CN113528600A - 一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，涉及生物制备技术领域。一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，包括以下步骤：取经重悬的沙门氏菌饲喂蝇蛆，培养获得产生免疫防御的活蝇蛆，进行清洗消毒，用提取液提取、离心，取上清液经沸水浴和冷却再离心，并浓缩保存粗提液，将其依次经凝胶柱G75和凝胶柱G25洗脱收集，获得纯化的蝇蛆抗菌肽。本发明用沙门氏菌诱导蝇蛆，刺激产生高表达抗菌肽，对粗提的抗菌肽，用凝胶层析柱分离和纯化，获得具有高抑菌活性的蝇蛆抗菌肽组分，其制备方法简单易操作。
Description
技术领域
本发明涉及生物制备技术领域，具体而言，涉及一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法、通过上述方法制备的蝇蛆抗菌肽，以及该蝇蛆抗菌肽作为鸡白痢治疗药物在鸡养殖业中的应用。
背景技术
近年来，由于人们滥用抗生素，使得许多致病菌出现耐药性，增加了一些疾病的治疗难度，出现了抗生素无法杀死的超级细菌。抗菌肽不仅在抗菌、抗病毒等方面具有显著的作用，而且不易导致耐药菌株的产生，使其成为新一代抗菌肽药物的理想选择。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMP)也称为肽类抗生素，或天然抗生素，是一类具有广谱抗微生物活性的小分子短肽，广泛存在于细菌、植物、脊椎和无脊椎动物中，是天然免疫的重要效应分子，目前发现的昆虫抗菌肽有170多种。
目前已从昆虫(如天蚕蛹、果蝇和麻蝇)、哺乳动物(如牛、猪甚至人)和环节动物(如蚯蚓)等体内分离到了多种抗菌肽。由于天然抗菌肽在自然界或有机体中含量较低，这给抗菌肽的分离纯化带来一定困难。多数抗菌肽结构复杂，不但难以进行结构鉴定，而且也导致化学合成这些物质时存在技术困难、费用高等问题。因此，从来源广泛、成分复杂的原料中分离纯化抗菌肽成为了研究的重要环节。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，此方法简单易操作且成本低。
本发明的另一目的，在于提供通过上述制备方法获得的蝇蛆抗菌肽，具有较高的抑菌活性。
本发明的再一目的，在于提供上述蝇蛆抗菌肽作为治疗鸡白痢的药物进行推广应用。
本发明的技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，包括以下步骤：
诱导蝇蛆：取重悬的沙门氏菌饲喂蝇蛆，培养得到产生免疫防御的蝇蛆；
蝇蛆抗菌肽的粗提取：将活蝇蛆清洗消毒，加入提取液进行提取、离心，取上清液经沸水浴和冷却后再离心，然后浓缩保存粗提液；
分离纯化：将粗提液经凝胶柱G75和凝胶柱G25洗脱收集，获得分离纯化的蝇蛆抗菌肽。
首先，本申请实施例能提供一种利用重悬沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，并经凝胶柱层析分离纯化获得蝇蛆抗菌肽。
其次，本申请实施例能提供一种利用重悬沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法获得的蝇蛆抗菌肽，使其作为治疗鸡白痢药物在养殖业中的应用。
相对于现有技术，本发明的实施例至少具有以下优点或有益效果：
本发明采用重悬的沙门氏菌对蝇蛆进行诱导，刺激其产生抗菌肽，然后收集蝇蛆并粗提抗菌肽，利用G75和G25凝胶层析柱进行分离和纯化，得到具有高抑菌活性的蝇蛆抗菌肽组分，其制备方法简单有效。
本发明制备获得的蝇蛆抗菌肽对沙门氏菌的抑菌活性高于对其他细菌的抑菌力，对鸡白痢具有非常好的疗效，通过沙门氏菌诱导获得的蝇蛆抗菌肽可以作为治疗或预防药物添加，并用于治疗鸡白痢。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的关键可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，其包括以下步骤：
诱导蝇蛆：取重悬的沙门氏菌饲喂蝇蛆，培养得到产生免疫防御的蝇蛆；
蝇蛆抗菌肽的粗提取：将存活的蝇蛆清洗消毒，加入提取液进行提取、离心，取上清液经沸水浴和冷却后再次离心，然后浓缩保存粗提液；
分离纯化：将粗提液依次经凝胶柱G75和凝胶柱G25洗脱收集，得到分离纯化后的蝇蛆抗菌肽。
在本发明的一些实施例中，上述沙门氏菌的重悬步骤为：将沙门氏菌菌液以12000r/min离心10～15min，弃上清，加入生理盐水，振荡混匀后再12000r/min离心10～15min，重复2～3次，最后将菌体沉淀与生理盐水振荡混匀使用。
在本发明的实施例中，上述诱导蝇蛆步骤中的饲喂培养的温度为24～26℃，培养时间为24h。
在本发明的一些实施例中，上述粗提取步骤中的清洗消毒具体为：先将虫体采用自来水冲洗5～6次，再用蒸馏水冲洗2～4次，用滤纸将虫体表面的水吸干后用75％的酒精对虫体进行消毒。
在本发明的一些实施例中，上述粗提取步骤中的虫体和提取液的比例为1mg：(2～4)mL。
在本发明的一些实施例中，上述提取液采用0.05mol/L，pH＝5.0的乙酸铵缓冲液、0.35μg/mL的PMSF和0.2％的巯基乙醇配制而成。
在本发明的一些实施例中，上述粗提取步骤中初次离心的次数为3～5次，每次的速率为12000r/min，时间为15～20min，再次离心的速率为12000r/min，离心时间为20～25min。
在本发明的一些实施例中，上述分离纯化步骤中粗提液过凝胶柱G75的步骤具体为：先用双蒸水以1.0mL/min的流速冲洗层析柱，再用流动相为0.05moL/L的乙酸铵溶液以同样的流速平衡1～2h，然后加粗提液，用流动相以1.0mL/min的流速进行洗脱，在280mm波长下检测，记录色谱曲线。
一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法获得的蝇蛆抗菌肽。
一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法获得的蝇蛆抗菌肽作为治疗鸡白痢药物在养殖业中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
另外需要说明的是本发明中所用的蝇蛆为石河子大学农学院人工气候温箱饲养获得；
本发明所使用的菌株均由石河子大学动物科技学院微生物实验室提供。
实施例1
一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，其包括以下步骤：
将沙门氏菌菌液以12000r/min离心10min，弃上清，加入生理盐水，振荡混匀后再12000r/min离心10min，重复2次，最后将菌体沉淀与生理盐水振荡混匀，得到重悬的沙门氏菌。
取重悬的沙门氏菌饲喂蝇蛆，将蝇蛆放置在25℃的环境下进行饲养，24h后培养得到产生免疫防御的蝇蛆虫体；
将存活的蝇蛆虫体采用自来水冲洗6次，再用蒸馏水冲洗4次，用滤纸将虫体表面的水吸干，然后用75％的酒精对虫体进行消毒，等虫体表面干燥后置于研钵中，按照虫体质量与提取液体积1mg：3mL的比例加入提取液(用0.05mol/L，pH＝5.0的乙酸铵缓冲液、0.35μg/mL的PMSF和0.2％的巯基乙醇配制而成)，进行充分研磨提取，然后在12000r/min高速冷冻离心机离心20min，取上清液弃去沉淀，重复离心3次，合并上清液并置于100℃沸水中水浴加热10min，迅速冷却后，在12000r/min的速率下离心20min，用超滤离心管(截留分子量为3KDa)对上清液进行浓缩，并置于-80℃冰箱，保存备用，得粗提液；
分别将sephadexG75和sephadexG25置于双蒸水中，室温浸泡12h充分溶胀，用蒸馏水除去杂质和细小颗粒，将溶胀好的sephadexG75凝胶与蒸馏水充分混匀后，从上端缓慢倒入洁净玻璃层析柱内，在加凝胶混悬液时，先堵住下端的出口，待其沉降约高3cm时，打开出水口，让水从色谱柱下端流出，不断加入凝胶溶液,使凝胶颗粒自然而均匀的沉降。装好的色谱柱不能有分段和气泡。柱子中如出现气泡、分层或分段，则需要重新装柱。
柱装好后用双蒸水以1.0ml/min的流速冲洗，平衡液体积为3倍柱床体积，再用流动相为0.05mol/L的乙酸铵溶液以同样的流速平衡1h，在280mm波长检测下，直至基线平稳。色谱柱的环境温度设定为室温。
在凝胶柱平衡后，加粗提液溶液1mL，用流动相0.05mol/L的乙酸铵溶液以1.0mL/min的流速进行洗脱，在280mm波长下检测，记录色谱曲线。当数据出现变化时，开始对样品进行部分收集，每5min收集1瓶，并迅速放-80℃保存。用药敏纸片法测定各收集品的抗菌活性，对抗菌活性强的样品进行收集，进一步作Sephadex G25色谱分析。
Sephadex G25和Sephadex G75的的试验方法相同，只是流动相流速减为0.5mL/min。将分步收集的样品进行真空冷冻干燥，以冷冻干燥前样品体积的1/10的比例加双蒸馏水溶解，得到蝇蛆抗菌肽。
实施例2
一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，其包括以下步骤：
将沙门氏菌菌液以12000r/min离心15min，弃上清，加入生理盐水，振荡混匀后再12000r/min离心10min，重复3次，最后将菌体沉淀与生理盐水振荡混匀，得到重悬的沙门氏菌。
取重悬的沙门氏菌饲喂蝇蛆，将蝇蛆放置在25℃的环境下进行饲养，24h后培养得到产生免疫防御的蝇蛆虫体；
将存活的蝇蛆虫体采用自来水冲洗5次，再用蒸馏水冲洗4次，用滤纸将虫体表面的水吸干，然后用75％的酒精对虫体进行消毒，等虫体表面干燥后置于研钵中，按照虫体质量与提取液体积1mg：4mL的比例加入提取液(用0.05mol/L，pH＝5.0的乙酸铵缓冲液、0.35μg/mL的PMSF和0.2％的巯基乙醇配制而成)，进行充分研磨提取，然后在12000r/min高速冷冻离心机离心20min，取上清液弃去沉淀，重复离心3次，合并上清液并置于100℃沸水中水浴加热10min，迅速冷却后，在12000r/min的速率下离心20min，用超滤离心管(截留分子量为3KDa)对上清液进行浓缩，并置于-80℃冰箱，保存备用，得粗提液；
分别将sephadexG75和sephadexG25置于双蒸水中，室温浸泡12h充分溶胀，用蒸馏水除去杂质和细小颗粒，将溶胀好的sephadexG75凝胶与蒸馏水充分混匀后，从上端缓慢倒入洁净玻璃层析柱内，在加凝胶混悬液时，先堵住下端的出口，待其沉降约高3cm时，打开出水口，让水从色谱柱下端流出，不断加入凝胶溶液,使凝胶颗粒自然而均匀的沉降。装好的色谱柱不能有分段和气泡。柱子中如出现气泡、分层、分段，则需要重新装柱。
柱装好后用双蒸水以1.0ml/min的流速冲洗，平衡液体积为4倍柱床体积，再用流动相为0.05mol/L的乙酸铵溶液以同样的流速平衡1h，在280mm波长检测下，直至基线平稳。色谱柱的环境温度设定为室温。
在凝胶柱平衡后，加粗提液溶液1mL，用流动相0.05mol/L的乙酸铵溶液以1.0mL/min的流速进行洗脱，在280mm波长下检测，记录色谱曲线。当数据出现变化时，开始对样品进行部分收集，每5min收集1瓶，并迅速放-80℃保存。用药敏纸片法测定各收集品的抗菌活性，对抗菌活性强的样品进行收集，进一步作Sephadex G25色谱分析。
Sephadex G25和Sephadex G75的的试验方法相同，只是流动相流速减为0.5mL/min。将分步收集的样品进行真空冷冻干燥，以冷冻干燥前样品体积的1/10的比例加双蒸馏水溶解，得到蝇蛆抗菌肽。
实施例3
一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，其包括以下步骤：
将沙门氏菌菌液以12000r/min离心12min，弃上清，加入生理盐水，振荡混匀后再12000r/min离心15min，重复3次，最后将菌体沉淀与生理盐水振荡混匀，得到重悬的沙门氏菌。
取重悬的沙门氏菌饲喂蝇蛆，将蝇蛆放置在24℃的环境下进行饲养，24h后培养得到产生免疫防御的蝇蛆虫体；
将存活的蝇蛆虫体采用自来水冲洗5次，再用蒸馏水冲洗2次，用滤纸将虫体表面的水吸干，然后用75％的酒精对虫体进行消毒，等虫体表面干燥后置于研钵中，按照虫体质量与提取液体积1mg：2mL的比例加入提取液(用0.05mol/L，pH＝5.0的乙酸铵缓冲液、0.35μg/mL的PMSF和0.2％的巯基乙醇配制而成)，进行充分研磨提取，然后在12000r/min高速冷冻离心机离心15min，取上清液弃去沉淀，重复离心3次，合并上清液并置于100℃沸水中水浴加热10min，迅速冷却后，在12000r/min的速率下离心25min，用超滤离心管(截留分子量为3KDa)对上清液进行浓缩，并置于-80℃冰箱，保存备用，得粗提液；
分别将sephadexG75和sephadexG25置于双蒸水中，室温浸泡12h充分溶胀，用蒸馏水除去杂质和细小颗粒，将溶胀好的sephadexG75凝胶与蒸馏水充分混匀后，从上端缓慢倒入洁净玻璃层析柱内，在加凝胶混悬液时，先堵住下端的出口，待其沉降约高3cm时，打开出水口，让水从色谱柱下端流出，不断加入凝胶溶液,使凝胶颗粒自然而均匀的沉降。装好的色谱柱不能有分段和气泡。柱子中如出现气泡、分层、分段，则需要重新装柱。
柱装好后用双蒸水以1.0ml/min的流速冲洗，平衡液体积为4倍柱床体积，再用流动相为0.05mol/L的乙酸铵溶液以同样的流速平衡2h，在280mm波长检测下，直至基线平稳。色谱柱的环境温度设定为室温。
在凝胶柱平衡后，加粗提液溶液1mL，用流动相0.05mol/L的乙酸铵溶液以1.0mL/min的流速进行洗脱，在280mm波长下检测，记录色谱曲线。当数据出现变化时，开始对样品进行部分收集，每5min收集一瓶，并迅速放-80℃保存。用药敏纸片法测定各收集品的抗菌活性，对抗菌活性强的样品进行收集，进一步作Sephadex G25色谱分析。
Sephadex G25和Sephadex G75的的试验方法相同，只是流动相流速减为0.5mL/min。将分步收集的样品进行真空冷冻干燥，以冷冻干燥前样品体积的1/10的比例加双蒸馏水溶解，得到蝇蛆抗菌肽。
实验例
(一)不同的分离纯化抗菌肽的操作方法对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌影响。
本实验例设置5个实验组，其中实验组1直接采用实施例1制备得到的蝇蛆抗菌肽粗提液，进行分离提纯；实验组2将粗提液进行阳离子交换层析洗脱液进行洗脱纯化；实验组3采用Sephadex G-75洗脱液进行洗脱纯化；实验组4采用Sephadex G-25洗脱液进行洗脱纯化；实验组5为对照组，采用庆大霉素。其药敏纸片法的结果如表1所示。
表1
注：同列数据肩标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。下表同。
从表1中可以看出，本试验通过硫酸铵沉淀蛋白、透析袋进行除盐及初步截留、超滤管进行浓缩超滤并截取、阳离子交换层析、凝胶层析提取分离到的蝇蛆抗菌肽，经检测均对沙门氏菌和金葡萄球菌具有一定抑菌作用，经阳离子交换层析、凝胶层析后蝇蛆抗菌肽均高于粗提液对沙门氏菌和金葡萄球菌的抑菌活性，但低于抗生素的抑菌活性，其中经Sephadex G-25层析最后纯化的蝇蛆抗菌肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为20.95±0.22、17.65±0.41，庆大霉素对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为25.48±0.51、18.96±0.64，Sephadex G-25洗脱液与庆大霉素相比差异不显著，说明纯化后效果良好，可能与其中含有的杂蛋白有关，杂蛋白含量高，具有抗菌活性的抗菌肽就相对较少，所以纯化后抑菌活性高于未经纯化的粗提液。本发明制备得到的蝇蛆抗菌肽对沙门氏菌的抑菌活性抗菌活性高于金葡萄球菌，说明对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性不同，这可能与抗菌肽的作用机理有关，抗菌肽可作用于细胞壁，使细胞壁溶解破裂，从而达到抑菌效果，与青霉素类药物作用机理相似，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁成分不同，可能导致这种差异。
(二)本实验例探究不同细菌诱导的蝇蛆抗菌肽对沙门氏菌的抑菌效果。
本实验例设置5个实验组，其中实验组1不经诱导，直接采用普通的蝇蛆虫体进行提取、分离和纯化；实验组2采用金黄色葡萄球菌进行诱导；实验组3采用大肠杆菌进行诱导；实验组4次用沙门氏菌进行诱导；实验组5为抗生素对照组。实验组1～4中的其他诱导条件、粗提取和分离纯化步骤均相同，均同实施例1。将实验组1～5采用药敏纸片法对沙门氏菌进行抑菌实验，实验结果如表2所示。
表2
| 组别 | 抑菌圈直径(mm) |
| 未诱导组 | 11.19±0.326<sup>d</sup> |
| 金黄色葡萄球菌诱导组 | 11.32±0.41<sup>cd</sup> |
| 大肠杆菌诱导组 | 11.88±0.22<sup>c</sup> |
| 沙门氏菌诱导组 | 14.48±0.32<sup>b</sup> |
| 抗生素组 | 18.25±0.25<sup>a</sup> |
从表2中可以看出，本试验通过硫酸铵沉淀蛋白、透析袋进行除盐及初步截留、超滤管进行浓缩超滤并截取、阳离子交换层析、凝胶层析提取分离到的蝇蛆抗菌肽，经检测均对沙门氏菌具有一定抑菌作用，不同细菌诱导的蝇蛆抗菌肽对于沙门氏菌的抑菌活性均高于未诱导组的抑菌效果，但低于抗生素的抑菌效果，其中未诱导组的抑菌圈直径为11.19±0.326，金黄色葡萄球菌诱导组、大肠杆菌诱导组和沙门氏菌诱导组的抑菌圈直径分别为11.32±0.41、11.88±0.22和14.48±0.32，本发明制备得到的重悬沙门氏菌诱导蝇蛆抗菌肽对沙门氏菌的抑菌活性抗菌活性高于其他细菌诱导的蝇蛆抗菌肽对沙门氏菌的抑菌活性。
(三)本实验组比较分析不同细菌诱导的蝇蛆抗菌肽对鸡白痢的治疗效果。
选取180只雏鸡，饲养至14日龄，建立鸡白痢病理模型，再分为五个实验组，对照组不治疗，未诱导组使用未诱导的蝇蛆抗菌肽进行治疗，金黄色葡萄球菌诱导组使用重悬的金黄色葡萄球菌诱导蝇蛆产生的抗菌肽进行治疗，大肠杆菌诱导组使用重悬的大肠杆菌诱导蝇蛆产生的抗菌肽进行治疗，沙门氏菌诱导组使用重悬的沙门氏菌诱导蝇蛆产生的抗菌肽进行治疗，抗生素组使用庆大霉素进行治疗。其结果如表3所示。
表3
从表3中可以看出，经过不同细菌诱导的蝇蛆抗菌肽对于鸡白痢的治疗效果有一定的差异，经过不同细菌诱导产生的蝇蛆抗菌肽对白痢鸡的治疗作用要好于未诱导的蝇蛆抗菌肽，并且经重悬沙门氏菌诱导的蝇蛆抗菌肽对白痢鸡的治疗效果优于其他细菌诱导的蝇蛆抗菌肽的治疗效果。
综上所述，本发明采用重悬的沙门氏菌对蝇蛆进行诱导，刺激其产生抗菌肽，然后对其粗提抗菌肽，利用G75和G25凝胶层析柱进行分离和纯化，得到具有高抑菌活性的蝇蛆抗菌肽组分，其制备方法简单有效。
本发明制备得到的蝇蛆抗菌肽对沙门氏菌具有较强的抑菌活性，对鸡白痢具有一定的治疗效果，通过沙门氏菌诱导获得的蝇蛆抗菌肽对沙门氏菌感染的鸡白痢病的治疗效果优于其他细菌诱导的蝇蛆抗菌肽。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，特点在于以下关键步骤：
诱导蝇蛆：取重悬的沙门氏菌饲喂蝇蛆，培养得到产生免疫防御的蝇蛆；
蝇蛆抗菌肽粗提取：将诱导的活蝇蛆清洗消毒，加入提取液提取并离心，取上清液经沸水浴和冷却再离心，然后浓缩保存粗提液；
分离纯化：将粗提液依次经凝胶柱G75和凝胶柱G25洗脱收集，得到分离纯化的蝇蛆抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，关键在于，所述沙门氏菌的重悬步骤为：将沙门氏菌菌液以12000r/min离心10～15min，弃上清，加入生理盐水，振荡混匀后再12000r/min离心10～15min，重复2～3次，最后将菌体沉淀与生理盐水振荡混匀使用。
3.根据权利要求1所述的利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，其关键在于，所述诱导蝇蛆步骤中的饲喂培养的温度为24～26℃，培养时间为24h。
4.根据权利要求1所述的利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，其关键在于，所述粗提取步骤中的清洗消毒具体为：先将蝇蛆用自来水冲洗5～6次，再用蒸馏水冲洗2～4次，用滤纸将虫体表面的水吸干后用75％的酒精对虫体进行消毒。
5.根据权利要求1所述的利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，其关键在于，所述粗提取步骤中的蝇蛆和提取液的比例为1mg：(2～4)mL。
6.根据权利要求5所述的利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，其关键在于，所述提取液用0.05mol/L，pH＝5.0的乙酸铵缓冲液、0.35μg/mL的PMSF和0.2％的巯基乙醇配制而成。
7.根据权利要求1所述的利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，其关键在于，所述粗提取步骤中，首次离心的次数为3～5次，每次的速率为12000r/min，时间为15～20min，再次离心的速率为12000r/min，离心时间为20～25min。
8.根据权利要求1所述的利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，其关键在于，所述分离纯化步骤中粗提液过凝胶柱G75的步骤具体为：先用双蒸水以1.0mL/min的流速冲洗层析柱，再用流动相为0.05moL/L的乙酸铵溶液以同样的流速平衡1～2h，然后加粗提液，用流动相以1.0mL/min的流速进行洗脱，于280mm波长检测，记录色谱曲线。
9.根据权利要求1～8任一项所述的利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法能获得蝇蛆抗菌肽。
10.根据权利要求9所述的利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法，获得的蝇蛆抗菌肽作为鸡白痢治疗药物在鸡养殖业中的应用。
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| CN101054408A (zh) * | 2007-04-02 | 2007-10-17 | 贵阳医学院 | 家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用 |
| CN101935344A (zh) * | 2010-08-04 | 2011-01-05 | 周义文 | 一种中国家蝇抗菌肽1及其分离纯化方法 |
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