KR101845469B1 - 정제봉독으로부터 멜리틴을 고 순도로 분리하는 멜리틴의 분리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수상:유기용매상이 90:10 ~ 50:50(v/v) 비율인 이동상이 흐르는, 고정상을 포함하는 컬럼에 정제봉독 수용액을 주입하여 흡착시키는 흡착 단계; 상기 흡착 단계의 이동상을 유지하여 상기 컬럼으로부터 멜리틴 이외의 성분을 용리하는 제1 용리 단계; 수상:유기용매상이 50:50 ~ 30:70(v/v)이 되도록 이동상의 비율을 변화시키는 제1 농도구배 단계; 및 상기 제1 농도구배 단계의 최종 비율의 이동상을 유지하여 멜리틴을 용리하는 제2 용리 단계를 포함하는, 정제봉독으로부터 멜리틴을 고 순도로 분리하는 멜리틴의 분리 방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 고 순도의 멜리틴을 분리함으로써 이를 이용함에 있어서 부작용을 유발할 수 있는 멜리틴 이외의 성분이 최소화되고, 이에 따라 봉독의 유효성분을 효과적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

정제봉독으로부터 멜리틴을 고 순도로 분리하는 멜리틴의 분리 방법{PROCESS FOR THE PURIFICATION OF MELITTIN ISOLATING HIGH PURITY MELITTIN FROM PURIFIED BEE VENOM}

본 발명은 정제봉독으로부터 멜리틴을 고 순도로 분리하는 멜리틴의 분리 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 정제봉독 수용액을 C4 수지 컬럼에 흡착시키고, 낮은 비율의 유기용매상으로 제1 용리 및 높은 비율의 유기용매상으로 제2 용리하는 단계를 거침으로써 고 순도 멜리틴을 분리하는 방법에 관한 것이다.

봉독(Bee Venom)은 꿀벌이 가지고 있는 독이며, 약 40 ~ 50 %의 멜리틴을 주성분으로 함유한다. 또한 13 ~ 15 %의 포스포리파제를 포함하는 단백질효소, 10 ~ 21 %에 해당하는 아파민, 아돌라핀, MCD(mast cell degranulating peptide) 등의 펩타이드성분 및 12 ~ 17 %의 아민, 아미노산, 당류 등을 포함하는 성분으로 구성된다. 봉독은 의학적으로 관절염 완화, 동맥경화 완화, 요통 완화, 피부상처의 치료, 면역체계를 강화하는 항균작용 및 항염증작용이 있는 것으로 보고되어 왔다. 그리고 최근에 피부의 미백작용 및 주름개선작용에 관여한다는 사실이 알려짐으로써 미용 목적으로도 이용가능성이 있다고 알려져 있다.

정제봉독(Purified Bee Venom, PBV)은 채집 장치를 이용하여 벌로부터 채집된 봉독원료를 자연건조, 수용정제, 멸균 및 동결건조 등의 공정을 거쳐 가공한 결과물이며, 정제봉독과 봉독원료의 생리활성은 유사한 것으로 알려져 있다.

현재 시중의 봉독과 정제봉독의 생리활성은 멜리틴(melittin)에 의한 것이라고 알려져 있다. 봉독과 정제봉독의 구성성분 중 특히 히스타민(histamin), 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)와 히알루로니다제(hyaluronidase)는 세포막 파괴, 혈액응고, 혈관확장 및 투과, 단백질의 가수분해 촉진 등의 작용을 하며, 강력한 알러지 반응을 유도한다. 따라서 봉독에 대한 과민성을 지닌 사용자에게서는 매우 심각한 안전상의 문제를 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Stefan Bogdanov; Bee Venom: composition, Health, Medicine: A Review, Bee Product Science (2011)). 이러한 부작용 때문에 안전성의 문제를 고려해 봉독의 사용을 제한하고 있으며, 생리활성 또한 충분히 구현되지 못하는 문제가 발생할 수 있다. 이를 해결하려면 봉독의 유효성분을 활용하기 위한 더욱 정밀한 정제가 필요하다.

선행문헌인 한국공개특허 제10-2015-0049865호(2013.10.31.)에 따르면, 양이온 교환 수지를 이용하여 순수한 멜리틴을 분리한 방법이 개시되어 있다. 그러나 상기와 같은 종래의 기술에서는 완충용액을 제조하여 이용하고, 추후 탈연공정을 수행하기 때문에, 용액, 시약 및 수지의 재활용이 어려우므로 생산비용이 많이 들고 대량으로 생산하기에도 적합하지 않다.

또한, 과거 종래의 방법 중 C18 및 ODS 수지로 멜리틴을 분리하는 기술에 있어서는 상기 수지의 강한 비극성(nonpolar) 흡착력 때문에 멜리틴 성분의 용리시간이 지연되고, 분리과정에서 높은 압력 때문에 펩타이드의 사슬이 절단되는 문제가 있었다. 또한 C18 및 ODS 수지를 이용하는 용리 과정에서는 일반적으로 메탄올(methanol)과 아세토나이트릴(acetonitrile) 등 유해 용매를 사용하기 때문에 추후 안전성 문제가 발생할 우려도 있다. 다른 방법으로 젤 여과(gel filtration) 방법도 알려져 있지만, 분리 또는 정제 과정이 진행됨에 따라 수율이 급격히 낮아지고, 대량생산에 적용하기 어려운 문제가 있었다.

본 발명은, 정제봉독의 구성 성분 중 알러지 및 안전상의 문제를 유발할 수 있는 성분을 제거하기 위해 더욱 정밀하게 멜리틴을 정제하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 멜리틴을 더욱 정밀하게 정제함으로써 히스타민, 포스포리파아제 A2 및 히알루로니다제 등 안전성의 문제를 유발하는 물질들을 제거하여, 봉독의 사용에 있어 부작용을 최소화하고 이에 따라 유효성분의 생리활성을 효과적으로 이용하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 용액, 시약 및 수지를 재활용하는 등의 친환경적인 방법으로 대량생산을 수행함으로써 멜리틴의 생산비용을 절감하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명에 따르면, 항균작용 및 항염증작용이 있는 고 순도의 멜리틴을 정제함으로써 의학 및 미용 목적으로 이용하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수상:유기용매상이 90:10 ~ 50:50(v/v) 비율인 이동상이 흐르는, 고정상을 포함하는 컬럼에 정제봉독(Purified Bee Venom, PBV) 수용액을 주입하여 흡착시키는 흡착 단계; 상기 흡착 단계의 이동상을 유지하여 상기 컬럼으로부터 멜리틴(melittin) 이외의 성분을 용리하는 제1 용리 단계; 수상:유기용매상이 50:50 ~ 30:70(v/v)이 되도록 이동상의 비율을 변화시키는 제1 농도구배 단계; 및 상기 제1 농도구배 단계의 최종 비율의 이동상을 유지하여 멜리틴을 용리하는 제2 용리 단계를 포함하는, 정제봉독으로부터 멜리틴을 고 순도로 분리하는 멜리틴의 분리 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 유기용매상은 에탄올일 수 있다.

본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 고정상은 C4 수지일 수 있다.

본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 방법은 제2 용리 단계 이후 수상:유기용매상이 90:10 ~ 50:50(v/v)이 되도록 이동상의 비율을 변화시키는 제2 농도구배 단계를 더 포함할 수 있다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, C4 수지 컬럼에 흡착시킨 정제봉독에서 물:에탄올이 90:10 ~ 50:50(v/v)인 이동상으로 멜리틴 이외의 성분을 용리한 후 물:에탄올이 50:50 ~ 30:70(v/v)인 이동상으로 멜리틴을 용리함으로써, 단순한 공정을 통해 순도 97 % 이상의 멜리틴을 분리하는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따르면, 고 순도의 멜리틴을 분리함으로써 이를 이용함에 있어서 부작용을 유발할 수 있는 멜리틴 이외의 성분이 최소화되고, 이에 따라 봉독의 유효성분을 효과적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따르면, C4 컬럼을 사용함으로써 공정의 시간이 단축되고, 공정에 이용한 용매를 회수하여 재사용할 수 있으므로 용매 절약이 가능함과 동시에 친환경적일 뿐만 아니라 공정의 자동 반복이 가능하여 분리 시간을 단축시킬 수 있으므로, 비용 절감 및 고 순도 멜리틴의 대량생산을 가능하게 하는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따르면, 봉독 및 정제봉독보다 항균, 항염증 등의 활성이 더 우수한 멜리틴을 분리해냄으로써 의약품 원료, 화장품 원료, 동물약품 원료 및 과학연구시약 등의 용도에 적용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라 멜리틴을 분리하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 주입 시료 농도를 (A) 100 mg/mL 및 (B) 200 mg/mL로 다르게 하여 정제봉독으로부터 분리된 멜리틴의 크로마토그램이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 분리된 멜리틴의 함량을 계산하기 위한 (A) 대조 멜리틴의 표준곡선 및 (B) 상기 분리된 멜리틴의 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명의 실험예 1에 따른 전기영동 테스트의 결과 사진이다(Marker 마커; DW 증류수; PBV 정제봉독; M 분리 멜리틴; 및 STD^M 대조 멜리틴).
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따른 분리 멜리틴 및 대조 멜리틴의 HPLC 크로마토그램이다.
도 6은 정제봉독과 본 발명의 분리 방법에 의해 분리된 멜리틴의 항염증효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 (A) 정제봉독과 (B) 본 발명의 분리 방법에 의해 분리된 멜리틴의 항균효과를 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 수상:유기용매상이 90:10 ~ 50:50(v/v) 비율인 이동상이 흐르는, 고정상을 포함하는 컬럼에 정제봉독(Purified Bee Venom, PBV) 수용액을 주입하여 흡착시키는 흡착 단계(S100); 상기 흡착 단계의 이동상을 유지하여 상기 컬럼으로부터 멜리틴(melittin) 이외의 성분을 용리하는 제1 용리 단계(S200); 수상:유기용매상이 50:50 ~ 30:70(v/v)이 되도록 이동상의 비율을 변화시키는 제1 농도구배 단계(S300); 및 상기 제1 농도구배 단계(S300)의 최종 비율의 이동상을 유지하여 멜리틴을 용리하는 제2 용리 단계(S400)를 포함하는, 정제봉독으로부터 멜리틴을 고 순도로 분리하는 멜리틴의 분리 방법을 제공한다.

상기 수상은 TFA(trifluoroacetic acid), 포름산(formic acid) 및 아세트산(acetic acid) 중에서 선택되는 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 컬럼 내부를 최적의 pH범위로 조정함으로써 효율적인 분리 공정을 수행할 수 있기 때문이다.

상기 유기용매상은 에탄올일 수 있다. 대체용매로 메탄올을 이용할 수 있으나 용매의 안전성을 고려할 때 에탄올을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 고정상은 C4 수지일 수 있다.

상기 방법은 상기 제2 용리 단계(S400) 이후 수상:유기용매상이 90:10 ~ 50:50(v/v)이 되도록 이동상의 비율을 변화시키는 제2 농도구배 단계(S500)를 더 포함할 수 있다.

상기 흡착 단계(S100)에서 주입시키는 정제봉독의 농도는 50 ~ 200 mg/ml인 것이 바람직하며, 50 mg/ml인 것이 분리된 멜리틴의 순도에 있어서 더욱 바람직하다.

상기 제1 용리 단계(S200)는 멜리틴보다 극성이 강한 성분들을 멜리틴보다 먼저 용리시키는 단계이다. 수상:유기용매상은 50:50(v/v)인 것이 바람직하다.

상기 제1 농도구배 단계(S300)는 이동상의 비율을 90:10 ~ 50:50(v/v)에서 50:50 ~ 30:70(v/v)이 되도록 점진적으로 변화시키는 단계이다.

상기 제2 용리 단계(S400)는 멜리틴 이외의 성분들을 분리한 후 남아있는 멜리틴을 용리시키는 단계이다. 수상:유기용매상은 30:70(v/v)인 것이 바람직하다.

상기 제2 농도구배 단계(S500)는 이동상의 비율을 50:50 ~ 30:70(v/v)에서 90:10 ~ 50:50(v/v)이 되도록 점진적으로 변화시키는 단계이다.

정제봉독의 성분을 C4 수지 컬럼에서 용리하는 이동상 조건(수상:유기용매상)은 다양한 비율로 설정할 수 있다. 수상의 비율이 50:50(v/v)보다 높은 이동상으로 용리할 경우 멜리틴의 분리효과가 우수하다. 단 용리에 걸리는 시간이 많이 지연될 수 있고 컬럼의 압력이 증가할 수 있다. 따라서 효율이 낮으며 안정성도 떨어진다. 반면 수상의 비율이 30:70(v/v)보다 낮은 이동상으로 용리할 경우 용리에 소요되는 시간은 단축되지만 분리효과는 우수하지 않다. 또한 고농도의 에탄올 조건에서는 봉독의 성분이 침전될 수 있다. 이는 최종 수득되는 멜리틴의 순도에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 대량의 시료를 분리하는 경우에 적용하기에도 적합하지 않다. 용리에 이용되는 이동상의 비율(물:에탄올)을 제1 용리 단계(S200)에서 50:50(v/v)로 설정하고 제2 용리 단계(S300)에서 30:70(v/v)로 설정하는 것은 우수한 분리효과, 재사용에 있어서의 안정성 및 수득되는 멜리틴의 순도에 있어서 바람직하다.

상기 방법에 따라 용리된 멜리틴 회수액 중 에탄올 층은 분리하여 공정에 재사용할 수 있다. 또한 제2 농도구배 단계(S500) 이후 이동상의 비율을 유지하는 안정화 단계를 더 포함하여 공정의 진행 사이클을 완성함으로써, 본 발명의 방법에 따라 정제봉독으로부터 멜리틴을 분리하는 자동 반복 공정을 수행할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. C4 수지 컬럼을 이용한 멜리틴의 분리

정제봉독[멜리틴 함량 64 %, (주)청진바이오텍]을 증류수에 용해시켜 50, 100 및 200 mg/mL 농도의 정제봉독 수용액을 준비하였다. Prep HPLC(Preparative High-performance liquid chromatography)에 C4 수지[YMC-Pack C4-HG(S-10 ㎛ / 12 nm / 50 X 20 mm I.D.)] 컬럼을 연결하고 물[0.2 % TFA(Trifluoroacetic acid)를 포함]:에탄올이 50:50(v/v)인 이동상으로 안정화시켰다. 안정화된 컬럼에 정제봉독 수용액을 자동주입하여 흡착(S100)시킨 후, 이동상의 비율(물:에탄올)을 0 ~ 10분 구간에서 50:50(v/v)(S200)로 유지하고, 11 ~ 12분 구간에서 30:70(v/v)(S300)로 변화, 13 ~ 30분 구간에서 그대로 유지하고(S400), 30 ~ 31분 구간에서 50:50(v/v)(S500)로 변화되도록 설정하고 유속은 6 mL/min으로 하여 용리 과정을 수행하였다(도 1). 용리 과정 중 멜리틴은 21 ~ 23분 구간에서 용리되었다. 용리 과정에 소요되는 시간은 시료의 농도, 칼럼의 규격, 상태, 용액의 유속, 온도 등 여러 조건에 따라 차이가 있기 때문에 이에 제한되지 않는다.

상기와 같이 C4 수지 컬럼에 흡착된 봉독의 성분으로부터 분리된 멜리틴을 포함하는 이동상 회수액을 분리하여 하기와 같이 저온 농축하였다. 진공회전농축기를 이용하여 멜리틴 회수액에서 에탄올을 회수한 뒤 남아 있는 증류수 층을 동결건조하여 멜리틴 분말을 수득하였다. 상기 과정에 따라 농도가 100 및 200 mg/ml인 정제봉독 수용액으로부터 분리한 멜리틴을 크로마토그램에서 확인할 수 있었다(도 2).

실시예 2. 멜리틴의 회수율 확인

대조 멜리틴(멜리틴 92 %, Sigma)을 3, 4 및 5 ㎕씩 각각 주입하여 주입량과 피크(peak)면적 대비 표준곡선을 준비하였다(도 3A). 실시예 1에 따라 50, 100 및 200 mg/mL의 정제봉독 수용액으로부터 수득된 각각의 멜리틴 회수액의 부피를 측정하였다. 이후 각 농도별 멜리틴 회수액을 5 ㎕씩 UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography)에 주입하고 얻어진 멜리틴의 피크면적을 기록하였다(도 3B). 상기 표준곡선에 근거하여 각 농도별 멜리틴 회수액에 포함된 멜리틴 함량을 계산하였다.

멜리틴의 회수율은 하기 수학식 1(a 멜리틴 회수액의 피크면적; v 멜리틴 회수액의 총 부피; A 표준 멜리틴의 피크면적; C 표준 멜리틴의 농도; P 표준 멜리틴의 순도 및 p 정제봉독 수용액의 멜리틴 함량)로 계산하여 하기 표 1에 기재하였다.

정제봉독의 주입농도	회수액 분석피크의 면적	멜리틴의 회수율
50 mg/mL	5,140,165	88.5 %
100 mg/mL	7,856,378	67.6 %
200 mg/mL	14,940,965	64.3 %

분리에 이용되는 시료의 농도가 높아질수록 멜리틴의 회수율은 낮아지는 것으로 확인되었다(표 1). 또한 정제봉독 수용액의 주입 농도에 따라 멜리틴을 나타내는 크로마토그램의 피크 모양이 달라지는 것을 확인하였다(도 3B).

실험예 1. 전기영동을 이용한 멜리틴의 순도 측정

증류수 700 ㎕, 30 % 아크릴아미드 믹스(acrylamide mix) 6.6 ㎖, 1.5 M Tris-HCl[tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl, pH 8.8] 2.5 ㎖, 10 % SDS(sodium dodecyl sulfate) 100 ㎕, 10 % 암모늄 퍼설페이트(ammonium persulfate) 100 ㎕, TEMED(tetramethylethylenediamine) 4 ㎕를 포함하는 20 %의 겔 조성을 준비하였다.

상기 20 %의 겔 조성물을 유리 플레이트에 약 10 ㎖ 분주하고 평형을 맞춰 분리용 겔(separating gel)을 응고시켰다. 그 뒤, 증류수 3.4 ㎖, 30 % 아크릴아미드 믹스 830 ㎕, 1.5 M Tris-HCl(pH 8.8) 630 ㎕, 10 % SDS 50 ㎕, 10 % 암모늄 퍼설페이트 50 ㎕, TEMED 5 ㎕을 포함하는 축적용 겔(staking gel) 조성물 5 ㎖을 분주한 후, 겔이 굳기 전에 콤(comb)을 끼워 응고시켰다. 축적용 겔이 응고된 다음, 콤을 제거하여 SDS PAGE 겔을 완성시켰다.

SDS PAGE로 확인하고자 하는 분획물과 샘플 버퍼(2X Laemmli, Sigma, S3401)를 1:1 비율로 혼합하고, 90 ℃의 수조(water bath)에서 5분 동안 중탕시켰다. 그리고 겔의 콤 홈에 마커 5 ㎕, 정제봉독 30 ㎕, 실시예 1에 따라 분리된 멜리틴 회수액 30 ㎕ 및 대조 멜리틴(Standard melittin, STD^M) 30 ㎕를 로딩하고, 겔을 SDS PAGE 탱크에 끼워서 완충 용액(running buffer, 25 mM Tris, 192 mM 글리신[glycine], 0.1 % SDS, pH 8.3)을 채웠다.

축적용 겔에서 60 V로 30분 동안, 분리용 겔에서 120 V로 60 ~ 90분 동안 전기영동을 수행하였다. 시료의 성분은 겔에 흘려주는 전류에 의해 분자량에 따라 분리되었고, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250(coomassie brilliant blue R-250, BIO-RAD)으로 염색 후 탈색 용액(destaining solution, BIO-RAD)으로 처리하였다(도 4).

실시예 1에 따라 분리된 멜리틴 회수액은 SDS PAGE 결과에서 선명하고 깨끗한 밴드로서 확인되었으며, 정제봉독 샘플에서 나타나는 포스포리파아제 A2 및 아파민을 포함하는 명확하지 않은 밴드들이 상기 멜리틴 회수액에서는 전혀 나타나지 않았다.

실험예 2. HPLC 정량분석

실시예 1에 따라 분리된 멜리틴 및 멜리틴 함량이 92 %인 대조 멜리틴을 각각 1.0 ㎎/㎖의 농도로 준비하여, HPLC(High-performance liquid chromatography) 장치와 펩티드 분석 전용 컬럼(150 X 4.6 mm, 4.0 μm, 90 Å, phenomenex^®)을 통해 증류수(0.2 % TFA 포함)와 아세토나이트릴(0.22 % TFA 포함)을 용매로 하여 각각 정량 분석한 후 하기 표 2로 나타내었다(도 5).

대조 멜리틴에 대한 HPLC 정량분석 결과에 의하면, 아파민과 멜리틴의 피크가 각각 10.4분 경과 지점과 21.4분 경과 지점에서 나타나고, PLA2의 피크가 16.4분 경과 지점에서 나타남을 확인할 수 있었다. 상기 결과에 따른 피크의 면적을 이용하면 하기 수학식 2에 근거하여 멜리틴의 함량을 계산할 수 있다.

실시예 1에 따른 멜리틴의 분석 결과를 상기 수학식 2에 대입하여 계산한 결과 멜리틴의 순도 값이 98.2 %로 도출되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 멜리틴의 항염증효과 확인

실시예 1에 따라 분리된 멜리틴의 항염증효과를 엘라스테이즈 억제 효과(Elastase inhibitory effect)로 조사하였다. RAW 264.7세포를 10 % FBS 및 페니실린(penicillin) 100 μg/ml, 스트렙토마이신(streptomycin) 100 U/ml이 포함된 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, Co., USA)에서 37 ℃, 5 % CO₂조건을 유지하여 배양하였다. 2시간 전에 염증반응 유도물질인 LPS(Lipo Poly Saccharide) 1 ug/ml를 먼저 처리한 RAW 264.7 세포에 정제봉독 및 상기 멜리틴의 농도(0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 3 ug/ml)를 달리하여 각각 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그리스 시약 키트(Griess reagent kit)를 이용하여 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양을 세포 배양액 중에 존재하는 NO^2-의 형태로서 측정하였다. 구체적으로, 그리스 시약을 혼합하여 상기 세포의 배양액과 96 웰 플레이트(well plate)에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 6).

이에 따른 결과로서, 실시예 1에 따라 분리된 멜리틴이 항염증효과에 있어서 정제봉독보다 우수한 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

실험예 4. 멜리틴의 항균효과 확인

실시예 1에 따라 분리된 멜리틴의 항균효과를 검증하기 위하여 한국미생물보존센터로부터 지시균 6종을 분양받아 실험에 이용하였다. 또한 상기 멜리틴의 우수성을 검증하기 위하여 정제봉독을 대조군으로 이용하였다. 실험에 사용한 지시균은 그람양성균인 Staphylococcus Aureus, Staphylococcus Epidermidis, Streptococus Mutant, Pseudomonas Aeruginosa, Escherichia Coli 및 Salmonella Typhimurium이며 실험 전 배지에 각각 이식하여 24시간 동안 배양함으로써 상기 지시균들을 활성화하였다.

지시균이 접종된 한천(agar)배지를 제조하여 페트리 디쉬(Petri dish)에 분주한 후 2 ~ 3시간 동안 건조시킨다. 정제봉독 및 상기 멜리틴에 해당하는 시료를 증류수에 용해시켜 농도별(0.25, 0.5, 1, 2.5, 5 mg/ml)로 준비한 후, 0.2 ㎛ 시린지 필터(syringe filter)를 이용하여 여과멸균을 수행하였다. 건조된 배지에 코르크 보어러(Cork-Borer)를 이용하여 구멍을 뚫은 후, 상기 구멍에 각 농도별 조건에 해당하는 시료를 90 uL씩 분주하였다. 각 배지를 37 ℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후, 자를 이용하여 배지의 구멍을 중심으로 생성된 환의 지름을 측정하였다(도 7).

실시예 1에 따라 분리된 멜리틴은 항균활성을 유지할 뿐만 아니라 표 3에 나타난 바와 같이 그 항균효과가 기존의 정제봉독에 비해 우수한 것을 확인할 수 있었다.

Claims (4)

1. 수상:유기용매상이 90:10 ~ 50:50(v/v) 비율인 이동상이 흐르는, 고정상을 포함하는 컬럼에 정제봉독(Purified Bee Venom, PBV) 수용액을 주입하여 흡착시키는 흡착 단계;
   상기 흡착 단계의 이동상을 유지하여 상기 컬럼으로부터 멜리틴(melittin) 이외의 성분을 용리하는 제1 용리 단계;
   수상:유기용매상이 50:50 ~ 30:70(v/v)이 되도록 이동상의 비율을 변화시키는 제1 농도구배 단계; 및
   상기 제1 농도구배 단계의 최종 비율의 이동상을 유지하여 멜리틴을 용리하는 제2 용리 단계
   를 포함하는, 정제봉독으로부터 멜리틴을 고 순도로 분리하는 멜리틴의 분리 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 유기용매상이 에탄올인 것을 특징으로 하는 분리 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 고정상이 C4 수지인 것을 특징으로 하는 분리 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 방법이 제2 용리 단계 이후 수상:유기용매상이 90:10 ~ 50:50(v/v)이 되도록 이동상의 비율을 변화시키는 제2 농도구배 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.

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