CN101058602A - 一种无指盘臭蛙抗菌肽及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学和生物医学领域，涉及一种无指盘臭蛙抗菌肽及其制备方法和用途。将活体无指盘臭蛙经电刺激、收集分泌物、离心去沉淀、冷冻干燥、离子交换、凝胶过滤、反相层析分离纯化后得到无指盘臭蛙抗菌肽，命名为OdorgrinA，由33个氨基酸组成，理论分子量(MW)3365.81D，实测分子量3365.24D，理论等电点(pI)9.31，全序列结构为：NH₂－GLLDTFKNLALNAAKSAGVSVLNSLSCKLSKTC－COOH。具有广谱抗菌活性，可用来生产抗菌药物和抗菌剂。

Description

一种无指盘臭蛙抗菌肽及其制备方法和用途

                          技术领域

本发明属于生物化学和生物医学领域，涉及一种无指盘臭蛙皮肤分泌抗菌肽OdorgrinA及其制备方法和应用。

                          背景技术

抗生素的发现是20世纪最辉煌的现代医药成果。由于抗生素的临床应用，许多曾被认为是致命的感染性疾病得以治愈，从而显著提高了人类的预期寿命。但由于过去30年来滥用和不合理使用抗生素，导致耐药菌株的广泛播散，使抗感染治疗又成了棘手的问题。例如，由于肺炎链球菌出现对青霉素、大环内酯类抗生素和氟喹喏酮类抗菌药物的耐药，使急性呼吸道感染变得难以控制。在国际上享有“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”美誉的万古霉素，也因为最近发现了相应的耐药细菌而面临着失效的危险。细菌对抗生素产生耐药性，使抗感染治疗失败，必然导致发病率和病死率的上升及医药费用的大幅增加，因此，病原体对抗生素产生耐药性是21世纪全球公共卫生面临的最严重的威胁之一。解决办法一方面是合理使用抗生素，尽量减少耐药菌株的出现，另一方面就是寻找新型的抗菌物质，这已经成为当前的研究热点。抗菌肽具有分子量小、水溶性好、抗原性低、稳定性高等特点。不但能够抗细菌，而且能够抗真菌、抗原虫、抗肿瘤、抗病毒，还能够杀死哺乳动物的精子，对哺乳动物正常细胞却只有很低的毒性。由于抗菌肽具有和抗生素完全不同的抗菌机理，因此具有高效、广谱、不易产生耐药性等特点；传统抗生素容易诱导细菌产生内毒素从而导致脓毒症，而有的抗菌肽可以与内毒素相互作用中和细菌内毒素从而抑制脓毒症的发生；有的抗菌肽除了具有抗菌活性以外还有促进伤口愈合的作用。所以尽管抗菌肽灭菌效果略低于传统的抗生素，但在耐药性病原体大量出现的今天，仍被认为是能取代现有抗生素的唯一选择。抗菌肽除了能够开发成新一代的临床抗菌药物外，利用其特性，还可以开发出其他临床药物。比如：有的抗菌肽有促进伤口愈合的作用，可以据此开发出愈伤药；抗菌肽可以杀死精子，可以据此研制出具有抗菌作用的新型避孕药；抗菌肽对膜具有特异的亲和性，可以将只具膜亲和作用的抗菌肽衍生物和药物结合，以便该药物能精确地作用于靶部位，研制出“药物导弹”；抗菌肽的抗病毒作用最近几年才发现，虽然其机理还不是很清楚，但由于对HIV等病毒有抑制作用，因此正成为研究热点。抗菌肽除了在药用领域大有前途外，在其他领域也有良好的应用前景，比如：抗菌肽基因可以转入动植物基因组中，从而培育出抗病新品种；抗菌肽可以用于食品的防腐保鲜；可以取代抗生素作为饲料添加剂；可以开发新型农药等等。

目前，已有多种抗菌肽正在进行临床前的可行性研究：如德国已将从果蝇体内提取的抗菌肽用于治疗化疗和器官移植后出现的重度真菌感染；美国开始试用从猪体内中性白细胞中获得的抗菌肽治疗癌症病人在放疗和化疗后出现的口腔溃疡，并把这种抗菌肽制成喷雾剂放入人工呼吸机中治疗重度肺炎病人；加拿大采用人工合成抗菌肽用于治疗革兰氏阳性菌引起的尿道旁组织感染。再如，美国学者发现，从青蛙表皮提取的抗菌肽，不仅可以杀死性病病菌和艾滋病毒，还能杀死精子。不难想像，用这种抗菌肽制成的药品不仅能防治性病，还能当避孕药。另外，研究中还发现，抗菌肽扼杀癌细胞的效果显著，据悉，俄罗斯专家试用抗菌肽对黑色素瘤、卵巢癌和淋巴癌进行治疗，效果十分显著。显然，抗菌肽也为治疗癌症开辟了新的途径。

两栖动物有自己的一套先天免疫系统，其核心就是抗菌肽。两栖动物皮肤已经被公认为是生物活性多肽和生物胺的巨大储存库，其皮肤分泌物中含有大量的生物活性分子，是天然的药物资源库。我国现有300多种两栖动物，其中多数为我国特有种，其中有些还是典型的中药或藏药材，显然，它们是一个不可多得的两栖动物活性物质的巨大宝库。无指盘臭蛙(Odorrana grahami)隶属两栖纲(AMPHIBIAN)无尾目(ANURA)蛙亚科(Raninae)。分布于四川、云南、贵州、湖南，为我国特有种。经我们研究发现，其皮肤分泌物具有抗菌活性。通过综合一系列的分离纯化技术，从其皮肤分泌物中分离纯化出了一种抗菌肽，取名为无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA，它具有广谱抗菌活性，尤其对普通金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和盘尼西林抗药性金黄色葡萄球菌(Penicillin-resistant Staphylococcus aureus)都具有相同的抗性，显然具有成为抗菌药物的潜力。

发明人将本发明的抗菌肽OdorgrinA全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。

                          发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有广谱抗菌活性的无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA及其制备方法和应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案：

无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA为我们首次从中国两栖动物无指盘臭蛙皮肤分泌物中分离纯化得到的一种单链多肽，由33个氨基酸组成，理论分子量(MW)为3365.81D，实测分子量为3365.24D，理论等电点(pI)为9.31，全序列结构为：

NH₂-GLLDTFKNLALNAAKSAGVSVLNSLSCKLSKTC-COOH。也可以表示为：

Gly-Leu-Leu-Asp-Thr-Phe-Lys-Asn-Leu-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Lys-Ser-Ala-Gly-Val-Ser-Val-Leu-Asn-Ser-Leu-Ser-Cys-Lys-Leu-Ser-Lys-Thr-Cys

本发明采用的无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的制备方法：

本方法包括粗提物的获取、阳离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析、反相柱层析等步骤，将活体无指盘臭蛙经中度电刺激，收集分泌物，离心去除沉淀，冷冻干燥后，经阳离子交换、凝胶过滤、反相层析分离纯化后即得无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA。具体方法如下：

粗提物的获取：无指盘臭蛙用15V-35V电刺激，让其充分分泌，分泌物经离心，取上清冷冻干燥，得到粗提物。继续饲养动物，每间隔一周，继续按此法反复取样以得到足量的粗提物。

阳离子交换柱层析：粗提物溶于A液(0.01mol/L的HAc缓冲液，pH4.2)，上阳离子交换柱，柱尺寸1.0cm×40.0cm，层析介质为CM-Sepharose fast flow。上样后，A液等梯度洗脱，然后A液-B液(B液为0.5mol/L NaCl-0.01mol/L的HAc缓冲液，pH4.2)线性梯度洗脱，最后C液(C液为2mol/L NaCl-0.01mol/L的HAc缓冲液，PH4.2)等梯度洗脱。206nm下检测紫外吸收值，收集抗菌活性峰，冷冻干燥，得到阳离子交换样品。

凝胶过滤柱层析：阳离子交换样品溶于双蒸水，上凝胶过滤柱，柱尺寸1.6cm×100.0cm，层析介质为SephadexG-25，洗脱液为双蒸水，206nm下检测紫外吸收值。收集抗菌活性峰，得到凝胶过滤样品溶液。

反相柱层析：凝胶过滤样品溶液上反相柱，柱尺寸1.6cm×10.0cm，层析介质为SOUCE 15RPC，D液为5％的乙腈溶液，E液为95％的乙腈溶液，D液-E液梯度洗脱，然后E液等梯度洗脱，214nm下检测紫外吸收值。收集抗菌活性峰，得到初步提纯样品溶液。初步提纯样品溶液再进行第二次反相层析，上完样后，等梯度洗脱，D液为79％，E液为21％；然后线性梯度洗脱，起始D液为79％，E液为21％，梯度结束时D液为54％，E液为46％；最后等梯度洗脱，洗脱液为E液。214nm下检测紫外吸收值，收集抗菌活性峰，冷冻干燥，得到无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA。

本发明采用反相高效液相层析检测无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的纯度：

OdorgrinA样品用F液(0.1％的三氟乙酸水溶液)溶解，注射10μL于分析型C18(4.6mm×250.0mm)高效液相反相柱。线性梯度洗脱，起始F液为70％，G液(0.1％的三氟乙酸乙腈溶液)为30％，梯度结束时F液为40％，G液为60％；最后等梯度洗脱，洗脱液为G液。以峰面积来计算纯度。

本发明采用自动氨基酸序列测定仪(Edman降解法)测定肽的氨基酸全序列结构。

本发明采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)法测定分子量。

本发明采用纸片扩散法测定无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的抗菌活性：

菌种为盘尼西林抗药性金黄色葡萄球菌(Penicillin-resistantStaphylococcus aureus)、普通金黄色葡萄球菌(Staphylococcus auneus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)。将样品按一定浓度溶于灭菌双蒸水中，倍比稀释，4℃放置备用。培养基为LB培养基。倒双层平板，第一层平板是1.3％的琼脂平板，每个培养皿倒入20mL，凝固冷却后备用。将4种细菌分别接种于LB培养基斜面上，35℃恒温箱培养18小时，每个斜面加入10mL灭菌生理盐水，吸取菌悬液于50℃水浴中的1.3％LB培养基中，加入菌悬液的量以使LB培养基中的菌浓度为每毫升约10⁵个，将此含菌LB培养基10mL倒在第一层平板上，待凝固冷却后，取直径6mm的滤纸片分别粘取倍比稀释的样品放置其上。35℃恒温箱培养18小时观察滤纸片周围的抑菌圈，其直径在10mm左右的为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。

由于本发明无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA具有广谱抗菌活性，因此本发明无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA或其盐可用于制造抗菌药物或抗菌剂。

                          附图说明

本发明内容通过附图作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

图1为本发明无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的离子交换层析图

图2为本发明无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的凝胶过滤层析图

图3为本发明无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的第一次反相层析图

图4为本发明无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的第二次反相层析图

图5为本发明无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的反相高效液相层析图

图6为本发明无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的质谱图

                          具体实施方式

具体实施方式将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明的范围。实施方式中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等)和《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯等)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的制备：

粗提物的获取：无指盘臭蛙用双蒸水洗净，放于烧杯中，加入双蒸水，用25V电刺激1分钟，间隔2分钟后再次刺激，共刺激5次，让其充分分泌，分泌物离心30分钟，取上清冷冻干燥，得到粗提物。继续饲养动物，每间隔一周，继续按此法反复取样以得到足量的粗提物。

阳离子交换柱层析：A液为0.01mol/L的HAc缓冲液，pH4.2，B液为0.5mol/L NaCl-0.01mol/L的HAc缓冲液，pH4.2，C液为2mol/L NaCl-0.01mol/L的HAc缓冲液，PH4.2。CM-Sepharose fast flow抽气至无气泡产生，装柱(1.0cm×40.0cm)，用A液平衡1小时，流速为120mL/h。粗提物充分溶于A液，先滤纸抽滤，再0.45μm微孔滤膜过滤，上柱分离。初始等梯度洗脱，洗脱液为A液；然后线性梯度洗脱，起始A液为100％，B液为0％，梯度结束时A液为0％，B液为100％；最后等梯度洗脱，洗脱液为C液。206nm下检测紫外吸收值，收集有抗菌活性的第44-53管洗脱液(见图1)，冷冻干燥，得到阳离子交换样品。

凝胶过滤柱层析：SephadexG-25用蒸馏水在室温下溶胀3小时，再用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl浸泡30分钟，抽滤除去碱液，用蒸馏水洗至中性，抽气至无气泡产生，装柱(1.6cm×100.0cm)，用双蒸水平衡24小时，流速为20mL/h。阳离子交换样品重溶于双蒸水，0.45μm微孔滤膜过滤，上柱脱盐纯化，洗脱液为双蒸水。206nm下检测紫外吸收值，自动部分收集器收集，收集有抗菌活性的18-23管洗脱液(见图2)，得到凝胶过滤样品溶液。

反相柱层析：柱尺寸1.6cm×10.0cm，层析介质为SOURCE 15RPC。

第一次反相层析：用E液(95％的乙腈溶液)冲洗柱子18分钟后，用D液(5％的乙腈溶液)平衡柱子直到基线走平。凝胶过滤样品溶液直接上样，上完样后，线性梯度洗脱，起始D液为100％，E液为0％，梯度结束时D液为0％，E液为100％；最后等梯度洗脱，洗脱液为E液。214nm下检测紫外吸收值，收集有抗菌活性的11-13管洗脱液(见图3)，得到初步提纯样品溶液。

第二次反相层析：平衡柱子方法同第一次反相层析，初步提纯样品溶液直接上样，上完样后，等梯度洗脱，D液为79％，E液为21％；然后线性梯度洗脱，起始D液为79％，E液为21％，梯度结束时D液为54％，E液为46％；最后等梯度洗脱，洗脱液为E液。214nm下检测紫外吸收值，收集第5峰的半高峰(见图4)，冷冻干燥，得到无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA。

无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的纯度检测：

采用反相高效液相层析来检测。F液为0.1％的三氟乙酸水溶液，G液为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液。G液冲洗柱子20分钟后，用起始洗脱液(含F液70％，G液30％)平衡柱子直到基线走平，OdorgrinA样品用F液溶解，注射10μL于分析型C18(4.6mm×250.0mm)高效液相反相柱。线性梯度洗脱，起始F液为70％，G液为30％，梯度结束时F液为40％，G液为60％；最后等梯度洗脱，洗脱液为G液。从图5可以看出，只有一个主峰，且主峰面积达到总峰面积的99％以上，说明OdorgrinA纯度达到了99％以上。

无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的氨基酸全序列结构测定：

采用自动氨基酸序列测定仪(Edman降解法)来测定。委托中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞学研究所蛋白质组学研究分析中心检测。检测结果表明，此肽由33个氨基酸组成，全序列结构为：

NH₂-GLLDTFKNLALNAAKSAGVSVLNSLSCKLSKTC-COOH。也可以表示为：

Gly-Leu-Leu-Asp-Thr-Phe-Lys-Asn-Leu-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Lys-Ser-Ala-Gly-Val-Ser-Val-Leu-Asn-Ser-Leu-Ser-Cys-Lys-Leu-Ser-Lys-Thr-Cys

根据氨基酸序列，利用“Compute pI/Mw tool(http：//expasy.org/tools/pi_tool.html)”计算出此肽的理论单一同位素(monoisotopic)质量为3365.81D，理论等电点(pI)为9.31。

无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的分子量测定：

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)法来测定。委托中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞学研究所蛋白质组学研究分析中心检测。从图6可以看出，此肽的单一同位素(monoisotopic)质量为3365.24D，与理论单一同位素质量(3365.81D)符合。

无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的抗菌活性检测：

本发明采用纸片扩散法测定抗菌活性。菌种为盘尼西林抗药性金黄色葡萄球菌(Penicillin-resistant Staphylococcus aureus)、普通金黄色葡萄球菌(Staphylococcus auneus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)。都按无菌操作，将OdorgrinA按一定浓度溶于灭菌双蒸水中，倍比稀释，4℃放置备用。培养基为LB培养基。倒双层平板，第一层平板是1.3％的琼脂平板，每个培养皿倒入20mL，凝固冷却后备用。将4种细菌分别接种于LB培养基斜面上，35℃恒温箱培养18小时，每个斜面加入10mL灭菌生理盐水，吸取菌悬液于50℃水浴中的1.3％LB培养基中，加入菌悬液的量以使LB培养基中的菌浓度为每毫升约10⁵个，将此含菌LB培养基10mL倒在第一层平板上，待凝固冷却后，取直径6mm的5层滤纸片分别粘取倍比稀释的样品放置其上。35℃恒温箱培养18小时观察滤纸片周围的抑菌圈，其直径在10mm左右的为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。检测结果，对四种菌的MIC值分别是：盘尼西林抗药性金黄色葡萄球菌(50μg/mL)、普通金黄色葡萄球菌(50μg/mL)、枯草杆菌(100μg/mL)和大肠杆菌(50μg/mL)。

                     SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院成都生物研究所

<120>一种无指盘臭蛙抗菌肽及其制备方法和用途

<130>/

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>33

<212>PRT

<213>动物

<400>1

Gly Leu Leu Asp Thr Phe Lys Asn Leu Ala Leu Asn Ala Ala Lys Ser

 1              5                   10                  15

Ala Gly Val Ser Val Leu Asn Ser Leu Ser Cys Lys Leu Ser Lys Thr

            20                  25                  30

Cys

Claims (3)

1.一种无指盘臭蛙抗菌肽，其特征是：单链多肽，由33个L型或者D型异构体氨基酸组成，理论分子量MW为3365.81D，实测分子量为3365.24D，理论等电点pI为9.31，全序列结构为：

NH₂-GLLDTFKNLALNAAKSAGVSVLNSLSCKLSKTC-COOH或表示为：

Gly-Leu-Leu-Asp-Thr-Phe-Lys-Asn-Leu-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Lys-

Ser-Ala-Gly-Val-Ser-Val-Leu-Asn-Ser-Leu-Ser-Cys-Lys-Leu-Ser-

Lys-Thr-Cys

2.权利要求1所述的无指盘臭蛙抗菌肽的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)粗提物的获取：将活体无指盘臭蛙用15V-35V电刺激，收集分泌物并离心，取上清液冷冻干燥，得到粗提物；继续饲养动物，每间隔一周，重复此方法获取粗提物。

(2)阳离子交换柱层析：粗提物溶于A液，上阳离子交换柱，柱尺寸1.0cm×40.0cm，层析介质为CM-Sepharose fast flow，上样后，A液等梯度洗脱，然后A液-B液线性梯度洗脱，最后C液等梯度洗脱，收集抗菌活性峰，冷冻干燥，得到阳离子交换样品，A液、B液、C液分别为如下液体：

A液：0.01mol/L的HAc缓冲液，pH4.2，

B液：0.5mol/L NaCl-0.01mol/L的HAc缓冲液，pH4.2，

C液：2mol/L NaCl-0.01mol/L的HAc缓冲液，PH4.2。

(3)凝胶过滤柱层析：阳离子交换样品溶于双蒸水，上凝胶过滤柱，柱尺寸1.6cm×100.0cm，层析介质为SephadexG-25，洗脱液为双蒸水，收集抗菌活性峰，得到凝胶过滤样品溶液。

(4)反相柱层析：凝胶过滤样品溶液上反相柱，柱尺寸1.6cm×10.0cm，层析介质为SOUCE 15RPC，D液-E液梯度洗脱，然后E液等梯度洗脱，收集抗菌活性峰，得到初步提纯样品溶液，初步提纯样品溶液再进行第二次反相层析，上完样后，等梯度洗脱，D液为79％，E液为21％，然后线性梯度洗脱，起始D液为79％，E液为21％，梯度结束时D液为54％，E液为46％，最后等梯度洗脱，洗脱液为E液，收集抗菌活性峰的半高峰，冷冻干燥，得到无指盘臭蛙抗菌肽，D液、E液分别为如下液体：

D液：5％的乙腈溶液，

E液：95％的乙腈溶液。

3.权利要求1或权利要求2所述的无指盘臭蛙抗菌肽或其盐在制造抗菌药物或抗菌剂中的用途。

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