CN108148119B - 一种环六肽化合物及其在制备抗肠道病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环六肽化合物及其在制备抗肠道病毒药物中的应用。本发明在对药用植物海南粗榧根际土壤来源链霉菌Streptomyces sp.30702的次生代谢产物研究过程中，分离获得一个结构新颖的环六肽soliseptide A，其结构式如式(Ⅰ)所示，该化合物含有罕见的哌嗪酸结构片段，且具有很强的抗肠道病毒活性，且在有效剂量下，对宿主细胞未发现有细胞毒性。因此是开发成为结构新颖、高效低毒的抗肠道病毒药物的理想侯选化合物。

Description

一种环六肽化合物及其在制备抗肠道病毒药物中的应用

技术领域：

本发明属于天然产物领域，具体涉及一种结构新颖的含有哌嗪酸片段的环六肽soliseptide A及其在制备抗肠道病毒药物方中的应用。

背景技术：

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是由肠道病毒感染引起的常见的传染病，见于全球各地，此病多发生于5岁以内儿童，能引起手掌、脚掌、口腔黏膜处发生疱疹，起病时多有发热，伴有咽部疼痛。此病传染性较强，主要通过粪-口途径以及呼吸道飞沫传播，或经接触患者皮肤、黏膜的疱疹液而感染。全球自20世纪70年代发现肠道病毒(EV71)起，先后有3次大范围的由EV71感染所致的HFMD大流行。放线菌(Actinobacteria)是一类极其重要的微生物资源，特别是在发现抗菌、抗病毒、抗肿瘤等抗生素先导化合物领域的贡献是难以估量的。

发明内容：

本发明公开了一种从链霉菌Streptomyces sp.30702中分离得到的结构新颖的具有哌嗪酸片段的环六肽soliseptide A。

本发明人在对来源于药用植物海南粗榧(Cephalotaxus hainanensis)根际土壤链霉菌Streptomyces sp.30702的次生代谢产物研究过程中，发现一个结构新颖的含有哌嗪酸片段的环六肽soliseptide A，其具有很强的抗肠道病毒(EV71)活性，且在有效剂量下，未发现有明显细胞毒性。因此是开发成为高效低毒的抗肠道病毒(EV71)药物的理想侯选化合物。

本发明的环六肽soliseptide A，或其药用盐，其结构式如式(Ⅰ)所示：

本发明的第二个目的是提供一种制备环六肽soliseptide A的方法，其特征在于，所述的环六肽soliseptide A是从链霉菌Streptomyces sp.30702的发酵培养物中制备分离得到的。

优选，所述的制备环六肽soliseptide A的方法，具体步骤如下：

a)、制备链霉菌Streptomyces sp.30702的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体破碎后用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经蒸馏浓缩后得到浸膏B；

b)、将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经中压正相液相色谱，用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，收集二氯甲烷/甲醇体积比95：5梯度洗脱下来的馏分，继续过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，以分析纯甲醇作为流动相洗脱，收集馏分再采用半制备高效液相进行纯化后得到环六肽soliseptide A。

所述的步骤a)的制备链霉菌Streptomyces sp.30702的发酵培养物，优选为：将活化的链霉菌Streptomyces sp.30702接入种子培养基中，28℃，180rpm，培养72h制得种子液，将种子液以5％的接种量接入到发酵培养基中，28℃，动态摇床培养10天制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方为每升培养基中含有：甘油15mL，大豆粉10g，酵母浸膏10g，KH₂PO₄ 0.5g,MgSO₄·7H₂O 0.5g,CaCO₃ 2g,海水素33g,余量为水，pH 7.2-7.4。

本发明的第三个目的是提供链霉菌Streptomyces sp.3070在制备环六肽soliseptide A中的应用。

本发明通过实验发现环六肽soliseptide A对手足口病主要致病病毒-肠道病毒(EV71)具有较强的抑制作用，且在浓度为30μM时，其抑制率为94.7％，在相同浓度下，对宿主细胞无明显细胞毒活性，因此可望开发成为无毒/低毒的抗肠道病毒(EV71)新药。

本发明的第四个目的是提供环六肽soliseptide A或其药用盐在制备抗肠道病毒(EV71)药物中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种抗肠道病毒(EV71)药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的环六肽soliseptide A，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

本发明的第六个目的是提供上述化合物soliseptide A或其药用盐在制备治疗手足口病药物中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种治疗手足口病的药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的权利要求1所述的化合物soliseptide A，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

本发明在对药用植物海南粗榧(Cephalotaxus hainanensis)根际土壤来源链霉菌Streptomyces sp.30702的次生代谢产物研究过程中，分离获得一个结构新颖的环六肽soliseptide A，该化合物含有罕见的哌嗪酸(piperazic acid)结构片段，且具有显著的抗肠道病毒(EV71)活性，且在有效剂量下，对宿主细胞未发现有细胞毒性。因此是开发成为结构新颖、高效低毒的抗肠道病毒药物的理想侯选化合物。

本发明的链霉菌Streptomyces sp.30702，于2016年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.13123。

附图说明：

图1是soliseptide A结构中关键的¹H–¹H COSY(加粗黑线)和HMBC(黑色，即箭头)相关；

图2是环六肽soliseptide A的铜靶单晶示意图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：环六肽soliseptide A的制备和分离

1、种子培养基(发酵培养基)：每升培养基含有甘油15mL，大豆粉10g，酵母浸膏10g，KH₂PO₄ 0.5g,MgSO₄·7H₂O 0.5g,CaCO₃ 2g,海水素33g,余量为水，pH 7.2-7.4。按上述组份和含量混合均匀，然后121℃，灭菌30min备用。

2、发酵

2.1、种子培养：将活化的链霉菌Streptomyces sp.30702接入每瓶含有300mL种子培养基的1000mL的锥形培养瓶中，28℃，180rpm，培养72h制得种子液。

2.2、发酵培养：将种子液以5％的接种量(体积百分比)接入到50L发酵培养基中，28℃，动态摇床培养10d，而制得发酵培养物。

3、萃取：发酵培养物经布氏漏斗过滤将发酵液和菌丝体分离，发酵液用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用分散机破碎3分钟，再用丙酮超声破碎提取3次，每次30min，合并浸提液，减压回收丙酮后剩余水混合液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液减压蒸馏浓缩后得到浸膏B，将浸膏A和浸膏B合并，减压蒸馏得到粗提物(27.8g)。

4、soliseptide A的分离和鉴定

将浸膏A和浸膏B合并的粗提物(27.8g)经中压正相柱层析液相色谱(MPLC)，用二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比为95:5洗脱的馏分(3.4g)进一步经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20分离纯化，采用分析纯甲醇洗脱，洗脱的馏分采用HPLC-DAD检测收集最大吸收波长在220nm吸收的馏分，该馏分最后用半制备高效液相精细分离，在洗脱体系为乙腈/水(体积比20：80，YMC-pack ODS-A,10×250mm,5μm,4mL/min)进行纯化后得到化合物soliseptide A(34.5mg，保留时间是20.3min)。

结构鉴定：化合物soliseptide A为无色针状晶体，其核磁数据归属如表1所示；其高分辨质谱HRESIMS给出一个分子离子峰m/z 683.4089([M+H]⁺)，确定其分子式为：C₃₁H₅₅N₈O₉，不饱和度为9。在¹³C NMR中，可以发现有六个酰胺羰基或者酯羰基碳信号(δ_C169.9,170.9,171.2,172.3,172.9,174.2)以及6个氨基酸α位的次甲基碳信号(δ_C 46.9,50.4,53.3,54.6,56.3,59.8)；此外在¹H NMR中，可以发现4个氨基活性氢信号(δ_H 7.74,7.60,5.49,5.43)。综合分析其¹H、¹³C和DEPT NMR谱，可以发现soliseptide A一共有31个碳，包括六个季碳【酰胺羰基或者酯羰基】，十一个次甲基(其中两个为连氧次甲基)、六个亚甲基和八个甲基(表1)。结合分子不饱和度和分析碳的级数，可推测soliseptide A为一个环六肽结构。

表1.soliseptide A的¹H-和¹³C-NMR数据归属，溶剂为DMSO-d₆。

通过¹H–¹H COSY和HMBC谱中关键的相关信号，可以建立以下六个氨基酸残基：缬氨酸(Val)、苏氨酸(Thr)、哌嗪酸(Pip)、氮甲基缬氨酸(N-Me-Val)、4-羟基哌嗪酸(4-OH-Pip)、氮羟基亮氨酸(N-OH-Leu)(图1)。通过多种尝试，在soliseptide A甲醇溶液中获得了晶型较好的单晶，通过铜靶X-ray单晶衍射的方法，不仅确定了环六肽soliseptide A的平面结构(图2)，而且确定了环六肽soliseptide A的六个氨基酸残基的构型分别为D-Val,L-Thr,D-Pip,L-N-Me-Val,D-4-OH-Pip,和L-N-OH-Leu，同时确定了24位次甲基的绝对构型为R；最终确定环六肽soliseptide A的结构式如式(Ⅰ)所示。

实施例3：化合物soliseptide A的抗肠道病毒活性测定

化合物soliseptide A对肠道病毒(EV71)具有显著抑制活性，实验方法参考文献(Jia Y.L.；Wei M.Y.；Chen H.Y.；Guan F.F.；Wang C.Y.；Shao C.L.(+)-and(-)-Pestaloxazine A,a pair of antiviral enantiomeric alkaloid dimers with asymmetric spiro[oxazinane-piperazinedione]skeleton from Pestalotiopsissp.Org.Lett.2015,17,4216–4219)。活性结果显示：化合物soliseptide A抑制肠道病毒(EV71)活性强于阳性对照药病毒唑(Ribavirin)(见表2)。此外，在30μM的浓度下，化合物soliseptide A没有表现出明显的细胞毒活性，因此提示该化合物能够被改构用于制备低毒高效的抗肠道病毒(EV71)药物。

表2：Soliseptide A(IC₅₀,μM)对肠道病毒EV71的抑制活性

^a Ribavirin：病毒唑为抗肠道病毒阳性对照药。

Claims (10)

1.化合物soliseptide A，或其药用盐，其结构式如式(Ⅰ)所示：

2.一种制备权利要求1所述的化合物soliseptide A的方法，其特征在于，所述的化合物soliseptide A是从链霉菌(Streptomyces sp.)30702CGMCC No.13123的发酵培养物中制备分离得到的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的制备化合物soliseptide A的方法，具体步骤如下：

a)、制备链霉菌(Streptomyces sp.)30702CGMCC No.13123的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体破碎后用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经蒸馏浓缩后得到浸膏B；

b)、将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经中压正相液相色谱，用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，收集二氯甲烷/甲醇体积比95：5梯度洗脱下来的馏分，继续过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，以分析纯甲醇作为流动相洗脱，收集馏分再经纯化后得到化合物soliseptide A。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤a)的制备链霉菌(Streptomyces sp.)30702CGMCC No.13123的发酵培养物是将活化的链霉菌(Streptomyces sp.)30702CGMCC No.13123接入种子培养基中，28℃，180rpm，培养72h制得种子液，将种子液以5％的接种量接入到发酵培养基中，28℃，动态摇床培养10天制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方为每升培养基中含有：甘油15mL，大豆粉10g，酵母浸膏10g，KH₂PO₄ 0.5g,MgSO₄·7H₂O 0.5g,CaCO₃ 2g,海水素33g,余量为水，pH7.2-7.4。

5.链霉菌(Streptomyces sp.)30702CGMCC No.13123在制备权利要求1所述的化合物soliseptide A中的应用。

6.权利要求1所述的化合物soliseptide A或其药用盐在制备抗肠道病毒EV71药物中的应用。

7.一种抗肠道病毒EV71药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的权利要求1所述的化合物soliseptide A，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

8.权利要求1所述的化合物soliseptide A或其药用盐在制备治疗手足口病药物中的应用。

9.一种治疗手足口病的药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的权利要求1所述的化合物soliseptide A，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

10.链霉菌(Streptomyces sp.)30702，其保藏编号为：CGMCC No.13123。

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