhd的ZEN降解酶对ZEN的降解率为8.47±4.75％。
实施例4
本实施例用于说明玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的测定方法
按照实施例2所述的方法绘制标准曲线并进行酶活力的测定，不同的是采用乙腈替换甲醇。
绘制的标准曲线为y＝51.33x+78.513，其相关性稍差，R2值为0.9732。
计算得到重组菌株Transetta/pET30a-rmzhd的ZEN降解酶对ZEN的降解率为7.88±5.14％。
从实施例2-4的结果比较可看出，在本发明的方法的有机溶剂和缓冲液分别优选为甲醇和柠檬酸缓冲液时，能够进一步提高该方法的准确度，降低测量误差，使得在后续筛选玉米赤霉烯酮降解菌的过程中横向比较的结果误差更低，结果更准确。
实施例5
本实施例用于说明玉米赤霉烯酮降解酶突变重组菌株的高通量筛选方法
菌株构建
全基因合成来源于麦氏喙枝孢霉(Rhinocladiellamackenziei)的rmzhd基因(genbank登录号NW_013550602.1)，BamHI和NotI连入pET30a，构建质粒pET30a-rmzhd，转化至E.ColiTransetta，构建重组菌株Transetta/pET30a-rmzhd，记为出发菌株。
突变库构建-易错PCR
提取重组菌株质粒pET30a-rmzhd，以pET30a-rmzhd质粒为模板，增加PCR体系dTTP和dCTP浓度，并加入一定浓度的Mg2+和Mn2+，回收PCR产物。易错PCR体系如表1所示，易错PCR条件如表2所示。
表1
Figure BDA0002794004200000161
表2
Figure BDA0002794004200000171
PCR产物rmzhd基因片段回收，Goldengate法连接后取连接产物转化E.coliTans1-T1，涂布平板计算库容量并测序计算突变率。
提取突变体质粒转化Transetta感受态细胞，涂布抗性筛选平板，37℃培养过夜。
高通量筛选
(1)培养基分装：利用全自动移液工作站将灭菌后的LB液体培养基(卡那霉素50μg/mL、氯霉素20μg/mL)分别分装至96孔深孔板和24空深孔板；
(2)挑菌活化：通过微生物克隆筛选系统Qpix挑取能够正常生长的突变体单克隆，接种于96孔深孔板，封膜后37℃过夜培养；
(3)转接诱导：取96孔深孔板活化菌液200μL转接至预先分装LB培养基的24孔深孔板(96空深孔板剩余菌液加入600μL 60％甘油，-80℃保种)，封透气膜后于37℃、200rpm摇床培养4h，分别于每孔中加入终浓度1mM IPTG，降温至25℃诱导18h后移取100μL 96孔酶标板中读取OD600nm数值，挑选OD600nm大于0.1的菌株；
(4)菌体裂解：取菌液在4000rpm离心20min，去上清后加入500μL裂解液(含溶菌酶5mg/mL)，重悬后于30℃、1000rpm震荡裂解2h获得粗酶液；
取5μL粗酶液及5μL 200ppm ZEN母液加入到每孔装有90μL柠檬酸缓冲液(pH5.5)的荧光检测专用酶标板中，封膜后于50℃反应30min，加入100μL色谱级甲醇终止反应。在酶标仪中，读取激发波274nm，发射波440nm时的OD值，读数与ZEN含量成正比，选取读数较出发菌株低的突变株；得到15株ZEN含量低于出发菌株的突变株，也即获得了15株具有耐酸性的(pH为5.5)ZEN降解率高的菌株。
(5)摇瓶发酵验证：根据酶标仪的检测数据，挑取其中一株ZEN降解率大于25％的菌株，以出发菌株作为对照，并按照以下方法测定待测菌株和出发菌株的ZEN降解酶活力(以ZEN降解率计)。
对甘油保存的菌株在LB培养基中活化12h，然后接种至60mL LB培养基中，37℃、200rpm培养4h，然后加入IPTG至终浓度1mmol/L，降温至25℃诱导18h。取菌液离心后加入1.5mL 50mM Tris-HCl缓冲液重悬，超声破碎菌体后获得粗酶液。
取5μL粗酶液及5μL 200ppm ZEN母液加入到每孔装有90μL柠檬酸缓冲液(pH5.5)的荧光检测专用酶标板中，于50℃水浴反应30min后加入100μL色谱级甲醇终止反应。在酶标仪中，读取激发波274nm，发射波440nm时的OD值。使用实施例2中的标准曲线，计算得到ZEN的降解率结果见表3。
取10μL粗酶液及10μL 200ppm ZEN母液加入到480μL柠檬酸缓冲液(pH5.5)中，于50℃水浴反应30min后加入500μL色谱级甲醇终止反应。反应后的溶液过膜后HPLC(根据GB/T 28716-2012)检测ZEN残余量，计算得到的ZEN的降解率结果见表3。
表3
Figure BDA0002794004200000191
从表3的数据可以看出本发明所述的筛选方法能够定向筛选ZEN酶活力较高的、具有耐酸性能的玉米赤霉烯酮降解菌，且获得的玉米赤霉烯酮降解菌相比于出发菌株对ZEN的降解率大大提高了，从12.31％提高到28.45％。
虽然HPLC法检测更准确，也更接近真实水平，但是，本发明采用的荧光法相比于HPLC法，与HPLC法相比也是比较准确的，特别是在用于高通量筛选和检测过程中仅仅需要横向对比的情况下，步骤更加简单，且能够实现高通量检测，大大提高了检测效率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种玉米赤霉烯酮浓度的测定方法，其特征在于，该方法包括：
a.使用第一有机溶剂将玉米赤霉烯酮标准样品配置成不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第一标准溶液；
b.在激发波长250-290nm、发射波长300-600nm的条件下，分别以荧光法测定不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第一标准溶液的荧光吸收值，并绘制标准曲线；
c.使用第一有机溶剂将待测样品配制成待测样品溶液，在与步骤b相同的条件下，荧光法检测待测样品溶液的荧光吸收值，并根据标准曲线计算待测样品中玉米赤霉烯酮的浓度。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，所述第一有机溶剂选自甲醇、乙腈和乙酸乙酯中的至少一种；
优选地，所述第一有机溶剂的纯度为色谱纯。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，以重量计，所述不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第一标准溶液中玉米赤霉烯酮的浓度范围为0.01-100ppm，优选为0.1-10ppm；和/或
以重量计，待测样品溶液中玉米赤霉烯酮的含量为0.01-100ppm，优选为0.1-10ppm。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述荧光法为高通量荧光检测法，优选在配置有荧光检测器的酶标仪和荧光检测用酶标板中进行；
优选地，酶标板的每个孔中样品的添加量为50-250μL。
5.一种玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力的测定方法，其特征在于，该方法包括：
(1)使用第二有机溶剂将玉米赤霉烯酮标准样品配置成不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第二标准溶液；
(2)取玉米赤霉烯酮降解酶待测液和第二有机溶剂混合后，与步骤(1)中得到的不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第二标准溶液混合，得到不同浓度的玉米赤霉烯酮的待测标准体系；
(3)在激发波长250-850nm、发射波长300-600nm的条件下，分别以荧光法测定不同浓度的玉米赤霉烯酮的待测标准体系的荧光吸收值，并绘制标准曲线；
(4)按照步骤(2)中相同的添加量，将待酶解的玉米赤霉烯酮溶液和玉米赤霉烯酮降解酶待测液混合并反应，然后将反应后的物料和第二有机溶剂混合后得到待测样品体系；
(5)在与步骤(3)相同的条件下，荧光法检测待测样品体系的荧光吸收值，并根据标准曲线计算反应后的溶液中玉米赤霉烯酮的浓度，并进一步计算玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二有机溶剂选自甲醇、乙腈和乙酸乙酯中的至少一种；
优选地，所述第二有机溶剂的纯度为色谱纯；和/或
所述玉米赤霉烯酮降解酶待测液的pH为3-8；
优选地，所述玉米赤霉烯酮降解酶待测液包含玉米赤霉烯酮降解酶以及缓冲液和/或NaCl溶液；
更优选地，所述缓冲液选自柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液和乙酸缓冲液中的至少一种。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，相比于100重量份的待测标准体系，玉米赤霉烯酮降解酶待测液的含量为30-50重量份，玉米赤霉烯酮第二标准溶液的含量为1-5重量份，余量为第二有机溶剂；
优选地，以重量计，所述不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮第二标准溶液中玉米赤霉烯酮的浓度范围使得所述待测标准体系中玉米赤霉烯酮的浓度范围为0.01-100ppm，优选为0.1-10ppm。
8.根据权利要求5-8中任意一项所述的方法，其中，以重量计，待酶解的玉米赤霉烯酮溶液中玉米赤霉烯酮的浓度使得所述待测样品体系中玉米赤霉烯酮的含量为0.01-100ppm，优选为0.1-10ppm。
9.根据权利要求5-8中任意一项所述的方法，其中，所述荧光法为高通量荧光检测法，优选在配置有荧光检测器的酶标仪和荧光检测用酶标板中进行；
优选地，酶标板的每个孔中样品的添加量为50-250μL。
10.一种玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法，其特征在于，该方法包括：
取不同待测菌株在液体培养基中培养以进行初筛，得到出筛菌株；取获自初筛菌株的粗酶液，采用权利要求5-9所述的方法检测初筛得到的菌株的粗酶液中玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力以进行复筛，得到目标玉米赤霉烯酮降解菌；
优选地，该方法还包括：将复筛得到的菌株进行发酵验证，利用理化检测方法验证目标玉米赤霉烯酮降解菌的性能。
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