CN101333254A - 果蝇抗菌肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种果蝇抗菌肽的制备方法。用细菌或真菌，采用针刺和培养法，诱导果蝇成虫产生抗菌肽，提取后可得到果蝇抗菌肽。所得到的抗菌肽细菌和真菌有抑制，并且具有热稳定性。自然培养的果蝇成虫体内不存在抗菌肽，通过本方法能诱导果蝇产生对细菌和真菌有抑制作用的抗菌肽。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体地说是涉及一种利用果蝇制备抗菌肽的方法。
背景技术
抗菌肽是昆虫浸染微生物等因素后在短时间内产生的抗菌物质。抗菌肽分子量较小，具有对热稳定、水溶性好、广谱抗菌等特点，而且与抗生素的抗菌机理完全不同，已成为新型抗菌、抗癌药物研究开发的目标，有着广阔的发展前景。
黑腹果蝇属于双翅目、果蝇科、果蝇属，它体形小，成蝇体长约0.5cm。雄性果蝇成虫腹部有7条环纹，有性梳。雌性果蝇成虫腹部有5条环纹，没有性梳。
果蝇繁殖快，生活周期分为卵→幼虫→蛹→成虫4个明显的时期。卵长约0.5mm、白色，前端背面的触丝能附着在食物或瓶壁上。卵经22～24h孵化为幼虫，幼虫约4～5mm，头部稍尖，有一黑色钩状口器。幼虫生活约4天左右化蛹，颜色淡黄、柔软，逐渐硬化变成深褐色，此时即将羽化成果蝇成虫。
果蝇喜好以腐败的水果等作为食物，从幼虫到成虫都生活在杂菌横生的污浊环境中，随时都有被病菌感染的机会，但它们却有着极强的适应恶劣环境的生存能力，预示着它们体内存在着独特的免疫防御机制，可能会产生抗菌肽。但长期以来由于人们对果蝇的研究往往偏重在遗传学上，又加果蝇个体小，故其经济价值未被深入开发，国内对其研究较少。
发明内容
本发明目的在于提供一种制备果蝇抗菌肽的方法。
本发明的技术方案为利用诱导培养的方法，用细菌或真菌诱导果蝇成虫产生抗菌肽。
具体做法为：用毛细针蘸细菌悬液，如金黄色葡萄球菌悬液，针刺果蝇腹部后培养；
或者将将果蝇置于含有真菌，如青霉的环境下培养。
将上述诱导后的果蝇加入Tris-HCl缓冲液，研磨果蝇至浆状，离心后取上清液，即得到果蝇抗菌肽。
经检测，本方法得到的果蝇抗菌肽对细菌和真菌有抑制作用。抗菌肽热稳定性较好，40℃、60℃、80℃和100℃处理10分钟仍保持抗菌活性。
自然培养的果蝇成虫体内不存在抗菌肽，通过本方法能诱导果蝇产生对细菌和真菌有抑制作用的抗菌肽。金黄色葡萄球菌能诱导果蝇产生抗菌肽，其抗菌肽不仅对金黄色葡萄球菌产生抗菌作用，也对大肠肝菌产生抗菌作用；青霉培养法诱导果蝇成虫产生的抗菌肽对青霉有抑制作用。该抗菌肽热稳定性较好，40℃、60℃、80℃和100℃处理10分钟仍保持抗菌活性。
具体实施方式
配制玉米粉果蝇培养基，121℃灭菌20min。用乙醚将原种瓶中的果蝇麻醉后，移入装有玉米粉培养基的培养瓶中，每瓶5对，25℃恒温培养。约7天后，用放大镜对果蝇幼虫和成虫的身体特征进行观察。
实施例1用金黄色葡萄球菌诱导抗菌肽
配制牛肉膏培养基121℃灭菌20min。划线法将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种在牛肉膏培养基斜面上，37℃培养24h。
取1支金黄色葡萄球菌斜面，分别加入5ml生理盐水(0.9％NaCl溶液)，用接种针轻轻刮取菌体后移入无菌试管中，充分振荡，制成金黄色葡萄球菌菌悬液。
针刺法：乙醚麻醉果蝇成虫，用毛细针蘸金黄色葡萄球菌菌悬液后，针刺果蝇腹部。刺伤后的果蝇继续于25℃培养24h。
实施例2用青霉菌诱导抗菌肽
配制PDA培养基，121℃灭菌20min。划线法将青霉接种在PDA培养基斜面上，28℃培养4-5天。
培养法：乙醚麻醉果蝇成虫，移入长满青霉的培养瓶中，在25℃培养4-5天。
实施例3抗菌肽的提取
分别取实施例1和2诱导得到的果蝇成虫，乙醚麻醉果蝇成虫，称重，以20：1的比例加Tris-HCl缓冲液，研磨果蝇至浆状。提取液3500r/min离心10min，上清液4℃保存。
实施例4抗菌活性的检测
配制牛肉膏培养基和PDA培养基，121℃灭菌20min。划线法将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种在牛肉膏培养基斜面上，37℃培养24h。划线法将青霉接种在PDA培养基斜面上，28℃培养4-5天。
各取1支大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和青霉斜面，分别加入5ml生理盐水(0.9％NaCl溶液)，用接种针轻轻刮取菌体或孢子后，移入无菌试管中，充分振荡，制成大肠杆菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和青霉孢子悬液。
(1)抗细菌活性：
取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液以及青霉孢子悬液各1ml，分别加入溶化而不烫手的100ml牛肉膏培养基和PDA培养基中，充分振荡后，倾倒入无菌培养皿中，每个培养皿约20ml。静置即得大肠杆菌检定板、金黄色葡萄球菌检定板和青霉检定板。
用直径6mm的滤纸片蘸取无菌水、头孢拉定溶液、未诱导的果蝇提取液和实施例1中针刺法诱导的果蝇提取液，轻轻贴在大肠杆菌检定板和金黄色葡萄球菌检定板上。平板置于37℃培养箱培养24h后，观察抑菌效果。结果如表1。
表1果蝇成虫提取液的抗细菌活性
| 样品 | 在大肠杆菌检定板的抑菌圈直径(mm) | 在金黄色葡萄球菌检定板的抑菌圈直径(mm) |
| 阴性对照(水) | 0 | 0 |
| 阳性对照(头孢拉丁溶液) | 12.5 | 14 |
| 未诱导的果蝇提取液 | 0 | 0 |
| 针刺金黄色葡萄球菌诱导的果蝇提取液 | 8.5 | 10 |
未诱导的果蝇成虫体内没有抗菌肽的产生。用针刺金黄色葡萄球菌诱导的果蝇成虫体内产生的抗菌肽不仅具有抗金黄色葡萄球菌的活性，也有抗大肠杆菌的活性。
(2)抗真菌活性：
滤纸片蘸取无菌水、两性霉素溶液、未诱导的果蝇提取液和实施例2中培养法诱导的果蝇提取液，轻轻贴在青霉检定板上。平板置于28℃培养箱培养24h后，观察抑菌效果。结果如表2。
表2果蝇成虫提取液的抗真菌活性
| 样品 | 在青霉检定板的抑菌圈直径(mm) |
| 阴性对照(水) | 0 |
| 阳性对照(两性霉素溶液) | 9.5 |
| 未诱导的果蝇提取液 | 0 |
| 青霉培养法诱导的果蝇提取液 | 6.5 |
培养法能诱导果蝇成虫产生抗青霉的抗菌肽。
实施例5抗菌肽的热稳定性试验
把实施例1中针刺法诱导的抗菌肽分别置于40℃、60℃、80℃、100℃的水浴中处理10min后，检测抗细菌活性。结果如表3。
表3果蝇成虫抗菌肽的热稳定性
| 样品及处理 | 在大肠杆菌检定板的抑菌圈直径(mm) | 在金黄色葡萄球菌检定板的抑菌圈直径(mm) |
| 阴性对照(水) | 0 | 0 |
| 阳性对照(头孢拉丁溶液) | 11 | 12 |
| 40℃，10min | 7 | 10.5 |
| 60℃，10min | 7.5 | 11 |
| 80℃，10min | 7.5 | 10 |
| 100℃，10min | 7 | 10 |
针刺法诱导的抗菌肽具有较好的热稳定性。
Claims (6)
1、一种果蝇抗菌肽的制备方法，其特征在于，用细菌或真菌诱导果蝇成虫产生抗菌肽。
2、权利要求1的果蝇抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用毛细针蘸细菌悬液，针刺果蝇腹部后培养。
3、权利要求1或2的果蝇抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述细菌选自金黄色葡萄球菌。
4、权利要求1的果蝇抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将果蝇置于含有真菌的环境下培养。
5、权利要求1或4果蝇抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述真菌选自青霉。
6、权利要求1的果蝇抗菌肽的制备方法，其特征在于，将诱导后的果蝇加入Tris-HCl缓冲液，研磨果蝇至浆状，离心后取上清液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007100430315A CN101333254A (zh) | 2007-06-29 | 2007-06-29 | 果蝇抗菌肽的制备方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007100430315A CN101333254A (zh) | 2007-06-29 | 2007-06-29 | 果蝇抗菌肽的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101333254A true CN101333254A (zh) | 2008-12-31 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2007100430315A Pending CN101333254A (zh) | 2007-06-29 | 2007-06-29 | 果蝇抗菌肽的制备方法 |
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| CN (1) | CN101333254A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103865933A (zh) * | 2013-11-30 | 2014-06-18 | 济南大学 | 一种wap基因在果蝇转基因中的应用 |
| CN110663649A (zh) * | 2019-10-24 | 2020-01-10 | 苏州市双利环保工程有限公司 | 蝇蛆的养殖方法 |
| CN115323023A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-11-11 | 河南牧业经济学院 | 一种治疗奶牛乳房炎药物的制备方法 |
| CN115918813A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-04-07 | 福建天马饲料有限公司 | 一种美洲鳗配合饲料 |
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2007
- 2007-06-29 CN CNA2007100430315A patent/CN101333254A/zh active Pending
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| CN103865933B (zh) * | 2013-11-30 | 2016-03-23 | 济南大学 | 一种wap基因在果蝇转基因中的应用 |
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Open date: 20081231 |