MX2011010005A - Metodo de purificacion industrial de ficotoxinas biologicamente activas. - Google Patents

Abstract

Esta invención se relaciona con un método de purificación industrial de ficotoxinas biológicamente activas, que comprende proporcionar una cantidad adecuada de una fuente de ficotoxinas; si la fuente de ficotoxinas es un pellet, este último se lisa usando métodos apropiados; el material proveniente de la lisis de cianobacterias, se somete una extracción en frío; obtener un concentrado de la fase acuosa obtenida en la etapa anterior ó del medio de cultivo de la primera etapa; centrifugar el concentrado para obtener un sobrenadante; pasar el sobrenadante por una columna de tierras de diatomeas y obtener un eluato de la ficotoxina; el eluato obtenido en el paso anterior, se hace pasar por columnas de carbón activado; el eluato de la etapa anterior, nuevamente se hace pasar por una columna de tierra de diatomeas; el eluato de la etapa anterior se deja en fase acuosa; el extracto parcialmente purificado de la etapa anterior, se somete a HPLC preparativa en varios pasos, obteniendo la ficotoxina biológicamente activa pura.

Description

METODO DE PURIFICACION INDUSTRIAL DE FICOTOXINAS BIOLÓGICAMENTE ACTIVAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con la producción industrial, en grandes cantidades, bajo condiciones controladas y en forma continua de las ficotoxinas paralizantes neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas -gonyaulatoxina 2 y gonyaulatoxina 3 - a partir de cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes, y en forma particular con la purificación de dichas ficotoxinas. Con el objetivo central de obtener un compuesto totalmente puro y que mantenga su potente actividad biológica hasta el final, donde se utiliza como materia prima para el desarrollo de un nuevo fármaco.

Estas ficotoxinas tienen aplicación en productos cosméticos o farmacéuticos, por ejemplo en productos cosméticos para combatir las arrugas y lineas de expresión, o en productos farmacéuticos de aplicación clínica tales como anestésicos locales, medicamentos para el control de patologías asociadas a hiperactividad muscular, para el control del dolor a nivel local y periférico, es decir productos para el mejoramiento de calidad de vida.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las ficotoxinas neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas son componentes activos producidos por florecimientos algales nocivos, de los géneros Alexandrium sp., Piridinium sp., y Gimnodinium sp. , (Lagos, N. (1998) Microalgal blooras: A global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31: 375-386) . En los últimos 15 años, se ha demostrado que además de ser producidas por los dinoflagelados en el mar, estas ficotoxinas también pueden ser producidas por cianobacterias de agua dulce, tales como las algas verdes-azules fotosintéticas .

Hasta ahora en la literatura se han identificado sólo 4 géneros de cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes, cada una de ellas con distinta composición, tanto en cantidad, como en tipos de ficotoxinas producidas, es decir con distintos perfiles de ficotoxinas paralizantes (Lagos, N., Onodera, H., Zagatto, P.A., Andrinolo, D. , Azevedo, S.M.F.Q., and Oshima, Y., 1999, The first evidence of paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, isolated from Brazil. TOXICON, 37: 1359-1373. Pereira, P., Onodera, H., Andrinolo, D. , Franca, S., Araujo, F. , Lagos, N., and Oshima, Y., 2000, Paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacteria Aphanizomenon flos-aquae, isolated from Montargil reservoir, Portugal. TOXICON, 38: 1689 - 1702.

El principio activo de estas ficotoxinas paralizantes, actúa como bloqueador especifico de los canales de sodio voltaje dependiente, que se encuentran en las células excitables (Kao, C.Y., 1966, Tetrodotoxin, saxitoxin and their significance in the study of excitation phenomenon. Pharm. Rev. 18: 997-1049) . Debido a la inhibición de los canales de sodio, se bloquea la transmisión del impulso nervioso y de esta forma se impide la liberación de neurotransmisores a nivel de placa neuromotora, lo que impide entonces la contracción muscular. Debido a estos efectos fisiológicos, estos compuestos son potencialmente útiles farmacológicamente, al usarlos como inhibidores de la actividad muscular en patologías asociadas a hiperactividad muscular, como son los espasmos musculares y distonías focales, cuando se aplica en forma inyectable y localmente. Adicionalmente, debido a que se genera un bloqueo a nivel de transmisión del impulso nervioso, cuando se aplican como una infiltración local, estos no sólo bloquean las vías eferentes de neurotransmisión, sino que además bloquean las vías aferentes y por ende producen también inhibición de las vías sensoriales, generando un efecto anestésico, ambos efectos inseparables al inyectarse localmente. Siendo este un efecto sorprendente pues ambos se dan simultáneamente (Patente US 4.001.413) .

Las ficotoxinas neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, en la actualidad no se encuentran disponibles comercialmente como un producto masivo, a pesar de sus grandes aplicaciones con fines terapéuticos y cosméticos. Es evidente que se requiere de un procedimiento industrial de producción de estos compuestos, para satisfacer su creciente demanda, relacionada con su gran cantidad de usos y aplicaciones clínicas y cosméticas recientemente desarrolladas .

La invención presentada aquí corresponde a la extracción, fraccionamiento y purificación de las ficotoxinas paralizantes neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, partiendo con un proceso innovador de cultivos celulares continuos, en condiciones controladas y en grandes cantidades a partir de cepas de cianobacterias (algas verdes - azules) . Teniendo como objetivo central el mantenimiento de la potente actividad biológica de este principio activo durante todo el proceso industrial de purificación.

Las cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes pertenecen a los géneros: Cylindrospermopsis sp, Mycrocistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaeria sp, Oscillatoria sp, Aphanizomenon sp (Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile) , y Lyngbya wollei entre otros. Ninguna de estas cianobacterias se ha empleado, hasta ahora, en la producción de ficotoxinas a niveles industriales.

La producción industrial de ficotoxinas a partir de cianobacterias debe resolver dos problemas técnicos, que si bien están interrelacionados son diferentes entre si. En primer lugar se debe generar una gran cantidad de biomasa productora de ficotoxinas, este problema técnico se resuelve en la invención protegida en la solicitud CL 722-2009 también de nuestra autoría. En segundo lugar, una vez producida la biomasa y las ficotoxinas estas últimas deben ser purificadas en ciertas condiciones, de manera que su principio activo sea farmacológicamente activo, mantenga su potente actividad biológica y que sus rendimientos sean masivos, este segundo problema técnico es el que se aborda en la presente invención .

El método propuesto es la purificación de ficotoxinas a partir de un cultivo clonal de cianobacteria, que produce un perfil simple de ficotoxinas paralizantes (una o dos ficotoxinas o donde una ficotoxina representa sobre el 75 % de la composición del perfil) . Como por ejemplo, una cepa que sólo produzca neosaxitoxina y saxitoxina o sólo gonyaulatoxinas 2/3, como componentes mayoritarios . El tener rendimientos sobre el 75% de un principio activo farmacológicamente, es también un efecto sorprendente, lo que se logra en este procedimiento industrial que se patenta.

La estructura química de estas ficotoxinas tiene una estructura general (I) , y su estructura particular la definen los radicales Rl a R5, según se indica en la tabla: La revelación de que estos alcaloides son producidos por cianobacterias es muy reciente, sólo en los últimos 15 años se ha demostrado que corresponden a metabolitos secundarios; los cuales se encuentran dentro de las células, pero que también bajo ciertas condiciones, son liberados al medio de cultivo. Por lo tanto, en un cultivo continuo de cianobacterias, se generan dos fuentes de estos productos, la primera en el pellet celular y la segunda en el medio donde se cultivan las cianobacterias .

Para la producción industrial de estas ficotoxinas y para poder purificarlas es indispensable tener un cultivo masivo de estas cianobacterias, como el que se protege en la solicitud CL 722-2009. Antes del proceso descrito en la solicitud CL 722-2009, el desarrollo de procesos industriales de alto volumen para la obtención de las ficotoxinas, no había sido desarrollado aún, sin embargo estas se purificaban en laboratorios de investigación básica, a partir de mariscos contaminados con marea roja, con el objetivo de obtener unos pocos microgramos de estas ficotoxinas como estándares analíticos (patrones para ser usados como material de referencia en análisis químicos) .

A la fecha, no existen publicaciones de procesos de purificación de estas ficotoxinas a partir de mariscos contaminados, y tampoco a partir de dinoflagelados a niveles industriales; en este caso los niveles industriales son considerados en un orden de magnitud de gramos de producción del metabolito o ficotoxina. Tampoco se ha publicado sobre aislamiento de ficotoxinas a partir de cianobacterias, lo que no es de extrañar, siendo las cianobacterias fuentes de estas ficotoxinas, sólo recientemente descritas en la literatura mundial (Lagos, 2003) .

En esta solicitud de patente se presenta la purificación y producción industrial de neosaxitoxina , saxitoxina y gonyaulatoxinas 2/3, usando un proceso biotecnológico innovador a partir de cianobacterias aisladas, clonadas y cuya producción industrial continua y en condiciones controladas, permiten la optimización de la producción de estas ficotoxinas; las cuales mantienen su potente actividad biológica durante todo el proceso industrial, generando un principio activo industrial útil para el desarrollo de nuevos fármacos .

La integración de la propuesta de producción con las tecnologías a emplear, pasa por el escalamiento productivo de cianobacterias anteriormente descrito, que permiten acceder a la producción de ficotoxinas en cantidades necesarias como para usos masivos farmacológicos y el desarrollo de nuevos fármacos o principios activos de uso cosmético.

Las ventajas de la presente invención para producir estas ficotoxinas, a través de producción masiva y en condiciones controladas de cianobacteria, son: • La disponibilidad de clones de cepas de cianobacterias seleccionadas y productoras de ficotoxinas con una composición única y perfil de toxina simple.

• Proceso de fácil purificación de las ficotoxinas y con un alto rendimiento.

• Relación costo - producción - rendimiento, muy favorable no logrado hasta ahora.

Campo de aplicación de la producción masiva de las ficotoxinas neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas El campo de aplicación corresponde al uso de estos alcaloides en clínica, como agentes terapéuticos en patologías asociadas a hiperactividad muscular, tales como, los espasmos musculares y distonías focales. Adicionalmente, su uso como anestésicos locales en diferentes preparados farmacéuticos de amplio espectro, permite definir a estas ficotoxinas como productos de gran utilidad en el tratamiento de diversas patologías, muchas de ellas de gran demanda comercial. Por otra parte, también pueden aplicarse en productos de carácter cosméticos para combatir las arrugas y líneas de expresión, aplicaciones de evidente demanda comercial. Sin embargo, estas ficotoxinas no están disponibles en el mercado en cantidades industriales al nivel de los requerimientos actuales, por esto el método de purificación, fraccionamiento y producción de neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, resuelve un problema biotecnológico que permanecía sin solución. La innovación propuesta aquí, permite satisfacer la gran demanda del mercado nacional e internacional por el principio activo de estas ficotoxinas puras, en gran escala, para sus usos terapéuticos, cosméticos y de otros productos que mejoren la calidad de vida de las personas.

Estas ficotoxinas presentan propiedades fisicoquímicas muy favorables para las aplicaciones en el campo de la medicina y de la industria cosmética. Sus propiedades físicas y químicas son las siguientes: solubles en agua, estables a temperatura ambiente, altamente resistentes a medios ácidos y a temperaturas extremas (sobre 100°C), bajísimo peso molecular (298 - 445 g/mol) , lo que permite aplicaciones más fáciles, menos peligrosas e indoloras, sin respuesta alérgica e inmune, a diferencia de otros compuestos, como por ejemplo la proteína de alto peso molecular de la toxina botulínica (Botox ®) .

Debido a estas propiedades físicas y químicas de las ficotoxinas, como son bajo peso molecular y gran estabilidad química, es posible realizar aplicaciones y desarrollos biotecnológicos de muchos productos y preparados farmacéuticos, como son el uso en cremas, geles, aplicaciones transdérmicas con aparatos de ultrasonido, infrarrojos y otros, parches de liberación controlada "patches" (parches pegados a la piel de aplicación lenta y continua) . Todo esto debido a la gran estabilidad de estos compuestos y a la posibilidad adicional de permitir hacer reacciones químicas con uniones covalentes a otros compuestos químicos.

Estas ventajas posicionan a las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas como alternativas superiores a la toxina botulinica, compuesto utilizado ampliamente en dermocosmética , que es una proteasa que tiene las desventajas de ser inestable, de alto peso molecular, genera respuesta inmune alérgica, que produce daño estructural (digiere el terminal nervioso y los terminales aledaños, produciendo efectos adversos no deseados y actualmente cuestionados a nivel mundial) y que se digiere a si misma en periodos cortos de tiempo.

Las aplicaciones clínicas recientemente publicadas para las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, están abriendo mercados, para aplicaciones de demanda masiva: en el ámbito cosmético, dolores de espalda, migrañas, fisura anal, control de dolor en cirugías laparoscopicas y manejo del dolor neuropático en general, con millones de pacientes potenciales, planteando una demanda futura incalculable de estos compuestos.

En la tabla 1, se indica las ventajas de las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas al compararlas, por ejemplo, contra la toxina botulinica (Botox®) , con la cual producen una respuesta fisiológica similar, por lo tanto ambas de aplicaciones similares en terapia clínica y cosmética, aunque la acción de cada una de ellas es por mecanismos moleculares muy distintos.

TABLA 1: Ventajas de las ficotoxinas respecto a toxina botulinica neoSTX: neosaxitoxina STX: saxitoxina GTX: gonyaulatoxina ACH: acetilcolina La relativa facilidad en el cambio de los usuarios de Botox ®, al uso de los potenciales productos generados con ficotoxinas (neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas ) debido a aplicaciones indoloras, de menor costo y de efecto instantáneo, generan ventajas competitivas de las ficotoxinas por sobre Botox ®.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN El objetivo general de la invención es la extracción, purificación y producción industrial de ficotoxinas biológicamente activas, componentes y metabolitos secundarios producidos por cianobacterias , que tiene gran valor agregado y comercial y que no se encuentran comercialmente disponibles, a niveles de producción industrial. Lo sorprendente de esta invención, es lograr estos compuestos biológicamente activos durante todo el proceso industrial, siendo un proceso biotecnológico único y sorprendente.

Un objetivo específico de la invención, corresponde a un proceso de purificación, masivo, industrial y de alto rendimiento de producción de las ficotoxinas neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, biológicamente activas, a partir de niveles prácticamente ilimitados de cepas de cianobacterias producidas en cultivo continuo y en condiciones controladas.

Otro objetivo específico de la invención, es lograr un procedimiento de purificación de ficotoxinas a partir de pellas húmedas y/o congeladas de cianobacterias, eliminando los pigmentos, y otros metabolitos secundarios principales acompañantes de las ficotoxinas en el proceso de purificación .

Un tercer objetivo específico de la invención, es lograr un procedimiento de purificación de las ficotoxinas liberadas al medio, a partir del medio de cultivo en que se encuentran las cianobacterias . Teniendo como objetivo central, la purificación biotecnológica del principio activo, con potente actividad biológica demostrada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 presenta un crornatograma correspondiente a 10 microlitros de extracto de la cianobacteria Aphanizomenon gracile, inyectados en cromatografía liquida de alta resolución analítico (HPLC) . Detección realizada por cromatografía líquida de alta resolución analítica con detección fluorescente en línea. Pico 1, Rt = 2.640 minutos pigmentos de cianobacterias. Pico 2, Rt = 7.980 minutos neosaxitoxina . Pico 3, Rt = 11.970 minutos saxitoxina.

La figura 2 es un cromatograma correspondiente a 10 microlitros de extracto purificado de Aphanizomenon gracile por cromatografía líquida de alta resolución preparativa de separación por tamaño (exclusión por tamaño) . Detección realizada por cromatografía líquida de alta resolución con detección fluorescente en línea. Pico 1, Rt = 3.067 minutos pigmentos de cianobacterias. Pico 2, Rt = 9.373 minutos neosaxitoxina. Pico 3, Rt = 12.953 minutos saxitoxina.

La figura 3 presenta un cromatograma de un estándar analítico que presenta como componentes principales neosaxitoxina y saxitoxina, con un poco de mezcla de gonyaulatoxinas (estándar NL2), determinado y cuantificado por cromatografía líquida de alta resolución analítica con detección fluorescente en línea. Primer pico Rt = 3.653 minutos, corresponde a mezcla de gonyaulatoxinas ; segundo pico 2, Rt = 5.040 minutos, corresponde a neosaxitoxina; tercer pico, Rt = 7.440 minutos saxitoxina.

La figura 4 es un cromatograma de neosaxitoxina purificada a partir de extractos de cianobacterias Aphanizomenon gracile (Rt = 4.933 minutos). Fracción eluída de cromatografía líquida de alta resolución preparativa, en columnas de intercambio iónico con detección fluorescente en línea .

La figura 5 presenta un cromatograma de estándares analíticos para gonyaulatoxinas. De izquierda a derecha: Pico 1: GTX4 (gonyaulatoxina 4); Pico 2 GTX1 (gonyaulatoxina 1); Pico 3 GTX 5 (gonyaulotoxina 5); Pico 4 GTX 3 (gonyaulatoxina 3) ; Pico 5 GTX2 (gonyaulatoxina 2) .

La figura 6 es un cromatograma de muestra de extracto de cepa de cianobacteria C. raciborskii. Primer pico Rt = 8.873 minutos, segundo pico Rt = 10.927 minutos, tercer pico Rt = 13.260 minutos; cuarto pico = 16.647.

La figura 7 es un cromatograma de fracción parcialmente purificada por cromatografía líquida de alta resolución preparativa por separación por tamaño (exclusión por tamaño) de C. raciborkii con presencia dominante del epímero GTX 3 y GTX 2 respectivamente.

La figura 8 presenta un cromatograma de la fracción final pura del epimero GTX 3 y GTX 2, obtenido a partir de cianobacterias en cultivo continuo de C. raciborkii .

La figura 9 es un gráfico de elución de una cromatografía preparativa de separación por tamaño que muestra las fracciones obtenidas y donde se identifica el rango de fracciones donde aparecen los distintos componentes presentes (compuestos orgánicos, ficotoxinas y sales).

La figura 10 es un gráfico de elución de una cromatografía preparativa de separación por intercambio aniónico que muestra las fracciones obtenidas y donde se identifica el rango de fracciones donde aparecen los distintos componentes presentes (ficotoxinas y sales) .

La figura 11 es un gráfico de elución de una cromatografía preparativa de separación por intercambio catiónico que muestra las fracciones obtenidas y donde se identifica el rango de fracciones donde aparecen los distintos componentes presentes (ficotoxinas y sales).

La figura 12 es un gráfico de elución de una cromatografía preparativa de separación por tamaño que muestra las fracciones obtenidas y donde se identifica el rango de fracciones donde aparecen las ficotoxinas purificadas (saxitoxina, neosaxitoxina) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se describe la purificación y producción industrial de las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas , las cuales son biológicamente activas, a partir de cultivos de cianobacterias productoras de estas ficotoxinas.

Las cianobacterias utilizadas pueden ser de los géneros: Cylindrospermopsis sp, Mycrocistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaeria sp, Oscillatoria sp, Aphanizomenon sp (Aphanizomenon issatchenkoi , Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile) .

Las cianobacterias se obtienen preferentemente desde un cultivo continuo, en condiciones controladas, masivo, semi-automático tal como el descrito en la solicitud de patente chilena correspondiente al mismo solicitante y presentada simultáneamente con esta solicitud, CL 722-2009.

La purificación industrial de las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas a partir de cianobacterias en cultivo continuo, se realiza por un método de extracción, fraccionamiento, partición por solventes, participación en fases sólidas, y partición en fases liquidas-sólidas de estas ficotoxinas (neosaxitoxina, saxitoxina, y gonyaulatoxinas) a partir de células del cultivo (pellet) o el sobrenadante del cultivo. Proceso biotecnológico continuo, secuencial y semi-automático, que genera cantidades industriales de un principio activo que mantienen su actividad biológica durante todo el proceso de purificación, hasta llegar a su producto final. El proceso involucra procedimientos químicos y bioquímicos en varias etapas de fraccionamiento por centrifugación diferencial, extracción con solventes acuosos y orgánicos, partición en fase de solventes hidrofóbicos , partición en fases sólidas, purificación a través de columnas y diversos tipos de cromatografías de alta resolución preparativas (intercambio catiónico, aniónico y separación por tamaño) , hasta obtener extractos parcialmente purificados, sin pigmentos, correspondientes a fracciones de perfiles de ficotoxinas simples y a partir de ellos ficotoxinas puras (Figuras 1 a 8). Todas etapas de un proceso biotecnológico único, y parte de un proyecto industrial sólo desarrollado en Chile.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un método de purificación de una producción industrial de las ficotoxinas neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, que presenta y mantienen su actividad biológica durante todo el proceso industrial de purificación, a partir de cianobacterias productoras de estas ficotoxinas.

Las cianobacterias productoras de estas ficotoxinas pertenecen a los géneros: Cylindrospermopsis sp., Mycrocistis sp. , Anabaena sp., Gomphosphaeria sp., Oscillatoria sp. , Aphanizomenon spp. {Aphanizomenon issatchenkoi , Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile) .

El material de partida es un cultivo unialgal de una especie de cianobacteria; el que sea unialgal, es indispensable para la obtención de estas ficotoxinas purificadas con altos rendimientos. Esto corresponde a un proceso de crecimiento y escalamiento a nivel industrial, para obtener una alta cantidad de ficotoxinas en el material de partida.

Las cianobacterias se obtienen por el desarrollo de un método y procedimiento de cultivo continuo, en condiciones controladas, masivo, semi-automático y de crecimiento logarítmico permanente de cianobacterias, descrito en la solicitud de patente chilena correspondiente al mismo solicitante y presentada simultáneamente con esta solicitud y con número de solicitud de patente Chilena CL 722-2009.

Durante el proceso de cultivo de estas especies de cianobacterias, las ficotoxinas se acumulan en el interior de las células, pero también, se liberan al medio de cultivo, teniendo de esta manera dos fuentes de ficotoxinas.

Por ejemplo, en el cultivo de Aphanizomenon gracile, el componente mayoritario liberado desde la cianobacteria es neosaxitoxina (Figura 2 y 4).

Por lo tanto, existen dos fuentes posibles de obtención de ficotoxinas a partir de un cultivo industrial de cianobacterias : a partir de los sobrenadantes filtrados (sin células y filamentos) del medio de desarrollo de la cianobacteria ; a partir de los pellet húmedos obtenidos por centrifugación del cultivo en desarrollo, que está compuesto por células y filamentos de la cianobacteria.

La obtención de las ficotoxinas de interés, que depende en cada caso de la cianobacteria productora cultivada, puede ser obtenida para cualquiera de las cianobacterias mencionadas, tanto desde sobrenadante como desde pellet obtenido .

La producción industrial de las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, a partir de cianobacterias en cultivo continuo, se realiza por un método de extracción, fraccionamiento, partición por solventes, participación en fases sólidas, y partición en fases liquidas-sólidas de estas ficotoxinas (neosaxitoxina, saxitoxina, y gonyaulatoxinas) a partir de células del cultivo (pellet) o el sobrenadante del cultivo. El proceso involucra procedimientos químicos y bioquímicos en varias etapas de fraccionamiento por centrifugación diferencial, extracción con solventes acuosos y orgánicos, partición en fase de solventes hidrofóbicos, partición en fases sólidas, purificación a través de columnas y diversos tipos de cromatografías de alta resolución preparativas (intercambio catiónico, aniónico y separación por tamaño) , hasta obtener extractos parcialmente purificados, sin pigmentos correspondientes a fracciones de perfiles de ficotoxinas simples y a partir de ellos ficotoxinas puras (Figuras 1 a 8). El enfoque fundamental está dirigido a obtener un principio activo, estable que mantenga toda su potencia en su actividad biológica, de tal manera que este principio activo sea utilizado como base para el desarrollo de nuevos productos farmacéuticos.

En una forma simplificada, el método de purificación de las ficotoxinas de la invención comprende los siguientes pasos : a. obtener un pellet y/o un sobrenadante de un cultivo de cianobacterias; b. si la fuente es un pellet, lisar las cianobacterias por los medios convencionales de lisado de células c. realizar una extracción en frío usando una mezcla de solventes orgánicos en fase acuosa; y separar las fases acuosa y orgánica del punto anterior, siendo la fase acuosa la fase de interés, ya que estas ficotoxinas son solubles en agua ; d. concentrar la fase acuosa obtenida en la etapa c) ó el medio de la etapa a) al menos 10 veces en volumen; e. centrifugar la fase acuosa concentrada; f. pasar el sobrenadante por una matriz sólida de tierra de diatomeas, las ficotoxinas quedan retenidas en la columna de diatomea, y deben ser eluidas con una solución de elusión; g. pasar el eluato que contiene las ficotoxinas por una matriz de carbón activado, nuevamente las ficotoxinas quedan retenidas en la columna de carbón activado, y deben ser eluidas con una solución de elusión; h. pasar el eluato del paso anterior que comprende las ficotoxinas nuevamente por una matriz sólida de tierra de diatomeas, lavar y eluir; i. evaporar los componentes orgánicos del eluato del punto anterior, obteniendo un extracto de ficotoxinas parcialmente purificado; j . someter el extracto de ficotoxinas parcialmente purificado obtenido a un proceso bioquímico de separación y fraccionamiento por HPLC preparativa (HPLC-Prep: cromatografía líquida de alta resolución preparativa) en varios pasos, según el principio físico o químico de fraccionamiento utilizado, que pueden comprender secuencialmente : separación por tamaño, intercambio aniónico, intercambio catiónico y nuevamente separación por tamaño. k. De este modo obtenemos preparados de ficotoxinas puras, adecuadas para fines farmacéuticos y cosméticos. 1. El método de la presente invención, proporciona por primera vez en la técnica, un procedimiento para purificar ficotoxinas, tales como neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, a partir de cianobacterias productoras de estas ficotoxinas. m. Este método comprende proporcionar una cantidad adecuada de una fuente de ficotoxinas, como por ejemplo un cultivo de cianobacterias, el medio de cultivo donde crecen las cianobacterias en dicho cultivo o un pellet de cianobacterias . n. En caso de provenir desde un cultivo de cianobacterias, las células se separan del medio de cultivo, como por ejemplo usando una etapa de centrifugación. Se obtiene asi una fase liquida acuosa correspondiente al medio de cultivo y un pellet húmedo correspondiente a las cianobacterias. Los pellets de cianobacterias pueden ser congelados o procesados directamente, la etapa de congelamiento no afecta la posterior purificación de las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas. o. Los pellet obtenidos se lisan usando métodos apropiados, conocidos en la técnica, tales como homogenización, extracción por solventes (fase orgánica/fase acuosa) , molino de perlas, ciclos de congelación/descongelación, ultrasonicación, lisis enzimática, entre otros. p. El material proveniente de la lisis de cianobacterias , se somete a una extracción en frío usando una mezcla de solventes orgánicos en fase acuosa (cloroformo:metanol 1:1 más ácido acético en una concentración de lOmM que comprende un 50% del volumen de la mezcla anterior) , posteriormente se realiza una separación de fases orgánica / acuosa, con una fase orgánica a pH 5 de cloroformo : metanol 1:1 en volumen que se repite entre 1 y 5 veces. Se recolectan todas las fases acuosas obtenidas en las repeticiones, constituyendo estas una única fase acuosa con la que se prosigue el procedimiento.

La fase acuosa obtenida o el sobrenadante del medio de cultivo se concentra, usando por ejemplo, un rotor vaporizador, a temperatura ambiente, hasta alcanzar una concentración de entre 5 y 20 veces el volumen original.

El concentrado se somete a centrifugación a velocidades de entre 15,000xg hasta 25,000xg por periodos de tiempo de entre 10 y 40 minutos.

El sobrenadante del centrifugado se hace pasar por una columna de tierras de diatomeas, lavando la columna con entre 5 y 15 veces su volumen con una solución apropiada, como por ejemplo, ácido acético 50mM. Se eluye la ficotoxina con una solución apropiada, como por ejemplo una mezcla alcohólica de extracción, etanol : agua : ácido acético 5 mM en una proporción de 2:1:1 vol/vol/vol) El eluato obtenido en el paso anterior se hace pasar por columnas de carbón activado, se lavan las columnas con agua destilada para eliminar pigmentos e impurezas retenidas. En las columnas quedan las ficotoxinas que se eluyen con una solución apropiada, como por ejemplo, una mezcla alcohólica de elusión etanol : agua : ácido acético 1 mM en una proporción de 3:2:1 vol/vol/vol) a pH 5.

El eluato de la etapa anterior nuevamente se hace pasar por una columna de tierra de diatomeas. Se lavan las columnas con una solución apropiada usando un volumen equivalente a 10 veces el volumen de la matriz de ácido acético 50mM y se eluyen las ficotoxinas con una solución apropiada, como por ejemplo por extracción por solvente con una mezcla alcohólica apropiada a pH 5, por ejemplo de cloroformo/metanol/agua; 1:1:1 vol/vol/vol.

El eluato de la etapa anterior se deja en fase acuosa, evaporando los solventes orgánicos, usando por ejemplo un equipo "speed vac" (Savant, NY, USA) . Se obtiene un extracto de ficotoxina parcialmente purificado.

El extracto parcialmente purificado de la etapa anterior se somete a HPLC preparativa (cromatografía líquida de alta resolución preparativa) en varios pasos, que pueden comprender secuencialmente : separación por tamaño, intercambio aniónico, intercambio catiónico y nuevamente separación por tamaño. La realización de varias cromatografías sucesivas garantiza una pureza analítica, apta para los requerimientos de la industria farmacéutica. No obstante, en ciertos casos, dependiendo del grado de pureza requerido las ficotoxinas, pueden purificarse utilizando sólo una etapa de HPLC-Prep.

Debe entenderse que los valores mencionados de las proporciones de los ingredientes de cada solución, concentraciones de ingredientes o valores de pH pueden variar en un intervalo de ±5% sin alterar el resultado de la invención .

En forma más detallada y esquemática, el método de purificación de la invención puede definirse en los siguientes pasos: a. Se proporciona una cantidad adecuada de una fuente de ficotoxinas, por ejemplo el cultivo de la cianobacteria pura, de acuerdo a lo descrito en la solicitud chilena "cultivo de cianobacteria productora de neosaxitoxina y saxitoxina a escala industrial", del mismo solicitante y presentada en la misma fecha de la presente solicitud (CL 722-2009) .

• Separación de las células y el medio de cultivo mediante centrifugación. Se utilizan volúmenes de 1 L de cultivo, obtenido de cada reactor y se centrifuga a 10.000 x g durante 25 minutos, obteniéndose un sobrenadante y un precipitado o pellet húmedo de cianobacteria .

• Etapa opcional de congelamiento de los pellets obtenidos. Se pueden congelar para purificar después o se comienza a purificar de inmediato. b. Se lisa el pellet obtenido, con un método preferido de lisis de pellet, este se pesa y se agrega el mismo volumen en peso de la mezcla de solventes orgánicos en fase acuosa (cloroformo: metanol; 1:1 + ácido acético 10 mM volumen 50% de la mezcla anterior) , para destruir la pared celular y membrana plasmática. Esto en medio levemente ácido (pH 5,0). Un pH levemente ácido, es un hecho importante y único, que permite la estabilidad del principio activo. c. El material proveniente de la lisis se somete a una extracción en frío y separación de fases (orgánica / acuosa) .

• Se repite la extracción de la fase orgánica obtenida.

• Se juntan las dos fases acuosas obtenidas.

• La fase acuosa se extrae dos veces con fase orgánica a pH 5,0. Igual volumen de mezcla cloroformo: metanol ; 1:1 vol/vol) . d. La fase acuosa así extraída, se concentra 10 veces su volumen (se obtiene un décimo del volumen inicial) , utilizando por ejemplo un rotor vaporizador a temperatura ambiente . e. el concentrado se somete a una centrifugación, preferentemente a 20.000 x g por 30 minutos. f . La fase acuosa, sobrenadante de la centrifugación, se trata con matriz sólida de tierras de diatomeas que consiste en hacer pasar el sobrenadante obtenido a través de una columna de tierra de diatomeas. Se lava la columna, con ácido acético 50 mM, en un cantidad preferentemente 10 veces el volumen de la columna y se extrae la ficotoxina retenida en la columna con una mezcla alcohólica de extracción o amortiguador de elución (etanol: agua: ácido acético 5 mM; 2 : 1 : 1 vol/vol/vol) g. El eluato de la columna, obtenido en el punto anterior, se hace pasar ahora por columnas de carbón activado, se lavan las columnas con agua destilada para eliminar pigmentos e impurezas retenidas. En las columnas quedan las ficotoxinas que se eluyen con una mezcla alcohólica de elusión (etanol: agua: ácido acético 1 mM; 3: 2: 1 vol/vol/vol) pH 5.0 Este fraccionamiento, elimina gran parte de los pigmentos y moléculas de bajo peso molecular mas frecuentes del lisado de cianobacteria, como son aminoácidos, bases nucleotidicas, péptidos, azúcares, (monosacáridos y disacáridos) . h. Nuevamente se realiza una elusión diferencial desde matrices sólidas empleando Tierras de diatomeas. Columnas de tierra de diatomeas se cargan con el extracto eluido de carbón activado. Aquí nuevamente quedan las ficotoxinas unidas a la matriz sólida por interacción de efecto hidrofóbico. Inicialmente se lavan estas columnas, donde se eluyen gran parte de los compuestos contaminantes de bajo peso molecular, que corresponden a fracciones que se eliminan. Las ficotoxinas quedan retenidas, posteriormente, se eluye la toxina desde la columna por extracción por solvente con una mezcla de cloroformo/metanol/agua ; 1:1:1 vol/vol/vol. El uso de columnas de tierra de diatomeas, genera un fraccionamiento estratificado total. Este procedimiento masivo y para grandes cantidades, al ser usados en una técnica Batch, no genera este fraccionamiento que se logra con las columnas. También es un efecto sorprendente, que el sólo hecho de modificar la técnica de Batch a columna, produce una gran pre-purificación inicial de material masivo e industrial, con el consecuente ahorro en costos, además de la gran eficiencia. i. El eluato de la 2a columna de tierra de diatomeas se deja en fase acuosa, evaporando los solventes orgánicos, por ejemplo con "speed vac" (Savant, NY, USA) . Se obtiene un extracto de ficotoxina parcialmente purificado. j . Este extracto parcialmente purificado se somete a HPLC preparativa (HPLC-Prep: cromatografía líquida de alta resolución preparativa) .

A) Separación por tamaño (HPLC preparativa) : Para esto se utiliza, por ejemplo columnas de acero inoxidable de alta presión, rellenas con bio-gel p-2 (Bio-rad) Fine 45-90 micrones (wet) . Estas columnas son de 10 centímetros de diámetro y 85 centímetros de largo, empacadas a presión con resina seca de bio-gel p-2 y que presenta un volumen de exclusión de 1800 daltons. Esta resina separa, en el volumen vacío (Vo) , cualquier molécula de tamaño mayor y que presente un peso molecular sobre 1800 daltons. De esta manera salen en las fracciones iniciales (al frente de la corrida) , todas las macromoléculas e incluidos pequeños péptidos de 10 aminos ácidos, quedando retenidas los compuestos de menor peso molecular como son estas ficotoxinas (298 a 445 daltons) . Usando esta resina de separación por tamaño, se elimina el 90 % del material orgánico no deseado, incluido una gran cantidad de pigmentos propios de estas cianobacterias . Todos estos compuestos y las macromoléculas solubles salen en las primeras fracciones (5 primeros litros eluidos) . Las fracciones intermedias muy cercanas a las finales, son las que contienen las ficotoxinas. En las fracciones finales, sale gran parte de la sal presente en los extractos. El uso de resina para separación por tamaño, es un concepto totalmente innovador, especialmente en la forma que se utiliza aqui. Las columnas de fraccionamiento son de diseño propio de esta invención, no sólo por su tamaño, si no que en la forma como se llenan las columnas. Este paso de purificación es trascendental, eficiente y entrega prácticamente el principio activo parcialmente purificado. Todos los fraccionamientos de cromatografía líquida preparativas usados desde aquí en adelante, poseen este proceso biotecnológico innovador de llenado de columna con matriz sólida a alta presión, lo que genera superficies de intercambio prácticamente ilimitadas y totalmente apropiadas para procesos industriales de purificación de principio activos masivos. También en estos procesos de HPLC preparativos, se debe mencionar la rapidez del proceso, cuestión fundamental para lograr un compuesto puro y adicionalmente biológicamente activo. La figura 9, muestra un gráfico de elución de cromatografía preparativa, que ejemplifica este paso de separación por tamaño. Las fracciones que presentan a las ficotoxinas, se concentran y luego se les aplica en un segundo proceso de separación que corresponde a un intercambio aniónico. La separación por tamaño sirve además, para eliminar la mayor cantidad de sales presentes en estos extractos y que no fueron totalmente eliminados en los fraccionamientos de fases realizados inicialmente en este proceso de purificación. Esto es importante, pues estas sales intervendrían en los procesos de intercambio iónicos. Por lo tanto, en esta separación no sólo se eliminan las macromoléculas y moléculas de peso molecular sobre 1800 daltons, sino que también el mayor porcentaje del contenido de sales de bajo peso molecular (sodio 23, cloruros 35, etc . ) .

B) Intercambio aniónico: En forma similar a como se realizaron las columnas preparativas, usando resina útil para separar por tamaño, se montan columnas iguales, pero ahora utilizando resina de Intercambio aniónico. Aquí se usa cellex-d (Bio-rad) con una capacidad de intercambio de 0.66 miliequivalentes por gramos. En esta cromatografía preparativa, las ficotoxinas que tienen carga neta positiva (+2 y +1) a pH neutro, eluyen en las primeras fracciones (2.5 litros iniciales) , pues no se retienen en la columna por tener carga positiva. Por lo tanto, eluyen en el volumen vacío. En estas columnas, sólo se retienen los compuestos que presentan carga negativa, los cuales quedan atrapados en la columna y son eluídos al final de la cromatografía, en fracciones que no tienen ficotoxinas, y que por ende, son eliminadas. La fracción inicial que contiene el total de ficotoxinas, es nuevamente concentrada ( liofilizador industrial) y se aplica ahora en columnas preparativas para intercambio catiónico. Esta fracción es prácticamente pura en ficotoxinas con carga neta +2 (Neosaxitoxina y saxitoxina) y carga neta +1 (gonyaulatoxinas) .

C) Intercambio catiónico: En esta cromatografía preparativa (columnas iguales dimensiones a las anteriores, rellenas con bio-rex® 70 de Bio-rad) , se quedarán retenidas los ficotoxinas, las cuales se separarán en dos grandes grupos: las con carga neta +2 y las con carga neta +1. Se eliminará en la fracciones iniciales, el poco de sales minerales con carga negativa (se miden por conductividad eléctrica) , y luego se eluyen la gonyaulatoxinas, para finalmente eluir la saxitoxina y la neosaxitoxina. Estas ultimas dos ficotoxinas separadas, y se mantiene una fracción que contiene una mezcla de las dos ficotoxinas, con- una proporción de 2/3 de neosaxitoxina y 1/3 de saxitoxina. La fracción final y última en eluir, prácticamente sólo contiene neosaxitoxina pura.

D) Por último, varias fracciones finales de intercambio catiónicos concentradas, se vuelven a separar en las columnas de resina de separación por tamaño bio-gel p-2 (proceso idéntico al proceso descrito en A) , para eliminar los restos de sal y obtener neosaxitoxina pura eluida en agua destilada .

Debe entenderse que los valores mencionados de las proporciones de los ingredientes de cada solución, concentraciones de ingredientes o valores de pH pueden variar en un rango de +5% sin alterar el resultado de la invención.

Las ficotoxinas susceptibles de ser purificadas con el método anteriormente descrito, corresponden a neosaxitoxina, saxitoxina y guanyaulotoxinas . La obtención de una toxina en particular, dependerá de la cepa de cianobacteria desde la cual se realiza la purificación, debido a que ciertas cepas producen preferentemente un tipo de ficotoxina en particular. Como criterio de separación y fraccionamiento, se consideran los tiempos de retención característicos del compuesto de interés (ficotoxinas) , como se presenta a continuación en los ejemplos de la presente solicitud.

La pureza de cada stock (lote) se puede determinar por espectroscopia visible y ultravioleta, además de espectroscopia de masa. La detección y cuantificación final se puede realizar por espectrofluorometría . Este último método analítico de detección cuantitativo, es específico para todas las ficotoxinas, como neosaxitoxina, saxitoxina y guanyaulatoxinas (Lagos, 1998. Microalgal blooms: a global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31: 375-386).

EJEMPLOS Ejemplo 1: ficotoxinas obtenidas y purificadas a partir de Aphanizomenon gracile mantenida en cultivo continuo y en condiciones controladas.

Como ya se ha indicado, en el cultivo de Aphanizomenon gracile, con un clon seleccionando y único, la ficotoxina mayoritariamente producida es neosaxitoxina . En este caso particular, este clon también produce una cantidad menor de saxitoxina .

La producción de neosaxitoxina a partir de cianobacterias de Aphanizomenon gracile, se realizó a partir de una cantidad inicial de 10 miligramos de pellet de células húmedas de Aphanizomenon gracile. El pellet obtenido (etapa a.) se sometió al método descrito en la memoria descriptiva, a saber: b. para los 10 mg de pellet se agregó 10 mL, mismo volumen en peso de la mezcla de solventes orgánicos en fase acuosa (cloroformo: metanol; 1:1 + ácido acético 10 mM volumen 50% de la mezcla anterior) , para destruir la pared celular y membrana plasmática. Esto en medio levemente ácido (pH 5, 0) . c. Las células lisadas de la etapa b. se someten a una extracción en frió y separación de fases (orgánica / acuosa) . d. La fase acuosa extraída según la letra c, se concentra 10 veces su volumen (se obtiene un décimo del volumen inicial) , utilizando por ejemplo un rotor vaporizador a temperatura ambiente. e. El concentrado se somete a centrifugación a 20.000 x g por 30 minutos. f. El sobrenadante de la centrifugación, 2 mL, se hace pasar a través de una columna de tierra de diatomeas. Esta columna se lava con 10 veces su volumen, en este caso 20 mi con ácido acético 50 mM. Después del lavado se extrae la neosaxitoxina retenida en la columna, con una mezcla alcohólica de extracción (Etanol: Agua: Ácido Acético 5 mM; 2 : 1 : 1 vol/vol/vol) , 5mL g. El eluato de la columna, obtenido en la letra f, se hace pasar por columnas de carbón activado, se lavan las columnas con agua destilada para eliminar pigmentos e impurezas retenidas. En las columnas quedan las ficotoxinas que se eluyen con una mezcla alcohólica de elusión (etanol: agua: ac. acético 1 mM; 3: 2: 1 vol/vol/vol) pH 5, en 10 mL h. El eluato se hace pasar por 1 columna de tierra de diatomeas, se lava con ácido acético 50 mM. Posteriormente, se eluye la toxina desde la columna con una mezcla de cloroformo/metanol/agua; 1:1:1 vol/vol/vol, 5 mL. i. El eluato de la 2a columna de tierra de diatomeas, se deja en fase acuosa, evaporando los solventes orgánicos con "speed vac" (Savant, NY, USA) . Se obtiene un extracto de neosaxitoxina parcialmente purificado. j . El extracto parcialmente purificado se somete a HPLC preparativa (cromatografía líquida de alta resolución preparativa), separación por tamaño.

Cada reactor después de dos días de cultivo produce en promedio del orden de 652.4 microgramos de toxina total por cada litro cosechado. La razón promedio entre neosaxitoxina/ saxitoxina es de 8.47. En porcentajes, se obtiene un promedio aproximado de 11.8 % de saxitoxina y 88.2 % de neosaxitoxina. Siendo evidentemente la producción de neosaxitoxina la que se busca, se realza y se protege, por ser este compuesto, el principio activo que se patenta en las aplicaciones clínicas como fármaco o como cosmético, neosaxitoxina es un 25 % más potente en su efecto biológico que saxitoxina y además es la ficotoxina más potentes de todas las descritas hasta ahora.

Las figuras 1, 2 y 4 muestran cromatogramas de corridas de HPLC detectadas con fluorescencia en línea, que describe un perfil de ficotoxinas producidas por la especie Aphanizomenon gracile . Las figuras 1 y 2 describen los perfiles HPLC de fracciones en distintos grados de purificación de extractos de Aphanizomenon gracile . Nuevamente, es importante recordar que estos son cromatogramas de cromatografías líquidas de alta resolución analíticas, que se realizan para detectar y cuantificar las ficotoxinas. No son los cromatogramas preparativos del proceso industrial. En el fondo, estos cromatogramas sólo sirven para mostrar el grado de pureza y el contenido de cada fracción purificada.

En la figura 1, se presenta un cromatograma de un extracto no purificado de Aphanizomenon gracile para ser cuantificado y conocer el perfil de ficotoxinas presentes en este extracto original. El cromatograma presenta un perfil simple con cantidades mayoritarias de neosaxitoxina y menor cantidad de saxitoxina (menos de un 13%) .

En la figura 2, se aprecia la purificación de 10 microlitros de extracto de Aphanizomenon gracile en cultivo continuo y bajo condiciones controladas purificado parcialmente por cromatografía líquida de alta resolución preparativa de separación por tamaño (exclusión por tamaño) . En este extracto purificado parcialmente ya se presenta un pico a Rt = 9.373 minutos que satura el cromatograma y corresponde a y neosaxitoxina, indicando gran cantidad de neosaxitoxina en esta fracción.

En la figura 4, se aprecia neosaxitoxina purificada a partir de extractos de cianobacterias Aphanizomenon gracile (Rt = 4.933 minutos), que se obtiene en la fracción elusión de HPLC en columnas de intercambio iónico, que corresponde a la última etapa de purificación (etapa final del método anteriormente descrito) . Se obtiene un solo pico que corresponde a un solo componente que en este caso es neosaxitoxina pura.

TABLA 2: Producción de neosaxitoxina y saxitoxina en función del número de filamentos y pellet peso húmedo de Aphanizomenon gracile.

STX: saxitoxina neoSTX: neosaxitoxina Ciano fil: filamentos de cianobacteria * Los filamentos de cianobacterias corresponden a asociaciones de 20 a 100 células de cianobacterias. Estas cianobacterias forman filamentos en solución y estos son los que se cuentan usando microscopio de fase invertida.

Los rendimientos obtenidos corresponden a una producción sorprendente, no esperada de ficotoxinas puras (neosaxitoxina y saxitoxina) por miligramo de cianobacteria húmeda, cuando se compara a la producción de filamentos y pellet de cianobacterias puestas en cultivo en condiciones habituales y descritas hasta ahora; en frascos pequeños de cultivo, sin micro-aeración continua y con ciclos de luz: día y sin luz : noche .

En el ejemplo descrito aquí, las cianobacterias están siempre en crecimiento logarítmico, con luz permanente las 24 horas y cosechando permanentemente las cianobacterias, induciendo un permanente crecimiento, mediante el aporte de nutrientes nuevos en volúmenes equivalentes al volumen cosechado en cada recambio.

Ejemplo 2: ficotoxinas obtenidas y purificadas a partir de cylindrospermopsis raciborskii mantenida en cultivo continuo y en condiciones controladas.

Se cultivó la cianobacteria Cylindrospermopsis raciborskii de acuerdo al método de cultivo continuo, en condiciones controladas, masiva, semi-automático y de crecimiento logarítmico permanente, descrito en la solicitud de patente chilena correspondiente al mismo autor y presentada simultáneamente con esta solicitud.

El extracto de la cepa Cylindrospermopsis raciborskii no purificado presenta un perfil cromatográfico de acuerdo a la figura 6. C. raciborskii presenta un perfil de toxina, donde predominan GTX 3 y GTX 2 con los mayores tiempos de retención en la columna (los dos últimos picos a la derecha respectivamente) .

El extracto de C. raciborskii obtenido del cultivo continuo, se somete al proceso de purificación correspondiente a las etapas ya señaladas en las mismas condiciones que en el ejemplo 1 y ya en la etapa de HPLC preparativa por separación por tamaño, se obtiene casi exclusivamente los efímeros GTX3 y GTX2 de guanyaulatoxinas, como se muestra en la figura 7.

La fracción final del ' método de purificación de ficotoxinas a partir de C. raciborskii , tiene solamente GTX3 y GTX2, como se muestra en la figura 8 y se pueden de esta manera colectar las fracciones correspondientes a cada guanyaulatoxina para obtener fracciones puras y en gran cantidad de GTX3 y GTX2.

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como prioridad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Método de purificación industrial de ficotoxinas biológicamente activas, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar una cantidad adecuada de una fuente de ficotoxinas, como por ejemplo el cultivo de un clon de cianobacterias , que se separa en el medio de cultivo y un pellet de cianobacterias; el medio de cultivo donde crecen las cianobacterias; un pellet húmedo de cianobacterias ó un pellet congelado de cianobacterias; b) si la fuente de ficotoxinas es un pellet, este último se lisa usando métodos apropiados, tales como homogenización, extracción por solventes (fase orgánica/fase acuosa) , molino de perlas, ciclos de congelación/ descongelación, ultrasonicación, lisis enzimática entre otros, c) el material proveniente de la lisis de cianobacterias, se somete a una extracción en frió y separación de fases orgánica/acuosa (mezcla cloroformo: metanol; 1:1 en 50 % y ácido acético 1 ri en 50% v/v, pH entre 4 y 5, siempre en medio levemente ácido estrictamente necesario para la mantención de la actividad biológica del principio activo d) obtener un concentrado de la fase acuosa obtenida en la etapa (c) ó el medio de cultivo de la etapa (a) ; e) centrifugar el concentrado para obtener un sobrenadante ; f) pasar el sobrenadante por una columna de tierras de diatomeas, lavar la columna con una solución de lavado apropiada; luego se obtiene un eluato de la ficotoxina con una solución de elusión apropiada; g) el eluato obtenido en el paso anterior, se hace pasar por columnas de carbón activado, se lavan las columnas de carbón activado con agua destilada para eliminar pigmentos e impurezas retenidas; se eluyen las ficotoxinas con una solución de elusión apropiada; h) el eluato de la etapa anterior, nuevamente se hace pasar por una columna de tierra de diatomeas; las columnas se lavan con una solución apropiada (como en el paso f) y se eluyen las ficotoxinas con una solución de extracción apropiada; i) el eluato de la etapa anterior se deja en fase acuosa, evaporando los solventes orgánicos, obteniéndose un extracto de ficotoxina parcialmente purificado; j) el extracto parcialmente purificado de la etapa anterior, se somete a HPLC preparativa (HPLC-Prep: cromatografía líquida de alta resolución preparativa) en varios pasos, obteniendo la ficotoxina biológicamente activa pura .

2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la extracción por solventes en la etapa (b) se agrega el mismo volumen en peso de la mezcla de solventes orgánicos en fase acuosa (cloroformo: metanol; 1:1 + ácido acético 10 mM volumen 50% de la mezcla anterior, pH entre 4 y 6) , para destruir la pared celular y membrana plasmática .

3. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la extracción por solventes en la etapa (c) se repite 3 veces.

4. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración en la etapa (d) se realiza usando un rotor vaporizador, a temperatura ambiente, hasta alcanzar una concentración de entre 5 y 20 veces.

5. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la centrifugación en la etapa (e) se realiza a velocidades de entre 15000xg hasta 25000xg por períodos de tiempo de entre 10 y 40 minutos.

6. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (f) y (h) la solución de lavado apropiada es ácido acético 50mM, en el paso (f) la columna se lava con entre 5 y 15 veces su volumen, y la solución de elución apropiada es una mezcla alcohólica de extracción (etanol: agua: ácido acético 5 mM; 2 : 1 : 1 vol/vol/vol) .

7. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (g) la solución de elusión es una mezcla alcohólica de elusión (etanol: agua: ácido acético 1 mM; 3: 2: 1 vol/vol/vol) pH 5.

8. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (h) la solución de es una mezcla de cloroformo/metanol/agua; 1:1:1 vol/vol/vol.

9. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (i) la evaporación de solventes orgánicos se realiza en una centrifuga al vacio.

10. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa j) los pasos de cromatografía HPLC-prep son secuencialmente, separación por tamaño, intercambio aniónico, intercambio catiónico y separación por tamaño.

11. Método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque las ficotoxinas son del grupo compuesto por las neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas : gonyaulatoxina 2 y gonyaulatoxina 3.

12. Método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque las cianobacterias productoras de ficotoxinas son de los géneros Cylindrospermopsis sp, Mycrocistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaeria sp, Oscillatoria sp, Aphanizomenon sp y Lyngbya wollei.

13. Uso de las ficotoxinas obtenidas por el método descrito en las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque sirven para preparar productos farmacéuticos, en cosmética, en productos de aplicación clínica (patologías), en anestésicos locales, en patologías asociadas a hiperactividad muscular, y en control del dolor a nivel local y periférico.