WO2010109386A1 - Método de purificación industrial de ficotoxinas biológicamente activas - Google Patents

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Marcelo Santiago LAGOS GONZÁLEZ
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Proteus S.A.
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    • C07D487/16—Peri-condensed systems

Definitions

  • This invention relates to the industrial production, in large quantities, under controlled conditions and in continuous form of the paralytic ficotoxins neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins -gonyaulatoxin 2 and gonyaulatoxin 3- from cyanobacteria producing paralytic ficotoxins, and in particular with The purification of said ficotoxins.
  • ficotoxins have application in cosmetic or pharmaceutical products, for example in cosmetic products to fight wrinkles and expression lines, or in pharmaceutical products of clinical application such as local anesthetics, medications for the control of pathologies associated with muscular hyperactivity, for the control of pain at the local and peripheral level, that is, products for the improvement of quality of life.
  • the phytotoxins neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins are active components produced by harmful algal blooms, of the genera Alexandrium sp., Piridinium sp., And Gimnodinium sp., (Lagos, N. (1998) Microalgal blooms: A global issue with negative impact in Chile, Biol. Res. 31: 375-386).
  • these ficotoxins can also be produced by freshwater cyanobacteria, such as photosynthetic green-blue algae.
  • the active substance of these paralytic ficotoxins acts as a specific blocker of the sodium voltage dependent channels found in excitable cells (Kao, CY, 1966, Tetrodotoxin, saxitoxin and their significance in the study of excitation phenomenon. Pharm. Rev 18: 997-1049). Due to the inhibition of sodium channels, the transmission of the nerve impulse is blocked and in this way the release of neurotransmitters at the level of neuromotor plaque is prevented, which then prevents muscle contraction. Due to these physiological effects, these compounds are potentially useful pharmacologically, when used as inhibitors of muscle activity in pathologies associated with muscular hyperactivity, such as muscle spasms and focal dystonia, when applied in injectable form and locally.
  • a blockade is generated at the level of nerve impulse transmission, when applied as a local infiltration, they not only block the efferent neurotransmission pathways, but also block the afferent pathways and thus also cause inhibition of the sensory pathways, generating an anesthetic effect, both inseparable effects when injected locally. This is a surprising effect because both occur simultaneously (US Patent 4,001,413).
  • the invention presented here corresponds to the extraction, fractionation and purification of the paralytic ficotoxins neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins, starting with an innovative process of continuous cell cultures, under controlled conditions and in large quantities from cyanobacterial strains (green-blue algae ). Having as main objective the maintenance of the powerful biological activity of this active principle during the entire industrial purification process.
  • the cyanobacteria that produce paralytic ficotoxins belong to the genera: Cylindrospermopsis sp, Mycrocistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaer ⁇ a sp, Oscillatoria sp, Aphanizomenon sp (Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon Lycng. None of these cyanobacteria has been used, so far, in the production of phycotoxins at industrial levels.
  • the proposed method is the purification of ficotoxins from a clonal culture of cyanobacteria, which produces a simple profile of paralyzing ficotoxins (one or two ficotoxins or where a ficotoxin represents about 75% of the profile composition).
  • a strain that only produces neosaxitoxin and saxitoxin or only 2/3 gonyaulatoxins, as major components. Having returns over 75% of a pharmacologically active ingredient, it is also a surprising effect, which is achieved in this patented industrial process.
  • the field of application corresponds to the use of these alkaloids in clinics, as therapeutic agents in pathologies associated with muscular hyperactivity, such as, muscle spasms and focal dystonia. Additionally, its use as local anesthetics in different pharmaceutical preparations with a broad spectrum, allows these phycotoxins to be defined as very useful products in the treatment of various pathologies, many of them of great commercial demand. On the other hand, they can also be applied in cosmetic products to combat wrinkles and fine lines, applications of obvious commercial demand.
  • ficotoxins have very favorable physicochemical properties for applications in the field of medicine and the cosmetic industry. Their physical and chemical properties are: water soluble, stable at room temperature, highly resistant to acidic environments and extreme temperatures (about 100 ⁇ €), very low molecular weight (298-445 g / mol), which allows applications more easy, less dangerous and painless, with no allergic and immune response, unlike other compounds, such as, for example, the high molecular weight protein of botulinum toxin (Botox ®).
  • neosaxitoxin saxitoxin
  • gonyaulatoxins as superior alternatives to botulinum toxin
  • a compound widely used in dermocosmetics which is a protease that has the disadvantages of being unstable, high molecular weight, generates allergic immune response, which produces structural damage (it digests the nervous terminal and the surrounding terminals, producing unwanted adverse effects and currently questioned worldwide) and that digests itself in short periods of time.
  • neosaxitoxin neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins
  • Massive demand in the cosmetic field, backaches, migraines, anal fissure, pain control in laparoscopic surgeries and management of neuropathic pain in general, with millions of potential patients, raising an incalculable future demand for these compounds.
  • Table 1 shows the advantages of phycotoxins: neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins when compared, for example, against botulinum toxin (Botox®), with which they produce a similar physiological response, therefore both of similar applications in clinical and cosmetic therapy, although the action of each of them is by very different molecular mechanisms.
  • Botox® botulinum toxin
  • neoSTX STX neosaxitoxin: GTX saxitoxin: ACH gonyaulatoxin: acetylcholine
  • the general objective of the invention is the extraction, purification and industrial production of biologically active ficotoxins, components and secondary metabolites produced by cyanobacteria, which has great added and commercial value and are not commercially available, at industrial production levels.
  • the surprising thing about this invention is to achieve these biologically active compounds throughout the industrial process, being a unique and surprising biotechnological process.
  • a specific objective of the invention corresponds to a process of purification, massive, industrial and high yield of the biotoxins neosaxitoxina, saxitoxina and gonyaulatoxinas, biologically active, from practically unlimited levels of cyanobacterial strains produced in continuous culture and under controlled conditions.
  • Another specific objective of the invention is to achieve a process of purification of phycotoxins from wet and / or frozen cyanobacterial pellets, eliminating pigments, and other secondary secondary metabolites accompanying the phycotoxins in the purification process.
  • a third specific objective of the invention is to achieve a purification process of the phycotoxins released to the medium, from the culture medium in which the cyanobacteria are found. Having as a central objective, the biotechnological purification of the active principle, with a demonstrated powerful biological activity.
  • Figure 3 shows a chromatogram of an analytical standard that presents as main components neosaxitoxin and saxitoxin, with a little mixture of gonyaulatoxins (NL2 standard), determined and quantified by analytical high resolution liquid chromatography with online fluorescent detection.
  • First peak Rt 3,653 minutes, corresponds to a mixture of gonyaulatoxins;
  • second peak 2, Rt 5,040 minutes, corresponds to neosaxitoxin;
  • third peak, Rt 7,440 minutes saxitoxin.
  • Figure 5 shows a chromatogram of analytical standards for gonyaulatoxins. From left to right: Peak 1: GTX4 (gonyaulatoxin 4); Peak 2 GTX1 (Gonyaulatoxin 1); Peak 3 GTX 5 (Gonyaulotoxin 5); Peak 4 GTX 3 (Gonyaulatoxin 3); Peak 5 GTX2 (Gonyaulatoxin 2).
  • Figure 6 is a sample chromatogram of extract of cyanobacterial strain C. raciborskii.
  • First peak Rt 8,873 minutes
  • second peak Rt 10,927 minutes
  • third peak Rt 13,260 minutes
  • fourth peak 16,647.
  • Figure 7 is a partially purified fraction chromatogram by preparative high performance liquid chromatography by size separation (exclusion by size) of C. raciborkü with dominant presence of the GTX 3 and GTX 2 epimer respectively.
  • Figure 8 shows a chromatogram of the final pure fraction of the GTX 3 and GTX 2 epimer, obtained from cyanobacteria in continuous culture of C. raciborkü.
  • Figure 9 is an elution graph of a preparative size separation chromatography showing the fractions obtained and where the range of fractions are identified where the different components present (organic compounds, phycotoxins and salts) appear.
  • Figure 10 is an elution graph of a preparative anion exchange separation chromatography showing the fractions obtained and where the range of fractions where the different components present (phycotoxins and salts) are identified.
  • Figure 1 1 is an elution graph of a preparative cation exchange separation chromatography showing the fractions obtained and where the range of fractions where the different components present (phycotoxins and salts) are identified.
  • Figure 12 is an elution plot of a preparative size separation chromatography showing the fractions obtained and where the range of fractions where purified phycotoxins (saxitoxin, neosaxitoxin) are identified.
  • neosaxitoxin saxitoxin
  • gonyaulatoxins which are biologically active, from cultures of cyanobacteria producing these ficotoxins.
  • the cyanobacteria used can be of the genera: Cylindrospermopsis sp, Mycrocistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaeria sp, Oscillatoria sp, Aphanizomenon sp (Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile).
  • the cyanobacteria are preferably obtained from a continuous culture, under controlled, massive, semi-automatic conditions such as that described in the Chilean patent application corresponding to the same applicant and filed simultaneously with this application, CL 722-2009.
  • neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins from cyanobacteria in continuous culture is carried out by a method of extraction, fractionation, partition by solvents, participation in solid phases, and partition in liquid-solid phases of these ficotoxins ( neosaxitoxin, saxitoxin, and gonyaulatoxins) from culture cells (pellet) or culture supernatant.
  • Continuous, sequential and semi-automatic biotechnological process which generates industrial quantities of an active ingredient that maintain its biological activity throughout the purification process, until it reaches its final product.
  • the process involves chemical and biochemical procedures in several stages of fractionation by differential centrifugation, extraction with aqueous and organic solvents, phase partition of hydrophobic solvents, partition in solid phases, purification through columns and various types of preparative high resolution chromatographs ( cationic, anionic exchange and size separation), until partially purified extracts are obtained, without pigments, corresponding to fractions of simple ficotoxin profiles and from them pure phycotoxins ( Figures 1 to 8). All stages of a unique biotechnological process, and part of an industrial project only developed in Chile.
  • the invention relates to a method of purification of an industrial production of the phytotoxins neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins, which presents and maintains its biological activity throughout the industrial process of purification, from cyanobacteria producing these ficotoxins.
  • the cyanobacteria producing these ficotoxins belong to the genera: Cylindrospermopsis sp., Mycrocistis sp., Anabaena sp., Gomphosphaeria sp., Oscillator ⁇ a sp., Aphanizomenon spp. (Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile).
  • the starting material is a unialgal culture of a species of cyanobacteria; which is unialgal, is indispensable for obtaining these purified ficotoxins with high yields. This corresponds to a process of growth and scaling at the industrial level, to obtain a high amount of phycotoxins in the starting material.
  • the cyanobacteria are obtained by the development of a method and procedure of continuous culture, under controlled conditions, massive, semi-automatic and permanent logarithmic growth of cyanobacteria, described in the Chilean patent application corresponding to the same applicant and filed simultaneously with this application and with Chilean patent application number CL 722-2009.
  • the ficotoxins During the culture process of these cyanobacterial species, the ficotoxins accumulate inside the cells, but also, they are released into the culture medium, thus having two sources of ficotoxins.
  • neosaxitoxin ( Figure 2 and 4).
  • the obtaining of the phycotoxins of interest which depends in each case on the cultivated producing cyanobacterium, can be obtained for any of the mentioned cyanobacteria, both from supernatant and from pellets obtained.
  • neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins from cyanobacteria in continuous culture, is carried out by an extraction method, fractionation, partition by solvents, participation in solid phases, and partition in liquid-solid phases of these ficotoxins (neosaxitoxin, saxitoxin, and gonyaulatoxins) from culture cells (pellet) or culture supernatant.
  • the process involves chemical and biochemical procedures in several stages of fractionation by differential centrifugation, extraction with aqueous and organic solvents, phase partition of hydrophobic solvents, partition in solid phases, purification through columns and various types of preparative high resolution chromatographs ( cationic, anionic exchange and size separation), until partially purified extracts are obtained, without pigments corresponding to fractions of simple ficotoxin profiles and from them pure phycotoxins ( Figures 1 to 8).
  • the fundamental approach is aimed at obtaining an active, stable principle that maintains all its potency in its biological activity, so that this active principle is used as the basis for the development of new pharmaceutical products.
  • the method of purification of the phycotoxins of the invention comprises the following steps: a. obtain a pellet and / or a supernatant from a cyanobacterial culture; b. If the source is a pellet, lyse the cyanobacteria by conventional means of cell lysate c. perform a cold extraction using a mixture of organic solvents in the aqueous phase; and separating the aqueous and organic phases from the previous point, the aqueous phase being the phase of interest, since these ficotoxins are soluble in water; d. concentrate the aqueous phase obtained in stage c) or the medium of stage a) at least 10 times in volume; and. centrifuge the concentrated aqueous phase; F.
  • the method of the present invention provides, for the first time in the art, a method for purifying ficotoxins, such as neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins, from cyanobacteria producing these ficotoxins.
  • ficotoxins such as neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins
  • This method comprises providing an adequate amount of a source of phycotoxins, such as a culture of cyanobacteria, the culture medium where the cyanobacteria grow in said culture or a pellet of cyanobacteria.
  • a source of phycotoxins such as a culture of cyanobacteria
  • the cells are separated from the culture medium, such as using a centrifugation step.
  • An aqueous liquid phase corresponding to the culture medium and a wet pellet corresponding to the cyanobacteria are thus obtained.
  • the cyanobacterial pellets can be frozen or processed directly, the freezing stage does not affect the subsequent purification of the phycotoxins: neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins.
  • the pellets obtained are lysed using appropriate methods, known in the art, such as homogenization, solvent extraction (organic phase / aqueous phase), pearl mill, freeze / thaw cycles, ultrasonication, enzymatic lysis, among others.
  • the material from the cyanobacterial lysis is subjected to a cold extraction using a mixture of organic solvents in the aqueous phase (chloroform: methanol 1: 1 plus acetic acid in a concentration of 1 OmM comprising 50% of the volume of Ia previous mixture), subsequently an organic / aqueous phase separation is performed, with an organic phase at pH 5 of chloroform: methanol 1: 1 in volume that is repeated between 1 and 5 times. All the aqueous phases obtained in the repetitions are collected, these constitute a single aqueous phase with which the procedure is continued.
  • chloroform methanol 1: 1 plus acetic acid in a concentration of 1 OmM comprising 50% of the volume of Ia previous mixture
  • an organic / aqueous phase separation is performed, with an organic phase at pH 5 of chloroform: methanol 1: 1 in volume that is repeated between 1 and 5 times. All the aqueous phases obtained in the repetitions are collected, these constitute a single aqueous phase with which the
  • the aqueous phase obtained or the supernatant of the culture medium is concentrated, using, for example, a vaporizer rotor, at room temperature, until a concentration of between 5 and 20 times the original volume is reached.
  • the concentrate is subjected to centrifugation at speeds of between 15,000xg to 25,000xg for periods of time between 10 and 40 minutes.
  • the centrifugal supernatant is passed through a column of diatomaceous earth, washing the column with 5 to 15 times its volume with an appropriate solution, such as 5OmM acetic acid.
  • the ficotoxin is eluted with an appropriate solution, such as an alcoholic extraction mixture, ethanol: water: 5 mM acetic acid in a ratio of 2: 1: 1 vol / vol / vol)
  • the eluate obtained in the previous step is passed through activated carbon columns, the columns are washed with distilled water to remove retained pigments and impurities.
  • the columns are the phycotoxins that are eluted with an appropriate solution, such as, for example, an alcoholic mixture of elution ethanol: water: 1 mM acetic acid in a ratio of 3: 2: 1 vol / vol / vol) at pH 5.
  • the eluted from the previous stage is again passed through a column of diatomaceous earth.
  • the columns are washed with an appropriate solution using a volume equivalent to 10 times the volume of the 5OmM acetic acid matrix and the phycotoxins are eluted with an appropriate solution, such as by solvent extraction with an appropriate alcoholic mixture at pH 5, for example chloroform / methanol / water; 1: 1: 1 vol / vol / vol.
  • the eluted from the previous stage is left in the aqueous phase, evaporating the organic solvents, using for example a "speed vac” device (Savant, NY, USA). A partially purified ficotoxin extract is obtained.
  • the partially purified extract of the previous stage is subjected to preparative HPLC (preparative high resolution liquid chromatography) in several steps, which may include sequentially: size separation, anion exchange, cation exchange and again size separation.
  • preparative HPLC preparative high resolution liquid chromatography
  • the method of purification of the invention can be defined in the following steps: a.
  • An adequate amount of a source of phycotoxins is provided, for example the culture of pure cyanobacteria, according to what is described in the Chilean application "cultivation of cyanobacterium producing neosaxitoxin and saxitoxin on an industrial scale", of the same applicant and presented in Ia same date of the present application (CL 722-2009).
  • the aqueous phase is extracted twice with organic phase at pH 5.0. Equal volume of chloroform mixture: methanol; 1: 1 vol / vol). d.
  • the aqueous phase thus extracted is concentrated 10 times its volume (one tenth of the initial volume is obtained), using for example a vaporizer rotor at room temperature. and.
  • the concentrate is subjected to centrifugation, preferably at 20,000 xg for 30 minutes.
  • the aqueous phase, centrifugal supernatant is treated with a solid matrix of diatomaceous earths, which consists in passing the obtained supernatant through a diatomaceous earth column.
  • the column is washed, with 50 mM acetic acid, in an amount preferably 10 times the volume of the column and the retained ficotoxin is extracted in the column with an alcoholic extraction mixture or elution buffer (ethanol: water: 5 mM acetic acid ; 2: 1: 1 vol / vol / vol) g.
  • an alcoholic extraction mixture or elution buffer ethanol: water: 5 mM acetic acid ; 2: 1: 1 vol / vol / vol
  • the ficotoxins that are eluted with an alcoholic mixture of circumvention (ethanol: water: 1 mM acetic acid; 3: 2: 1 vol / vol / vol) pH 5.0
  • This fractionation eliminates a large part of the pigments and molecules of most frequent low molecular weight of the cyanobacterial lysate, such as amino acids, nucleotide bases, peptides, sugars (monosaccharides and disaccharides).
  • a differential circumvention is performed from solid matrices using Diatomaceous Lands. Diatomaceous earth columns are loaded with the eluted extract of activated carbon.
  • the ficotoxins are bound to the solid matrix by interaction of hydrophobic effect.
  • FIG. 9 shows an elution graph of preparative chromatography, which exemplifies this step of separation by size. The fractions they present at Phycotoxins are concentrated and then applied in a second separation process that corresponds to an anion exchange. The separation by size also serves to eliminate the greatest amount of salts present in these extracts and which were not totally eliminated in the phase fractionations initially performed in this purification process.
  • the ficotoxins that can be purified with the method described above correspond to neosaxitoxin, saxitoxin and guanyaulotoxins. Obtaining a particular toxin will depend on the cyanobacterial strain from which the purification is performed, because certain strains preferably produce a particular type of ficotoxin. As a criterion of separation and fractionation, the retention times characteristic of the compound of interest (phycotoxins) are considered, as presented below in the examples of this application.
  • each stock (lot) can be determined by visible and ultraviolet spectroscopy, in addition to mass spectroscopy.
  • the final detection and quantification is Can perform by spectroflurometry.
  • This last analytical method of quantitative detection is specific for all phycotoxins, such as neosaxitoxin, saxitoxin and guanyaulatoxins (Lagos, 1998. Microalgal blooms: a global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31: 375-386).
  • Example 1 phycotoxins obtained and purified from Aphanizomenon gracile maintained in continuous culture and under controlled conditions.
  • neosaxitoxin from cyanobacteria of Aphanizomenon gracile was made from an initial amount of 10 milligrams of wet cell pellets of Aphanizomenon gracile.
  • the pellet obtained (step a.) was subjected to the method described in the specification, namely: b. for the 10 mg of pellet, 10 mL was added, same volume by weight of the mixture of organic solvents in the aqueous phase (chloroform: methanol; 1: 1 + 10 mM acetic acid volume 50% of the previous mixture), to destroy the wall cell and plasma membrane. This in slightly acidic medium (pH 5.0).
  • C. The cells used of stage b.
  • the aqueous phase extracted according to letter c its volume is concentrated 10 times (one tenth of the initial volume is obtained), using for example a vaporizer rotor at room temperature. and. The concentrate is subjected to centrifugation at 20,000 xg for 30 minutes.
  • the centrifugation supernatant, 2 ml_ is passed through a diatomaceous earth column. This column is washed with 10 times its volume, in this case 20 ml with 50 mM acetic acid. After washing, the neosaxitoxin retained in the column is extracted with an alcoholic extraction mixture (Ethanol: Water: 5 mM Acetic Acid; 2: 1
  • the eluate of the column, obtained in the letter f, is passed through activated carbon columns, the columns are washed with distilled water to remove retained pigments and impurities.
  • the ficotoxins that are eluted with an alcoholic mixture of circumvention ethanol: water: 1 mM acetic acid; 3: 2: 1 vol / vol / vol) pH 5, in 1 O mL h.
  • the eluate is passed through 1 column of diatomaceous earth, washed with 50 mM acetic acid.
  • the toxin is eluted from the column with a mixture of chloroform / methanol / water; 1: 1: 1 vol / vol / vol, 5 ml_. i.
  • the eluted from the 2- column of diatomaceous earth is left in the aqueous phase, evaporating the organic solvents with "speed vac" (Savant, NY, USA).
  • a partially purified neosaxitoxin extract is obtained.
  • the partially purified extract is subjected to preparative HPLC (preparative high resolution liquid chromatography), size separation.
  • neosaxitoxin is 25% more potent in its biological effect than saxitoxin and is also the most potent ficotoxin of all those described so far.
  • Figures 1, 2 and 4 show chromatograms of HPLC runs detected with fluorescence in line, which describes a profile of phycotoxins produced by the Aphanizomenon gracile species.
  • Figures 1 and 2 describe the HPLC profiles of fractions in different degrees of purification of Aphanizomenon gracile extracts. Again, it is important to remember that these are high performance analytical liquid chromatography chromatograms, which are performed to detect and quantify the phycotoxins. They are not the preparative chromatograms of the industrial process. Basically, these chromatograms only serve to show the degree of purity and the content of each purified fraction.
  • a chromatogram of an unpurified extract of Aphanizomenon gracile is presented to be quantified and to know the profile of ficotoxins present in this original extract.
  • the chromatogram has a simple profile with major amounts of neosaxitoxin and less saxitoxin (less than 13%).
  • Cyanobacteria filaments correspond to associations of 20 to 100 cyanobacteria cells. These cyanobacteria form filaments in solution and these are the ones that are counted using inverted phase microscope.
  • the yields obtained correspond to a surprising, unexpected production of pure phycotoxins (neosaxitoxin and saxitoxin) per milligram of wet cyanobacteria, when compared to the production of filaments and pellets of cyanobacteria put into cultivation under usual conditions and described so far; in small culture jars, without continuous micro-aeration and with light cycles: day and without light: night.
  • cyanobacteria are always in logarithmic growth, with 24-hour permanent light and permanently harvesting cyanobacteria, inducing permanent growth, by providing new nutrients in volumes equivalent to the volume harvested in each exchange.
  • Example 2 phycotoxins obtained and purified from cylindrospermopsis raciborskii maintained in continuous culture and under controlled conditions.
  • the Cylindrospermopsis raciborskii cyanobacterium was cultured according to the continuous culture method, under controlled, massive, semi-automatic and permanent logarithmic growth conditions, described in the Chilean patent application corresponding to the same author and filed simultaneously with this application.
  • the extract of the strain Cylindrospermopsis raciborskii not purified has a chromatographic profile according to Figure 6.
  • C. raciborskii has a toxin profile, where GTX 3 and GTX 2 predominate with the longest retention times in the column (the last two peaks to the right respectively).
  • the extract of C. raciborskii obtained from the continuous culture is subjected to the purification process corresponding to the stages already indicated in the same conditions as in example 1 and already in the preparative HPLC stage by size separation, almost exclusively the ephemeral GTX3 and GTX2 of guanyaulatoxins, as shown in Figure 7.
  • the final fraction of the method of purification of ficotoxins from C. raciborskii has only GTX3 and GTX2, as shown in Figure 8 and can thus collect the fractions corresponding to each guanyaulatoxin to obtain pure and large quantities of GTX3 and GTX2.

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Abstract

Esta invención se relaciona con un método de purificación industrial de ficotoxinas biológicamente activas, que comprende proporcionar una cantidad adecuada de una fuente de ficotoxinas; si la fuente de ficotoxinas es un pellet, este último se lisa usando métodos apropiados; el material proveniente de la lisis de cianobacterias, se somete a una extracción en frío; obtener un concentrado de la fase acuosa obtenida en la etapa anterior ó del medio de cultivo de la primera etapa; centrifugar el concentrado para obtener un sobrenadante; pasar el sobrenadante por una columna de tierras de diatomeas y obtener un eluído de la ficotoxina; el eluído obtenido en el paso anterior, se hace pasar por columnas de carbón activado; el eluído de la etapa anterior, nuevamente se hace pasar por una columna de tierra de diatomeas; el eluído de la etapa anterior se deja en fase acuosa; el extracto parcialmente purificado de la etapa anterior, se somete a HPLC preparativa en varios pasos, obteniendo la ficotoxina biológicamente activa pura.

Description

MÉTODO DE PURIFICACIÓN INDUSTRIAL DE FICOTOXINAS BIOLÓGICAMENTE
ACTIVAS
CAMPO DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Esta invención se relaciona con Ia producción industrial, en grandes cantidades, bajo condiciones controladas y en forma continua de las ficotoxinas paralizantes neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas -gonyaulatoxina 2 y gonyaulatoxina 3- a partir de cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes, y en forma particular con Ia purificación de dichas ficotoxinas. Con el objetivo central de obtener un compuesto totalmente puro y que mantenga su potente actividad biológica hasta el final, donde se utiliza como materia prima para el desarrollo de un nuevo fármaco.
Estas ficotoxinas tienen aplicación en productos cosméticos o farmacéuticos, por ejemplo en productos cosméticos para combatir las arrugas y líneas de expresión, o en productos farmacéuticos de aplicación clínica tales como anestésicos locales, medicamentos para el control de patologías asociadas a hiperactividad muscular, para el control del dolor a nivel local y periférico, es decir productos para el mejoramiento de calidad de vida.
DESCRIPCIÓN DEL ARTE PREVIO
Las ficotoxinas neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas son componentes activos producidos por florecimientos algales nocivos, de los géneros Alexandrium sp., Piridinium sp., y Gimnodinium sp., (Lagos, N. (1998) Microalgal blooms: A global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31 : 375-386). En los últimos 15 años, se ha demostrado que además de ser producidas por los dinoflagelados en el mar, estas ficotoxinas también pueden ser producidas por cianobacterias de agua dulce, tales como las algas verdes- azules fotosintéticas.
Hasta ahora en Ia literatura se han identificado sólo 4 géneros de cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes, cada una de ellas con distinta composición, tanto en cantidad, como en tipos de ficotoxinas producidas, es decir con distintos perfiles de ficotoxinas paralizantes (Lagos, N., Onodera, H., Zagatto, P. A., Andrinolo, D., Azevedo, S.M.F.Q., and Oshima, Y., 1999, The first evidence of paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskü, isolated from Brazil. TOXICON, 37 : 1359 - 1373. Pereira, P., Onodera, H., Andrinolo, D., Franca, S., Araujo, F., Lagos, N., and Oshima, Y., 2000, Paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacteria Aphanizomenon flos-aquae, isolated from Montargil reservoir, Portugal. TOXICON, 38: 1689 - 1702.
El principio activo de estas ficotoxinas paralizantes, actúa como bloqueador específico de los canales de sodio voltaje dependiente, que se encuentran en las células excitables (Kao, C. Y., 1966, Tetrodotoxin, saxitoxin and their significance in the study of excitation phenomenon. Pharm. Rev. 18: 997-1049). Debido a Ia inhibición de los canales de sodio, se bloquea Ia transmisión del impulso nervioso y de esta forma se impide Ia liberación de neurotransmisores a nivel de placa neuromotora, Io que impide entonces Ia contracción muscular. Debido a estos efectos fisiológicos, estos compuestos son potencialmente útiles farmacológica mente, al usarlos como inhibidores de Ia actividad muscular en patologías asociadas a hiperactividad muscular, como son los espasmos musculares y distonías focales, cuando se aplica en forma inyectable y localmente. Adicionalmente, debido a que se genera un bloqueo a nivel de transmisión del impulso nervioso, cuando se aplican como una infiltración local, estos no sólo bloquean las vías eferentes de neurotransmisión, sino que además bloquean las vías aferentes y por ende producen también inhibición de las vías sensoriales, generando un efecto anestésico, ambos efectos inseparables al inyectarse localmente. Siendo este un efecto sorprendente pues ambos se dan simultáneamente (Patente US 4.001 .413).
Las ficotoxinas neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, en Ia actualidad no se encuentran disponibles comercialmente como un producto masivo, a pesar de sus grandes aplicaciones con fines terapéuticos y cosméticos. Es evidente que se requiere de un procedimiento industrial de producción de estos compuestos, para satisfacer su creciente demanda, relacionada con su gran cantidad de usos y aplicaciones clínicas y cosméticas recientemente desarrolladas.
La invención presentada aquí corresponde a Ia extracción, fraccionamiento y purificación de las ficotoxinas paralizantes neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, partiendo con un proceso innovador de cultivos celulares continuos, en condiciones controladas y en grandes cantidades a partir de cepas de cianobacterias (algas verdes - azules). Teniendo como objetivo central el mantenimiento de Ia potente actividad biológica de este principio activo durante todo el proceso industrial de purificación.
Las cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes pertenecen a los géneros: Cylindrospermopsis sp, Mycrocistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaería sp, Oscillatoria sp, Aphanizomenon sp (Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile), y Lyngbya wollei entre otros. Ninguna de estas cianobacterias se ha empleado, hasta ahora, en Ia producción de ficotoxinas a niveles industriales.
La producción industrial de ficotoxinas a partir de cianobacterias debe resolver dos problemas técnicos, que si bien están interrelacionados son diferentes entre sí. En primer lugar se debe generar una gran cantidad de biomasa productora de ficotoxinas, este problema técnico se resuelve en Ia invención protegida en Ia solicitud CL 722-2009 también de nuestra autoría. En segundo lugar, una vez producida Ia biomasa y las ficotoxinas estas últimas deben ser purificadas en ciertas condiciones, de manera que su principio activo sea farmacológicamente activo, mantenga su potente actividad biológica y que sus rendimientos sean masivos, este segundo problema técnico es el que se aborda en Ia presente invención.
El método propuesto es Ia purificación de ficotoxinas a partir de un cultivo clonal de cianobacteria, que produce un perfil simple de ficotoxinas paralizantes (una o dos ficotoxinas o donde una ficotoxina representa sobre el 75 % de Ia composición del perfil). Como por ejemplo, una cepa que sólo produzca neosaxitoxina y saxitoxina o sólo gonyaulatoxinas 2/3, como componentes mayoritarios. El tener rendimientos sobre el 75 % de un principio activo farmacológicamente, es también un efecto sorprendente, Io que se logra en este procedimiento industrial que se patenta.
La estructura química de estas ficotoxinas tiene una estructura general (I), y su estructura particular Ia definen los radicales R1 a R5, según se indica en Ia tabla:
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
La revelación de que estos alcaloides, son producidos por cianobacterias es muy reciente, sólo en los últimos 15 años se ha demostrado que corresponden a metabolitos secundarios; los cuales se encuentran dentro de las células, pero que también bajo ciertas condiciones, son liberados al medio de cultivo. Por Io tanto, en un cultivo continuo de cianobacterias, se generan dos fuentes de estos productos, Ia primera en el pellet celular y Ia segunda en el medio donde se cultivan las cianobacterias.
Para Ia producción industrial de estas ficotoxinas y para poder purificarlas es indispensable tener un cultivo masivo de estas cianobacterias, como el que se protege en Ia solicitud CL 722-2009 . Antes de el proceso descrito en Ia solicitud CL 722-2009, el desarrollo de procesos industriales de alto volumen para Ia obtención de las ficotoxinas, no había sido desarrollado aún, sin embargo estas se purificaban en laboratorios de investigación básica, a partir de mariscos contaminados con marea roja, con el objetivo de obtener unos pocos microgramos de estas ficotoxinas como estándares analíticos (patrones para ser usados como material de referencia en análisis químicos).
A Ia fecha, no existen publicaciones de procesos de purificación de estas ficotoxinas a partir de mariscos contaminados, y tampoco a partir de dinoflagelados a niveles industriales; en este caso los niveles industriales son considerados en un orden de magnitud de gramos de producción del metabolito o ficotoxina. Tampoco se ha publicado sobre aislamiento de ficotoxinas a partir de cianobacterias, Io que no es de extrañar, siendo las cianobacterias fuentes de estas ficotoxinas, sólo recientemente descritas en Ia literatura mundial (Lagos, 2003).
En esta solicitud de patente se presenta Ia purificación y producción industrial de neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas 2/3, usando un proceso biotecnológico innovador a partir de cianobacterias aisladas, clonadas y cuya producción industrial continua y en condiciones controladas, permiten Ia optimización de Ia producción de estas ficotoxinas; las cuales mantienen su potente actividad biológica durante todo el proceso industrial, generando un principio activo industrial útil para el desarrollo de nuevos fármacos. La integración de Ia propuesta de producción con las tecnologías a emplear, pasa por el escalamiento productivo de cianobacterias anteriormente descrito, que permiten acceder a Ia producción de ficotoxinas en cantidades necesarias como para usos masivos farmacológicos y el desarrollo de nuevos fármacos o principios activos de uso cosmético.
Las ventajas de Ia presente invención para producir estas ficotoxinas, a través de producción masiva y en condiciones controladas de cianobacteria, son:
• La disponibilidad de clones de cepas de cianobacterias seleccionadas y productoras de ficotoxinas con una composición única y perfil de toxina simple.
• Proceso de fácil purificación de las ficotoxinas y con un alto rendimiento.
• Relación costo - producción - rendimiento, muy favorable no logrado hasta ahora.
Campo de aplicación de Ia producción masiva de las ficotoxinas neosaxitoxina, saxitoxina y qonvaulatoxinas
El campo de aplicación corresponde al uso de estos alcaloides en clínica, como agentes terapéuticos en patologías asociadas a hiperactividad muscular, tales como, los espasmos musculares y distonías focales. Adicionalmente, su uso como anestésicos locales en diferentes preparados farmacéuticos de amplio espectro, permite definir a estas ficotoxinas como productos de gran utilidad en el tratamiento de diversas patologías, muchas de ellas de gran demanda comercial. Por otra parte, también pueden aplicarse en productos de carácter cosméticos para combatir las arrugas y líneas de expresión, aplicaciones de evidente demanda comercial. Sin embargo, estas ficotoxinas no están disponibles en el mercado en cantidades industriales al nivel de los requerimientos actuales, por esto el método de purificación, fraccionamiento y producción de neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, resuelve un problema biotecnológico que permanecía sin solución. La innovación propuesta aquí, permite satisfacer Ia gran demanda del mercado nacional e internacional por el principio activo de estas ficotoxinas puras, en gran escala, para sus usos terapéuticos, cosméticos y de otros productos que mejoren Ia calidad de vida de las personas.
Estas ficotoxinas presentan propiedades fisicoquímicas muy favorables para las aplicaciones en el campo de Ia medicina y de Ia industria cosmética. Sus propiedades físicas y químicas son las siguientes: solubles en agua, estables a temperatura ambiente, altamente resistentes a medios ácidos y a temperaturas extremas (sobre 100<€), bajísimo peso molecular (298 - 445 g/mol), Io que permite aplicaciones más fáciles, menos peligrosas e indoloras, sin respuesta alérgica e inmune, a diferencia de otros compuestos, como por ejemplo Ia proteína de alto peso molecular de Ia toxina botulínica (Botox ®).
Debido a estas propiedades físicas y químicas de las ficotoxinas, como son bajo peso molecular y gran estabilidad química, es posible realizar aplicaciones y desarrollos biotecnológicos de muchos productos y preparados farmacéuticos, como son el uso en cremas, geles, aplicaciones transdérmicas con aparatos de ultrasonido, infrarrojos y otros, parches de liberación controlada "patches" (parches pegados a Ia piel de aplicación lenta y continua). Todo esto debido a Ia gran estabilidad de estos compuestos y a Ia posibilidad adicional de permitir hacer reacciones químicas con uniones covalentes a otros compuestos químicos.
Estas ventajas posicionan a las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas como alternativas superiores a Ia toxina botulínica, compuesto utilizado ampliamente en dermocosmética, que es una proteasa que tiene las desventajas de ser inestable, de alto peso molecular, genera respuesta inmune alérgica, que produce daño estructural (digiere el terminal nervioso y los terminales aledaños, produciendo efectos adversos no deseados y actualmente cuestionados a nivel mundial) y que se digiere a si misma en periodos cortos de tiempo.
Las aplicaciones clínicas recientemente publicadas para las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, están abriendo mercados, para aplicaciones de demanda masiva: en el ámbito cosmético, dolores de espalda, migrañas, fisura anal, control de dolor en cirugías laparoscopicas y manejo del dolor neuropático en general, con millones de pacientes potenciales, planteando una demanda futura incalculable de estos compuestos.
En Ia tabla 1 , se indica las ventajas de las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas al compararlas, por ejemplo, contra Ia toxina botulínica (Botox®), con Ia cual producen una respuesta fisiológica similar, por Io tanto ambas de aplicaciones similares en terapia clínica y cosmética, aunque Ia acción de cada una de ellas es por mecanismos moleculares muy distintos.
TABLA 1 : Ventajas de las ficotoxinas respecto a toxina botulínica
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neoSTX: neosaxitoxina STX: saxitoxina GTX: gonyaulatoxina ACH: acetilcolina
La relativa facilidad en el cambio de los usuarios de Botox ®, al uso de los potenciales productos generados con ficotoxinas (neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas) debido a aplicaciones indoloras, de menor costo y de efecto instantáneo, generan ventajas competitivas de las ficotoxinas por sobre Botox ®. OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN
El objetivo general de Ia invención es Ia extracción, purificación y producción industrial de ficotoxinas biológicamente activas, componentes y metabolitos secundarios producidos por cianobacterias, que tiene gran valor agregado y comercial y que no se encuentran comercialmente disponibles, a niveles de producción industrial. Lo sorprendente de esta invención, es lograr estos compuestos biológicamente activos durante todo el proceso industrial, siendo un proceso biotecnológico único y sorprendente.
Un objetivo específico de Ia invención, corresponde a un proceso de purificación, masivo, industrial y de alto rendimiento de producción de las ficotoxinas neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, biológicamente activas, a partir de niveles prácticamente ilimitados de cepas de cianobacterias producidas en cultivo continuo y en condiciones controladas.
Otro objetivo específico de Ia invención, es lograr un procedimiento de purificación de ficotoxinas a partir de pellas húmedas y/o congeladas de cianobacterias, eliminando los pigmentos, y otros metabolitos secundarios principales acompañantes de las ficotoxinas en el proceso de purificación.
Un tercer objetivo específico de Ia invención, es lograr un procedimiento de purificación de las ficotoxinas liberadas al medio, a partir del medio de cultivo en que se encuentran las cianobacterias. Teniendo como objetivo central, Ia purificación biotecnológica del principio activo, con potente actividad biológica demostrada.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 , presenta un cromatograma correspondiente a 10 microlitros de extracto de Ia cianobacteria Aphanizomenon gracile, inyectados en cromatografía liquida de alta resolución analítico (HPLC). Detección realizada por cromatografía líquida de alta resolución analítica con detección fluorescente en línea. Pico 1 , Rt = 2,640 minutos pigmentos de cianobacterias. Pico 2, Rt = 7,980 minutos neosaxitoxina. Pico 3, Rt = 1 1 ,970 minutos saxitoxina.
La figura 2, es un cromatograma correspondiente a 10 microlitros de extracto purificado de Aphanizomenon gracile por cromatografía líquida de alta resolución preparativa de separación por tamaño (exclusión por tamaño). Detección realizada por cromatografía líquida de alta resolución con detección fluorescente en línea. Pico 1 , Rt = 3,067 minutos pigmentos de cianobacterias. Pico 2, Rt = 9,373 minutos neosaxitoxina. Pico 3, Rt = 12,953 minutos saxitoxina.
La figura 3, presenta un cromatograma de un estándar analítico que presenta como componentes principales neosaxitoxina y saxitoxina, con un poco de mezcla de gonyaulatoxinas (estándar NL2), determinado y cuantificado por cromatografía líquida de alta resolución analítica con detección fluorescente en línea. Primer pico Rt = 3,653 minutos, corresponde a mezcla de gonyaulatoxinas; segundo pico 2, Rt = 5,040 minutos, corresponde a neosaxitoxina; tercer pico , Rt = 7,440 minutos saxitoxina.
La figura 4, es un cromatograma de neosaxitoxina purificada a partir de extractos de cianobacterias Aphanizomenon gracile (Rt = 4,933 minutos). Fracción eluída de cromatografía líquida de alta resolución preparativa, en columnas de intercambio iónico con detección fluorescente en línea.
La figura 5, presenta un cromatograma de estándares analíticos para gonyaulatoxinas. De izquierda a derecha: Pico 1 : GTX4 (gonyaulatoxina 4); Pico 2 GTX1 (gonyaulatoxina 1 ); Pico 3 GTX 5(gonyaulotoxina 5); Pico 4 GTX 3 (gonyaulatoxina 3); Pico 5 GTX2 (gonyaulatoxina 2).
La figura 6, es un cromatograma de muestra de extracto de cepa de cianobacteria C. raciborskii. Primer pico Rt = 8,873 minutos, segundo pico Rt = 10,927 minutos, tercer pico Rt = 13,260 minutos; cuarto pico = 16,647.
La figura 7, es un cromatograma de fracción parcialmente purificada por cromatografía líquida de alta resolución preparativa por separación por tamaño (exclusión por tamaño) de C. raciborkü con presencia dominante del epímero GTX 3 y GTX 2 respectivamente.
La figura 8, presenta un cromatograma de Ia fracción final pura del epímero GTX 3 y GTX 2, obtenido a partir de cianobacterias en cultivo continuo de C. raciborkü.
La figura 9, es un gráfico de elución de una cromatografía preparativa de separación por tamaño que muestra las fracciones obtenidas y donde se identifica el rango de fracciones donde aparecen los distintos componentes presentes (compuestos orgánicos, ficotoxinas y sales).
La figura 10, es un gráfico de elución de una cromatografía preparativa de separación por intercambio aniónico que muestra las fracciones obtenidas y donde se identifica el rango de fracciones donde aparecen los distintos componentes presentes (ficotoxinas y sales).
La figura 1 1 , es un gráfico de elución de una cromatografía preparativa de separación por intercambio catiónico que muestra las fracciones obtenidas y donde se identifica el rango de fracciones donde aparecen los distintos componentes presentes (ficotoxinas y sales).
La figura 12, es un gráfico de elución de una cromatografía preparativa de separación por tamaño que muestra las fracciones obtenidas y donde se identifica el rango de fracciones donde aparecen las ficotoxinas purificadas (saxitoxina, neosaxitoxina).
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Se describe Ia purificación y producción industrial de las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, las cuales son biológicamente activas, a partir de cultivos de cianobacterias productoras de estas ficotoxinas.
Las cianobacterias utilizadas pueden ser de los géneros: Cylindrospermopsis sp, Mycrocistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaeria sp, Oscillatoria sp, Aphanizomenon sp (Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile). Las cianobacterias se obtienen preferentemente desde un cultivo continuo, en condiciones controladas, masivo, semi-automático tal como el descrito en Ia solicitud de patente chilena correspondiente al mismo solicitante y presentada simultáneamente con esta solicitud, CL 722-2009.
La purificación industrial de las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas a partir de cianobacterias en cultivo continuo, se realiza por un método de extracción, fraccionamiento, partición por solventes, participación en fases sólidas, y partición en fases líquidas-sólidas de estas ficotoxinas (neosaxitoxina, saxitoxina, y gonyaulatoxinas) a partir de células del cultivo (pellet) o el sobrenadante del cultivo. Proceso biotecnológico continuo, secuencial y semi-automático, que genera cantidades industriales de un principio activo que mantienen su actividad biológica durante todo el proceso de purificación, hasta llegar a su producto final. El proceso involucra procedimientos químicos y bioquímicos en varias etapas de fraccionamiento por centrifugación diferencial, extracción con solventes acuosos y orgánicos, partición en fase de solventes hidrofóbicos, partición en fases sólidas, purificación a través de columnas y diversos tipos de cromatografías de alta resolución preparativas (intercambio catiónico, aniónico y separación por tamaño), hasta obtener extractos parcialmente purificados, sin pigmentos, correspondientes a fracciones de perfiles de ficotoxinas simples y a partir de ellos ficotoxinas puras (Figuras 1 a 8). Todas etapas de un proceso biotecnológico único, y parte de un proyecto industrial sólo desarrollado en Chile.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a un método de purificación de una producción industrial de las ficotoxinas neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, que presenta y mantienen su actividad biológica durante todo el proceso industrial de purificación, a partir de cianobacterias productoras de estas ficotoxinas.
Las cianobacterias productoras de estas ficotoxinas pertenecen a los géneros: Cylindrospermopsis sp., Mycrocistis sp., Anabaena sp., Gomphosphaeria sp., Oscillatoría sp., Aphanizomenon spp. (Aphanizomenon issatchenkoi, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon gracile).
El material de partida es un cultivo unialgal de una especie de cianobacteria; el que sea unialgal, es indispensable para Ia obtención de estas ficotoxinas purificadas con altos rendimientos. Esto corresponde a un proceso de crecimiento y escalamiento a nivel industrial, para obtener una alta cantidad de ficotoxinas en el material de partida.
Las cianobacterias se obtienen por el desarrollo de un método y procedimiento de cultivo continuo, en condiciones controladas, masivo, semi-automático y de crecimiento logarítmico permanente de cianobacterias, descrito en Ia solicitud de patente chilena correspondiente al mismo solicitante y presentada simultáneamente con esta solicitud y con número de solicitud de patente Chilena CL 722-2009.
Durante el proceso de cultivo de estas especies de cianobacterias, las ficotoxinas se acumulan en el interior de las células, pero también, se liberan al medio de cultivo, teniendo de esta manera dos fuentes de ficotoxinas.
Por ejemplo, en el cultivo de Aphanizomenon gracile, el componente mayoritario liberado desde Ia cianobacteria es neosaxitoxina (Figura 2 y 4).
Por Io tanto, existen dos fuentes posibles de obtención de ficotoxinas a partir de un cultivo industrial de cianobacterias:
- a partir de los sobrenadantes filtrados (sin células y filamentos) del medio de desarrollo de Ia cianobacteria; a partir de los pellet húmedos obtenidos por centrifugación del cultivo en desarrollo, que está compuesto por células y filamentos de Ia cianobacteria. La obtención de las ficotoxinas de interés, que depende en cada caso de Ia cianobacteria productora cultivada, puede ser obtenida para cualquiera de las cianobacterias mencionadas, tanto desde sobrenadante como desde pellet obtenido.
La producción industrial de las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, a partir de cianobacterias en cultivo continuo, se realiza por un método de extracción, fraccionamiento, partición por solventes, participación en fases sólidas, y partición en fases líquidas-sólidas de estas ficotoxinas (neosaxitoxina, saxitoxina, y gonyaulatoxinas) a partir de células del cultivo (pellet) o el sobrenadante del cultivo. El proceso involucra procedimientos químicos y bioquímicos en varias etapas de fraccionamiento por centrifugación diferencial, extracción con solventes acuosos y orgánicos, partición en fase de solventes hidrofóbicos, partición en fases sólidas, purificación a través de columnas y diversos tipos de cromatografías de alta resolución preparativas (intercambio catiónico, aniónico y separación por tamaño), hasta obtener extractos parcialmente purificados, sin pigmentos correspondientes a fracciones de perfiles de ficotoxinas simples y a partir de ellos ficotoxinas puras (Figuras 1 a 8). El enfoque fundamental está dirigido a obtener un principio activo, estable que mantenga toda su potencia en su actividad biológica, de tal manera que este principio activo sea utilizado como base para el desarrollo de nuevos productos farmacéuticos.
En una forma simplificada, el método de purificación de las ficotoxinas de Ia invención comprende los siguientes pasos: a. obtener un pellet y/o un sobrenadante de un cultivo de cianobacterias; b. si Ia fuente es un pellet, lisar las cianobacterias por los medios convencionales de lisado de células c. realizar una extracción en frío usando una mezcla de solventes orgánicos en fase acuosa; y separar las fases acuosa y orgánica del punto anterior, siendo Ia fase acuosa Ia fase de interés, ya que estas ficotoxinas son solubles en agua ; d. concentrar Ia fase acuosa obtenida en Ia etapa c) ó el medio de Ia etapa a) al menos 10 veces en volumen; e. centrifugar Ia fase acuosa concentrada; f. pasar el sobrenadante por una matriz sólida de tierra de diatomeas, las ficotoxinas quedan retenidas en Ia columna de diatomea, y deben ser eluidas con una solución de elusión; g. pasar el eluido que contiene las ficotoxinas por una matriz de carbón activado, nuevamente las ficotoxinas quedan retenidas en Ia columna de carbón activado, y deben ser eluidas con una solución de elusión; h. pasar el eluido del paso anterior que comprende las ficotoxinas nuevamente por una matriz sólida de tierra de diatomeas, lavar y eluir; i. evaporar los componentes orgánicos del eluido del punto anterior, obteniendo un extracto de ficotoxinas parcialmente purificado; j. someter el extracto de ficotoxinas parcialmente purificado obtenido a a un proceso bioquímico de separación y fraccionamiento por HPLC preparativa (HPLC-Prep: cromatografía líquida de alta resolución preparativa) en varios pasos, según el principio físico o químico de fraccionamiento utilizado, que pueden comprender secuencialmente: separación por tamaño, intercambio aniónico, intercambio catiónico y nuevamente separación por tamaño. De este modo obtenemos preparados de ficotoxinas puras, adecuadas para fines farmacéuticos y cosméticos.
El método de Ia presente invención, proporciona por primera vez en Ia técnica, un procedimiento para purificar ficotoxinas, tales como neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, a partir de cianobacterias productoras de estas ficotoxinas.
Este método comprende proporcionar una cantidad adecuada de una fuente de ficotoxinas, como por ejemplo un cultivo de cianobacterias, el medio de cultivo donde crecen las cianobacterias en dicho cultivo o un pellet de cianobacterias.
En caso de provenir desde un cultivo de cianobacterias, las células se separan del medio de cultivo, como por ejemplo usando una etapa de centrifugación. Se obtiene así una fase líquida acuosa correspondiente al medio de cultivo y un pellet húmedo correspondiente a las cianobacterias. Los pellets de cianobacterias pueden ser congelados o procesados directamente, Ia etapa de congelamiento no afecta Ia posterior purificación de las ficotoxinas: neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas. Los pellet obtenidos se lisan usando métodos apropiados, conocidos en Ia técnica, tales como homogenización, extracción por solventes (fase orgánica/fase acuosa), molino de perlas, ciclos de congelación/descongelación, ultrasonicación, lisis enzimática, entre otros.
El material proveniente de Ia lisis de cianobacterias, se somete a una extracción en frío usando una mezcla de solventes orgánicos en fase acuosa (cloroformo:metanol 1 :1 más ácido acético en una concentración de 1 OmM que comprende un 50% del volumen de Ia mezcla anterior), posteriormente se realiza una separación de fases orgánica / acuosa, con una fase orgánica a pH 5 de cloroformo:metanol 1 :1 en volumen que se repite entre 1 y 5 veces. Se recolectan todas las fases acuosas obtenidas en las repeticiones, constituyendo estas una única fase acuosa con Ia que se prosigue el procedimiento.
La fase acuosa obtenida o el sobrenadante del medio de cultivo se concentra, usando por ejemplo, un rotor vaporizador, a temperatura ambiente, hasta alcanzar una concentración de entre 5 y 20 veces el volumen original.
El concentrado se somete a centrifugación a velocidades de entre 15.000xg hasta 25.000xg por períodos de tiempo de entre 10 y 40 minutos.
El sobrenadante del centrifugado se hace pasar por una columna de tierras de diatomeas, lavando Ia columna con entre 5 y 15 veces su volumen con una solución apropiada, como por ejemplo, ácido acético 5OmM. Se eluye Ia ficotoxina con una solución apropiada, como por ejemplo una mezcla alcohólica de extracción, etanol:agua:ácido acético 5 mM en una proporción de 2:1 :1 vol/vol/vol)
El eluído obtenido en el paso anterior se hace pasar por columnas de carbón activado, se lavan las columnas con agua destilada para eliminar pigmentos e impurezas retenidas. En las columnas quedan las ficotoxinas que se eluyen con una solución apropiada, como por ejemplo, una mezcla alcohólica de elusión etanol:agua:ácido acético 1 mM en una proporción de 3:2:1 vol/vol/vol) a pH 5.
El eluído de Ia etapa anterior nuevamente se hace pasar por una columna de tierra de diatomeas. Se lavan las columnas con una solución apropiada usando un volumen equivalente a 10 veces el volumen de Ia matriz de ácido acético 5OmM y se eluyen las ficotoxinas con una solución apropiada, como por ejemplo por extracción por solvente con una mezcla alcohólica apropiada a pH 5, por ejemplo de cloroformo/metanol/agua; 1 :1 :1 vol/vol/vol.
El eluído de Ia etapa anterior se deja en fase acuosa, evaporando los solventes orgánicos, usando por ejemplo un equipo "speed vac" (Savant, NY, USA). Se obtiene un extracto de ficotoxina parcialmente purificado.
El extracto parcialmente purificado de Ia etapa anterior se somete a HPLC preparativa (cromatografía líquida de alta resolución preparativa) en varios pasos, que pueden comprender secuencialmente: separación por tamaño, intercambio aniónico, intercambio catiónico y nuevamente separación por tamaño. La realización de varias cromatografías sucesivas garantiza una pureza analítica, apta para los requerimientos de Ia industria farmacéutica. No obstante, en ciertos casos, dependiendo del grado de pureza requerido las ficotoxinas, pueden purificarse utilizando sólo una etapa de HPLC-Prep.
Debe entenderse que los valores mencionados de las proporciones de los ingredientes de cada solución, concentraciones de ingredientes o valores de pH pueden variar en un rango de ±5% sin alterar el resultado de Ia invención.
En forma más detallada y esquemática, el método de purificación de Ia invención puede definirse en los siguientes pasos: a. Se proporciona una cantidad adecuada de una fuente de ficotoxinas, por ejemplo el cultivo de Ia cianobacteria pura, de acuerdo a Io descrito en Ia solicitud chilena "cultivo de cianobacteria productora de neosaxitoxina y saxitoxina a escala industrial", del mismo solicitante y presentada en Ia misma fecha de Ia presente solicitud (CL 722-2009).
• Separación de las células y el medio de cultivo mediante centrifugación. Se utilizan volúmenes de 1 L de cultivo, obtenido de cada reactor y se centrifuga a 10.000 x g durante 25 minutos, obteniéndose un sobrenadante y un precipitado o pellet húmedo de cianobacteria. • Etapa opcional de congelamiento de los pellets obtenidos. Se pueden congelar para purificar después o se comienza a purificar de inmediato. b. Se lisa el pellet obtenido, con un método preferido de lisis de pellet, este se pesa y se agrega el mismo volumen en peso de Ia mezcla de solventes orgánicos en fase acuosa (cloroformo: metanol; 1 :1 + ácido acético 10 mM volumen 50% de Ia mezcla anterior), para destruir Ia pared celular y membrana plasmática. Esto en medio levemente ácido (pH 5,0). Un pH levemente ácido, es un hecho importante y único, que permite Ia estabilidad del principio activo. c. El material proveniente de Ia lisis se somete a una extracción en frío y separación de fases (orgánica / acuosa).
• Se repite Ia extracción de Ia fase orgánica obtenida.
• Se juntan las dos fases acuosas obtenidas.
• La fase acuosa se extrae dos veces con fase orgánica a pH 5,0. Igual volumen de mezcla cloroformo: metanol ; 1 :1 vol/vol). d. La fase acuosa así extraída, se concentra 10 veces su volumen (se obtiene un décimo del volumen inicial), utilizando por ejemplo un rotor vaporizador a temperatura ambiente. e. el concentrado se somete a una centrifugación, preferentemente a 20.000 x g por 30 minutos. f. La fase acuosa, sobrenadante de Ia centrifugación, se trata con matriz sólida de tierras de diatomeas que consiste en hacer pasar el sobrenadante obtenido a través de una columna de tierra de diatomeas. Se lava Ia columna, con ácido acético 50 mM, en un cantidad preferentemente 10 veces el volumen de Ia columna y se extrae Ia ficotoxina retenida en Ia columna con una mezcla alcohólica de extracción o buffer de elución (etanol: agua: ácido acético 5 mM; 2 : 1 : 1 vol/vol/vol) g. El eluído de Ia columna, obtenido en el punto anterior, se hace pasar ahora por columnas de carbón activado, se lavan las columnas con agua destilada para eliminar pigmentos e impurezas retenidas. En las columnas quedan las ficotoxinas que se eluyen con una mezcla alcohólica de elusión (etanol: agua: ácido acético 1 mM; 3: 2: 1 vol/vol/vol) pH 5.0 Este fraccionamiento, elimina gran parte de los pigmentos y moléculas de bajo peso molecular mas frecuentes del lisado de cianobacteria, como son aminoácidos, bases nucleotídicas, péptidos, azúcares, (monosacáridos y disacáridos). h. Nuevamente se realiza una elusión diferencial desde matrices sólidas empleando Tierras de diatomeas. Columnas de tierra de diatomeas se cargan con el extracto eluído de carbón activado. Aquí nuevamente quedan las ficotoxinas unidas a Ia matriz sólida por interacción de efecto hidrofóbico. Inicialmente se lavan estas columnas, donde se eluyen gran parte de los compuestos contaminantes de bajo peso molecular, que corresponden a fracciones que se eliminan. Las ficotoxinas quedan retenidas, posteriormente, se eluye Ia toxina desde Ia columna por extracción por solvente con una mezcla de cloroformo/metanol/agua; 1 :1 :1 vol/vol/vol. El uso de columnas de tierra de diatomeas, genera un fraccionamiento estratificado total. Este procedimiento masivo y para grandes cantidades, al ser usados en una técnica Batch, no genera este fraccionamiento que se logra con las columnas. También es un efecto sorprendente, que el sólo hecho de modificar Ia técnica de Batch a columna, produce una gran pre-purificación inicial de material masivo e industrial, con el consecuente ahorro en costos, además de Ia gran eficiencia. i. El eluído de Ia 2- columna de tierra de diatomeas se deja en fase acuosa, evaporando los solventes orgánicos, por ejemplo con "speed vac" (Savant, NY, USA). Se obtiene un extracto de ficotoxina parcialmente purificado. j. Este extracto parcialmente purificado se somete a HPLC preparativa (HPLC-Prep: cromatografía líquida de alta resolución preparativa).
A) Separación por tamaño (HPLC preparativo): Para esto se utiliza, por ejemplo columnas de acero inoxidable de alta presión, rellenas con bio-gel p-2 (Bio-rad) Fine 45-90 micrones (wet). Estas columnas son de 10 centímetros de diámetro y 85 centímetros de largo, empacadas a presión con resina seca de bio-gel p-2 y que presenta un volumen de exclusión de 1800 daltons. Esta resina separa, en el volumen vacío (Vo), cualquier molécula de tamaño mayor y que presente un peso molecular sobre 1800 daltons. De esta manera salen en las fracciones iniciales (al frente de Ia corrida), todas las macromoléculas e incluidos pequeños péptidos de 10 aminos ácidos, quedando retenidas los compuestos de menor peso molecular como son estas ficotoxinas (298 a 445 daltons). Usando esta resina de separación por tamaño, se elimina el 90 % del material orgánico no deseado, incluido una gran cantidad de pigmentos propios de estas cianobacterias. Todos estos compuestos y las macromoléculas solubles salen en las primeras fracciones (5 primeros litros eluídos). Las fracciones intermedias muy cercanas a las finales, son las que contienen las ficotoxinas. En las fracciones finales, sale gran parte de Ia sal presente en los extractos. El uso de resina para separación por tamaño, es un concepto totalmente innovador, especialmente en Ia forma que se utiliza aquí. Las columnas de fraccionamiento son de diseño propio de esta invención, no sólo por su tamaño, si no que en Ia forma como se llenan las columnas. Este paso de purificación es trascendental, eficiente y entrega prácticamente el principio activo parcialmente purificado. Todos los fraccionamientos de cromatografía líquida preparativas usados desde aquí en adelante, poseen este proceso biotecnológico innovador de llenado de columna con matriz sólida a alta presión, Io que genera superficies de intercambio prácticamente ilimitadas y totalmente apropiadas para procesos industriales de purificación de principio activos masivos. También en estos procesos de HPLC preparativos, se debe mencionar Ia rapidez del proceso, cuestión fundamental para lograr un compuesto puro y adicionalmente biológicamente activo. La figura 9, muestra un gráfico de elución de cromatografía preparativa, que ejemplifica este paso de separación por tamaño. Las fracciones que presentan a las ficotoxinas, se concentran y luego se les aplica en un segundo proceso de separación que corresponde a un intercambio aniónico. La separación por tamaño sirve además, para eliminar Ia mayor cantidad de sales presentes en estos extractos y que no fueron totalmente eliminados en los fraccionamientos de fases realizados inicialmente en este proceso de purificación. Esto es importante, pues estas sales intervendrían en los procesos de intercambio iónicos. Por Io tanto, en esta separación no sólo se eliminan las macromoléculas y moléculas de peso molecular sobre 1800 daltons, sino que también el mayor porcentaje del contenido de sales de bajo peso molecular (sodio 23, cloruros 35, etc.).
Intercambio aniónico: En forma similar a como se realizaron las columnas preparativas, usando resina útil para separar por tamaño, se montan columnas iguales, pero ahora utilizando resina de Intercambio aniónico. Aquí se usa cellex- d (Bio-rad) con una capacidad de intercambio de 0,66 miliequivalentes por gramos. En esta cromatografía preparativa, las ficotoxinas que tienen carga neta positiva (+2 y +1 ) a pH neutro, eluyen en las primeras fracciones (2,5 litros iniciales), pues no se retienen en Ia columna por tener carga positiva. Por Io tanto, eluyen en el volumen vacío. En estas columnas, sólo se retienen los compuestos que presentan carga negativa, los cuales quedan atrapados en Ia columna y son eluídos al final de Ia cromatografía, en fracciones que no tienen ficotoxinas, y que por ende, son eliminadas. Las fracción inicial que contiene el total de ficotoxinas, es nuevamente concentrada (liofilizador industrial) y se aplica ahora en columnas preparativas para intercambio catiónico. Esta fracción es prácticamente pura en ficotoxinas con carga neta +2 (Neosaxitoxina y saxitoxina) y carga neta +1 (gonyaulatoxinas). C) Intercambio catiónico: En esta cromatografía preparativa (columnas iguales dimensiones a las anteriores, rellenas con bio-rex® 70 de Bio-rad), se quedarán retenidas los ficotoxinas, las cuales se separarán en dos grandes grupos: las con carga neta +2 y las con carga neta +1 . Se eliminará en Ia fracciones iniciales, el poco de sales minerales con carga negativa (se miden por conductividad eléctrica), y luego se eluyen Ia gonyaulatoxinas, para finalmente eluir Ia saxitoxina y Ia neosaxitoxina. Estas ultimas dos ficotoxinas separadas, y se mantiene una fracción que contiene una mezcla de las dos ficotoxinas, con una proporción de 2/3 de neosaxitoxina y 1/3 de saxitoxina. La fracción final y última en eluir, prácticamente sólo contiene neosaxitoxina pura.
D) Por último, varias fracciones finales de intercambio catiónicos concentradas, se vuelven a separar en las columnas de resina de separación por tamaño bio-gel p- 2 (proceso idéntico al proceso descrito en A), para eliminar los restos de sal y obtener neosaxitoxina pura eluida en agua destilada.
Debe entenderse que los valores mencionados de las proporciones de los ingredientes de cada solución, concentraciones de ingredientes o valores de pH pueden variar en un rango de ±5% sin alterar el resultado de Ia invención.
Las ficotoxinas susceptibles de ser purificadas con el método anteriormente descrito, corresponden a neosaxitoxina, saxitoxina y guanyaulotoxinas. La obtención de una toxina en particular, dependerá de Ia cepa de cianobacteria desde Ia cual se realiza Ia purificación, debido a que ciertas cepas producen preferentemente un tipo de ficotoxina en particular. Como criterio de separación y fraccionamiento, se consideran los tiempos de retención característicos del compuesto de interés (ficotoxinas), como se presenta a continuación en los ejemplos de Ia presente solicitud.
La pureza de cada stock (lote) se puede determinar por espectroscopia visible y ultravioleta, además de espectroscopia de masa. La detección y cuantificación final se puede realizar por espectroflurometría. Este último método analítico de detección cuantitativo, es específico para todas las ficotoxinas, como neosaxitoxina, saxitoxina y guanyaulatoxinas (Lagos, 1998. Microalgal blooms: a global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31 : 375-386).
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : ficotoxinas obtenidas y purificadas a partir de Aphanizomenon gracile mantenida en cultivo continuo y en condiciones controladas.
Como ya se ha indicado, en el cultivo de Aphanizomenon gracile, con un clon seleccionando y único, Ia ficotoxina mayoritariamente producida es neosaxitoxina. En este caso particular, este clon también produce una cantidad menor de saxitoxina.
La producción de neosaxitoxina a partir de cianobacterias de Aphanizomenon gracile, se realizó a partir de una cantidad inicial de 10 miligramos de pellet de células húmedas de Aphanizomenon gracile. El pellet obtenido (etapa a.) se sometió al método descrito en Ia memoria descriptiva, a saber: b. para los 10 mg de pellet se agregó 10 mL, mismo volumen en peso de Ia mezcla de solventes orgánicos en fase acuosa (cloroformo: metanol; 1 :1 + ácido acético 10 mM volumen 50% de Ia mezcla anterior), para destruir Ia pared celular y membrana plasmática. Esto en medio levemente ácido (pH 5,0). c. Las células usadas de Ia etapa b. se someten a una extracción en frío y separación de fases (orgánica / acuosa). d. La fase acuosa extraída según Ia letra c, se concentra 10 veces su volumen (se obtiene un décimo del volumen inicial), utilizando por ejemplo un rotor vaporizador a temperatura ambiente. e. El concentrado se somete a centrifugación a 20.000 x g por 30 minutos. f. El sobrenadante de Ia centrifugación, 2 ml_, se hace pasar a través de una columna de tierra de diatomeas. Esta columna se lava con 10 veces su volumen, en este caso 20 mi con ácido acético 50 mM. Después del lavado se extrae Ia neosaxitoxina retenida en Ia columna, con una mezcla alcohólica de extracción (Etanol: Agua: Ácido Acético 5 mM; 2 : 1
: 1 vol/vol/vol), 5ml_ g. El eluído de Ia columna, obtenido en Ia letra f, se hace pasar por columnas de carbón activado, se lavan las columnas con agua destilada para eliminar pigmentos e impurezas retenidas. En las columnas quedan las ficotoxinas que se eluyen con una mezcla alcohólica de elusión (etanol: agua: ac. acético 1 mM; 3: 2: 1 vol/vol/vol) pH 5, en 1 O mL h. El eluido se hace pasar por 1 columna de tierra de diatomeas, se lava con con ácido acético 50 mM. Posteriormente, se eluye Ia toxina desde Ia columna con una mezcla de cloroformo/metanol/agua; 1 :1 :1 vol/vol/vol, 5 ml_. i. El eluído de Ia 2- columna de tierra de diatomeas, se deja en fase acuosa, evaporando los solventes orgánicos con "speed vac" (Savant, NY, USA). Se obtiene un extracto de neosaxitoxina parcialmente purificado. j. El extracto parcialmente purificado se somete a HPLC preparativa (cromatografía líquida de alta resolución preparativa), separación por tamaño.
Cada reactor después de dos días de cultivo produce en promedio del orden de 652,4 microgramos de toxina total por cada litro cosechado. La razón promedio entre neosaxitoxina/ saxitoxina es de 8,47. En porcentajes, se obtiene un promedio aproximado de 1 1 ,8 % de saxitoxina y 88,2 % de neosaxitoxina. Siendo evidentemente Ia producción de neosaxitoxina Ia que se busca, se realza y se protege, por ser este compuesto, el principio activo que se patenta en las aplicaciones clínicas como fármaco o como cosmético, neosaxitoxina es un 25 % más potente en su efecto biológico que saxitoxina y además es Ia ficotoxina más potentes de todas las descritas hasta ahora. Las figuras 1 ,2 y 4 muestran cromatogramas de corridas de HPLC detectadas con fluorescencia en línea, que describe un perfil de ficotoxinas producidas por Ia especie Aphanizomenon gracile. Las figuras 1 y 2, describen los perfiles HPLC de fracciones en distintos grados de purificación de extractos de Aphanizomenon gracile. Nuevamente, es importante recordar que estos son cromatogramas de cromatografías líquidas de alta resolución analíticas, que se realizan para detectar y cuantificar las ficotoxinas. No son los cromatogramas preparativos del proceso industrial. En el fondo, estos cromatogramas sólo sirven para mostrar el grado de pureza y el contenido de cada fracción purificada.
En Ia figura 1 , se presenta un cromatograma de un extracto no purificado de Aphanizomenon gracile para ser cuantificado y conocer el perfil de ficotoxinas presentes en este extracto original. El cromatograma presenta un perfil simple con cantidades mayoritarias de neosaxitoxina y menor cantidad de saxitoxina (menos de un 13%).
En Ia figura 2, se aprecia Ia purificación de 10 microlitros de extracto de Aphanizomenon gracile en cultivo continuo y bajo condiciones controladas purificado parcialmente por cromatografía líquida de alta resolución preparativa de separación por tamaño (exclusión por tamaño). En este extracto purificado parcialmente ya se presenta un pico a Rt = 9,373 minutos que satura el cromatograma y corresponde a y neosaxitoxina, indicando gran cantidad de neosaxitoxina en esta fracción.
En Ia figura 4, se aprecia neosaxitoxina purificada a partir de extractos de cianobacterias Aphanizomenon gracile (Rt = 4,933 minutos), que se obtiene en Ia fracción elusión de HPLC en columnas de intercambio iónico, que corresponde a Ia última etapa de purificación (etapa final del método anteriormente descrito). Se obtiene un solo pico que corresponde a un solo componente que en este caso es neosaxitoxina pura. TABLA 2: Producción de neosaxitoxina y saxitoxina en función del número de filamentos y pellet peso húmedo de Aphanizomenon gracile.
Figure imgf000028_0001
STX: saxitoxina neoSTX: neosaxitoxina
Ciano fil: filamentos de cianobacteria
* Los filamentos de cianobacterias corresponden a asociaciones de 20 a 100 células de cianobacterias. Estas cianobacterias forman filamentos en solución y estos son los que se cuentan usando microscopio de fase invertida.
Los rendimientos obtenidos corresponden a una producción sorprendente, no esperada de ficotoxinas puras (neosaxitoxina y saxitoxina) por miligramo de cianobacteria húmeda, cuando se compara a Ia producción de filamentos y pellet de cianobacterias puestas en cultivo en condiciones habituales y descritas hasta ahora; en frascos pequeños de cultivo, sin micro-aeración continua y con ciclos de luz: día y sin luz : noche.
En el ejemplo descrito aquí, las cianobacterias están siempre en crecimiento logarítmico, con luz permanente las 24 horas y cosechando permanentemente las cianobacterias, induciendo un permanente crecimiento, mediante el aporte de nutrientes nuevos en volúmenes equivalentes al volumen cosechado en cada recambio.
Ejemplo 2: ficotoxinas obtenidas y purificadas a partir de cylindrospermopsis raciborskii mantenida en cultivo continuo y en condiciones controladas. Se cultivó Ia cianobacteria Cylindrospermopsis raciborskii de acuerdo al método de cultivo continuo, en condiciones controladas, masiva, semi-automático y de crecimiento logarítmico permanente, descrito en Ia solicitud de patente chilena correspondiente al mismo autor y presentada simultáneamente con esta solicitud.
El extracto de Ia cepa Cylindrospermopsis raciborskii no purificado presenta un perfil cromatográfico de acuerdo a Ia figura 6. C. raciborskii presenta un perfil de toxina, donde predominan GTX 3 y GTX 2 con los mayores tiempos de retención en Ia columna (los dos últimos picos a Ia derecha respectivamente).
El extracto de C. raciborskii obtenido del cultivo continuo, se somete al proceso de purificación correspondiente a las etapas ya señaladas en las mismas condiciones que en el ejemplo 1 y ya en Ia etapa de HPLC preparativa por separación por tamaño, se obtiene casi exclusivamente los efímeros GTX3 y GTX2 de guanyaulatoxinas, como se muestra en Ia figura 7.
La fracción final del método de purificación de ficotoxinas a partir de C. raciborskii, tiene solamente GTX3 y GTX2, como se muestra en Ia figura 8 y se pueden de esta manera colectar las fracciones correspondientes a cada guanyaulatoxina para obtener fracciones puras y en gran cantidad de GTX3 y GTX2.

Claims

REIVINDICACIONES
Método de purificación industrial de ficotoxinas biológicamente activas, CARACTERIZADO porque comprende los pasos de: a) proporcionar una cantidad adecuada de una fuente de ficotoxinas, como por ejemplo el cultivo de un clon de cianobacterias, que se separa en el medio de cultivo y un pellet de cianobacterias; el medio de cultivo donde crecen las cianobacterias; un pellet húmedo de cianobacterias ó un pellet congelado de cianobacterias; b) si Ia fuente de ficotoxinas es un pellet, este último se lisa usando métodos apropiados, tales como homogenización, extracción por solventes (fase orgánica/fase acuosa), molino de perlas, ciclos de congelación/descongelación, ultrasonicación, lisis enzimática entre otros, c) el material proveniente de Ia lisis de cianobacterias, se somete a una extracción en frío y separación de fases orgánica / acuosa (mezcla cloroformo: metanol; 1 :1 en 50 % y ácido acético 1 mM en 50% v/v, pH entre 4 y 5, siempre en medio levemente ácido estrictamente necesario para Ia mantención de Ia actividad biológica del principio activo d) obtener un concentrado de Ia fase acuosa obtenida en Ia etapa (c) ó el medio de cultivo de Ia etapa (a); e) centrifugar el concentrado para obtener un sobrenadante; f) pasar el sobrenadante por una columna de tierras de diatomeas, lavar Ia columna con una solución de lavado apropiada; luego se obtiene un eluído de Ia ficotoxina con una solución de elusión apropiada; g) el eluído obtenido en el paso anterior, se hace pasar por columnas de carbón activado, se lavan las columnas de carbón activado con agua destilada para eliminar pigmentos e impurezas retenidas; se eluyen las ficotoxinas con una solución de elusión apropiada; h) el eluído de Ia etapa anterior, nuevamente se hace pasar por una columna de tierra de diatomeas; las columnas se lavan con una solución apropiada (como en el paso f) y se eluyen las ficotoxinas con una solución de extracción apropiada; i) el eluído de Ia etapa anterior se deja en fase acuosa, evaporando los solventes orgánicos, obteniéndose un extracto de ficotoxina parcialmente purificado; j) el extracto parcialmente purificado de Ia etapa anterior, se somete a HPLC preparativa (HPLC-Prep: cromatografía líquida de alta resolución preparativa) en varios pasos, obteniendo Ia ficotoxina biológicamente activa pura.
2. Método de acuerdo a Ia reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque Ia extracción por solventes en Ia etapa (b) se agrega el mismo volumen en peso de Ia mezcla de solventes orgánicos en fase acuosa (cloroformo: metanol; 1 :1 + ácido acético 10 mM volumen 50% de Ia mezcla anterior, pH entre 4 y 6), para destruir Ia pared celular y membrana plasmática.
3. Método de acuerdo a Ia reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque Ia extracción por solventes en Ia etapa (c) se repite 3 veces.
4. Método de acuerdo a Ia reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque Ia concentración en Ia etapa (d) se realiza usando un rotor vaporizador, a temperatura ambiente, hasta alcanzar una concentración de entre 5 y 20 veces.
5. Método de acuerdo a Ia reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque Ia centrifugación en Ia etapa (e) se realiza a velocidades de entre 15.000xg hasta 25.000xg por períodos de tiempo de entre 10 y 40 minutos.
6. Método de acuerdo a Ia reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en Ia etapa (f) y (h) Ia solución de lavado apropiada es ácido acético 5OmM, en el paso (f) Ia columna se lava con entre 5 y 15 veces su volumen, y Ia solución de elución apropiada es una mezcla alcohólica de extracción (etanol: agua: ácido acético 5 mM; 2 : 1 : 1 vol/vol/vol).
7. Método de acuerdo a Ia reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en Ia etapa (g) Ia solución de elusión es una mezcla alcohólica de elusión (etanol: agua: ácido acético 1 mM; 3: 2: 1 vol/vol/vol) pH 5.
8. Método de acuerdo a Ia reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en Ia etapa (h) Ia solución de es una mezcla de cloroformo/metanol/agua; 1 :1 :1 vol/vol/vol.
9. Método de acuerdo a Ia reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en Ia etapa (i) Ia evaporación de solventes orgánicos se realiza en una centrífuga al vacío.
10. Método de acuerdo a Ia reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque en Ia etapa j) los pasos de cromatografía HPLC-prep son secuencialmente, separación por tamaño, intercambio aniónico, intercambio catiónico y separación por tamaño.
1 1. Método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 10, CARACTERIZADO porque las ficotoxinas son del grupo compuesto por las neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas: gonyaulatoxina 2 y gonyaulatoxina 3.
12. Método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 10, CARACTERIZADO porque las cianobacterias productoras de ficotoxinas son de los géneros Cylindrospermopsis sp, Mycrocistis sp, Anabaena sp, Gomphosphaeria sp, Oscillatoría sp, Aphanizomenon sp y Lyngbya wollei.
3. Uso de las ficotoxinas obtenidas por el método descrito en las reivindicaciones 1 a 12, CARACTERIZADO porque sirven para preparar productos farmacéuticos, en cosmética, en productos de aplicación clínica (patologías), en anestésicos locales, en patologías asociadas a hiperactividad muscular, y en control del dolor a nivel local y periférico.
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