JP5728774B2 - 生物学的に活性な藻類毒素の工業的精製法 - Google Patents

Description

本発明は麻痺性藻類毒素を産生するシアノバクテリアから、制御条件下で連続的に、麻痺性藻類毒素であるネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシン（gonyaulatoxins）（ゴニャウラトキシン２およびゴニャウラトキシン３）を大量に工業的に生産すること、取り分け当該藻類毒素の精製に関する。本発明の主要な目的は、最終産物に至るまでその強力な生物活性を保持する実質的に純粋な化合物を得ることにあり、該化合物は新しい医薬の開発のための原料物質として使用される。

これらの藻類毒素類は化粧品または医薬品、例えば、皺および表情線に対処する化粧品に、または局所麻酔薬、筋肉機能亢進と関連する病状を制御する医薬、局所および末梢レベルの疼痛を制御する医薬、すなわち生活の質向上のための製品などの臨床応用医薬品に適用することができる。

藻類毒素であるネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンは、アレキサンドリウム・エスピー（Alexandrium sp.）、ピリジニウム・エスピー（Piridinium sp.）、およびギムノジニウム・エスピー（Gimnodinium sp.）（非特許文献１)などの属の有害な藻類の花が産生する活性化合物である。過去１５年に、これらの藻類毒素は海洋性双鞭毛藻類により産生される外に、光合成藍藻類のような淡水性シアノバクテリアによっても産生されることが証明されている。

これまでに、麻痺性藻類毒素を産生し得るシアノバクテリアは４つの属のみが同定されており、それぞれが産生する藻類毒素の量とタイプの両方において異なる藻類毒素混合物を産生する。すなわち、シアノバクテリアは異なるプロフィールの藻類毒素を産生する。（非特許文献２; 非特許文献３）。

これら麻痺性藻類毒素の活性本体は、興奮性細胞に存在する電位依存性ナトリウムチャンネルの特異的ブロッカーとして作用する（非特許文献４）。ナトリウムチャンネルの阻害により、神経インパルスの伝達が遮断され、この方式で神経伝達物質の放出が運動ニューロン接合部のレベルで防止され、それが筋肉の収縮を防止する。これらの生理的作用により、これらの化合物は、筋肉痙攣および限局性筋失調症などの筋肉機能亢進と関連する病態に、注射剤として局所投与して、筋肉活性インヒビターとして使用した場合、薬理学的に非常に有用である。さらに、伝達レベルでの神経インパルスの遮断が、それらの化合物を局所浸透させて投与したときに生じるので、それらは遠心性神経伝達経路を遮断し得るのみならず、求心性経路をも遮断し得る。そしてこの様式で、これらは知覚経路の阻害を惹き起こし、また麻酔作用を生じる。これら２つの作用は、これらの化合物を局所注射した場合には、分離することができない。このことは両方の作用が同時性であるということであり、驚くべき作用である（特許文献１）。

藻類毒素ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンは、治療および化粧料を目標とする巨大な潜在的応用性があるにも関わらず、現時点では大量生産品として、現時点で商業的に利用することができない。大量の使用と最近開発された臨床的および化粧品利用に関連してそれらの増大する要求を満足させるためには、これらの化合物の工業的生産手法が必要とされることは明らかである。

本明細書にて提示される発明は、シアノバクテリア菌株（藍藻類）から、制御条件下において細胞を大量に連続的に培養する革新的な方法から出発して、麻痺性藻類毒素ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンを抽出、分画および精製することを目的とする。重要な目的は、この活性本体の強力な生物活性を工業的精製方法のすべての過程で保持することである。

麻痺性藻類毒素を産生し得るシアノバクテリアは、シリンドロスペルモプシス・エスピー（Cylindrospermopsis sp.）、ミクロシスティス・エスピー（Microcystis sp.）、アナバエナ・エスピー（Anabaena sp.）、ゴンフォスフェリア・エスピー（Gomphosphaeria sp.）、オシラトリア・エスピー（Oscillatoria sp.）、アファニゾメノン・エスピー（Aphanizomenon sp.）（アファニゾメノン・イッサトチェンコイ（Aphanizomenon issatchenkoi）、アファニゾメノン・フロス−アクア（Aphanizomenon flos-aquae）、アファニゾメノン・グラシル（Aphanizomenon gracile））、リングビヤ・ウォレイ（Lyngbya wollei）その他の属に属する。これらのシアノバクテリアは、いずれもこれまでに工業的レベルでの藻類毒素産生に使用されたことがない。

シアノバクテリアからの藻類毒素の工業的生産では、相互に関係するが互いに異なる２つの技術上の問題を解決しなければならない。その一つは、大量の藻類毒素産生バイオマスを生成させねばならないことである。この技術的問題は特許文献２（本発明の著者らが提出）において保護された発明により解決されている。二番目は、このバイオマスと藻類毒素が産生されたところで、これらの化合物を、活性化合物の薬理活性を維持し、その強力な生物活性を保存し、収量を大量に生み出すために適切な条件下で精製しなければならないことである。この第二の技術的問題を本発明が解決する。

提案される方法は、単純なプロフィールの麻痺性藻類毒素（１種もしくは２種の藻類毒素からなるか、または総プロフィール組成の７５％以上に相当する１種の藻類毒素のプロフィールを有する）を産生するシアノバクテリアのクローン培養物、例えば、主成分としてネオサキシトキシンおよびサキシトキシンまたはゴニャウラトキシン２／３のみを産生する菌株から藻類毒素を精製することである。薬理学的に活性な本体を７５％以上の収率で取得することは驚くべき効果であり、この効果を本発明の工業的手法にて達成する。

これらの藻類毒素の化学構造は一般式（Ｉ）を有し、その具体的構造は以下の表による置換基Ｒ１〜Ｒ５により定義される：

これらのアルカロイド類がシアノバクテリアによって産生されるということが判明したのは極最近である。それらが細胞内で見出される二次的代謝産物であり、それらが特定の条件下で培地に放出されることが証明されたのは、ほんの過去１５年のことである。従って、連続的シアノバクテリアの培養においては、これらの化合物の２つの起源がある；１つは細胞ペレットであり、２つ目はシアノバクテリアを培養する培地である。

これらの藻類毒素の工業的生産と、それに続く精製のためには、特許文献２に記載されているように、これらシアノバクテリアの大量培養物が絶対的に必要とされる。特許文献２に記載された方法の以前には、藻類毒素を得るための大容量の工業的方法の開発は達成されていなかった。一方で藻類毒素は、分析用標準（化学分析における参照化合物として使用される標準）として使用するために数マイクログラムのこれらの毒素を得る目的で、赤潮で汚染された貝類から、基礎研究所にて精製された。

今日まで、汚染された貝類から、または双鞭毛藻類から工業的レベルでこれらの藻類毒素の精製方法について記載している出版物はない；この場合、工業的レベルとは代謝産物または藻類毒素の生産についてグラムの規模であると見做される。また、シアノバクテリアからの藻類毒素の単離についても出版物はなく、このことは、これらの藻類毒素を産生し得るシアノバクテリアについては、つい最近文献に記載されたばかりであるということを考慮しても、予期できる（Lagos, 2003）。

米国特許第４，００１，４１３号 チリ国特許出願公開第７２２−２００９号明細書

Lagos, N. (1998) Microalgal blooms: A global issue with negative impact in Chile (微小藻類開花：チリにおける有害な衝撃的世界的問題) . Biol. Res. 31: 375-386 Lagos, N., Onodera, H., Zagatto, P.A., Andrinolo, D., Azevedo, S.M.F.Q., and Oshima, Y., 1999, The first evidence of paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, isolated from Brazil （ブラジルにて分離された淡水性シアノバクテリア、シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ中の麻痺性貝類毒素の最初の証明）. TOXICON, 37: 1359-1373 Pereira, P., Onodera, H., Andrinolo, D., Franca, S., Araujo, F., Lagos, N., and Oshima, Y., 2000, Paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacteria Aphanizomenon flos-aquae, isolated from Montargil reservoir, Portugal （ポルトガル、モンタルギル貯水池から分離された淡水性シアノバクテリア、アファニゾメノン・フロス−アクアの麻痺性貝類毒素）. TOXICON, 38: 1689-1702 Kao, C.Y., 1966, Tetrodotoxin, saxitoxin and their significance in the study of excitation phenomenon (興奮現象の研究におけるテトロドトキシン、サキシトキシンおよびそれらの有意性). Pharm. Rev. 18: 997-1049

本発明の主たる目的は、高い付加価値と商業的価値を有し、工業的生産レベルでは商業的に入手し得ないシアノバクテリアが産生する生物学的に活性な藻類毒素、化合物および二次代謝産物の工業的抽出、精製および生産である。本発明についての驚くべき事実は、工業的工程のすべてを通じてこれらの生物活性化合物を得ることが出来ることであり、その工程はそれ自体ユニークな驚くべき生物工学的方法である。

本発明の具体的な目的は、制御条件下において連続培養で生産される実質的に無制限レベルのシアノバクテリアから、藻類毒素のネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンを生物学的に活性な形状で大量に生産する工業的な大規模高収率精製方法である。

本発明のもう一つの具体的な目的は、湿潤および／または凍結シアノバクテリアペレットから藻類毒素を精製する手法であって、その精製工程において藻類毒素に伴う色素と他の主要な二次的代謝産物を除去する手法を完成することである。

本発明の第三の具体的な目的は、シアノバクテリアが増殖する培地中に放出された藻類毒素をその培地から精製する手法を完成することである。重要な目的は、明らかとなった生物活性を有する活性本体の生物工学的精製である。

本明細書は、藻類毒素ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンを生物学的に活性な形状で、これらの藻類毒素を産生し得るシアノバクテリアの培養物から精製し、工業的に生産することに関する。
本発明にて使用するシアノバクテリアは、シリンドロスペルモプシス・エスピー（Cylindrospermopsis sp.）、ミクロシスティス・エスピー（Microcystis sp.）、アナバエナ・エスピー（Anabaena sp.）、ゴンフォスフェリア・エスピー（Gomphosphaeria sp.）、オシラトリア・エスピー（Oscillatoria sp.）、アファニゾメノン・エスピー（Aphanizomenon sp.）（アファニゾメノン・イッサトチェンコイ（Aphanizomenon issatchenkoi）、アファニゾメノン・フロス−アクア（Aphanizomenon flos-aquae）、アファニゾメノン・グラシル（Aphanizomenon gracile））の属に属する。

シアノバクテリアは、本件出願と同じ出願人が同時に提出したチリ国特許出願第７２２−２００９号明細書に記載されたものと同様に、制御条件下で連続大量半自動培養により選択的に得られる。

連続培養におけるシアノバクテリアからの藻類毒素ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンの工業的精製は、培養細胞ペレットから、または培養上清からの抽出、分画、溶媒分配、固相上での分配、およびこれら藻類毒素類（ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシン）の液体−固体界面での分配を含む方法を用いて実施する。この精製法は全精製工程を通してその最終産物までその生物活性を維持する工業的量の活性本体を生産する連続的一連の半自動的方法である。この方法はそれぞれの分画段階からなる化学的生化学的方法であり、その段階では分画遠心、水性溶媒および有機溶媒による抽出、疎水性溶媒相での分配、固相上での分配、カラム精製および数種の分取用高速クロマトグラフィー（カチオン交換、アニオン交換およびサイズ排除）を用い、単一の藻類毒素プロフィールをもつフラクションに相当する、色素不含有の部分精製抽出物およびこれらフラクションからの純粋な藻類毒素を得る（図１〜８）。これらの段階はすべてユニークな生物工学的方法であり、チリ国においてのみ開発されてきた工業的方法の一部である。

本特許出願においては、ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシン２／３の精製と工業的生産方法が提示されるが、本方法ではこれら藻類毒素の連続的工業的製造を制御条件下に最適化する分離クローン化シアノバクテリアから出発して革新的な生物工学的方法を使用する一方、新しい医薬品の開発に有用な工業的活性本体を産生する工業的工程のすべてを通して、それらの強力な生物活性が維持される。

生産に関する提案の統合および本発明に使用される技術では、新規大量の薬理学的使用と新規医薬品の開発に必要な量または化粧品への適用の活性本体を産生するシアノバクテリアの以前に記載された生産規模が考察される。

シアノバクテリアから制御条件下でこれらの藻類毒素を大量に生産する本発明の利点は以下のとおりである：
・特異な組成と単純な毒素プロフィールをもつ藻類毒素を産生し得る選択されたシアノバクテリア菌株からのクローンの利用可能性。
・藻類毒素に対する容易な高収率精製工程。
・今日まで達成されたことのない非常に好都合なコスト−生産−収率関連性。

藻類毒素ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシン大量生産の適用分野
これらのアルカロイドの適用分野は、筋肉痙攣および限局性筋失調症などの筋肉機能亢進と関連する病態における治療薬としての臨床応用分野を含む。さらにそれらは異なる広範囲のスペクトルの医薬製剤における局所麻酔剤として使用でき、そのことが多様な病態の処置のために非常に有用な製品としてこれらの藻類毒素を位置づけることができ、その多くに大きな市場の需要がある。他方、それらは皺および表情線に対する化粧用製品にも適用可能であり、その適用については明らかに市場の需要がある。しかし、これらの藻類毒素は、現在必要とされるレベルの工業的な量を市場にて入手することはできない。従って、本発明のネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンの精製、分画および生産方法は、これまで未解決のままであった生物工学上の問題を解決するものである。本明細書にて提案される改革は、国内市場および国際市場でのこれらの純粋な藻類毒素の活性本体に対する大きな需要を、治療上と化粧料としての使用および人々の生活の質を向上させる他の製品についても大きな規模で満足させることができる。

これらの藻類毒素は医薬と化粧品工業に適用し得る非常に好ましい物理化学的性質を有する。それらの物理化学的性質は以下のとおりである：それらは水溶性で、室温で安定であり、酸性媒体と高温（１００℃以上）に強く耐性を示し、極めて低分子量（２９８〜４４５ｇ／モル）であって、そのことがより容易な危険性の少ない、疼痛のない利用を可能とし、高分子量のボツリヌス毒素タンパク質［ボトックス（Botox）；登録商標］などの他のタンパク質と違って、アレルギー性または免疫性の反応はない。

藻類毒素の低分子量と高い化学的安定性などの物理化学的性質の故に、クリーム、ゲルなど、また超音波、赤外線および他の装置による経皮投与、制御放出型パッチ（連続的徐放性の皮膚接着性パッチ）での使用など、多くの製品と医薬製剤のための適用と生物工学的展開を案出することが可能である。これらの適用はすべてこれらの化合物のすぐれた安定性と他の化合物と共有結合により化学反応し得るさらなる可能性により可能となる。

これらの利点により、ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンは、皮膚化粧料用途に広く使用されている化合物、ボツリヌス毒よりもすぐれた代替品となる；ボツリヌス毒は不安定であり、高分子量を有し、アレルギー性免疫反応を惹き起こし、構造的損傷を生じ（神経末端と周辺の末端を消化して、不所望の有害作用を惹き起こす；このことは現在世界的に大問題となっている）、また短時間で自己消化してしまうという欠点を有するプロテアーゼである。

藻類毒素ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンについて最近公開された臨床的応用は、大量に必要とする応用分野へも市場を開きつつある；それは化粧品の分野であり、腰痛、偏頭痛、肛門裂傷、腹腔鏡外科手術における疼痛コントロールおよび全身神経障害性疼痛のコントロールのためであり、何百万人もの潜在的患者が存在し得て、これらの化合物については計算し得ない未来の要請がある。

表２に藻類毒素ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンの利点を、例えば、ボツリヌス毒（ボトックス；登録商標）と比較して示す；このものは臨床治療と化粧料において藻類毒素と同様の生理的反応を生じ、従って、同様に利用することができるが、藻類毒素の分子作用メカニズムとボツリヌス毒のメカニズムとは全く異なるものである。

ボトックス（登録商標）の使用者が、無痛、低価格および即効投与であることから、強力な藻類毒素由来製品（ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンを含む）の使用に変更するのは比較的容易であり、藻類毒素の方がボトックス（登録商標）に対して競合的に有利である。

分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置に注入したシアノバクテリアであるアファニゾメノン・グラシルの抽出液１０マイクロリットルのクロマトグラムを示す。使用した検出法は蛍光オンライン検出であった。ピーク１、ＲＴ＝２．６４０分、シアノバクテリア色素；ピーク２、ＲＴ＝７．９８０分、ネオサキシトキシン；ピーク３、ＲＴ＝１１．９７０分、サキシトキシン。 分取用サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（分子サイズにより分離）により精製したアファニゾメノン・グラシルからの精製抽出液１０マイクロリットルのクロマトグラムである。使用した検出法は蛍光オンライン検出であった。ピーク１、ＲＴ＝３．０６７分、シアノバクテリア色素；ピーク２、ＲＴ＝９．３７３分、ネオサキシトキシン；ピーク３、ＲＴ＝１２．９５３分、サキシトキシン。 オンライン蛍光検出器付き分析用高速液体クロマトグラフィーにより測定定量した、主要成分としてのネオサキシトキシンとサキシトキシンを含み、少量のゴニャウラトキシン混合物を含有する分析用標準品（ＮＬ２標準品）のクロマトグラムである。ピーク１、ＲＴ＝３．６５３分、ゴニャウラトキシン混合物；ピーク２、ＲＴ＝５．０４０分、ネオサキシトキシン；ピーク３、ＲＴ＝７．４４０分、サキシトキシン。 シアノバクテリアであるアファニゾメノン・グラシルの抽出液（ＲＴ＝４．９３３分）。から精製したネオサキシトキシン試料のクロマトグラムであるこれはオンライン蛍光検出器付きイオン交換カラムを用いる分取用高速液体クロマトグラフィーから溶出されるフラクションに相当する。 ゴニャウラトキシンの分析用標準品のクロマトグラムを示す。左から右へ：ピーク１：ＧＴＸ４（ゴニャウラトキシン４）；ピーク２：ＧＴＸ１（ゴニャウラトキシン１）；ピーク３：ＧＴＸ５（ゴニャウラトキシン５）；ピーク４：ＧＴＸ３（ゴニャウラトキシン３）；ピーク５：ＧＴＸ２（ゴニャウラトキシン２）。 シアノバクテリアであるC．ラシボルスキイからの抽出液である試料のクロマトグラムを示す。ピーク１：ＲＴ＝８．８７３分；ピーク２：ＲＴ＝１０．９２７分；ピーク３：ＲＴ＝１３．２６０分；ピーク４：ＲＴ＝１６．６４７分。 サイズ排除高速液体クロマトグラフィーにより部分的に精製したＣ．ラシボルスキイからのフラクションのクロマトグラムであり、最も優先してエピマーのＧＴＸ３およびＧＴＸ２の存在をそれぞれ示す。 シアノバクテリアであるＣ．ラシボルスキイの連続培養物から得られるエピマーＧＴＸ３およびＧＴＸ２の最終精製フラクションのクロマトグラムを示す。 サイズ排除分取用クロマトグラフィーの溶出プロットを示し、得られたフラクションを示すと共に、異なる当該化合物が存在する（有機化合物、藻類毒素および塩類）フラクションの範囲を確認する。 アニオン交換分取用クロマトグラフィーの溶出プロットを示し、得られたフラクションを示すと共に、異なる当該化合物が存在する（藻類毒素および塩類）フラクションの範囲を確認する。 カチオン交換分取用クロマトグラフィーの溶出プロットを示し、得られたフラクションを示すと共に、異なる当該化合物が存在する（藻類毒素および塩類）フラクションの範囲を確認する。 サイズ排除分取用クロマトグラフィーの溶出プロットを示し、得られたフラクションを示すと共に、異なる精製藻類毒素が存在する（サキシトキシンおよびネオサキシトキシン）フラクションの範囲を確認する。

本発明は藻類毒素ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンの工業的生産のための精製方法であって、これらの藻類毒素を産生し得るシアノバクテリアから、工業的精製工程の全工程を通してその生物学的活性を維持しながら精製する。

本発明にて使用するシアノバクテリア属は、シリンドロスペルモプシス・エスピー(Cylindrospermopsis sp.)、ミクロシスティス・エスピー(Microcystis sp.)、アナバエナ・エスピー(Anabaena sp.)、ゴンフォスフェリア・エスピー(Gomphosphaeriia sp.)、オシラトリア・エスピー(Oscillatoria sp.)、アファニゾメノン・エスピー(Aphanizomenon sp.)［アファニゾメノン・イッサトチェンコイ、アファニゾメノン・フロス−アクア、アファニゾメノン・グラシル(Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile)］に属する。

出発原料はシアノバクテリア種の単藻培養物である；単藻培養はこれらの精製藻類毒素を高収率で得るために不可欠である。これは出発原料において大量の藻類毒素を得るために工業的レベルまで増殖し拡大する工程の一部である。

シアノバクテリアは、本件出願と同じ出願人が同時に提出したチリ国特許出願第７２２−２００９号明細書に記載された、シアノバクテリアの永続的対数増殖を持続させる制御条件下の連続大量半自動培養の方法と手法の開発を通して得られる。

これらシアノバクテリア種の培養工程の間に、藻類毒素類は細胞内部に蓄積されるが、培地にも放出されるので、２つの異なる藻類毒素源が構成される。
例えば、アファニゾメノン・グラシルの培養の場合、シアノバクテリア細胞から放出される主要成分はネオサキシトキシンである（図２および４）。

それ故、工業的シアノバクテリア培養物から藻類毒素を入手するために２種の可能な起源が存在する：
−シアノバクテリア増殖培地の濾過上清（細胞もフィラメントも含まない）から；
−シアノバクテリア細胞およびフィラメントを含んでなる成長培地の遠心分離によって得られる湿潤ペレットから。

標的藻類毒素の生産は、それぞれの場合で培養される生産株シアノバクテリアにもよるが、上記シアノバクテリアのいずれについても上清から、または得られたペレットから得ることができる。

シアノバクテリアの連続培養物からの藻類毒素ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンの工業的生産は、培養細胞（ペレット）から、または培養上清からの抽出、分画化、溶媒分配、固相上での分配、およびこれら藻類毒素類（ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシン）の液相−固相の分配からなる方法を用いて実施する。この工程は数種の分画段階からなる化学的生化学的工程を含み、その段階では分画遠心、水性溶媒および有機溶媒による抽出、疎水性溶媒相での分配、固相上での分配、カラム精製および数種の分取用高速クロマトグラフィー（カチオン交換、アニオン交換およびサイズ排除）を用い、単一の藻類毒素プロフィールをもつ画分に相当する、色素不含有の部分精製抽出物およびこれらフラクションからの純粋な藻類毒素を得る（図１〜８）。この基本的な方法は、新規の医薬製品の開発のための基礎として使用されるような方法で、その生物活性の効力のすべてを維持する安定な活性本体を得ることを目的とする。

単純化した方法において、本発明の藻類毒素の精製方法は以下の工程を含む：
ａ．シアノバクテリア培養物のペレットおよび／または上清を取得すること；
ｂ．その起源がペレットである場合、細胞溶解の簡便な手段を用いてシアノバクテリアを溶解すること；
ｃ．水相中、有機溶媒の混合物を用いて低温抽出を行うこと；そして前工程の水相と有機相を分離する；これらの藻類毒素は水溶性なので、水相が目標とする相である；
ｄ．工程（ｃ）で得られる水相、または工程（ａ）の培地を少なくとも10倍の容積に濃縮すること；
ｅ．濃縮した水相を遠心分離すること；
ｆ．珪藻土の固体マトリックスに上清を通すこと、その場合、藻類毒素が保持されるので、溶出液にてそこから溶出しなければならない；
ｇ．藻類毒素を含有する溶出液を活性炭のマトリックスに通すこと、その場合、再び藻類毒素が活性炭カラムに保持されるので、溶出液にてそこから溶出しなければならない；
ｈ．藻類毒素を含有する前工程からの溶出液を再び珪藻土の固体マトリックスに通し、洗浄し、さらにもう一度溶出すること；
ｉ．前工程の溶出液の有機成分を蒸発させて、部分的に精製した藻類毒素抽出液を得ること；
ｊ．前工程で得た一部精製した藻類毒素抽出物を生化学的分離と、使用される物理化学的分画原理に従って、それぞれの工程で、分取用ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−Ｐｒｅｐ：分取用高速液体クロマトグラフィー）による分画プロセスに付すこと；この原理は連続するサイズ排除、アニオン交換、カチオン交換および再度のサイズ排除工程を含む

この方法において、純粋な藻類毒素調製物が得られるが、このものは医薬および化粧品への利用に適している。
本発明の方法は現在の技術状態において初めて、ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンなどの藻類毒素類を、これらの藻類毒素類を産生し得るシアノバクテリアから精製する手法を提供する。
本方法は適切な量の藻類毒素源、例えば、シアノバクテリア培養物（培養物とはシアノバクテリアがそこで増殖する培地をいう）またはシアノバクテリア細胞ペレットを提供することを含む。

シアノバクテリアの培養物を用いる場合、細胞は培地から、例えば、遠心分離の工程で分離する。この方法においては、培地に相当する水溶液相とシアノバクテリア細胞に相当する湿潤ペレットが得られる。シアノバクテリアのペレットは、凍結工程が引き続く藻類毒素ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンの精製に影響しないので、直接凍結処理することができる。

ペレットは当該技術分野において既知の適切な方法、例えば、均質化、溶媒抽出（有機相／水相）、ビーズ磨砕、凍結／融解サイクル、超音波処理、酵素溶解などを用いて溶解する。

シアノバクテリアの溶解により得られる物質は、水相中有機溶媒混合物（前混合物５０容量％を含んでなる１０ｍＭ酢酸含有クロロホルム：メタノール＝１：１の混合物
）を用いる低温抽出に付し、次いで、容量比１：１のクロロホルム：メタノールを含むｐＨ５の有機相を用いて有機相と水相を分離するが、この分離は１回ないし５回繰り返す。水相をすべて収集して単一の水相とし、これにより精製手順を継続する。

前工程で得られた水相または培地上清は、例えば、室温でのロータリーエバポレーターにより当初の体積の５倍ないし２０倍までの濃度に達するまで濃縮する
この濃縮物を相対遠心力１５，０００×ｇないし２５，０００×ｇで、１０分ないし４０分間の範囲で遠心分離する。
遠心分離上清は珪藻土のカラムを通し、カラムをその容量の５倍ないし１５倍の適当な溶液、例えば、５０ｍＭ酢酸で洗う。藻類毒素は適当な溶液、例えば、アルコール性抽出混合物、エタノール：水：５ｍＭ酢酸＝２：１：１(体積比)の溶液で溶出する。

前工程の溶出液を活性炭カラムに通し、次いでこれを蒸留水で洗い、保持された色素と不純物を除去する。藻類毒素はカラムに保持されるので、適当な溶液、例えば、アルコール性溶出混合物、エタノール：水：１ｍＭ酢酸２：１：１(体積比)の溶液ｐＨ５で溶出する。前工程での溶出液を再度珪藻土カラムに通す。このカラムを適当な溶液である50mM酢酸溶液を、マトリックス容量と等容量ないし１０倍容量を用いて洗い、藻類毒素は適切な溶液での溶出、例えば、適当なｐＨ５のアルコール性溶液、例えば、１：１：１（容量比）のクロロホルム／メタノール／水混合物で溶出する。

前工程での溶出物は、例えば、“スピードバック”(speed vac)装置（サバント（Savant）、ニューヨーク、米国）により有機溶媒を蒸発させて、水相に残す。その結果、部分的に精製された藻類毒素が得られる。

前工程からの部分精製抽出物は、サイズ排除、アニオン交換、カチオン交換および再度のサイズ排除の順からなる数段階の分取用ＨＰＬＣ（分取用高速液体クロマトグラフィー）に付す。数段階の連続するクロマトグラフィーの実施は、医薬工業の要件に適する分析純度を保証する。しかし、特定の事例においては、必要とされる純度の程度によって、藻類毒素は一回の分取用HPLCステップのみにて精製することができる。
理解すべきことは、各溶液の成分の比率および割合、成分濃度またはｐＨ値についての記載値は、±５％の範囲で変わり得るものであるが、本発明の結果を変えるものではないことである。

より詳細な図式によると、本発明の藻類毒素精製法は以下の段階により定義することができる：
ａ．適切な量の藻類毒素源は、本出願と同時に提出された同じ出願人によるチリ国特許出願「ネオサキシトキシンおよびサキシトキシンを産生し得るシアノバクテリアの工業的レベルでの培養」（第722-2009号明細書）の開示に従って、純粋なシアノバクテリアの培養物などとして提供される。
・遠心分離による細胞と培地の分離。各反応器から得られた１Ｌ容量の培養物を１０，０００×ｇで２５分間遠心分離して、上清と湿潤シアノバクテリのアペレットの沈殿を得る。
・細胞ペレットを凍結する任意のステップ。細胞ペレットは後に精製するために凍結してもよいし、または直ちに精製を開始してもよい。

ｂ．該ペレットは好適なペレット溶解方法により溶解し、次いで秤量し、ペレット重量当たり等容量の水相中有機溶媒の混合物（クロロホルム：メタノール（１：１）＋１０ｍＭ酢酸、前者混合物との５０％混合物）を加えて、細胞壁と細胞質膜を破壊する。これは弱酸性媒体（ｐＨ５．０）にて実施する。弱酸性媒体は活性本体の活性維持を可能とするユニークかつ重要な要件である。

ｃ．細胞溶解からの物質は低温抽出および相分離（有機／水性）に付す。
・先に得られた有機相の抽出を繰り返す。
・得られた２つの有機相を併合する。
・水相をｐＨ５．０の有機相で２回抽出する。体積比1:1で等容量のクロロホルム：メタノール混合溶液を使用する。

ｄ．抽出した水相は、例えば、ロータリーエバポレーターにより室温で濃度が１０倍になるまで（当初容量の１／１０まで）濃縮する。
ｅ．濃縮物は、好ましくは２０，０００×ｇで３０分間遠心分離する。
ｆ．遠心分離段階での上清水相は、上清を珪藻土カラムに通すことからなる工程で、固体珪藻土マトリックスで処理する。このカラムをカラム容積の好ましくは１０倍の量の５０ｍＭ酢酸で洗い、カラムに保持される藻類毒素は抽出アルコール性溶液または溶出バッファー（２：１：１容量比のエタノール／水／５ｍＭ酢酸）で抽出する。

ｇ．前工程のカラムからの溶出液をここで活性炭カラムに通し、次いで蒸留水で洗って担持されている色素と不純物を除去する。藻類毒素はカラムに担持されるので、これをアルコール性溶出混合物（３：２：１容量比の７エタノール：水：１ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で溶出する。この分画はシアノバクテリア溶解液中に存在するより多くの色素と低分子化合物、例えば、アミノ酸、ヌクレオチド塩基、ペプチド、糖類（単糖類および二糖類）の大きなフラクションを除去する。

ｈ．固体珪藻土マトリックスからの新たな分別溶出を引き続き実施する。珪藻土カラムに活性炭から溶出した抽出液が吸着される。再度、藻類毒素は疎水性相互作用により固体マトリックス上に保持される。これらのカラムは最初に洗浄して大量画分としての低分子量成分を溶出させ、除去する。次いで、保持されている藻類毒素を１：１：１容量比のクロロホルム／メタノール／水の混合溶媒での抽出によりカラムから溶出する。珪藻土カラムの使用は、全体として層状化した分画を生み出す。大量にに得るためのこの大規模手法は、バッチ法にて使用された場合に、これらカラムにより達成される分画を生成しない。もう一つの驚くべき効果は、バッチ法をカラムでの分離に置き換えたことによる効果であり、予想外に大量の工業原料の大規模初期事前精製手段を生み出し、その結果、コストの節約と効率の大きな増進をもたらす。

ｉ．二番目の珪藻土カラムからの溶出液は、例えば、“スピードバック”(speed vac)装置（サバント（Savant）、ニューヨーク、米国）により有機溶媒を蒸発させることで水相に残る。その結果、部分的に精製された藻類毒素が得られる。

ｊ．この部分精製した抽出液は分取用ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−Ｐｒｅｐ：分取用高速液体クロマトグラフィー）に付す。
Ａ）サイズによる分離（分取用ＨＰＬＣ）：この分離のために、高圧ステンレス製カラムにバイオ−ゲルＰ−２（バイオ−ラッド）ファインで、45〜90um(湿潤)のものを詰めたものを使用する。これらのカラムは直径１０ｃｍ、長さ８５ｃｍを有し、加圧下で乾燥バイオ−ゲルＰ−２樹脂を詰める。この樹脂の排除サイズは１８００ダルトンである。この樹脂はボイド容量（Ｖｏ）で、１８００ダルトンよりも大きなサイズまたはそれより高い分子量をもつ分子を分離する。この方法において、すべての高分子および少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するペプチドは最初のフラクション（最初に流出）で通過するが、低分子量の化合物、例えば、藻類毒素類（２９８ないし４４５ダルトン）は保持される。このサイズ排除樹脂を用いて、不所望の有機物質の９０％を除去するが、そこにはこれらのシアノバクテリアの特徴である大量の色素をも含む。これらの化合物および可溶性高分子のすべてがカラムから最初のフラクションで排出される（最初の５リットルが溶出される）。終盤のフラクションに近い中間位のフラクションは藻類毒素を含むフラクションである。最終フラクションでは、抽出物に存在する大部分の塩が除去される。サイズ排除のために特に本明細書で使用される形態で、この樹脂を使用することは、完全に革新的な着想である。分画カラムは本発明の特別のデザインであり、それらのサイズのみならず、カラムに充填する方法も特別である。この精製段階は卓越して効率的であり、実質的に部分精製活性本体を送達する。高圧下、固体マトリックスをカラムに充填するこの革新的な生物工学的方法を使用することで、ここから使用される分取用液体クロマトグラフィーによる分画化はすべて、そのマトリックスが大量の活性本体の工業的精製方法に完全に適している事実上無制限の接触面を生成する。これらの分取用ＨＰＬＣ法においては、本方法の好ましい敏速さに言及することもまた価値がある。この敏速さは純粋な生物活性化合物を得るための基本的な問題である。図９はこのサイズ排除工程を例証する分取用クロマトグラフィーの溶出プロットを示す。藻類毒素含有フラクションを濃縮し、次いでアニオン交換工程に相当する第二の分離に付す。サイズ排除はこれらの抽出物中に存在する塩の殆どを除去するためにも有用であり、これらの塩は当初この精製工程で実施された相分画化では、完全に除去されなかったものである。この工程は、これらの塩がイオン交換工程を阻害し得るので重要である。従って、高分子と１８００ダルトンを超える分子量の分子がこの分離工程で除去されるばかりでなく、低分子量の塩成分（ナトリウム２３、塩素３５等）の殆どもまた除去される。

Ｂ）アニオン交換：分取用サイズ排除カラムと同様のカラムを組み立てるが、ここではアニオン交換樹脂を使用する。ここでは、セレックス−Ｄ（Cellex-D）（バイオ−ラッド）樹脂を使用するが、この樹脂は1グラムあたり0.66ミリと雨量の交換容量をもつ。この分取クロマトグラフィーにおいては、中性のｐＨにおいて正の実効電荷（＋２および＋１）を有する藻類毒素類が、正電荷の故にカラムに保持されないので、最初のフラクション（当初２．５リットル）に溶出する。それ故、これらの藻類毒素類はカラムのボイド容量に溶出する。これらのカラムにおいて、負電荷をもつ化合物のみが保持され、藻類毒素類を含まないフラクション中、クロマトグラフィーの最後に溶出され、従って、除去される。藻類毒素の全量を含む最初のフラクションは再度濃縮し（工業的凍結乾燥機）、次いで分取用カチオン交換カラムに適用する。このフラクションは＋２（ネオサキシトキシンおよびサキシトキシン）および＋１（ゴニャウラトキシン）の実効電荷をもつ実質的に純粋な藻類毒素を含む。

Ｃ）カチオン交換：この分取用クロマトグラフィー（前記と同様寸法のカラムを使用し、バイオ−ラッドのバイオ−レックス（登録商標）７０を充填）においては、藻類毒素が保持され、２つの主要群に分離される：すなわち、実行電荷が＋２のものと、＋１実効電荷のものである。その最初のフラクションには負電荷（電気伝導度により測定）をもつ残り少量の塩のフラクションが溶出され、次いでゴニャウラトキシンが溶出され、最後にサキシトキシンとネオサキシトキシンが溶出される。これら最後の２種の分離された藻類毒素を分離し、それら両方の混合物をネオサキシトキシン２／３、およびサキシトキシン１／３の割合で含むフラクションとする。最後に溶出するフラクションは実質的に純粋なネオサキシトキシンを含有する。

Ｄ）最後に、カチオン交換分離による数種の濃縮最終フラクションを、再度、サイズ排除カラムにバイオ−ゲルＰ−２（Ａに記載したものと同一の方法を使用）を充填したものにて分離し、残りの塩を除去し、蒸留水で溶出して純粋なサキシトキシンを得る。

理解しなければならないことは、各溶液の成分の比率および割合、成分濃度またはｐＨ値についての記載値は、±５％の範囲で変わり得るものであり、本発明の結果を変えるものではないことである。

上記方法による精製に適する藻類毒素類は、ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンである。一つの特定毒素の取得は、精製を実施するシアノバクテリア菌株に左右される。その理由は特定の菌株が特定のタイプの藻類毒素を優先的に産生するからである。標的化合物（藻類毒素類）の特徴的保持時間は、以下の本出願の実施例に示されるように、分離と分画化の判定基準と考えられる。

各ストック（バッチ）の純度は、可視および紫外吸収スペクトル法により、また質量スペクトル法により判定することができる。最終の検出と定量は、分光蛍光分析法により実施することができる。この最後の定量的検出分析法はネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシンなどの藻類毒素類すべてに特異的である（Lagos, 1998. Microalgal blooms: A global issue with negative impact in Chile (微小藻類開花：チリにおける有害な衝撃的世界的問題). Biol. Res. 31: 375-386）。

実施例１
制御条件下に連続培養で維持したアファニゾメノン・グラシル（Aphanizomenon gracile）から取得精製した藻類毒素類
すでに示したように、選択した単一クローンを用いるアファニゾメノン・グラシル培養物中では、ネオサキシトキシンが、産生される主要な藻類毒素である。この特別な事例において、このクローンはまた少量のサキシトキシンをも産生する。

シアノバクテリア、アファニゾメノン・グラシルからのネオサキシトキシンの産生は、湿潤アファニゾメノン・グラシル細胞１０ミリグラムの初期量から実施した。ペレット（工程ａにて取得）は上記の方法に付した；すなわち：
ｂ．細胞ペレット１０ｍｇについて、重量あたり同じ容量の水相中の有機溶媒混合物１０ｍＬ（１：１のクロロホルム／メタノール＋５０ｍＭ酢酸；前記混合物と５０％の割合）を加えて、弱酸性媒体（ｐＨ５．０）中、細胞壁と細胞質膜を破壊する。
工程ｂからの溶解細胞は低温抽出と相分離に付す（有機／水性）。

ｄ．工程ｃからの抽出水相は、例えば、室温で、ロータリーエバポレーターを用い、容量比較で１０倍まで濃縮する（元の容積の１／１０にする）。
ｅ．濃縮物を２０，０００×ｇで３０分間、遠心分離する。
ｆ．遠心分離による上清２ｍＬを珪藻土のカラムに通す。このカラムをその容量１０倍（２０ｍｌ）の５０ｍＭ酢酸で洗う。洗浄段階後に、カラムに保持されたネオサキシトキシンを５ｍｌのアルコール性抽出混合物、(エタノール：水：５ｍＭ酢酸＝２：１：１容積比)で溶出する。

ｇ．工程ｆで得られたカラムからの溶出液は活性炭を通す；次いでこれを蒸留水で洗い、保持された色素と不純物を除去する。藻類毒素はカラムに保持されたままであり、アルコール性溶出混合物（pH5のエタノール／水／１mM酢酸が3:2:1の混合物）１０ｍＬで溶出する。
ｈ．溶出液を珪藻土カラムに通し、５０ｍＭ酢酸で洗う。引き続き、５ｍｌのクロロホルム／メタノール／水が体積比で1：1：1の混合物で毒素をカラムから溶出する。

ｉ．第二の珪藻土カラムからの溶出物は、例えば、“スピードバック”(speed vac)装置（サバント（Savant）、ニューヨーク、米国）により有機溶媒を蒸発させて、水相に残る。部分的に精製されたネオサキシトキシンが得られる。
ｊ．部分精製した抽出物は、サイズ排除分取用ＨＰＬＣ（分取用高速液体クロマトグラフィー）に付す。

培養２日後に各反応器は、各収集物１リットル当たり、平均６５２．４マイクログラムの総毒素を産生する。平均のネオサキシトキシン／サキシトキシン比は８．４７である。百分比では、サキシトキシンが平均１１．８％、そしてネオサキシトキシンが８８．２％で得られる。主たる目的はネオサキシトキシンを生産することであり、この化合物が医薬品または化粧品として臨床的適用で特許となっている活性本体であるため、その製造法が求められ、増強され、保護されている。ネオサキシトキシンはサキシトキシンよりも２５％以上強力な生物作用を有し、従来記載されている中で最も強力な藻類毒素である。

図１、２および４はアファニゾメノン・グラシル種が産生した藻類毒素プロフィールを示すオンライン蛍光検出により検出したＨＰＬＣ走行のクロマトグラムを示す。図１および２はアファニゾメノン・グラシル抽出物からのそれぞれの精製度合いを表すフラクションのＨＰＬＣプロフィールを示す。それらが藻類毒素類を検出定量するために実施する分析用高速液体クロマトグラフィーからのクロマトグラムであることに再度言及するのは価値のあることである。それらは工業的方法からの分取クロマトグラムではない。これらのクロマトグラムは純度の度合いと各精製フラクションの含量を示すために有用であるのみである。

図１はこの当初の抽出物に存在する藻類毒素のプロフィールを知り、定量するために実施した未精製アファニゾメノン・グラシル抽出物のクロマトグラムを示す。このクロマトグラムは主たる比率のネオサキシトキシンと少量のサキシトキシン（１３％未満）を含む単一のプロフィールを示す。

図２は制御条件下で連続的に増殖したアファニゾメノン・グラシルから分取用サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（分子サイズにより分離）により部分的に精製した抽出物１０マイクロリットルについての精製を示す。この部分精製抽出物において、このクロマトグラムを飽和するＲＴ＝９．３７３分の典型的なピークは、ネオサキシトキシンに相当するピークで、それが既に存在することは、このフラクションに大量のネオサキシトキシンが存在することを示している。

図４は最後の精製段階（上記方法の最終段階）に相当する、イオン交換カラムによるＨＰＬＣから溶出したフラクションで得られるシアノバクテリアであるアファニゾメノン・グラシルの抽出液（ＲＴ＝４．９３３分）から精製したネオサキシトキシン標品を示す。単一の成分に相当する単一のピークが得られ、このピークは純粋なネオサキシトキシンに相当する。

得られた収量は、小型培養フラスコ中、連続的微少通気なしに、また昼光と無光夜間のサイクルで、従来記載されている通常の培養条件におけるフィラメントとシアノバクテリアペレットの生産と比較した場合、湿潤シアノバクテリア１ミリグラム当たりの純粋な藻類毒素（ネオサキシトキシンおよびサキシトキシン）の生産が驚くべき程に予想外のものであることを示す。

本明細書に記載の実施例において、シアノバクテリアは１日２４時間の永続的光照射とシアノバクテリアの永続的収集により、常に対数増殖期にあり、各収穫時に収集した容量に等しい容量の新たな栄養素を添加することにより、永続的に増殖させる。

実施例２
制御条件下の連続培養において維持されたシリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Cylindrospermopsis raciborskii）から取得精製した藻類毒素
シアノバクテリアであるシリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイは、本出願と同時に同じ出願人らが提出したチリ国特許出願明細書に記載された、永続的対数増殖期において制御条件下、連続大量半自動培養法に従う培養物であった。

シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ菌株の未精製抽出物は、図６に示すクロマトグラフィープロフィールを有する。シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイはＧＴＸ３およびＧＴＸ２が優勢な毒素プロフィールを有し、カラム中で最長の保持時間を示す（それぞれ右側最後の２つのピーク）。

連続培養からのシリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ抽出物は、実施例１に記載したのと同じ条件で、上記の工程に従って、精製工程に付す。また図７に示すように
サイズ排除分取用ＨＰＬＣ工程では、それまでにＧＴＸ３とＧＴＸ２エピマーが、殆どが排他的に得られる。

シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイからの藻類毒素精製法による最終フラクションは、図８に示すように、ＧＴＸ３とＧＴＸ２のみを含み、各ゴニャウラトキシンを含むフラクションは大量の純粋なＧＴＸ３とＧＴＸ２を得るために収集することができる。

Claims (11)

1. 生物学的に活性であり、ネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニャウラトキシン（ゴニャウラトキシン２およびゴニャウラトキシン３）からなる群より選択される１の藻類毒素の工業的精製方法であって、当該方法が以下の工程を含む方法：
   ａ．シアノバクテリアクローン培養物のような、適当な量の藻類毒素源を提供する工程であって、該培養物は培地とシアノバクテリア細胞ペレットに分けられ；該培地はシアノバクテリアを増殖させるものであり；該ペレットが湿潤シアノバクテリアペレットまたは凍結シアノバクテリアペレットである；
   ｂ．該藻類毒素源がペレットである場合、当該ペレットを、均質化、溶媒抽出（有機相／水相）、ビーズ磨砕、凍結／融解サイクル、超音波処理及び酵素溶解からなる群より選択されるいずれか１の方法を用いて溶解する工程；
   ｃ．シアノバクテリア細胞溶解からの原料を、ｐＨ４ないし５として、活性本体の生物活性を維持するために常に弱酸性媒体として、低温抽出と有機相／水相分離（クロロホルム：メタノール＝１：１の混合物５０容積％と１ｍＭ酢酸５０容積％）に付す工程；
   ｄ．工程（ｃ）で得られる水相、または工程（ａ）の培地の濃縮物を得る工程；
   ｅ．濃縮物を遠心分離して上清を得る工程；
   ｆ．珪藻土カラムに上清を通し、カラムを適当な洗浄液で洗い、次いで、適当な溶出液により藻類毒素溶出物を得る工程；
   ｇ．前工程の溶出液を活性炭カラムに通し、当該活性炭カラムを次いで蒸留水で洗い、保持された色素と不純物を除去し、藻類毒素を適当な溶出液で溶出する；
   ｈ．前工程の溶出液を再度珪藻土カラムに通し、カラムを適当な溶液（工程ｆ同様）で洗い、藻類毒素を適当な抽出液で溶出する工程；
   ｉ．前工程の溶出液は有機溶媒を蒸発させて水相に残し、部分的に精製された藻類毒素抽出液を得る工程；
   ｊ．前工程で得た部分的に精製された抽出物をそれぞれの工程で分取用ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−Ｐｒｅｐ：分取用高速液体クロマトグラフィー）に付し、純粋な生物活性藻類毒素を得る工程。
2. 工程（ｂ）の溶媒抽出において、重量で等容量の水相中の有機溶媒（クロロホルム／メタノール（１：１）＋１０ｍＭ酢酸と５０％の前記混合物、ｐＨ４ないし６）が、細胞壁と細胞質膜を破壊する請求項１に記載の方法。
3. 工程（ｃ）の溶媒抽出を３回繰り返す請求項１に記載の方法。
4. 工程（ｄ）の濃縮を、濃度が初期の５倍ないし２０倍以上に達するまで、ロータリーエバポレーターを用いて室温で実施する請求項１に記載の方法。
5. 工程（ｅ）の遠心分離が１５，０００×ｇないし２５，０００×ｇの範囲の相対遠心力で１０分ないし４０分の時間実施する請求項１に記載の方法。
6. 工程（ｆ）および（ｈ）における適当な洗浄液が５０ｍＭ酢酸であり、工程（ｆ）においてカラムはその容量の５倍ないし１５倍で洗い、適当な溶出液がアルコール性抽出混合物（２：１：１容量比のエタノール／水／５ｍＭ酢酸）である請求項１に記載の方法。
7. 工程（ｇ）における溶出液がアルコール性溶出混合物（３：２：１容量比のエタノール／水／１ｍＭ酢酸、ｐＨ５）である請求項１に記載の方法。
8. 工程（ｈ）における溶液が１：１：１容量比のクロロホルム／メタノール／水の混合物である請求項１に記載の方法。
9. 工程（ｉ）において、有機溶媒の蒸発を真空遠心分離機にて実施する請求項１に記載の方法。
10. 工程（ｊ）において、分取用高速液体クロマトグラフィーが、順次、サイズ排除、アニオン交換、カチオン交換およびサイズ排除である請求項１に記載の方法。
11. 藻類毒素を産生し得るシアノバクテリアが、シリンドロスペルモプシス・エスピー、ミクロシスティス・エスピー、アナバエナ・エスピー、ゴンフォスフェリア・エスピー、オシラトリア・エスピー、アファニゾメノン・エスピーおよびリングビヤ・ウォレイに属する請求項１ないし１０いずれか１項に記載の方法。

Images