CN101205552A - 酵母细胞壁β-1,3-葡聚糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种酵母细胞壁β－1，3－葡聚糖的制备方法，依照如下步骤完成：1)杂质处理：将酵母干粉分散于水中，过滤除去其中的杂质；2)碱处理：向过滤后的酵母悬液中加入碱，使悬液中碱最终浓度仍为0.5－7％；3)清洗：利用虹吸的方法吸去上清液，直到上清液澄清透明无杂质，且pH值到7－8为止；4)喷雾干燥：最终得到β－1，3－葡聚糖固体粉末。本发明的优点是：1.降低工业化生产的成本。2.操作过程、使用的设备简单，易于实现工业化生产。3.原料中蛋白去除率高，产物β－1，3－葡聚糖的得率和纯度较高。

Description

酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的制备方法

技术领域：

本发明涉及从废弃啤酒酵母菌中提取酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的方法。

背景技术：

糖类是生物体的主要成分之一，而多糖是除蛋白质、核酸外的又一高分子化合物，在生物活性物质研究蓬勃发展的今天，多糖由于其独特的生物功能，已成为备受重视的功能因子之一。

真菌葡聚糖重要的来源是啤酒酵母(Saccharomy cescerviseae)，S.cerevisiae是人类使用的最古老的微生物之一，它安全无毒，在食品和医药工业有着广泛的应用。酵母细胞能利用廉价的培养基，繁殖快，生物量收率高，适合大规模工业化生产。酵母细胞被细胞壁包围，一般地，酵母细胞壁占细胞干重的20～25％，它呈三明治状——外层为甘露聚糖(mannan)，内层为葡聚糖(glucan)，都是分枝状聚合物，中间夹着一层蛋白质(包括多种酶，如葡聚糖酶、甘露聚糖酶等)。

酵母的细胞壁主要由以下成分组成：①具有β(1→6)键合的葡聚糖侧链的原纤维的碱不溶性β(1→3)键合的葡聚糖；②具有β(1→6)键合的葡聚糖侧链的碱溶性β(1→3)键合的葡聚糖；③具有间歇性的β(1→3)键的不定型的酸溶性的β(1→6)葡聚糖；④连接到蛋白质的不定型的碱溶性的甘露聚糖。细胞壁中β-1，3-葡聚糖占多糖的50％-60％，表明酵母细胞壁是β-1，3-葡聚糖较好的提取原料。

目前对啤酒废酵母的综合利用，多集中在对其蛋白质、核酸、维生素、微量元素和酶方面，研究最多的是从酵母中回收蛋白质和可溶性营养物制作营养添加剂和调味品。

β-1，3-葡聚糖(β-1，3-D-glucan)是以葡萄糖为基本单位，通过(1-3)-β-D-糖苷键连接而成的一类高分子化合物。它广泛存在于细菌、酵母、蘑菇、谷类和海藻中，系β-1，3-D-吡喃型葡聚糖聚合物，呈梳子状结构，(1→3)-β-主链和(1→6)-β-分支是其免疫活性所必需的。

目前β-1，3-葡聚糖的制备方法有以下三种：

1、国外报道

Masler等(1986)报道了酸碱处理制备酵母β-1，3-葡聚糖的方法：将1kg压榨酵母分散到1.5L、6％(w/v)NaOH溶液，60℃搅拌4h。然后加入1L水，1200g离心20min，收集沉淀。沉淀再分散到1.5L、3％(w/v)NaOH溶液，90℃保温2h，1200g离心20min，收集沉淀。沉淀用200mL水洗3遍。室温下，用200mL、4％(w/v)HCl浸提2遍，每遍2h，1200g离心20min，收集沉淀，干燥后得到β-1，3-葡聚糖产品。Williams等作了一些修改：S.cerevisiae分散到3％(w/v)NaOH溶液，75℃搅拌2h，自然冷却，继续搅拌5h，离心，弃上清，沉淀再分散到3％(w/v)NaOH溶液75℃下搅拌1h，自然冷却至室温，继续搅拌3h，加水过夜。离心，弃上清，沉淀再分散到3％(w/v)NaOH，75℃搅拌1h，用HCl调至pH 4.5，离心，弃上清，沉淀依次用水、无水乙醇和无水乙醚洗涤数次，37℃下干燥。传统的β-1，3-葡聚糖制备方法是基于酸碱反复萃取，这种方法明显不足在于酸、碱试剂用量大、产物杂质含量高、耗时和环境污染大。从真菌细胞提取的β-1，3-葡聚糖仍含有5～10％的杂质，主要是蛋白质和甘露聚糖等多糖。

2、国内研究

将新鲜酵母300g(相当于重100g)悬浮于1L，1mol/LNaOH溶液中，100℃下剧烈搅拌1h冷却至40～50℃，3000rpm离心15min，弃上清液，不溶物用1L、0.75mol/L NaOH溶液重新悬浮，加热至100℃维持15min，3000rpm离心去上清，沉淀用1L、0.75mol/L NaOH溶液重新悬浮，加热至100℃维持15min，冷却后用HCl调节至pH 4.5，然后用200mL蒸馏水洗涤2遍，200mL无水乙醇脱水2次，再用200mL无水乙醚脱水，37℃下风干12h，获得碱不溶性β-1，3-葡聚糖。使用无水乙醚一方面可以脱水，另一方面还能脱脂，用皂化法检测不出脂肪。用酸-碱法制备β-1，3-葡聚糖，0.75mol/L NaOH在100℃下作用2h。能有效地去除甘露糖蛋白，0.75mol/L硫酸提高了β-1，3-葡聚糖的比粘度，制备的β-1，3-葡聚糖不溶于水、乙醇、丙酮等有机溶剂，但能在二甲基亚砜中形成稳定的悬浊液，亦可溶于发烟盐酸。从啤酒废酵母泥中提取的酵母多糖溶液为粘稠的胶体，表现为非牛顿假塑性，其溶液的粘度随温度升高、受热时间延长而下降。

3、自溶法生产葡聚糖

将新鲜酵母300g(相当于干重100g)悬浮于1L 1mol/L的NaOH溶液中，100℃下剧烈搅拌1h，自溶的酵母细胞冷却至40～50℃，3000rpm/min离心15m in，去上清液。自溶的酵母细胞用1L 0.75mol/L的NaOH溶液重新悬浮，直接加热至100℃维持15min，3000rpm/min离心去上清液，溶解的酵母细胞再用1L 0.75mol/L的NaOH溶液重复提取一次，降至70℃保温16h，冷却后用HCl调pH至4.5，3000rpm/min离心去上清液，用200mL蒸馏水悬浮煮沸10min，重复两次，离心去上清液，200mL无水乙醇分两次脱水，再用200mL无水乙醚脱水，37℃下风干12h，得碱不溶性葡聚糖，称为酵母葡聚糖。

酵母泥预处理→水洗，离心→自溶→离心，沉淀溶于水中→超声波粉碎→木瓜蛋白酶，pH 7.0，55℃，酶解→离心→沉淀→碱溶→离心→沉淀水洗→无水乙醇洗涤→抽提→烘干

以上方法存在下列不足之处：1、原料问题：文献报道中有的实验采用新鲜酵母为原料，这样的原料来源不便，成本较高。2、工艺问题：文献报道大部分为实验室小量试验，很少有工业化规模的研究的报道，一些工艺不便于工业化规模使用。3、后处理问题：大量的酵母经过处理后形成了可溶性物质和葡聚糖混合的状态，如果通过离心的方式进行分离，则要大型的离心设备，并且消耗大量的电能。4、干燥问题：已有方法在后处理过程中多采用有机溶剂进行脱水，工业化生产有易燃易爆的危险。

发明的内容：

本发明的目的是提供一种酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖制备方法，该方法的工艺简单，有效地降低成本，并且可工业化生产。

本发明的技术方案是：一种酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的制备方法，其特征在于：依照如下步骤完成：1)杂质处理：将酵母干粉分散于水中，酵母干粉与水的质量比为1∶1.5-1∶20搅拌使其充分混合，通过60-100目筛过滤除去其中的杂质；如果原料为酵母悬液，则直接通过60-100目筛过滤除去其中的杂质；2)碱处理：向过滤后的酵母悬液中加入碱，使悬液中碱的浓度达到0.5-7％，升温到96-121℃，搅拌转速10-500转/min，反应1-7小时，静置过夜，弃去上清液，再加入水和碱，使碱最终浓度仍为0.5-7％，加热到96-121℃，反应时间为1-7小时；3)清洗：静置使葡聚糖沉降，弃去上清液，再将沉淀物加水混匀，静置0.2-48小时，利用虹吸的方法吸去上清液，如后反复清洗，每次静置0.2-48小时，直到上清液澄清透明无杂质，且pH值到7-8为止；4)喷雾干燥：将清洗后的酵母葡聚糖经均质后，浓缩到喷雾干燥设备要求的浓度范围，通过喷雾干燥设备进行喷雾干燥，最终得到β-1，3-葡聚糖固体粉末。

本发明还可以采用如下技术措施：

上述碱采用NaOH或KOH。

上述杂质处理步骤中采用80目筛子进行过滤。

上述碱处理步骤中碱的浓度为4％，温度为100℃，搅拌转速350转/min，反应时间为3小时；第二次处理碱浓度为4％，温度为100℃，时间为1-7小时；静置时间为3-12小时，pH为7-8。

上述杂质处理和碱处理步骤之间可以增加酶处理工艺，酶的加入量为3-30AU/千克蛋白，处理时间在0.1小时-10小时之间，处理温度在50-60℃之间，pH值为7-10。

上述酶采用碱性蛋白酶。

本发明的优点是：1、本发明采用的是啤酒工业和酒精工业废弃的酵母菌，这样的原料量大、成本低廉且较易获得，并且有废弃物利用的社会效益。2、本发明所述方法较其它方法省去了很多步骤，有助于降低工业化生产的成本。3、本发明所述的操作过程简单，易于实现工业化生产，使用的设备较简单。4、原料中蛋白去除率高，产物β-1，3-葡聚糖的得率和纯度较高。5、本发明根据葡聚糖在水中和碱液中都不溶的特点，采用自然沉降的方式进行分离，并且用虹吸的方式分离上清液，这样有利于节省设备投资，降低生产成本。6、酶处理条件温和，对葡聚糖的生物活性没有任何破坏。由于酶对蛋白的降解，对于后处理具有明显的优势。

附图说明：

图1是本发明的工艺流程图。

具体实施方式：

实施例1

取500g啤酒干酵母加入4.5升水，混合均匀后，通过80目筛去除麦皮等杂质，然后加入NaOH，使NaOH终浓度为4％，加热到100℃，350转/min搅拌反应3h，静置过夜，次日弃去上清液，倒入与弃去上清液等量的清水，加入NaOH并且使其终浓度为4％，加热到100℃，350转/min搅拌反应3h，静置弃去上清液，倒入清水，反复洗涤得到的沉降物，经喷雾干燥得到葡聚糖。

实施例2：

取500g啤酒干酵母加入4.5升水，混合均匀后，通过60目筛去除麦皮等杂质，然后加入NaOH，使NaOH终浓度为4.5％，加热到110℃，300转/min搅拌反应3.5h，静置过夜，次日弃去上清液，倒入与弃去上清液等量的清水，加入NaOH并且使其终浓度为5％，加热到110℃，350转/min搅拌反应3h，静置弃去上清液，倒入清水，反复洗涤得到的沉降物，经喷雾干燥得到葡聚糖。

实施例3：

取1Kg啤酒干酵母加入4.5升水，混合均匀后，通过80目筛去除麦皮等杂质，然后加入NaOH调节pH值到8，加入碱性蛋白酶，于55℃反应2小时；加入5L清水，然后加入NaOH使悬液浓度为1％，加热到100℃，300转/min搅拌反应3h，静置弃去上清液，倒入清水，反复洗涤得到的沉降物，经喷雾干燥得到葡聚糖。

Claims (6)

1.一种酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的制备方法，其特征在于：依照如下步骤完成：1)杂质处理：将酵母干粉分散于水中，酵母干粉与水的质量比为1∶1.5——1∶20搅拌使其充分混合，通过60-100目筛过滤除去其中的杂质；如果原料为酵母悬液，则直接通过60-100目筛过滤除去其中的杂质；2)碱处理：向过滤后的酵母悬液中加入碱，使悬液中碱的浓度达到0.5-7％，升温到96-121℃，搅拌转速10-500转/min，反应1-7小时，静置过夜，弃去上清液，再加入水和碱，使碱最终浓度仍为0.5-7％，加热到96-121℃，反应时间为1-7小时；3)清洗：静置使葡聚糖沉降，弃去上清液，再将沉淀物加水混匀，静置0.2-48小时，利用虹吸的方法吸去上清液，如后反复清洗，每次静置0.2-48小时，直到上清液澄清透明无杂质，且pH值到7-8为止；4)喷雾干燥：将清洗后的酵母葡聚糖经均质后，浓缩到喷雾干燥设备要求的浓度范围，通过喷雾干燥设备进行喷雾干燥，最终得到β-1，3-葡聚糖固体粉末。

2.根据权利要求1所述的酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的制备方法，其特征在于：上述碱采用NaOH或KOH。

3.根据权利要求1所述的酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的制备方法，其特征在于：上述杂质处理步骤中采用80目筛子进行过滤。

4.根据权利要求1所述的酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的制备方法，其特征在于：上述碱处理步骤中碱的浓度为4％，温度为100℃，搅拌转速350转/min，反应时间为3小时；第二次处理碱浓度为4％，温度为100℃，时间为1-7小时；静置时间为3-12小时，pH为7-8。

5.根据权利要求1所述的酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的制备方法，其特征在于：上述杂质处理和碱处理步骤之间可以增加酶处理工艺，酶的加入量为3-30AU/千克蛋白，处理时间在0.1小时-10小时之间，处理温度在50-60℃之间，pH值为7-10。

6.根据权利要求5所述的酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的制备方法，其特征在于：上述酶采用碱性蛋白酶。