CN109303195B - 一种可替代抗生素的酵母细胞壁及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及畜牧养殖领域，具体涉及一种可替代抗生素的酵母细胞壁及其制备方法和应用。本发明提供的可替代抗生素的酵母细胞壁，其通过碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β‑葡聚糖酶和纤维素酶酶解而得到。本发明还提供了制备方法，包括：(1)将含酵母的原料进行自溶破壁，分离得到酵母细胞壁沉淀物；(2)将所述酵母细胞壁沉淀物进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β‑葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解，得到酵母细胞壁。本发明所得到的可替代抗生素的酵母细胞壁，无毒、无残留、无耐药性，能有效提高肉鸡的免疫力，减少发病率，增加养殖效益，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及畜牧养殖领域，具体涉及一种可替代抗生素的酵母细胞壁及其制备方法和应用。
背景技术
饲用抗生素具有促进禽畜生长、改善饲料利用率、降低死亡率和改善繁殖性能的功效。然而近年来，因动物产品药物残留引起的抗药菌株的比率不断增加，医治细菌性疾病的难度越来越大，所需抗生素的有效使用剂量节节攀升。大量的非治疗性抗生素的使用给养殖行业带来了许多问题。因此，开发新型安全的绿色饲料添加剂，替代或部分替代抗生素在禽畜养殖业中应用，对于缓解禽畜产品药品残留和病原微生物耐药性，保障食品安全，具有重要意义。
酵母细胞壁源于酵母，酵母生产作为一个产业的发展已经经历了200多年的历史，目前全球总产能约为350万吨，在此基础之上，酵母细胞壁由于酵母来源差异、加工工艺不同，导致在替代抗生素时，添加量大、效果不稳定。
故而开发一种可替代抗生素的酵母细胞壁，无毒、无残留、无耐药性，符合产业的发展，对畜牧业健康发展有着积极的意义。
发明内容
本发明所解决的现有技术问题是：现有的酵母细胞壁由于酵母来源差异、加工工艺不同，导致在替代抗生素时，添加量大、效果不稳定。本发明的目的是提供一种无毒、无残留、无耐药性、可替代日粮中抗生素的酵母细胞壁，通过对酵母细胞壁进行酶解改性处理，具有提高肉鸡生长性能的特点，能有效提高肉鸡的免疫力，减少发病率，增加养殖效益。
本发明通过提供一种可替代抗生素的酵母细胞壁的制备方法，使得酵母细胞壁无毒、无残留、无耐药性，可替代日粮中的抗生素，该酵母细胞壁经过酶解改性处理，具有提高肉鸡生长性能的特点，能有效提高肉鸡的免疫力，减少发病率，增加养殖效益。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
一种可替代抗生素的酵母细胞壁，其通过碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解而得到。
优选的，对于所述的可替代抗生素的酵母细胞壁，其通过碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解而得到。
优选的，对于所述的可替代抗生素的酵母细胞壁，所述酵母为酿酒酵母FX-2，其保藏编号为CCTCC NO:M2016418。
优选的，对于所述的可替代抗生素的酵母细胞壁，其中，以酵母细胞壁干物质质量计，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为1.5-6‰、2.5-5‰、0.2-1‰和0.2-1‰；优选的，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为1.5-4‰、2.5-4‰、0.2-0.8‰和0.2-0.8‰；更优选的，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为1.5-3‰、2.5-3‰、0.2-0.5‰和0.2-0.5‰。
优选的，对于所述的可替代抗生素的酵母细胞壁，其中，所述细胞壁是先经自溶破壁，然后经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解而得到。
一种可替代抗生素的酵母细胞壁的制备方法，其包含下述步骤：
(1)将含酵母的原料进行自溶破壁，分离得到酵母细胞壁沉淀物；
(2)将所述酵母细胞壁沉淀物进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解，得到酵母细胞壁。
优选的，对于所述的制备方法，在步骤(1)中，所述自溶破壁是在盐浓度2-4％、pH值5.5-6.5并且温度55-75℃条件下进行。
优选的，对于所述的制备方法，所述含酵母的原料是采用酿酒酵母菌种，糖蜜为碳源，尿素为氮源，进行发酵处理而得到。
优选的，对于所述的制备方法，发酵处理的pH为4.0-6.0，发酵时间为16-24h，发酵温度为28-30℃。
优选的，对于所述的制备方法，在步骤(2)中，将酵母细胞壁沉淀物进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解之前，先将酵母细胞壁沉淀物进行稀释成以酵母细胞壁沉淀物干物质计浓度为(10-20％)(w/v)的悬浮液，然后再进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解。
优选的，对于所述的制备方法，所述碱性蛋白酶的酶解温度为40-60℃，pH为6.0-8.5，水解时间为7-10小时；所述甘露聚糖酶的酶解温度为40-60℃，pH为6.0-8.0，水解时间为10-15小时；所述β-葡聚糖酶的酶解温度为55-60℃，pH为5.0-6.0，水解时间为5-8小时；所述纤维素酶的酶解温度为50-65℃，pH为4.0-5.5，水解时间为8-10小时。
优选的，对于所述的可替代抗生素的酵母细胞壁，其在家禽饲料中的应用，优选在肉鸡饲料中的应用。
一种饲料，是将可替代抗生素的酵母细胞壁添加到基础日粮中，添加量为250-500克/吨。
优选的，对于所述的饲料，所述饲料为肉鸡饲料。
本发明所取得的有益效果是：本发明所得到的可替代抗生素的酵母细胞壁与传统酵母细胞壁产品相比，添加量小，性能稳定，并且用本发明的制备方法得到的酵母细胞壁为天然产物，绿色安全，能提高肉鸡的免疫力，减少发病率，增加养殖效益。
菌株保藏信息及获取鉴定信息
本发明所用的菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC：M2016418，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮政编码：430072；电话：(027)-68752319。酿酒酵母FX-2记载在专利文献201611141122.8《酿酒酵母高密度培养方法及其pH调控方法》中。
本发明所使用的酿酒酵母FX-2来自于发酵面团，发酵面团中含有多种野生菌，以发酵面团为样品，制备面团浸出液，经过稀释涂布平板分离法分离得到纯种的菌株，经鉴定确认该菌株属于酿酒酵母。
菌株鉴定方法为:将菌株的26S rDNA的D1/D2区序列，与GenBank核酸数据库中的序列进行同源性分析，结果表明序列同源性大于99％，从而确定本发明分离得到的菌株属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，生物学分类为酿酒酵母FX-2(Saccharomycescerevisiae)。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种可替代抗生素的酵母细胞壁的制备方法，制备得到的酵母细胞壁，与现有的酵母细胞壁相比，其在肉鸡中使用添加剂量小(250-500g/t)，并且所述的酵母细胞壁为天然产物，绿色安全，能够提高肉鸡的免疫力，减少发病率。
本发明的酵母细胞壁的制备方法是用酿酒酵母为原料，经自溶、水解破壁、分离，经复合酶酶解、干燥得到酵母细胞壁。
在本发明优选的具体实施方式中，本发明的酵母细胞壁的制备方法，是通过自溶破壁，然后进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解处理。通过自溶盐，优选为氯化钠，在偏酸性环境下处理，能够保持无菌环境，激发酵母的内源酶活性，促进酵母细胞裂解，达到除去酵母细胞中的内容物，使剩下的酵母细胞壁沉淀物含有较高的多糖成分的目的。“逐一进行酶解”是指按顺序进行酶解，即依次进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解处理。
然后将经过自溶处理后的物质进行分离，除去酵母自溶物，得到酵母细胞壁沉淀物，将酵母细胞壁沉淀物采用多种酶进行复合酶解，包括碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶依次进行酶解处理。酵母细胞壁的结构从外层到内层依次为磷酸化的甘露聚糖、甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖，因此，发明人经过实验探究发现，首先采用碱性蛋白酶处理，用来破坏酵母细胞壁，使蛋白质降解，暴露甘露聚糖和葡聚糖，接着采用甘露聚糖酶处理，能够破坏酵母细胞壁的结构，使得甘露聚糖成分分离；然后采用β-葡聚糖酶进行处理，降解细胞壁中的葡聚糖使其变成小分子片段；最后采用纤维素酶进行处理，进一步使酵母细胞壁中的葡聚糖变成小分子片段，从而暴露出功能位点。
其中，在本发明的一种优选实施方式中，本发明提供了一种可替代抗生素的酵母细胞壁的制备方法，包括以下步骤：
(1)自溶破壁
将含酵母的原料在盐质量浓度为2-4％、pH值5.5-6.5、温度55-75℃的条件下自溶处理，分离得到酵母细胞壁沉淀物；
(2)酶解处理
将酵母细胞壁沉淀物加水稀释成干物质质量浓度为10-20％，加入质量浓度为1.5-6‰碱性蛋白酶(所述酶的含量均以酵母细胞壁干物质的质量计，以下均同)，控制温度40-60℃，pH至6.0-8.5，水解7-10小时；然后加入质量浓度为2.5-5‰的甘露聚糖酶，控制温度40-60℃，pH至6.0-8.0，水解时间10-15小时；然后调节pH为5.0-6.0，加入0.2-1‰的β-葡聚糖酶，控制温度为55-60℃水解5-8小时；最后调节温度为50-65℃，pH为4-5.5下，加入0.2-1‰的纤维素酶，水解时间为8-10小时。
优选的，加入质量浓度为1.5-4‰碱性蛋白酶(所述酶的含量均以酵母细胞壁干物质的质量计，以下均同)，控制温度40-60℃，pH至6.0-8.5，水解7-10小时；然后加入质量浓度为2.5-4‰的甘露聚糖酶，控制温度40-60℃，pH至6.0-8.0，水解时间10-15小时；然后调节pH为5.0-6.0，加入0.2-0.8‰的β-葡聚糖酶，控制温度为55-60℃水解5-8小时；最后调节温度为50-65℃，pH为4-5.5下，加入0.2-0.8‰的纤维素酶，水解时间为8-10小时。
更优选的，加入质量浓度为1.5-3‰碱性蛋白酶(所述酶的含量均以酵母细胞壁干物质的质量计，以下均同)，控制温度40-60℃，pH至6.0-8.5，水解7-10小时；然后加入质量浓度为2.5-3‰的甘露聚糖酶，控制温度40-60℃，pH至6.0-8.0，水解时间10-15小时；然后调节pH为5.0-6.0，加入0.2-0.5‰的β-葡聚糖酶，控制温度为55-60℃水解5-8小时；最后调节温度为50-65℃，pH为4-5.5下，加入0.2-0.5‰的纤维素酶，水解时间为8-10小时。
(3)离心干燥
将步骤(2)得到的酶解产物升温到90℃保温30min-1h，干燥得到改性酵母细胞壁。
在本发明的又一种优选实施方式中，在自溶处理之前，采用酿酒酵母菌种，以糖蜜为碳源，尿素为氮源，发酵pH值4.0-6.0、温度28-30℃、发酵16-24小时，获得最佳酵母细胞壁多糖含量的酵母原料。优选，所述酿酒酵母菌种为酿酒酵母FX-2(Saccharomycescerevisiae FX-2)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418。
下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。其中，实施例和对比例中所用到的原料的信息如下表所示。
表1本发明所用到的原料的信息
| 原料 | 厂家 |
| 碱性蛋白酶(100万u/g) | 南宁庞博生物工程有限公司 |
| 甘露聚糖酶(10000u/g) | 山东西唐生物科技有限公司 |
| β-葡聚糖酶(20万u/g) | 德国英联酶制剂公司 |
| 纤维素酶(2000u/g) | 南宁庞博生物工程有限公司 |
| 恩拉霉素 | 浙江海正药业股份有限公司 |
| 传统细胞壁产品 | 自备 |
传统细胞壁产品：即为本发明中的酵母经过发酵、自溶后获得的酵母细胞壁沉淀物，没有进行酶解处理。
实施例一
(一)改性酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备得到改性酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值5.5，培养温度30℃，发酵周期16小时，得到酵母原料。
请提供如下内容：
具体的培养基的成分和含量：
发酵罐体积：165m3
发酵工艺：温度30℃，pH 4.2-5.4，培养时间16h
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为2％，pH值5.5，温度55℃，自溶20小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为15％的浓度，加入2‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度55℃，pH值8.5，水解7小时；
b.继续加入2.5‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度55℃，pH值8.0，水解时间控制在15小时；
c.继续加入0.2‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度55℃，调节pH为6.0，水解时间控制在5小时；
d.调节温度至65℃，加入0.2‰质量浓度的纤维素酶，调节pH至4.0，水解时间控制在8小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温30min，干燥，得到改性酵母细胞壁。
(二)动物实验
1)选用1日龄新广黄肉鸡(由佛山市新广畜牧发展有限公司提供，下同)120羽，随机分为2个处理，每个处理6个重复，每个重复10羽。基础日粮配方参考NY/T33-2004(由中华人民共和国农业部发布的鸡饲养标准)，采用玉米-豆粕型日粮，抗生素组优选在基础日粮中添加250g/t恩拉霉素，试验组在基础日粮中添加250g/t酵母细胞壁。
2)生长性能的测定
表2是基础日粮组成及营养水平，下述实施例和对比例的基础日粮及营养水平与实施1中的相同，表3是试验设计，其中在对照组中，添加的是250g/t恩拉霉素，试验组添加的是250g/t酵母细胞壁，测定结果见表4。
表2基础日粮组成及营养水平
表3试验设计
| 处理 | 日粮组成 |
| 抗生素组 | 基础日粮+4％恩拉霉素250g/t |
| 试验组 | 基础日粮+酵母细胞壁250g/t |
表3进行的试验设计，所涉及的检测指标包括21日龄的平均体重、平均日增重、平均采食量和料肉比，其中，
21日龄平均体重(g)＝21日龄鸡的总重量/鸡的总数量；
平均日增重(g/t)＝21日龄鸡的总重量/21
平均采食量(g/t)＝21日龄鸡的总采食量/21
料肉比＝饲料量/重量
所得到的试验结果见表4。
表4添加250g/t酵母细胞壁对肉鸡生长性能的影响
| 21d体重(g) | 平均日增重(g/t) | 平均日采食量(g/t) | 料肉比 | |
| 抗生素组 | 298.84±18.32 | 14.23±0.87 | 23.65±1.47 | 1.66±0.07 |
| 试验组 | 298.12±21.32 | 14.20±1.01 | 23.66±2.21 | 1.66±0.06 |
从表4中可以看出，数据处理和分析采用SPSS15.0软件，t检验分析，两组间21日龄体重无显著差异(P＞0.05)，平均日增重无显著差异(P＞0.05)，采食量无显著差异(P＞0.05)，料肉比无显著差异(P＞0.05)。试验结果说明本发明实施例一中提供的酵母细胞壁可以替代恩拉霉素，生产性能无显著差异。
实施例二
(一)改性酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值5.5，培养温度30℃，发酵周期18小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为3％，pH值6.5，温度55℃，自溶20小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为10％的浓度，加入1.5‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度40℃，pH值6.0，水解7小时；
b.继续加入3‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度40℃，pH值6.0，水解时间控制在10小时；
c.继续加入0.5‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度55℃，调节pH为5.0，水解时间控制在5小时；
d.继续加入0.2‰质量浓度的纤维素酶，控制温度为50℃，调节pH至(5.5)，水解时间控制在10小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温1小时，干燥，得到改性酵母细胞壁。
(二)动物实验
1)选用1日龄新广黄肉鸡120羽，随机分为2个处理，每个处理6个重复，每个重复10羽。基础日粮配方参考NY/T 33-2004，采用玉米-豆粕型日粮，抗生素组在基础日粮中添加250g/t恩拉霉素；试验组在基础日粮中添加500g/t酵母细胞壁。
2)生长性能的测定
表5是试验设计，其中在对照组中，添加的是250g/t恩拉霉素，试验组添加的是500g/t酵母细胞壁，测定结果见表6。
表5试验设计
| 处理 | 日粮组成 |
| 抗生素组 | 基础日粮+4％恩拉霉素250g/t |
| 试验组 | 基础日粮+酵母细胞壁500g/t |
检测指标：42日龄平均体重、日增重、采食量、料肉比，试验结果见表6。
表6添加500g/t酵母细胞壁对肉鸡生长性能的影响
| 42d体重(g) | 平均日增重(g/t) | 平均日采食量(g/t) | 料肉比 | |
| 抗生素组 | 959.77±48.90 | 22.85±2.33 | 49.12±6.26 | 2.15±0.10 |
| 试验组 | 965.68±17.65 | 22.99±0.84 | 49.13±5.27 | 2.14±0.12 |
采用与实施例一相同的方法进行分析，从表6中可以看出：42日龄体重，试验组比抗生素组提高0.6％，无显著差异(P>0.05)，平均日增重无显著差异(P>0.05)，采食量提高0.02％，但无显著差异(P>0.05)，料肉比降低0.46％，无显著差异(P>0.05)。试验结果说明本发明实施例二提供的酵母细胞壁可以替代恩拉霉素，生产性能略有提高，但无显著差异。
实施例三
(一)改性酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备得到改性酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值6.0，培养温度28℃，发酵周期24小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为4％，pH值6.5，温度75℃，自溶30小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为20％的浓度，加入6‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度60℃，pH值8.5，水解10小时；
b.继续加入5‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度60℃，pH值8.0，水解时间控制在15小时；
c.继续加入1‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度60℃，调节pH为6.0，水解时间控制在8小时；
d.加入1‰质量浓度的纤维素酶，控制温度为65℃，调节pH至4.0，水解时间控制在8小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温1小时，干燥，得到改性酵母细胞壁。
(二)动物实验
1)选用1日龄新广黄肉鸡120羽，随机分为2个处理，每个处理6个重复，每个重复10羽。基础日粮配方参考NY/T 33-2004，采用玉米-豆粕型日粮，抗生素组在基础日粮中添加250g/t恩拉霉素；试验组在基础日粮中添加1000g/t酵母细胞壁。
2)生长性能的测定
表7是试验设计，其中在对照组中，添加的是250g/t恩拉霉素，试验组添加的是1000g/t酵母细胞壁，测定结果见表8。
表7试验设计
| 处理 | 日粮组成 |
| 抗生素组 | 基础日粮+4％恩拉霉素250g/t |
| 试验组 | 基础日粮+酵母细胞壁1000g/t |
检测指标：42日龄平均体重、日增重、采食量、料肉比，试验结果见表8
表8添加1000g/t酵母细胞壁对肉鸡生长性能的影响
| 42d体重(g) | 平均日增重(g/t) | 平均日采食量(g/t) | 料肉比 | |
| 抗生素组 | 959.77±48.90a | 22.85±2.33a | 49.12±6.26 | 2.15±0.10 |
| 试验组 | 1003.52±47.14b | 23.89±3.97b | 50.27±8.32 | 2.14±0.10 |
注：同列数据后的不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)
采用与实施例一相同的方法进行分析，从表8中可以看出：42日龄体重，试验组比抗生素组提高4.6％，差异显著(P<0.05)，平均日增重差异显著(P<0.05)，采食量提高2.35％，但无显著差异(P>0.05)，料肉比降低0.47％，无显著差异(P>0.05)。试验结果说明本发明实施例三提供的酵母细胞壁可以替代恩拉霉素，生产性能显著提高。
实施例四
(一)改性酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备得到改性酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值5.5，培养温度30℃，发酵周期16小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为2％，pH值5.5，温度55℃，自溶20小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为15％的浓度，加入4‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度55℃，pH值8.5，水解7小时；
b.继续加入4‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度55℃，pH值8.0，水解时间控制在15小时；
c.继续加入0.8‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度55℃，调节pH为6.0，水解时间控制在5小时；
d.调节温度至65℃，加入0.8‰质量浓度的纤维素酶，调节pH至4.0，水解时间控制在8小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温30min，干燥，得到改性酵母细胞壁。
(二)动物实验
1)选用1日龄新广黄肉鸡120羽，随机分为2个处理，每个处理6个重复，每个重复10羽。基础日粮配方参考NY/T 33-2004，采用玉米-豆粕型日粮，抗生素组在基础日粮中添加250g/t恩拉霉素；试验组在基础日粮中添加1000g/t酵母细胞壁。
2)生长性能的测定
表9是试验设计，其中在对照组中，添加的是250g/t恩拉霉素，试验组添加的是1000g/t酵母细胞壁，测定结果见表10。
表9试验设计
| 处理 | 日粮组成 |
| 抗生素组 | 基础日粮+4％恩拉霉素250g/t |
| 试验组 | 基础日粮+酵母细胞壁1000g/t |
检测指标：42日龄平均体重、日增重、采食量、料肉比，试验结果见表10。
表10添加1000g/t酵母细胞壁对肉鸡生长性能的影响
| 42d体重(g) | 平均日增重(g/t) | 平均日采食量(g/t) | 料肉比 | |
| 抗生素组 | 959.77±48.90 | 22.85±2.33 | 49.12±6.26 | 2.15±0.10 |
| 试验组 | 979.12±43.14 | 23.31±3.97 | 49.88±8.32 | 2.14±0.10 |
采用与实施例一相同的方法进行分析，从10表可以看出，42日龄体重，试验组比抗生素组提高2.0％，但无显著差异(P＞0.05)，对于平均日增重，试验组比抗生素组提高2.0％，但无显著差异(P＞0.05)，平均采食量无显著差异(P＞0.05)，料肉比降低0.47％，无显著差异(P＞0.05)。试验结果表明本发明实施例四中提供的酵母细胞壁可以替代恩拉霉素，生产性能略有提高，无显著差异。
实施例五
(一)改性酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备酵母细胞壁：
(2)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏标号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值5.5，培养温度30℃，发酵周期18小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为3％，pH值6.5，温度55℃，自溶20小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为10％的浓度，加入3‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度40℃，pH值6.0，水解7小时；
b.继续加入3‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度40℃，pH值6.0，水解时间控制在10小时；
c.继续加入0.6‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度55℃，调节pH为5.0，水解时间控制在5小时；
d.继续加入0.6‰质量浓度的纤维素酶，控制温度为50℃，调节pH至5.5，水解时间控制在10小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温1小时，干燥，得到改性酵母细胞壁。
(二)动物实验
1)选用1日龄新广黄肉鸡120羽，随机分为2个处理，每个处理6个重复，每个重复10羽。基础日粮配方参考NY/T 33-2004，采用玉米-豆粕型日粮，抗生素组在基础日粮中添加250g/t恩拉霉素；试验组在基础日粮中添加1000g/t酵母细胞壁。
2)生长性能的测定
表11是试验设计，其中在对照组中，添加的是250g/t恩拉霉素，试验组添加的是1000g/t酵母细胞壁，测定结果见表12。
表11试验设计
| 处理 | 日粮组成 |
| 抗生素组 | 基础日粮+4％恩拉霉素250g/t |
| 试验组 | 基础日粮+酵母细胞壁1000g/t |
检测指标：42日龄平均体重、日增重、采食量、料肉比，试验结果见表12
表12添加1000g/t酵母细胞壁对肉鸡生长性能的影响
| 42d体重(g) | 平均日增重(g/t) | 平均日采食量(g/t) | 料肉比 | |
| 抗生素组 | 959.77±48.90a | 22.85±2.33a | 49.12±6.26 | 2.15±0.10 |
| 试验组 | 983.21±41.26b | 23.41±2.17b | 50.10±5.32 | 2.14±0.10 |
注：同列数据后的不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)
采用与实施一相同的方法进行分析，从表12中可以看出，对于42日龄体重，试验组比抗生素组提高2.4％，差异显著(P＜0.05)，对于平均日增重，试验组比抗生素组提高2.4％，差异显著(P＜0.05)，对于平均日采食量，试验组比抗生素提高2.0％，无显著差异(P＞0.05)，对于料肉比，试验组比抗生素组降低0.47％，无显著差异(P＞0.05)，说明本实施例的酵母细胞壁可以替代恩拉霉素，生产性能显著提高。
实施例六
(一)改性酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备得到改性酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值5.5，培养温度30℃，发酵周期16小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为2％，pH值5.5，温度55℃，自溶20小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为15％的浓度，加入3‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度55℃，pH值8.5，水解7小时；
b.继续加入3‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度55℃，pH值8.0，水解时间控制在15小时；
c.继续加入0.5‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度55℃，调节pH为6.0，水解时间控制在5小时；
d.调节温度至65℃，加入0.5‰质量浓度的纤维素酶，调节pH至4.0，水解时间控制在8小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温30min，干燥，得到改性酵母细胞壁。
(二)动物实验
1)选用1日龄新广黄肉鸡120羽，随机分为2个处理，每个处理6个重复，每个重复10羽。基础日粮配方参考NY/T 33-2004，采用玉米-豆粕型日粮，抗生素组在基础日粮中添加250g/t恩拉霉素；试验组在基础日粮中添加1000g/t酵母细胞壁。
2)生长性能的测定
表13是试验设计，其中在对照组中，添加的是250g/t恩拉霉素，试验组添加的是1000g/t酵母细胞壁，测定结果见表14。
表13试验设计
| 处理 | 日粮组成 |
| 抗生素组 | 基础日粮+4％恩拉霉素250g/t |
| 试验组 | 基础日粮+酵母细胞壁1000g/t |
检测指标：42日龄平均体重、日增重、采食量、料肉比，试验结果见表14。
表14添加1000g/t酵母细胞壁对肉鸡生长性能的影响
| 42d体重(g) | 平均日增重(g/t) | 平均日采食量(g/t) | 料肉比 | |
| 抗生素组 | 959.77±48.90 | 22.85±2.33 | 49.12±6.26 | 2.15±0.10 |
| 试验组 | 963.21±42.26 | 22.93±2.08 | 49.07±6.02 | 2.14±0.10 |
采用与实施例一相同的方法进行分析，从表14中可以看出，对于42日龄体重，试验组比抗生素组提高0.36％，无显著差异(P＞0.05)，对于日增重，试验组比对照组提高0.35％，无显著差异(P＞0.05)，采食量降低0.10％，无显著差异(P＞0.05)，料肉比降低0.47％，无显著差异(P＞0.05)，说明本实施例提供的酵母细胞壁可以替代恩拉霉素，生产性能略微提高。
实施例七
(一)改性酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备酵母细胞壁：
(3)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值5.5，培养温度30℃，发酵周期18小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为3％，pH值6.5，温度55℃，自溶20小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为10％的浓度，加入2‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度40℃，pH值6.0，水解7小时；
b.继续加入2.5‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度40℃，pH值6.0，水解时间控制在10小时；
c.继续加入0.4‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度55℃，调节pH为5.0，水解时间控制在5小时；
d.继续加入0.4‰质量浓度的纤维素酶，控制温度为50℃，调节pH至5.5，水解时间控制在10小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温1小时，干燥，得到改性酵母细胞壁。
(二)动物实验
1)选用1日龄新广黄肉鸡120羽，随机分为2个处理，每个处理6个重复，每个重复10羽。基础日粮配方参考NY/T 33-2004，采用玉米-豆粕型日粮，抗生素组在基础日粮中添加250g/t恩拉霉素；试验组在基础日粮中添加1000g/t酵母细胞壁。
2)生长性能的测定
表15是试验设计，其中在对照组中，添加的是250g/t恩拉霉素，试验组添加的是1000g/t酵母细胞壁，测定结果见表16。
表15试验设计
| 处理 | 日粮组成 |
| 抗生素组 | 基础日粮+4％恩拉霉素250g/t |
| 试验组 | 基础日粮+酵母细胞壁1000g/t |
检测指标：42日龄平均体重、日增重、采食量、料肉比，试验结果见表16。
表16添加1000g/t酵母细胞壁对肉鸡生长性能的影响
| 42d体重(g) | 平均日增重(g/t) | 平均日采食量(g/t) | 料肉比 | |
| 抗生素组 | 959.77±48.90 | 22.85±2.33 | 49.12±6.26 | 2.15±0.10 |
| 试验组 | 969.52±45.26 | 23.08±2.61 | 49.39±6.24 | 2.14±0.10 |
采用与实施例一相同的方法进行分析，从表16可以看出，对于42日龄体重，试验组比抗生素提高1.0％，无显著差异(P＞0.05)；对于日增重，试验组比抗生素组提高1.0％，无显著差异(P＞0.05)；对于采食量，试验组比抗生素提高0.55％，无显著差异(P＞0.05)，料肉比降低0.47％，无显著差异(P＞0.05)。试验结果说明本实施提供的酵母细胞壁可以替代恩拉霉素，生产性能略有提高。
对比例一
(一)改性酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备得到改性酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值6.0，培养温度28℃，发酵周期24小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为4％，pH值6.5，温度75℃，自溶30小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为20％的浓度，加入6‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度60℃，pH值8.5，水解10小时；
b.继续加入5‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度60℃，pH值8.0，水解时间控制在15小时；
c.继续加入1‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度60℃，调节pH为6.0，水解时间控制在8小时；
d.加入1‰质量浓度的纤维素酶，控制温度为65℃，调节pH至4.0，水解时间控制在8小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温1小时，干燥，得到改性酵母细胞壁。
(二)动物实验
1)选用1日龄新广黄肉鸡120羽，随机分为2个处理，每个处理6个重复，每个重复10羽。基础日粮配方参考NY/T 33-2004，采用玉米-豆粕型日粮，抗生素组在基础日粮中添加250g/t恩拉霉素；试验组在基础日粮中添加1000g/t对比例一所得到的酵母细胞壁。
2)生长性能的测定
表17是试验设计，其中在对照组中，添加的是250g/t恩拉霉素，试验组添加的是1000g/t对比例一所得到的酵母细胞壁，测定结果见表18。
表17试验设计
| 处理 | 日粮组成 |
| 抗生素组 | 基础日粮+4％恩拉霉素250g/t |
| 试验组 | 基础日粮+对比例一所得到的酵母细胞壁1000g/t |
检测指标：42日龄平均体重、日增重、采食量、料肉比，试验结果见表18。
表18添加1000g/t对比例一所得到的酵母细胞壁对肉鸡生长性能的影响
| 42d体重(g) | 平均日增重(g/t) | 平均日采食量(g/t) | 料肉比 | |
| 抗生素组 | 959.77±48.90 | 22.85±2.33 | 49.12±6.26 | 2.15±0.10 |
| 试验组 | 971.71±46.36 | 23.14±2.36 | 49.52±6.31 | 2.14±0.10 |
采用与实施例一相同的方法进行分析，从表18可以看出，对于42日龄体重，试验组比抗生素组提高1.24％，无显著差异(P＞0.05)；对于日增重，试验组比抗生素组提高1.3％，无显著差异(P＞0.05)；对于日采食量，试验组比抗生素组提高0.8％，无显著差异(P＞0.05)；对于料肉比，试验组比抗生素降低0.47％。
将实施例三与对比例一相比，虽然对比例一提供的酵母细胞壁可以替代恩拉霉素，但是对比例一的生产性能不高，而实施例一种的对于42日龄体重以及平均日增重，均表现出显著差异(P＜0.05)，使用实施例三提供的酵母细胞壁，生产性能显著提高。
对比例二
(一)改性酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备得到改性酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值6.0，培养温度28℃，发酵周期24小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为4％，pH值6.5，温度75℃，自溶30小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为20％的浓度，加入5‰质量浓度(以酵母细胞壁干物质计，以下同)的甘露聚糖酶，控制温度60℃，pH值8.0，水解时间控制在15小时；
b.继续加入1‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度60℃，调节pH为6.0，水解时间控制在8小时；
c.加入1‰质量浓度的纤维素酶，控制温度为65℃，调节pH至4.0，水解时间控制在8小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温1小时，干燥，得到改性酵母细胞壁。
(二)动物实验
1)选用1日龄新广黄肉鸡120羽，随机分为2个处理，每个处理6个重复，每个重复10羽。基础日粮配方参考NY/T 33-2004，采用玉米-豆粕型日粮，抗生素组在基础日粮中添加250g/t恩拉霉素；试验组在基础日粮中添加1000g/t对比例二所得到的酵母细胞壁。
2)生长性能的测定
表19是试验设计，其中在对照组中，添加的是250g/t恩拉霉素，试验组添加的是1000g/t对比例二所得到的酵母细胞壁，测定结果见表20。
表19试验设计
| 处理 | 日粮组成 |
| 抗生素组 | 基础日粮+4％恩拉霉素250g/t |
| 试验组 | 基础日粮+对比例二所得到的酵母细胞壁1000g/t |
检测指标：42日龄平均体重、日增重、采食量、料肉比，试验结果见表20
表20添加1000g/t对比例二所得到的酵母细胞壁对肉鸡生长性能的影响
| 42d体重(g) | 平均日增重(g/t) | 平均日采食量(g/t) | 料肉比 | |
| 抗生素组 | 959.77±48.90 | 22.85±2.33 | 49.12±6.26 | 2.15±0.10 |
| 试验组 | 965.38±48.96 | 22.99±2.38 | 49.20±6.22 | 2.14±0.10 |
采用与实施例一相同的方法进行分析，从表20可以看出，关于42日龄体重，试验组比抗生素组提高0.58％，无显著差异(P＞0.05)；平均日增重无显著差异(P＞0.05)，采食量提高0.16％，无显著差异(P＞0.05)；料肉比降低0.47％。
将实施例三与对比例二相比，虽然对比例二中的酵母细胞壁可以替代恩拉霉素，但生产性能较低，而采用实施例三制备的酵母细胞壁，42日龄体重及平均日增重差异显著，生产性能显著提高。
对比例三
采用传统的细胞壁产品对动物进行试验
1)选用1日龄新广黄肉鸡120羽，随机分为2个处理，每个处理6个重复，每个重复10羽。基础日粮配方参考NY/T 33-2004，采用玉米-豆粕型日粮，抗生素组在基础日粮中添加250g/t恩拉霉素；试验组在基础日粮中添加1000g/t传统酵母细胞壁，所述传统酵母细胞壁即是本发明中的酵母经过发酵、自溶后得到的酵母细胞壁沉淀物，没有进行一系列酶解处理。
2)生长性能的测定
表21是试验设计，其中在对照组中，添加的是250g/t恩拉霉素，试验组添加的是1000g/t传统酵母细胞壁，测定结果见表22。
表21试验设计
| 处理 | 日粮组成 |
| 抗生素组 | 基础日粮+4％恩拉霉素250g/t |
| 试验组 | 基础日粮+传统酵母细胞壁1000g/t |
检测指标：42日龄平均体重、日增重、采食量、料肉比，试验结果见表22。
表22添加1000g/t传统酵母细胞壁对肉鸡生长性能的影响
| 42d体重(g) | 平均日增重(g/t) | 平均日采食量(g/t) | 料肉比 | |
| 抗生素组 | 959.77±48.90 | 22.85±2.33 | 49.12±6.26 | 2.15±0.10 |
| 试验组 | 947.17±47.96 | 22.55±2.76 | 48.71±6.02 | 2.16±0.10 |
采用与实施例一相同的方法进行分析，从表22可以看出，对于42日龄体重，试验组比抗生素组降低1.3％，对于平均日增重，试验组比抗生素组降低1.3％，对于平均日采食量，试验组比抗生素组降低0.83％，对于料肉比，试验组比抗生素组提高0.47％，说明传统的酵母细胞壁如果替代恩拉霉素，生产性能变低，因此，本对比例中的传统酵母壁不能替代恩拉霉素。
综上所述，虽然对比例一和对比例二所得到的酵母细胞壁虽然能够替代酵母细胞壁，但生产性能不高；对比例三采用传统的酵母细胞壁，与恩拉霉素组进行相比，生产性能低，即传统的酵母细胞壁不能够替代抗生素恩拉霉素。采用本发明所制备的酵母细胞壁能够替代抗生素恩拉霉素，并且生产性能显著提高，能够增加养殖效益。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。
Claims (17)
1.一种可替代抗生素的酵母细胞壁，其特征在于，其是先经自溶破壁，然后经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解而得到；以酵母细胞壁干物质质量计，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为1.5-6‰、2.5-5‰、0.2-1‰和0.2-1‰；所述碱性蛋白酶的酶解温度为40-60℃，pH为6.0-8.5，水解时间为7-10小时；所述甘露聚糖酶的酶解温度为40-60℃，pH为6.0-8.0，水解时间为10-15小时；所述β-葡聚糖酶的酶解温度为55-60℃，pH为5.0-6.0，水解时间为5-8小时；所述纤维素酶的酶解温度为50-65℃，pH为4.0-5.5，水解时间为8-10小时。
2. 根据权利要求1所述的可替代抗生素的酵母细胞壁，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母FX-2，其保藏编号为CCTCC NO: M2016418。
3.根据权利要求1所述的可替代抗生素的酵母细胞壁，其特征在于，以酵母细胞壁干物质质量计，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为1.5-4‰、2.5-4‰、0.2-0.8‰和0.2-0.8‰。
4.根据权利要求2所述的可替代抗生素的酵母细胞壁，其特征在于，以酵母细胞壁干物质质量计，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为1.5-4‰、2.5-4‰、0.2-0.8‰和0.2-0.8‰。
5.根据权利要求1所述的可替代抗生素的酵母细胞壁，其特征在于，以酵母细胞壁干物质质量计，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为1.5-3‰、2.5-3‰、0.2-0.5‰和0.2-0.5‰。
6.根据权利要求2所述的可替代抗生素的酵母细胞壁，其特征在于，以酵母细胞壁干物质质量计，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为1.5-3‰、2.5-3‰、0.2-0.5‰和0.2-0.5‰。
7.一种可替代抗生素的酵母细胞壁的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将含酵母的原料进行自溶破壁，分离得到酵母细胞壁沉淀物；
（2）将所述酵母细胞壁沉淀物进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解，得到酵母细胞壁；以酵母细胞壁干物质质量计，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为1.5-6‰、2.5-5‰、0.2-1‰和0.2-1‰；所述碱性蛋白酶的酶解温度为40-60℃，pH为6.0-8.5，水解时间为7-10小时；所述甘露聚糖酶的酶解温度为40-60℃，pH为6.0-8.0，水解时间为10-15小时；所述β-葡聚糖酶的酶解温度为55-60℃，pH为5.0-6.0，水解时间为5-8小时；所述纤维素酶的酶解温度为50-65℃，pH为4.0-5.5，水解时间为8-10小时。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述的自溶破壁是在盐浓度2-4%、pH值5.5-6.5并且温度55-75℃条件下进行。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述含酵母的原料是采用酿酒酵母菌种，糖蜜为碳源，尿素为氮源，进行发酵处理而得到。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述含酵母的原料是采用酿酒酵母菌种，糖蜜为碳源，尿素为氮源，进行发酵处理而得到。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，发酵处理的pH为4.0-6.0，发酵时间为16-24h，发酵温度为28-30℃。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，发酵处理的pH为4.0-6.0，发酵时间为16-24h，发酵温度为28-30℃。
13.根据权利要求7-12任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，将酵母细胞壁沉淀物进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解之前，先将酵母细胞壁沉淀物进行稀释成以酵母细胞壁沉淀物干物质计浓度为10-20%的悬浮液，然后再进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解。
14.根据权利要求1-6任一项所述的可替代抗生素的酵母细胞壁或者权利要求7-13任一项所述的方法制备的可替代抗生素的酵母细胞壁在制备家禽饲料中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其在制备肉鸡饲料中的应用。
16.一种饲料，其特征在于，将权利要求1-6任一项所述的可替代抗生素的酵母细胞壁或权利要求7-13任一项所述的方法制备得到的酵母细胞壁添加在基础日粮中，添加量为250-500克/吨。
17.根据权利要求16所述的饲料，其特征在于，所述饲料为肉鸡饲料。
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