CN115918813A - 一种美洲鳗配合饲料 - Google Patents

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CN115918813A CN202211728876.9A CN202211728876A CN115918813A CN 115918813 A CN115918813 A CN 115918813A CN 202211728876 A CN202211728876 A CN 202211728876A CN 115918813 A CN115918813 A CN 115918813A
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Abstract

本申请涉及鱼类养殖领域,具体公开了一种美洲鳗配合饲料,包括动物蛋白源、植物蛋白源、脂肪源、矿物质和维生素,还包括以下重量百分含量的原料:0.5‑2.5%酿酒酵母壁多糖和0.05‑0.15%昆虫提取肽,所述酿酒酵母壁多糖为将酿酒酵母进行多糖聚集体的破坏处理之后获得的免疫多糖,所述昆虫提取肽为从双翅目或鞘翅目昆虫中提取获得的提取肽。本申请的美洲鳗配合饲料具有可提高鳗鲡的成活率以及使体色满足出口的感官要求的优点。

Description

一种美洲鳗配合饲料
技术领域
本申请涉及鱼类养殖领域,更具体地说,涉及一种美洲鳗配合饲料。
背景技术
美洲鳗主要产于美国、加拿大等国,1996年国内正式引进美洲鳗,主要放养于江、浙、闽、粤等沿海省份。鳗鲡是我国重要的经济淡水养殖鱼类,其肉味鲜美,营养价值及保健值很高,素有“水中人参”的美誉。目前,我国是世界上鳗鱼养殖第一大国,已成为鳗产业化程度最高的国家之一,构建了集鳗苗捕捞、培育、成鳗养殖、饲料生产、鳗鲡加工、出口贸易和配套服务为一体的完整产业链;鳗鲡为我国出口创汇创造了良好的经济效益,其中福建鳗鱼产品出口多年来居全国第一,出口额占全国鳗鱼产品出口总额的60%左右。
鳗鲡在养殖过程中会产生应激反应,应激是动物受到体内外环境改变的刺激后,机体自我调节达到新的动态平衡所产生的一系列非特异反应或称非特异反应的总合。它是动物自身演化过程中产生的自我保护的自然反应。应激反应也是鳗鱼养殖过程中的一种常见的生理状态,应激反应会抑制鳗鱼的免疫功能,经常处于应激状态的鳗鱼会造成生理功能紊乱,而更容易感染疾病。依据应激的程度、持续时间不同大致可分为慢性应激、急性应激、短期应激、长期应激等。养殖过程中很多难以治愈的顽固性疾病往往是长期处于应激反应的结果,如鳗鱼几乎所有的“细菌性”、“病毒性”病症几乎都与慢性、长期应激有关联。虽然应激本身不是一种病,但却是一种或多种病的发生原因,一定程度影响鳗鲡的成活率,以及影响鳗鲡体色,导致无法满足鳗鲡出口感官上的色泽要求,进而影响鳗鲡养殖效率和生产效益。
配合饲料是根据鳗鱼不同生产发育阶段的营养要求,将各种原料进行科学配化而成的复合饲料,它具有营养成分全、储藏运输方便和经济效益高等优点。相关技术一般在配合饲料中添加动物蛋白、植物蛋白、脂肪、矿物质、维生素以及其他添加剂,以满足美洲鳗在不同生长发育阶段中的营养要求。目前市面上的鳗鱼配合饲料已能较好地满足鳗鲡生长的营养需求,然而,对于由应激反应等原因,导致鳗鲡成活率不高以及出现体色的感官要求未能达到出口要求的问题,亟需提供针对性的配合饲料的改进设计。
发明内容
为了提高鳗鲡的成活率以及使体色满足出口的感官要求,本申请提供一种美洲鳗配合饲料。
本申请提供的一种美洲鳗配合饲料采用如下的技术方案:
一种美洲鳗配合饲料,包括动物蛋白源、植物蛋白源和脂肪源,还包括以下重量百分含量的原料:0.5-2.5%酿酒酵母壁多糖和0.05-0.15%昆虫提取肽,所述酿酒酵母壁多糖为将酿酒酵母进行多糖聚集体的破坏处理之后获得的免疫多糖,所述昆虫提取肽为从双翅目或鞘翅目昆虫中提取获得的多肽。
通过采用上述技术方案,在饲料中添加了0.5-2.5%酿酒酵母壁多糖和0.05-0.15%昆虫提取肽,酿酒酵母壁多糖为将酿酒酵母进行多糖聚集体的破坏处理之后获得的免疫多糖,酿酒酵母壁多糖可采用常规制备工艺,例如:酵母细胞壁-脱脂-超声/酸碱预处理-(中和)酶解-干燥-酵母璧多糖(粗)-脱蛋白-脱色-纯化。主要步骤在于通过超声或酸碱水解等预处理途径破坏多糖的聚集体。破坏处理之后获得的免疫多糖的主要活性成分是β-葡聚糖和甘露聚糖,具备提高机体免疫力、吸附肠道病原菌和霉菌毒素、调节肠道菌群、提高抗氧化/抗应激能力等功能。昆虫提取肽主要是抗菌肽,从双翅目或鞘翅目昆虫中提取获得的多肽富含甘氨酸,有一定的免疫调节作用,可提高鱼体的抗应激能力,因此,采用本申请的美洲鳗配合饲料喂养鳗鲡后,可使鳗鲡机体的抗应激能力提高,进而达到提高鳗鲡成活率以及体色满足出口的感官要求的技术效果。
优选的,所述酿酒酵母壁多糖的重量百分含量为0.5-0.8%,所述昆虫提取肽的重量百分含量为0.05-0.08%。。
通过采用上述技术方案,酿酒酵母壁多糖的有效添加量为0.5-2.5%,例如0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%中的任一数值,经试验发现,酿酒酵母壁多糖的作用效果随添加量的增加先呈上升趋势,在0.7%左右到达顶峰,之后作用随添加量增加而逐渐下降,在其有效添加量范围内下降的趋势较为缓慢,因此,酿酒酵母壁多糖的有效添加量为0.5-2.5%,更优选的为0.5-0.8%。昆虫提取肽的有效添加量为0.05-0.15%,例如0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.11%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%中的任一数值,经试验发现,昆虫提取肽的蛋白活性随添加量的增加先呈上升趋势,在0.07%左右到达顶峰,之后在其有效添加量范围内(0.15%以内)活性作用随添加量的继续增加而略微上升,超过0.15%添加量后则无明显上升,因此,昆虫提取肽的有效添加量为0.05-0.15%,更优选的为0.05-0.08%。
优选的,所述酿酒酵母壁多糖与所述昆虫提取肽的重量比为10-20:1。
通过采用上述技术方案,酿酒酵母壁多糖与昆虫提取肽的重量比控制在10-20:1范围内,例如,其比例可以是10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1中的任一数值,该比例值是出于有效保证酿酒酵母壁多糖与昆虫提取肽之间成分稳定性(互不干扰或影响)的考虑而进行的含量设计,主要是避免昆虫提取肽中的多肽以及其他活性成分(如未知生长因子、卵磷脂等)影响多糖的稳定性,进而使二者的作用均可以有效发挥。
优选的,所述酿酒酵母壁多糖包括重量百分含量为50-60%的β-葡聚糖和20-35%的甘露聚糖,所述β-葡聚糖的分子量为250-280KDa。
通过采用上述技术方案,酿酒酵母壁多糖的主要成分是β-葡聚糖和甘露聚糖,此外根据不同的提取工艺还包括少量的水分、脂类或几丁质,控制β-葡聚糖和甘露聚糖的比重,β-葡聚糖含量在50-60%,例如为50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%中的任一数值,即比例占一半或略微朝上,可尽量多地发挥β-葡聚糖的提高机体免疫力的左右;甘露聚糖含量在20-45%,例如为20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%中的任一数值,比例较之β-葡聚糖少,可有效发挥甘露聚糖的吸附肠道病原菌和霉菌毒素的作用。优选的,β-葡聚糖和甘露聚糖的重量比为(5-6):(3-4);例如可以是5:3、5:4、2:1、3:2、4:3中的任一数值,主要考虑在二者作用之间寻求作用发挥的平衡点。优选的,β-葡聚糖的分子量为250-280KDa,例如可以是250KDa、255KDa、260KDa、265KDa、270KDa、275KDa、280KDa中的任一数值,对于酿酒酵母壁多糖的原料设计,一方面是考虑尽量提高β-葡聚糖的比例值,另一方面则是考虑选择较低的分子量,经多次试验发现,250-280KDa分子量的β-葡聚糖可较好的应用于美洲鳗的喂养中,有效帮助鱼体提高抗氧化能力。
优选的,所述昆虫提取肽的分子量为8-30KDa。
通过采用上述技术方案,昆虫提取肽的主要成分是抗菌肽,此外根据不同的提取工艺还含有不定量且少量的免疫球蛋白、未知生长因子、或卵磷脂/卵黄素等,昆虫提取肽的分子量为8-30KDa,例如可以是8KDa、9KDa、10KDa、11KDa、12KDa、13KDa、14KDa、15KDa、16KDa、17KDa、18KDa、19KDa、20KDa、21KDa、22KDa、23KDa、24KDa、25KDa、26KDa、27KDa、28KDa、29KDa、30KDa中的任一数值,主要是基于尽量选择较低的分子量的基本考虑,经多次试验发现,8-30KDa分子量的昆虫提取肽可较好的应用于美洲鳗的喂养中,有效帮助鱼体提高抗氧化能力。
此外,250-280KDa分子量的β-葡聚糖以及8-30KDa分子量的昆虫提取肽,不仅可助力鱼体针对急性应激反应和短期应激反应具备一定抗应激能力,而且并更侧重于在鱼体的抗慢性应激反应能力和抗长期应激反应能力的助力。即,鱼体可表现出对于微弱应激源产生的长期且慢性的应激反应具备抗应激能力。
对于甘露聚糖的分子量,经多次试验发现,其分子量对鳗鲡喂养的影响较小,因此在此不做限定,例如,可选择在100-1000KDa范围内,更为具体的,例如100KDa、120KDa、150KDa、180KDa、200KDa、250KDa、280KDa、350KDa、450KDa、500KDa、550KDa、600KDa、650KDa、700KDa、750KDa、800KDa、850KDa、900KDa、950KDa等均可。
优选的,采用超声处理和/或酸碱水解处理对酿酒酵母进行所述多糖聚集体的破坏处理。
通过采用上述技术方案,多糖聚集体的破坏处理可选择超声处理和/或酸碱水解处理,辅助后续的多联酶解,可以提高酿酒酵母壁多糖的提取率以及获得目标分子量的酿酒酵母壁多糖。
优选的,所述酿酒酵母壁多糖采用以下制备方法制得:对酿酒酵母依次进行热水浸提处理、超声处理和酶解处理,将酶解处理后获得的上清液进行冻干,获得所述酿酒酵母壁多糖。
通过采用上述技术方案,依次进行热水浸提处理、超声处理和酶解处理,可获得较高的酿酒酵母壁多糖的提取率以及获得目标分子量的酿酒酵母壁多糖。
优选的,所述双翅目昆虫为蝇蛆,所述鞘翅目昆虫为黄粉虫。
通过采用上述技术方案,昆虫提取肽的原料可以选择双翅目昆虫中的蝇蛆,或者鞘翅目昆虫中的黄粉虫。
优选的,还包括0.05-0.15%包膜维生素C。
通过采用上述技术方案,配合饲料中可加入0.05-0.15%包膜维生素C,例如可选择0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.11%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%中的任一数值,用于增强机体抗病力和对各种应激现象的适应性,经试验发现,包膜维生素C的作用随其含量的增加的趋势同昆虫提取肽相似,即,包膜维生素C的作用随添加量的增加先呈上升趋势且超过0.15%添加量后则无明显上升,故可设计酿酒酵母壁多糖、昆虫提取肽与包膜维生素C的重量比为10-20:1:1,即昆虫提取肽与包膜维生素C的重量比为1:1。具体趋势为,包膜维生素C在含量为0.13%左右到达作用顶峰,之后在其有效添加量范围内(0.15%以内)活性作用随添加量的继续增加而略微上升,因此,昆虫提取肽的添加量优选为0.13-0.15%,0.05-0.15%为其有效含量区间。
优选的,美洲鳗配合饲料包括由重量百分含量的原料组成:动物蛋白源50-65%;粘合剂20-30%;植物蛋白源5-15%;脂肪源1-5%;酿酒酵母壁多糖0.5-2.5%;复合添加剂2.5-4.5%;包膜维生素C 0.05-0.15%;昆虫提取肽0.05-0.15%;盐0-0.5%。
通过采用上述技术方案,提供一个具体的配合饲料组分设计,动物蛋白源控制在50-65%,例如可以是50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%中的任一数值,动物蛋白源占整体饲料组分的一半略微向上,动物蛋白源含量设计一般根据成本和饲料转化率进行选择,即,动物蛋白源含量过高,成本过大,含量过低则饲料转化率过低,经试验发现,在添加有酿酒酵母壁多糖与昆虫提取肽之后,其含量在58-60%时,转化率存在一个峰值,而当含量继续增加,其转化率并未因含量的增加而上升,故设计动物蛋白源含量在58-60%为优选方案。
植物蛋白源控制在5-15%,例如可以是5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%中的任一数值,用于替代部分鱼粉,降低饲料成本,其添加量受成本影响,当其含量超过15%,则饲料转化率下降较多,故设计有效含量区间在5-15%。
粘合剂控制在20-30%,例如可以是20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%中的任一数值,用于使饲料便于搅拌成团,具有较好的粘弹性,并在水中保持较好的稳定性。其含量小于20%时水中稳定性较差,当其含量大于30%时,饲料的利用率降低。
脂肪源含量为1-5%,例如可以是1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%中的任一数值,用于提供能量,并起到诱食作用。其含量过多会导致饲料储存要求及加工要求更高,因此需控制在5%以内。
复合添加剂含量为2.5-4.5%,例如可以是2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%中的任一数值,可以是矿物质、磷酸二氢钙、氯化胆碱和多维中的至少一种或多种添加剂组合后而获得的复合添加剂,用于补充鱼体所需微量营养及微量元素。
包膜维生素C为0.05-0.15%,例如可以是0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.11%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%中的任一数值,用于增强机体抗病力和对各种应激现象的适应性。
盐的含量为0-0.5%,即可以不加盐,也可以添加0.5%以下的盐,例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%中的任一数值,用于平衡鳗鱼体内的渗透压。
综上所述,本申请具有以下有益效果:
1、由于本申请采用0.5-2.5%酿酒酵母壁多糖和0.05-0.15%昆虫提取肽,利用酿酒酵母壁多糖具备提高机体免疫力、吸附肠道病原菌和霉菌毒素、调节肠道菌群、提高抗氧化能力的功能以及昆虫提取肽具有免疫调节作用,可提高鱼体的抗应激能力,进而提高鳗鲡成活率以及体色满足出口的感官要求的技术效果。
2、本申请中优化设计了酿酒酵母壁多糖、昆虫提取肽、包膜维生素C以及其他原料的重量百分含量、重量比或分子量,利用含量比例以及数值的优化设计,可更好地促进鱼体获得较好的抗应激能力。
3、本申请的方法,通过优化酿酒酵母壁多糖的制备方法,可以提高酿酒酵母壁多糖的提取率以及获得目标分子量的酿酒酵母壁多糖。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
原料说明:
酿酒酵母壁多糖:即为将酿酒酵母的酵母细胞壁通过超声处理和/或酸碱水解处理等预处理方式,将其中的多糖的聚集体进行破坏处理,而获得的免疫多糖,即为本申请的酿酒酵母壁多糖。
昆虫提取肽:即为从双翅目或鞘翅目昆虫中提取获得的抗菌肽,例如从蝇蛆或黄粉虫中提取获得的抗菌肽。
动物蛋白源:可选择鱼用饲料中已知的各种动物蛋白源,例如鱼粉等。
植物蛋白源:可选择鱼用饲料中已知的各种植物蛋白源,例如发酵豆粕、大豆浓缩蛋白、花生粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉等中的一种或多种混合物。
粘合剂:鳗鱼饲料粘合剂用于粉状饲料在养殖使用搅拌成团状时起到粘结作用,能使饲料具有较好的粘弹性,并在水中保持较好的稳定性,利于鳗鱼的摄食,且减少散失。例如,可选择预糊化淀粉作为粘合剂。
脂肪源:可选择鱼用饲料中已知的各种脂肪源,例如鱼油、椰子油、豆油、玉米油、花生油等。
复合添加剂:可选择鱼用饲料中已知的各种添加剂的混合物作为本申请的复合添加剂,例如矿物质、磷酸二氢钙、氯化胆碱和多维中的至少一种或多种组合。
原料和/或中间体的制备例
制备例1-3为本申请的酿酒酵母壁多糖具体制备工艺:
制备例1
本制备例的酿酒酵母壁多糖具体制备方法包括如下步骤:
(1)热水浸提:酿酒酵母经去离子水洗涤多次后,配制成质量分数15%的菌悬液,往菌悬液中加入NaCl使最终菌悬液的质量分数为3%,pH值为5.0;在55℃恒温水浴振荡器中诱导自溶24h,然后升温至85℃对诱导自溶后的混合液进行灭酶;冷却至30℃后用去离子水离心洗涤多次,沉淀处理则采用0.02mol/L且pH值为7.5的磷酸盐缓冲液配制成质量分数湿重15-20%的菌悬液,然后进行热水浸提4h,冷却至30℃后用去离子水离心洗涤多次,获得沉淀物,沉淀物可保存于3-5℃环境。
(2)超声处理:将步骤(2)获得的沉淀物于固液比1:1000g/ml,在20KHz、400W条件下进行超声处理,超声处理时间为30min;体系温度保持在25℃以下。
(3)酶解:取步骤(2)超声处理后的混合液,采用甘露聚糖酶进行酶解,具体酶解条件为:时间50min,酶添加量1%,温度55℃,pH值7.0,料液比湿重1:4(g/ml)。
(4)冻干:取步骤(3)获得的酶解上清液进行冻干,即得目标产品。经成分测定,获得的目标产品中,按目标产品的总质量百分比例计,β-葡聚糖占59%,甘露聚糖占33%,β-葡聚糖的分子量为260KDa左右,甘露聚糖的分子量为630KDa左右。
制备例2
本制备例的酿酒酵母壁多糖具体制备方法包括如下步骤:
(1)热水浸提:酿酒酵母经去离子水洗涤多次后,配制成质量分数10%的菌悬液,往菌悬液中加入NaCl使最终菌悬液的质量分数为2%,pH值为4.6;在45℃恒温水浴振荡器中诱导自溶22h,然后升温至80℃对诱导自溶后的混合液进行灭酶;冷却至20℃后用去离子水离心洗涤多次,沉淀采用0.01mol/L且pH值为7的磷酸盐缓冲液配制成质量分数湿重15%的菌悬液,然后进行热水浸提3.5h,冷却至20℃后用去离子水离心洗涤多次,获得沉淀物,沉淀物可保存于3-5℃环境。
(2)超声处理:将步骤(2)获得的沉淀物于固液比1:900g/ml,在20KHz、400W条件下进行超声处理,超声处理时间为25min;体系温度保持在25℃以下。
(3)酶解:取步骤(2)超声处理后的混合液,采用甘露聚糖酶进行酶解,具体酶解条件为:时间45min,酶添加量0.8%,温度50℃,pH值7.0,料液比湿重1:3.5(g/ml)。
(4)冻干:取步骤(3)获得的酶解上清液进行冻干,即得目标产品。经成分测定,获得的目标产品中,按目标产品的总质量百分比例计,β-葡聚糖占57%,甘露聚糖占35%,β-葡聚糖的分子量为280KDa左右,甘露聚糖的分子量为680KDa左右。
制备例3
本制备例的酿酒酵母壁多糖具体制备方法包括如下步骤:
(1)热水浸提:酿酒酵母经去离子水洗涤多次后,配制成质量分数20%的菌悬液,往菌悬液中加入NaCl使最终菌悬液的质量分数为4%,pH值为5.2;在60℃恒温水浴振荡器中诱导自溶24h(22-26h),然后升温至90℃对诱导自溶后的混合液进行灭酶;冷却至40℃后用去离子水离心洗涤多次,沉淀采用0.03mol/L且pH值为7.8的磷酸盐缓冲液配制成质量分数湿重20%的菌悬液,然后进行热水浸提4.5h(3.5-4.5h),冷却至40℃后用去离子水离心洗涤多次,获得沉淀物,沉淀物可保存于3-5℃环境。
(2)超声处理:将步骤(2)获得的沉淀物于固液比1:1100g/ml,在20KHz、400W条件下进行超声处理,超声处理时间为35min;体系温度保持在25℃以下。
(3)酶解:取步骤(2)超声处理后的混合液,采用甘露聚糖酶进行酶解,具体酶解条件为:时间60min,酶添加量1.5%,温度60℃,pH值7.2,料液比湿重1:4.5(g/ml)。
(4)冻干:取步骤(3)获得的酶解上清液进行冻干,即得目标产品。经成分测定,获得的目标产品中,按目标产品的总质量百分比例计,β-葡聚糖占60%,甘露聚糖占31%,β-葡聚糖的分子量为280KDa左右,甘露聚糖的分子量为680KDa左右。
制备例4-7为本申请昆虫提取肽的具体制备工艺
制备例4
本制备例的昆虫提取肽的具体制备方法包括如下步骤:
(1)原料:挑选4g左右大小相近的3日龄蝇蛆作为原料。
(2)体外诱导抗菌肽表达:取上述3日龄蝇蛆,冰上麻醉后,从腹部针刺,一条一针,然后采用浓度为20ul的大肠杆菌液对针刺后的蝇蛆进行浸泡诱导60s,再进行100w、50Hz超声波诱导20min。
(3)粗提:将蝇蛆充分研磨,加入0.2mol/L、pH值为6的磷酸盐缓冲液中浸提24h,重复提取3次;再转入超声波破碎仪进行破碎,用5%乙醇重复提取3次,完成后在4℃、2000r/min下离心处理20min,取上清液冷冻干燥,获得抗菌肽的粗提物。
(4)精提:葡聚糖凝胶柱层析(Sephadex-50,层析柱的规格为60cm×3cm):用0.2mol/l乙酸铵洗脱液平衡,待液面在床表面上1-2mm时,将样品注入。洗脱时选用0.2mol/l乙酸铵为洗脱液,凝胶柱装好后洗脱液洗脱到出现基线,再进行梯度洗脱,每20min收集一次。即获得目标产品。
经成分测定,获得的目标产品中,按目标产品的总质量百分比例计,抗菌肽占89%,昆虫提取肽的分子量为10KDa左右。
制备例5
本制备例的昆虫提取肽的具体制备方法包括如下步骤:
(1)原料:挑选4g左右大小相近的3日龄蝇蛆作为原料。
(2)体外诱导抗菌肽表达:取上述3日龄蝇蛆,冰上麻醉后,从腹部针刺,一条一针,然后采用浓度为25ul的金黄色葡萄杆菌液对针刺后的蝇蛆进行浸泡诱导70s,再进行100w、50Hz超声波诱导20min。
(3)粗提:将蝇蛆充分研磨,加入0.15mol/L、pH值为5.5的磷酸盐缓冲液中浸提22h,重复提取4次;再转入超声波破碎仪进行破碎,用4.5%乙醇重复提取4次,完成后在5℃、3000r/min下离心处理15min,取上清液冷冻干燥,获得抗菌肽的粗提物。
(4)精提:葡聚糖凝胶柱层析:用0.2mol/L乙酸铵洗脱液平衡,待液面在床表面上1-2mm时,将样品注入。洗脱时选用0.2mol/l乙酸铵为洗脱液,凝胶柱装好后洗脱液洗脱到出现基线,再进行梯度洗脱,每25min收集一次。即获得目标产品。
经成分测定,获得的目标产品中,按目标产品的总质量百分比例计,抗菌肽占86%,昆虫提取肽的分子量为25KDa左右。
制备例6
本制备例的昆虫提取肽的具体制备方法包括如下步骤:
(1)原料:挑选4g左右大小相近的3日龄蝇蛆作为原料。
(2)体外诱导抗菌肽表达:取上述3日龄蝇蛆,冰上麻醉后,从腹部针刺,一条一针,然后采用浓度为18ul的大肠杆菌液或金黄色葡萄杆菌液对针刺后的蝇蛆进行浸泡诱导58s,再进行100w、50Hz超声波诱导25min。
(3)粗提:将蝇蛆充分研磨,加入0.25mol/L、pH值为6.2的磷酸盐缓冲液中浸提26h,重复提取5次;再转入超声波破碎仪进行破碎,用5%乙醇重复提取5次,完成后在4℃、1500r/min下离心处理30min,取上清液冷冻干燥,获得抗菌肽的粗提物。
(4)精提:葡聚糖凝胶柱层析:用0.2mol/L乙酸铵洗脱液平衡,待液面在床表面上1-2mm时,将样品注入。洗脱时选用0.2mol/l乙酸铵为洗脱液,凝胶柱装好后洗脱液洗脱到出现基线,再进行梯度洗脱,每15min收集一次。即获得目标产品。
经成分测定,获得的目标产品中,按目标产品的总质量百分比例计,抗菌肽占88%,昆虫提取肽的分子量为15KDa左右。
制备例7
本制备例的昆虫提取肽的具体制备方法包括如下步骤:
(1)原料:挑选4g左右大小相近的5龄黄粉虫作为原料。
(2)体外诱导抗菌肽表达:取上述5龄黄粉虫,冰上麻醉后,针刺黄粉虫背部节间处,一条二针,然后采用浓度为35ul的大肠杆菌液或金黄色葡萄杆菌液对针刺后的蝇蛆进行浸泡诱导100s,再进行100w、50Hz超声波诱导30min。
(3)粗提:将黄粉虫充分研磨,加入0.2mol/L、pH值为6的磷酸盐缓冲液中浸提26h,重复提取5次;再转入超声波破碎仪进行破碎,用5%乙醇重复提取5次,完成后在4℃、2000r/min下离心处理20min,取上清液冷冻干燥,获得抗菌肽的粗提物。
(4)精提:葡聚糖凝胶柱层析:用0.2mol/l乙酸铵洗脱液平衡,待液面在床表面上1-2mm时,将样品注入。洗脱时选用0.2mol/l乙酸铵为洗脱液,凝胶柱装好后洗脱液洗脱到出现基线,再进行梯度洗脱,每20min收集一次。即获得目标产品。
经成分测定,获得的目标产品中,按目标产品的总质量百分比例计,抗菌肽占84%,昆虫提取肽的分子量为28KDa左右。
另需说明的是,实施例中未明确限定制备方法的原料均来源于市购。
实施例
实施例1-10
实施例1-10的美洲鳗配合饲料由下述表格1示出的重量百分含量比例的各原料组成。实施例1-10的酿酒酵母壁多糖采用制备例1的制备方法制备获得,昆虫提取肽采用制备例4的制备方法制备获得。
表1
Figure BDA0004030857550000101
Figure BDA0004030857550000111
实施例11-21
实施例11-21的美洲鳗配合饲料由下述表格2示出的重量百分含量比例的各原料组成。实施例1-10的酿酒酵母壁多糖采用制备例1的制备方法制备获得,昆虫提取肽采用制备例4的制备方法制备获得。
表2
Figure BDA0004030857550000112
Figure BDA0004030857550000121
实施例22-31
实施例22-32的美洲鳗配合饲料中各原料的重量百分含量比例与实施例1-10相同,区别仅在于植物蛋白源由发酵豆粕替换为:大豆浓缩蛋白。
实施例32-41
实施例32-41的美洲鳗配合饲料中各原料的重量百分含量比例与实施例1-10相同,区别仅在于植物蛋白源由发酵豆粕替换为:大豆浓缩蛋白与发酵豆粕按1:1的重量比例的混合物。
对比例
对比例1-3的美洲鳗配合饲料由下述表格3示出的重量百分含量比例的各原料组成。对比例1-3为以实施例16为参照基础而进行的对照试验。需说明的是,考虑预糊化淀粉在预设含量范围内(即不超过总饲料含量的30%),预糊化淀粉含量增加0.6%以内对饲料的整体性能基本无影响,故而,对比例试验中,在酿酒酵母壁多糖和/或昆虫提取肽的空白对比例中,采用由预糊化淀粉来补足酿酒酵母壁多糖和/或昆虫提取肽缺失所对应的含量,以保证总饲料百分含量为100%。
表3
Figure BDA0004030857550000122
Figure BDA0004030857550000131
性能检测试验
1、粉状配合饲料的制备
按照实施例1-41和对比例1-3示出的各美洲鳗配合饲料的各原料配比设计,将各原料先进行初步的原料检验,不合格原料做退货处理,合格原料予以接收,以确保原料的基本品质;然后将各原料根据要求进行粉碎(能量原料、蛋白原料)、筛选(矿物质原料)或预处理(油脂及液体原料),然后将各原料采用PLC配料系统进行配料处理,依次进行一次混合,若需添加微量元素的,则在一次混合时加入,一次混合后进入超微粉碎系统,进行超微粉碎,然后进行二次混合,若需添加液体原料及油脂的,则在二次混合时加入,二次混合后进入分级筛进行分筛,依次进行成品检验及包装,即制得各实施例及对比例的粉状配合饲料。一般粉碎参数设置为98%粉料过80目。
2、效果试验
2.1主要营养成分检测
于实施例1-41中挑选出典型实施例1、2、5-7、14、16-19作为代表实施例,按照GB10648-1999对采用上述粉状配合饲料的制备方法制备获得的实施例1、2、5-7、14、16-19的粉状配合饲料进行主要营养成分检测,检测结果如下表4所示。
表4
Figure BDA0004030857550000132
2.2美洲鳗鲡生长、肝肠健康及体色的试验说明
2.2.1材料与方法
2.2.1.1试验动物和试验设计
挑选健康无病、平均体重(12.28±0.02)g/尾的美洲鳗鲡幼鱼960尾,随机分为8个处理组,分别投喂实施例12配比制得的粉状配合饲料、实施例13配比制得的粉状配合饲料、实施例14配比制得的粉状配合饲料、实施例16配比制得的粉状配合饲料、实施例17配比制得的粉状配合饲料、对比例1配比制得的粉状配合饲料、对比例2配比制得的粉状配合饲料、对比例3配比制得的粉状配合饲料。每个处理组为4个重复,每个重复30尾。试验期为10周。
2.2.1.2试验管理
本试验在福清中试基地进行。正式试验开始前,将1000尾美洲鳗鲡幼鱼暂养于养殖缸(半径0.6m、高1.1m,体积为1200L,注水量为800L)中,24h充气。暂养期间投喂鳗鲡商品饲料,以料水比1:1.1进行混合,手工揉制成团状饲料,按1%的投饵率,早晚(06:00、18:00)各投喂一次。投喂半小时后对暂养缸排污、换水(换水量为1/3)。暂养期间水质状况为:水温25-27℃,溶解氧浓度7.6-8.4mg/L,pH为7.6-8.0,氨氮浓度0.02-0.14mg/L。
2.2.1.3样品采集及处理
养殖试验结束后,禁食24h,对每个养殖缸中所有鱼称重并记录总重。每个养殖缸随机取3尾鱼,进行皮肤体色参数的测定,解剖取出肠道和肝脏,置于冻存管中,液氮速冻,保存于-80℃冰箱,从每个处理组中选取4个肝脏样品(每个重复1个样品)送至上海将来实业股份有限公司进行肝脏炎症因子水平测定。
2.2.1.4测定指标及方法
生长性能指标及说明:
增重率(Weight gain rate,WGR,%)=100×(Wt-W0)/W0;
成活率(Survival rate,SR,%)=100×Nf/Ni;
式中:t(d)为饲喂天数;W0(g)为平均每尾鱼初始体重(initial body weight,IBW);Wt(g)为平均每尾鱼末体重(final body weight,FBW);Ni为初始鱼尾数;Nf为终末鱼尾数。
皮肤体色参数测定:
以鳗鲡鳃盖后缘至肛门区段为体色测定部位(按等间距在背、腹部均各测5个位点)。测定前用纱布擦净鱼体水分,对分光测色计进行较零。皮肤体色参数的测定:采用分光测色计CM-700d(Konica Minolta,日本)进行避光测定鱼体亮度(L*)、红度(a*)和黄度(b*)值并记录。
肝脏炎症因子水平测定:
肝脏中白细胞介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)、白细胞介素8(Interleukin 8,IL-8)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)和γ干扰素(Interferonγ,IFN-γ)水平均采用上海将来实业股份有限公司酶联免疫吸附试验试剂盒检测。
数据统计与分析:
所有试验数据均以平均值±标准差(Mean±SD)表示,用SPSS 20.0分析软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),若存在显著的差异,则采用Duncan’s法进行多重比较,P<0.05表示差异显著。
2.2.2结果
2.2.2.1饲料中添加酿酒酵母壁多糖和昆虫提取肽对美洲鳗鲡幼鱼生长性能的影响
表5
Figure BDA0004030857550000151
由表5可知,饲料中添加酿酒酵母壁多糖和昆虫提取肽可显著提高美洲鳗鲡幼鱼成活率(P<0.05),上述指标随着酿酒酵母壁多糖和昆虫提取肽添加水平升高呈降低的趋势,均在实施例16和实施例17达到最高值。
2.2.2.2饲料中添加酿酒酵母壁多糖和昆虫提取肽对美洲鳗鲡幼鱼体色的影响目前出口活鳗要求背部体色天然,无金边,腹部白亮,过冰应激后黑色素细胞不扩散,体色不变深,腹部不出现红色应激条纹。
表6
Figure BDA0004030857550000161
由表6可知,与对比例1-3组相比,饲料中添加酿酒酵母壁多糖和昆虫提取肽背部体色参数无显著变化(P>0.05);实施例12-14、实施例16-17组腹部亮度值(L*)和黄度值(b*)显著升高(P<0.05);腹部红度值(a*)无显著变化(P>0.05)。此外,实施例16-17背、腹部体色差值最大。背部和腹部的颜色差异更明显,与野生状况下的体色接近。
鳗鲡产品出口除了安全指标、药残检测等需符合相关规定外,体色的感官要求也是重要的参考指标,活鳗出口感官上的色泽要求是:背部呈深青灰色或银灰色,腹部近白色,腹背黑白分明,具有鳗鲡固有的光泽;体表有粘液。鱼体的体色变化,实质上鱼体生理健康,尤其是肝胰脏受到损伤的一种表现形式。在鳗鲡生产中,其体色易出现黑化或呈古铜色,成鳗的体形体色在一定程度上影响其出口和销售价格,养殖出良好体形体色的健康鳗鱼是养殖者热切期望的,也一直备受饲料企业关注。
2.2.2.3饲料中添加酿酒酵母壁多糖和昆虫提取肽对美洲鳗鲡幼鱼肝脏炎症因子水平的影响
表7
Figure BDA0004030857550000162
Figure BDA0004030857550000171
由表7可知,与对比例1-3相比,饲料中添加酿酒酵母壁多糖和昆虫提取肽肝脏中IL-1β、IL-8、TNF-a和INF-γ水平显著降低(P<0.05)。其中实施例16-17肝脏中IL-1β、IL-8、TNF-a和INF-γ水平呈最低值。
结论:在本试验条件下,饲料中添加酿酒酵母壁多糖和昆虫提取肽可促进美洲鳗鲡幼鱼生长,增强肝脏健康状况,一定程度改善体色以及提高成活率。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种美洲鳗配合饲料,包括动物蛋白源、植物蛋白源和脂肪源,其特征在于,还包括以下重量百分含量的原料:0.5-2.5%酿酒酵母壁多糖和0.05-0.15%昆虫提取肽,所述酿酒酵母壁多糖为将酿酒酵母进行多糖聚集体的破坏处理之后获得的免疫多糖,所述昆虫提取肽为从双翅目或鞘翅目昆虫中提取获得的多肽。
2.根据权利要求1所述的美洲鳗配合饲料,其特征在于,所述酿酒酵母壁多糖的重量百分含量为0.5-0.8%,所述昆虫提取肽的重量百分含量为0.05-0.08%。
3.根据权利要求1或2所述的美洲鳗配合饲料,其特征在于,所述酿酒酵母壁多糖与所述昆虫提取肽的重量比为10-20:1。
4.根据权利要求1所述的美洲鳗配合饲料,其特征在于,所述酿酒酵母壁多糖包括重量百分含量为50-60%的β-葡聚糖和20-45%的甘露聚糖,所述β-葡聚糖的分子量为250-280KDa。
5.根据权利要求1所述的美洲鳗配合饲料,其特征在于,所述昆虫提取肽的分子量为8-30KDa。
6.根据权利要求1所述的美洲鳗配合饲料,其特征在于,采用超声处理和/或酸碱水解处理对酿酒酵母进行所述多糖聚集体的破坏处理。
7.根据权利要求6所述的美洲鳗配合饲料,其特征在于,所述酿酒酵母壁多糖采用以下制备方法制得:对酿酒酵母依次进行热水浸提处理、超声处理和酶解处理,将酶解处理后获得的上清液进行冻干,获得所述酿酒酵母壁多糖。
8.根据权利要求1所述的美洲鳗配合饲料,其特征在于,所述双翅目昆虫为蝇蛆,所述鞘翅目昆虫为黄粉虫。
9.根据权利要求1所述的美洲鳗配合饲料,其特征在于,还包括0.05-0.15%包膜维生素C。
10.根据权利要求9所述的美洲鳗配合饲料,其特征在于,由重量百分含量的原料组成:
动物蛋白源50-65%;
粘合剂20-30%;
植物蛋白源5-15%;
脂肪源1-5%;
酿酒酵母壁多糖0.5-2.5%;
复合添加剂2.5-4.5%;
包膜维生素C 0.05-0.15%;
昆虫提取肽0.05-0.15%;
盐0-0.5%。
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