CN105085671A - 抗肠道病毒3d蛋白的单克隆免疫球蛋白g抗体及其免疫原性组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了特异性结合多肽的抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体，其中所述多肽由选自SEQ？ID？NO：1和SEQ？ID？NO：2组中的一个共识序列表示。本发明也提供了免疫原性组合物，包含重组的3D蛋白质或一个3D蛋白衍生的免疫原性多肽，以及药学上可接受的佐剂。
Description
技术领域
本发明一般涉及对肠道病毒的预防和治疗试剂，并且更具体地涉及对肠道病毒的3D蛋白特异的单克隆免疫球蛋白G（IgG）的抗体，并进一步涉及免疫原性组合物，包括3D蛋白质或具有抗3D蛋白的抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体识别表位的多肽。
背景技术
肠道病毒被分为四个主要亚型A，B，C和D，每个亚型包含许多血清型。肠道病毒引起不同的疾病。例如，手，足和口病（HFMD）中的主要病原体是属于小核糖核酸病毒家族的肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒（CV）。手足口病日益严重的威胁到公众健康，特别是对婴幼儿。EV71和CV感染导致严重的无菌性脑膜炎，脑炎，心肌炎，急性麻痹，肺水肿，导致高死亡率。
作为小核糖核酸病毒家族内肠病毒属的成员，EV71具有典型正义单链RNA基因组，含有单个开放阅读框，编码4个衣壳蛋白（VP1-4）和7个非结构蛋白（2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D）。3D（也称为3Dpol）蛋白作为病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），在病毒负链合成和一些蛋白质的尿苷酰化(uridylylation)中起着主要作用。从EV71的晶体结构的研究中发现，一个EV71病毒粒子包含由三个病毒结构蛋白VP1-VP3的60个拷贝形成的核衣壳，衣壳的内表面附着60个拷贝的小蛋白VP4。
3D在所有肠道病毒中有着高度序列同源性，但与人类蛋白质具有低的同源性。EV71的3D与小核糖核酸病毒家族的脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，鼻病毒和口蹄疫病毒聚合酶的同源RdRps具有结构/序列相似性。
3D具有N-末端的活性部位。Kiener等用来自EV71C4菌株的重组3CD蛋白作为免疫原，分离了单克隆抗体4B12（IgG1），识别线性表位DFEQALFS（对应于3D的53-60位置和EV71聚蛋白的1784-1791），接近3D聚合酶的活性位点;4B12在变性点杂交法检测到的所有肠道病毒71亚型（Kieneretal.Characterizationofamonoclonalantibodyagainstthe3Dpolymeraseofenterovirus71anditsuseforthedetectionofhumanenterovirusAinfection.JVirolMethods.2012;180(1-2):75-83）。4B12能够检测广泛亚型毒株，有力提示3D-特异性单克隆抗体对诊断感染可能是有用的，但没有提及或建议预防或治疗使用4B12，更不用说一般的3D特异性抗体。
由于疫苗是控制传染病的最好策略，不同EV71的候选疫苗进行了研究，包括EV71灭活全病毒疫苗，减毒活病毒疫苗，重组VP1疫苗，基于VP1的DNA疫苗，合成肽疫苗和病毒样颗粒疫苗。福尔马林灭活EV71疫苗在小鼠和恒河猴引发令人满意的免疫保护和交叉反应性中和抗体的;在中国，EV71灭活疫苗于2013年已完成三期临床试验。由于在感染过程中外衣壳含有主要抗原位点，合成肽疫苗只含有衣壳蛋白，包括VP1和VP2（Kungetal.Updateonthedevelopmentofenterovirus71vaccines.ExpertOpinBiolTher.2014;3:1-10）。
因为EV71是一种RNA病毒，通过容易出错的RdRp对如肠病毒71型核衣壳基因的复制可能会导致相当大的遗传和抗原多样性。Chen等人证明，通过抗VP1一组单克隆抗体，基因型不反映其抗原性，EV71病毒可分为不同的抗原组（Chenetal.AntigenicanalysisofdivergentgenotypeshumanEnterovirus71virusesbyapanelofneutralizingmonoclonalantibodies:currentgenotypingofEV71doesnotreflecttheirantigenicity.Vaccine.2013;31(2):425-30）。所有这些表明，选择一个理想的菌株来开发具有广泛有效性的疫苗是一个挑战。
由于目前没有疫苗和特效抗病毒药物，人类静脉内注射免疫球蛋白（IVIG）一直在临床上用于治疗严重的EV71感染。然而，EV71感染中抗体依赖性增强作用（ADE）的发现，显示抗体在控制EV71感染的复合作用。ADE是一种现象，其中先前存在的亚水平的中和抗体增强病毒进入和复制。亚水平的中和抗体显示，加强EV71感染含有Fc受体的人单核细胞，并加重EV71感染小鼠。此外，肠病毒抗体之间存在的广泛交叉反应性，也可能成为在EV71感染中的ADE的潜在风险。
Han等证明，低浓度（为50μg/ml）的抗EV71的中和抗体（免疫球蛋白）可增强肠病毒71型感染单核细胞系（Hanetal.Antibodydependentenhancementinfectionofenterovirus71invitroandinvivo.VirolJ.2011;8:106）。Cao等进一步研究了各IgG亚类在中和及增强EV71感染中的作用，并发现人的免疫球蛋白的中和活性主要是由IgG1亚类介导，IgG2亚类较低，IgG3部分没有中和活性，但提高了肠病毒71型在体外的感染（Caoetal.,HumanIgGsubclassesagainstenterovirusType71:neutralizationversusantibodydependentenhancementofinfection.PLoSOne.2013;8(5):e64024）。因此，新型疫苗的设计应诱导产生抗体，具有强中和，但较弱的ADE活性。
由于结构衣壳蛋白因突变而具有抗原多样性，因此难以找出对他们的通用抗体;到目前为止，已知两个通用的IgG单克隆抗体，一个抗VP1（Limetal.Characterizationofanisotype-dependentmonoclonalantibodyagainstlinearneutralizingepitopeeffectiveforprophylaxisofenterovirus71infection.PLoSOne.2012;7(1):e29751），另一个抗VP3（Kieneretal.Anoveluniversalneutralizingmonoclonalantibodyagainstenterovirus71thattargetsthehighlyconserved"knob"regionofVP3protein. PLoSNeglTropDis. 2014;8(5):e2895）。然而，这些通用抗体的ADE能力没有被研究。
Jia等人的研究对灭活EV71病毒疫苗的安全问题提出了严重关切（Jiaetal.Thecross-reactivityoftheenterovirus71tohumanbraintissueandidentificationofthecross-reactivityrelatedfragments.VirolJ.2010;7:47）。Jia等人证明在EV71感染的患者的血清中存在特异性IgG，具有对人类大脑的交叉反应活性;然后使用19个纯化多肽制备多克隆血清，P230-323，P646-755，P857-1012及P1329-1440的抗血清对成年人的大脑和胎儿髓质中的神经元表现出较强的染色，P1-69，P324-443，P444-565，P566-665，P746-876，P1441-1526，P1549-1668，P1732-1851和P2072-2193的抗血清显示弱染色，以及P70-159的，P140-249，P1197-1338，P1649-1731和P1843-1951的抗血清显示没有染色。
因此，迫切需要开发新方法来针对肠道病毒，如EV71和CV引起手足口病。
本发明快速筛查，以达到降低分析成本、提高检验效率的目的。
发明内容
本发明提供了特异性结合多肽的单克隆免疫球蛋白G（IgG）抗体.在一个实施例中，所述多肽由选自SEQIDNO：1和SEQIDNO：2中的一个共识序列表示。
在所述抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体的另一个实施例中，与SEQIDNO：1所示多肽结合的抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体是3D-2A10-IgG（CCTCCNO：C2014143），与SEQIDNO：2所示多肽结合的抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体是3D-3A12-IgG（CCTCCNO：C2014141）。
在所述抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体的另一个实施例中，所述抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体是从包含Fc结构域抗体，单链抗体，和Fab片段中选出。
在所述抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体的另一个实施例中，SEQIDNO：1所示多肽是选自由SEQIDNOS：3-8所示的多肽，SEQIDNO：2所示多肽是选自由SEQIDNOS：10-14所示的多肽。
本发明同时提供了免疫原性组合物。在一个实施例中，所述免疫原性组合物包含重组3D蛋白质或3D蛋白衍生的免疫原性多肽，以及药学上可接受的佐剂。
在所述免疫原性组合物的另一个实施例中，所述重组3D蛋白选自由SEQIDNOS：15-22所示的3D蛋白，和具有相应的野生型3D蛋白至少85％同一性的变体。
在所述免疫原性组合物的另一个实施例中，所述3D蛋白衍生的免疫原性多肽包含由SEQIDNO：1所示的第一多肽，由SEQIDNO：2所示的第二多肽，和一个人工连接子，其中第一和第二多肽由连接子共价偶联。
在所述免疫原性组合物的另一个实施例中，所述第一多肽是选自由SEQIDNOS：3-8所示的多肽，第二多肽是选自由SEQIDNOS：10-14所示的多肽。
在所述免疫原性组合物的另一个实施例中，所述人工连接子是选自由SEQIDNOS：23和24所示的连接子。
通过如下结合附图对优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点是显而易见的。
附图说明
本发明的优选实施方案现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。
图1、EV713D特异性抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体的表征。（A）图片显示用3D特异性IgG单克隆抗体（3A12，2A10，7A6G1和11F1）对EV71感染的细胞的间接免疫荧光染色;鞭毛蛋白特异性单克隆抗体（5G10）作为阴性对照，3D-免疫的小鼠血清作为阳性对照。（B）用3D特异性IgG单克隆抗体（3A12，2A10，7A6G1和11F1）对EV71感染的VERO-1008细胞裂解液的免疫印迹;鞭毛蛋白特异性单克隆抗体（5G10）作为阴性对照，3D-免疫的小鼠血清作为阳性对照。
图2、3D特异性IgG单克隆抗体在细胞内抑制EV71的复制。（A）图示在经由转染而在细胞内抗体存在下的病毒滴度。（B）图示在不同剂量的2A10或EV-5的存在下的病毒滴度。EV-5是一种EV71VP2特异性单克隆抗体。
图3、3D特异性IgG单克隆抗体抑制体外3D聚合酶活性。（A）示意图示3D（RdRp的）介导的RNA延伸。（B）图片显示不同的IgG单克隆抗体对3D介导的RNA伸长的影响。
图4、图示在鼠模型中EV713D特异性IgG单克隆抗体的抗病毒功能。
图5、图示在2A10-IgG或EV-5-IgG单克隆抗体的存在下EV71复制的抗体依赖性增强。
图6、EV713D特异性3A12和2A10的表位，在EV713D（1RA6）的三维模型中的空间状态。EV713D（1RA6）用来指示3A12和2A10的两个识别表位的位置。
图7、图示由VTT-3D表达载体所表达的3D的免疫印迹（VTT-3D，一种表达3D的减毒牛痘病毒）。
图8、图示免疫和攻毒程序。
图9、图示初免后的3D特异性抗体应答：（A）血清IgG;（B）血清IgA的;（C）唾液IgA;和（D）阴道IgA。
图10、图示第一次加强免疫后的3D特异性抗体应答：（A）血清IgG;（B）血清IgA;（C）唾液IgA;和（D）阴道IgA。
图11、图示第二次加强免疫后的3D特异性抗体应答：（A）血清IgG;（B）血清IgA;（C）唾液IgA;和（D）阴道IgA。
图12、图示由被免疫母亲出生的新生小鼠的肠中的3D特异性IgG抗体应答。
图13、图示经小鼠适应株EV71攻毒后的新生小鼠的存活百分比。
图14、图示用纯化的3D蛋白质免疫后的抗体应答。
具体实施方式
可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。
在本申请中，为了更充分地描述本发明所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。
除非另有说明，在本发明的实践将采用分子生物学（包括重组技术），微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的现有技术，这些是在本领域的技能之内。
这些技术在文献中已有完全解释，如分子克隆：实验室说明书，第三版（Sambrook和Russel，2001年）;动物细胞培养（RIFreshmey主编，1987年版）;分子生物学当代程序（FMAusubel等主编，1987年，包括补充至2001年）;免疫学当代程序（JEColigan等主编，1991年）;免疫分析手册“（D.Wild主编，斯托克顿出版社，纽约，1994年）;免疫学分析方法（R.Masseyeff，WHAlbert和NAStaines等主编，Weinheim：VCHVERLAGSGESELLSCHAFTMBH，1993年）。
本发明发现，以肠道病毒A亚型的一个BrCr毒株为例，肠道病毒71型（EV71）的3D蛋白具有免疫原性，诱导特异性免疫应答，保护宿主免于EV71的攻击。进一步的研究制备了3D蛋白特异性的单克隆免疫球蛋白G（IgG）的抗体，能抑制EV71型的复制而不诱导抗体依赖性增强（ADE），当提供给宿主后能保护宿主免于攻击。此外，所述中和性抗体的结合表位可以由人工连接子连接形成免疫原性多肽。
EV71BrCr毒株的3D蛋白（SEQIDNO：15）被表达和纯化，纯化的3D蛋白用来免疫的小鼠，遵照标准程序用于产生单克隆IgG抗体。通过常规的杂交瘤技术制备了两个3D蛋白特异性单克隆IgG抗体（杂交瘤细胞株3D-2A10-IgG和杂交瘤细胞株3D-3A12-IgG）。相应的杂交瘤细胞系已经保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），CCTCCNO：C2014143为杂交瘤细胞株3D-2A10-IgG和CCTCCNO：C2014141为杂交瘤细胞株3D-3A12IgG抗体，保藏单位：中国典型培养物保养中心，保藏地址湖北武汉大学，保藏日期：2014年7月22日。单克隆IgG抗体可以是包含的Fc结构域的抗体，单链抗体，或Fab片段。各种抗体的定义和生产是众所周知的。
使用从任一末端连续缺失的重组3D蛋白，鉴定了抗体结合的多肽。3D-3A12IgG抗体结合到KEPAVLTS（SEQIDNO：3），3D-2A10-IgG的结合YSTYVKDELRSLDKI（SEQIDNO：9）。利用序列比对，所识别的多肽在所有来自肠道病毒亚型A，B，C和D的肠道病毒毒株中是高度保守的。如下表1所示，3D-3A12IgG抗体结合到由一个共识序列KEPAVLX7X8所表示的多肽（SEQIDNO：1），其中X7选自T，H，R和N，X8选自S，N和K。3D-2A10-IgG抗体结合到由一个共识序列X1X2TX4VKDELRSX12X13KX15被表示的多肽（SEQIDNO：2），其中X1选自Y，M，L和F，X2选自S和V，X4选自Y和F，X12选自L，A，K和R，X13选自的D，E，T和S，X15选自I和V。
表1、由3D-2A10-IgG或3D-3A12IgG抗体识别的共识序列和示例性序列
肠道病毒包括亚型A，B，C和D。
肠道病毒A亚型包含23个血清型;示范性3D序列包括：（1）人肠道病毒71型（EV71），BrCr毒株（GenBankAB204852.1）（SEQIDNO：15），其中SEQIDNO：15包含抗体结合多肽，由SEQIDNOS：3和9分别表示;（2）人柯萨奇病毒A16型毒株shzh00-1（GenBankAY790926.1）（SEQIDNO：16），其中SEQIDNO：16包含抗体结合多肽，由SEQIDNOS：3和9分别表示。
肠道病毒B亚型包含60种血清型;示范性3D序列包括：（1）人柯萨奇病毒B3Beijing0811毒株（GenBankGQ141875.1）（SEQIDNO：17），其中SEQIDNO：17包含抗体结合多肽，由SEQIDNOS：5和10分别表示;（2）人类柯萨奇A9GRIGGS毒株（GenBankD00627.1）（SEQIDNO：18），其中SEQIDNO：18包含抗体结合多肽，由SEQIDNOS：5和10分别表示。
肠道病毒C亚型包含23个血清型;示范性3D序列包括：（1）人脊髓灰质炎病毒1株CHN-Jiangxi//89-1（GenBank：AF111984.2）（SEQIDNO：19），其中SEQIDNO：19包含抗体结合多肽，由SEQIDNOS：6和11分别表示;（2）人柯萨奇病毒A1KS-ZPH01F/XJ/CHN/2011分离株（GenBank：JX174177.1）（SEQIDNO：20），其中SEQIDNO：20包含抗体结合多肽，由SEQIDNOS：6和12分别表示。
肠道病毒D亚型包含5种血清型;示范性3D序列包括：（1）人肠道病毒68Fermon毒株（GenBank：AY426531.1）（SEQIDNO：21），其中SEQIDNO：21包含抗体结合多肽，由SEQIDNOS：7和13分别表示;（2）人类肠道病毒94E210分离株（GenBank：DQ916376.1）（SEQIDNO：22），其中SEQIDNO：22包含抗体结合多肽，由SEQIDNOS：8和14分别表示。
重组3D蛋白可以单独或者与来自于肠道病毒的其它蛋白质一起在免疫原性组合物中用作免疫原。如下文的实施例所示，EV713D蛋白质与细菌鞭毛蛋白一起使用能诱导抗体应答和部分地保护住的攻毒。由于3D蛋白在所有肠道病毒中高度保守，因此预计3D蛋白可以用作免疫原，对各种亚型具有广泛保护。此外，3D蛋白质的某些变体也可以用于免疫原性组合物，其中，这些变体与相应的野生型蛋白相比，同一性至少85％，优选地90％，更优选地为95％。此外，佐剂可以是任何已知的，如M59，铝佐剂。
由于3D-2A10-IgG和3D-3A12-IgG结合两种不同表位，这将有利于构建多肽，这两个表位的每一个具有至少一个拷贝。这个3D蛋白衍生的免疫原性多肽可用于免疫原性组合物来预防肠道病毒的感染。克隆和表达这些多肽可以使用公知的技术来进行。在一个实施方案中，3D蛋白衍生的免疫原性多肽包含由SEQIDNO：1所示的第一多肽，由SEQIDNO：2所示的第二多肽，和一个人工连接子，其中第一和第二多肽由连接子共价耦合。在某些实施方案中，第一和第二多肽可具有多于一个的拷贝，串联或交替形式。任何已知的肽连接子可以在本发明中可以使用，示例性连接子包括GGGGS（SEQIDNO：23），和TPLGDTTHTSG（YangJY,HumanVaccines&Immunotherapeutics2013;9;1–9）（SEQIDNO：24）。在一种免疫原性多肽中，连接子可以被复制或串联使用。
由于针对3D蛋白的抗体不显示ADE效果，有利的是使用的抗体组合物来治疗患者的肠道病毒感染。用于治疗用途的抗体组合物是公知的，如抗体用于治疗癌症。抗体组合物通常包含药学上可接受的成分，例如氯化钠溶解在药学上可接受的溶液。
实施例
提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理；它们决不旨在限制或缩小本发明的范围
实施例1
EV713D特异性IgG单克隆抗体
1.1、抗原制备
EV71BrCr毒株的完整3D基因（编码SEQIDNO：15所示的蛋白质）克隆到载体pET28a，酶切位点为NcoI和XhoI。简言之，将含有重组3D表达载体转化的大肠杆菌BL21（DE3），细菌生长，通过诱导来制备这些重组蛋白，并通过亲和色谱法在Ni-NTA柱上（Qiagen公司）纯化。
1.2、免疫和制备EV713D特异性IgG单克隆抗体
制备EV713D-特异性单克隆抗体方法如先前描述（LiYM,LiuF,HanCandYanHM.MonoclonalantibodythatblockstheToll-likereceptor5bindingregionofflagellin.Hybridoma(Larchmt).2012Feb;31(1):60-62）。简言之，5周龄雌性SPFBALB/c小鼠皮下免疫100μg3D，时间间隔为2周。最后一次加强后四个星期和细胞融合的前3天，小鼠用200μg3D腹腔接种加强。三天后，收获小鼠脾细胞，和SP2/0融合，融合中使用50％聚乙二醇（Sigma-Aldrich公司，密苏里州）。杂交瘤培养物上清液用ELISA筛选。阳性杂交瘤细胞通过有限稀释进行克隆，稳定的杂交瘤克隆被注射到液体石蜡预处理BALB/c小鼠的腹腔。随后，收获单克隆抗体，用抗体纯化试剂盒（NAbTMProteinA/GSpinKit,ThermoScientific,USA），根据制造商的说明纯化。
1.3、3D特异性IgG单克隆抗体的结合特异性的验证
24孔板中的Vero-1008细胞用EV71（MOI=0.1）感染。感染24小时后，用无水甲醇固定细胞，进行间接免疫荧光试验（IFA），先用3D特异性单抗（3A12，2A10，7A6G1和11F1），接着用荧光素异氰酸酯缀合的山羊抗小鼠IgG的抗体;鞭毛蛋白特异性单克隆抗体（5G10）作为阴性对照，3D免疫的小鼠的血清作为阳性对照。如图1（A）所示，3A12，2A10，7A6G1和11F1显示明显染色，达到与阳性对照相媲美的水平，阴性对照单克隆抗体5G10显示无染色。
Vero-1008细胞培养和感染如上所述。细胞裂解物用SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜上，印迹用指定抗体按照常规免疫印迹程序。如图1（B）所示，泳道1，3A12;泳道2，2A10;泳道3，7A6G1;泳道4,11F1;泳道5，5G10作为阴性对照;和泳道6，阳性对照。结果表明，3D蛋白质特异性IgG单克隆抗体（3A12，2A10，7A6G1和11F1）显示对应于3D蛋白质的特定条带，但阴性对照（5G10）没有显示3D的结合。
1.4、3D特异性IgG单克隆抗体对EV71复制的细胞内抑制
Vero-1008细胞接种于24孔板，每孔1×105细胞，培养24小时后，在MOI=0.1下感染EV71。感染1小时后，除去细胞上清液，洗涤细胞3次。5μgIgG抗体稀释在OPTI-MEM中，然后加到100微升的OPTI-MEM，5微升脂质体2000加入到100微升的OPTI-MEM，最后将混合物加入到病毒感染的细胞。然后，转染3小时后，细胞上清液用含3％FBS的0.5mlDMEM替换。八个小时之后，收获EV71感染的细胞，经过1次冻融循环，通过噬斑测定法测定这些细胞样品中的病毒滴度（由PFU/孔表示）。如图2所示，转染的3A12和2A10显著降低病毒滴度;转染的7A6G1降低病毒滴度，但与3A12和2A10相比没有那么显著;但转染的11F1未能降低病毒滴度。至于EV-5，这是一个VP2特异性IgG单克隆抗体;转染的EV-5未能降低病毒滴度;值得注意的是，EV-5，当直接加入到细胞培养物，显示增加病毒滴度，表明其抗体依赖性增强（ADE）的效果。病毒滴度的数据表明，通过不同的3D特异性IgG单克隆抗体识别的表位对他们抑制EV71复制的能力是非常重要的。
除抗体的剂量外，Vero-1008细胞的培养，感染和抗体处理如上所述。如图2（B）所示，转染的2A10在试验剂量（0，0.2％，1或5微克/孔）范围内对病毒滴度的的降低显示剂量依赖性的抑制作用，但转染的EV-5在所有测试的剂量范围内无抑制。三个独立实验经过重复，且报告的是代表性的数据。
1.5、3D特异性IgG单克隆抗体抑制体外3D聚合酶活性
图3（A）示意3D（RdRp）介导的RNA延伸。
在10微升反应系统中，加入1微克功能性3D，可触发RNA的起始和延伸。RNA种类由包括7摩尔尿素的15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分开，用Stains-All染色。为测定抑制，加入2μgIgG单克隆抗体到各反应。3D的核糖核酸延伸活性，由延伸的RNA条带的出现来确定。如图3（B）所示，泳道1，无聚合酶的阴性对照;泳道2，阳性对照组（没有介入因素）;泳道3，3A12;泳道4，2A10;泳道5，7A6G1;泳道6,11F1;和泳道7，EV-5。3A12，2A10和7A6G显著抑制RNA延伸条带的出现，但11F1和EV-5未能抑制RNA延伸。进行了三个独立的实验，报告的是有代表性的数据。
1.6、3D特异性单克隆抗体在鼠模型中的抗病毒效果
EV713D特异性IgG的抗病毒功效在鼠模型中进行了研究。30只1日龄新生小鼠被随机分成6组（每组5只小鼠）。通过腹腔接种分别给予每组100微克/50微升的3A12，2A10，7A6G1，11F1或EV-5IgG抗体，PBS组作为阴性对照;然后通过腹腔接种每组给予103TCID50EV71攻毒。IgG注射4次，间隔为24小时。每天收集小鼠存活数据，收集2周。如图4所示，2A10-IgG和3A12-IgG分别提供20％或40％的保护。
1.7、2A10-IgG或EV-5-IgG存在下的体外病毒复制
将1×104PFUEV71加入到连续稀释的200μl单克隆抗体（EV-5抗体针对EV71VP2，或2A10IgG抗体针对EV713D）。孵育1小时后，该混合物感染Caco-2细胞。收集EV71感染的Caco-2细胞，通过噬斑测定法测定这些细胞样品中的病毒滴度。如图5所示，在0.25-16μg/ml的浓度下，与基线（P<0.01）相比，EV-5显著增强病毒感染，但2A10在所有测试的剂量下没有增强病毒感染。
1.8、测绘EV713D特异的3A12和2A10的表位和在EV713D（1RA6）的三维模型中的空间状况
3D基因（编码由SEQIDNO：15所代表的蛋白质）和其截短突变体被克隆到pET28a表达载体，通过Western印迹测定IgAs对3D蛋白质和突变体的结合活性。此外，用合成的不同长度的多肽来确定3A12-IgG和2A10IgG抗体识别的确切范围。如表1所示，3A12和2A10识别的多肽分别为：KEPAVLTS（SEQIDNO：3）和YSTYVKDELRSLDKI（SEQIDNO：9）。来自所有A，B，C和D亚型的各种肠道病毒株的比对揭示了，由3A12识别的一个共识序列KEPAVLX7X8（SEQIDNO：1），和由2A10识别的另一个共识序列X1X2TX4VKDELRSX12X13KX15（SEQIDNO：2）。如图6所示，EV713D（1RA6）被用来显示3A12和2A10的两个已识别的表位的位置。
1.9、EV713D特异IgAs在胞内抑制EV71和CV株的复制
由于IgA的单克隆抗体可方便地用于测定不同毒株的胞内抑制，3A12-IgG和2A10-IgG经由亚型转换成对应的IgA的单克隆抗体，3A12-IgA和2A10-IgA。细节被包括在标题为“3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体”的申请中，在此引入其全文。
胞内抑制EV71和CV株的复制的结果被总结在下文表2中。
表2、胞内抑制EV71和CV株的复制
其中“a”表示，用培养基组的病毒滴度作为100%，计算在不同抗体的存在下病毒存活的百分比后，计算“％病毒降低”。
实施例2
3D作为抗原
2.1、在表达3D的重组痘苗病毒天坛株（VTT-3D）中识别3D
在重组痘苗病毒感染的VERO-1008细胞中检测EV713D。如图7所示，泳道1，蛋白分子量标记，泳道2，模拟感染的VERO-1008对照，泳道3，VTTenv感染的VERO-1008，泳道4-7，4个纯化的重组牛痘病毒克隆感染的VERO-1008。受感染或未受感染的VERO-1008通过SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜。3D特异性IgG单克隆抗体2A10IgG抗体作为结合抗体。结果表明，3D基因在Vero细胞插入牛痘病毒基因组，并正确表达。
2.2、免疫程序
表3、免疫程序
图8是免疫方案的示意图。
每次免疫后检测抗体应答：首免（图9）;第一次加强（图10）;第二次加强（图11）。在VTT-3D组中的每只小鼠免疫100微升107PFU病毒，而在3D组中的每只小鼠免疫100μl30微克3D蛋白。收集血清和来自阴道和唾液的黏膜样本，通过ELISA来确定的抗3D蛋白的IgA的滴度。
检测的新生小鼠的抗体应答（图12）。
2.3、EV71攻毒保护
经过三次免疫后，在VTT-3D组，3D组，PBS组以及EV71灭活组中的每只新生小鼠攻毒103TCID50EV71小鼠适应株病毒。每天观察新生小鼠。灭活EV71的免疫完全保护小鼠。在PBS阴性对照组中的所有小鼠，在攻毒后3-5天死亡。如图13所示，3D和VTT-3D提供10％-30％的保护。
实施例3
3.1、用纯化的3D蛋白质免疫
3D蛋白的表达和纯化在实施例1.1中进行了描述。纯3D蛋白加上来自大肠杆菌的鞭毛素或CTB作为佐剂，然后免疫小鼠，途径包括皮下（SC），鼻内（IN）或腹膜内（IP）。表4总结了免疫方案。两次免疫之间的间隔为2周;SC和IP的体积是100微升，而IN的体积是20μL。
表4、用纯化的3D蛋白的免疫方案
3.2、抗体应答
最后免疫的2周后，收集血清，小肠和肺样品，小肠和肺的样品匀浆，收集上清液用于测试。这些样品中的3D特异性IgA或IgG抗体应答通过ELISA滴定。图14示出了3D-特异性IgG抗体滴度：血清（A），肺（b）和小肠（c）；3D特异性IgA抗体的滴度：血清（d），肺（e）和小肠（F）。
尽管本发明参照特异的实施方式来描述，但是将被理解的是，实施例是说明性的，本发明的范围并不局限于此。本发明的替代实施例对本发明涉及的领域的普通技术人员将变得显而易见。这样的替代实施例都被认为是包含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明的范围由所附的权利要求被描述，由前面的描述所支持。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>鄢慧民；李么明；周谛晗；俞杰
<120>IMMUNOGLOBULINGMONOCLONALANTIBODIESAGAINST3DPROTEINSOF
ENTEROVIRUSES;抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体
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<400>21
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15
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<213>ArtificialSequence
<220>
<223>artificiallinker
<400>24
ThrProLeuGlyAspThrThrHisThrSerGly
1510
Claims (9)
1.抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体，其特征在于，所述抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体特异性结合多肽，其中所述多肽由选自SEQIDNO：1和SEQIDNO：2中的一个共识序列表示。
2.根据权利要求1所述抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体，其特征在于，与SEQIDNO：1所示多肽结合的抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体是3D-2A10-IgG（CCTCCNO：C2014143），与SEQIDNO：2所示多肽结合的抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体是3D-3A12-IgG（CCTCCNO：C2014141）。
3.根据权利要求1所述抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体，其特征在于，所述抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体是从包含Fc结构域抗体，单链抗体，和Fab片段中选出。
4.根据权利要求1所述抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体，其特征在于，其中SEQIDNO：1所示多肽是选自由SEQIDNOS：3-8所示的多肽，SEQIDNO：2所示多肽是选自由SEQIDNOS：10-14所示的多肽。
5.包含如权利1所述的抗肠道病毒3D蛋白的单克隆免疫球蛋白G抗体免疫原性组合物，其包含重组3D蛋白质或3D蛋白衍生的免疫原性多肽，以及药学上可接受的佐剂。
6.根据权利要求5所述免疫原性组合物，其特征在于，其中所述重组3D蛋白是选自由SEQIDNOS：15-22所示的3D蛋白，和具有相应的野生型3D蛋白至少85％同一性的变体。
7.根据权利要求5所述免疫原性组合物，其特征在于，其中3D蛋白衍生的免疫原性多肽包含由SEQIDNO：1所示的第一多肽，由SEQIDNO：2所示的第二多肽，和一个人工连接子，其中第一和第二多肽由连接子共价偶联。
8.根据权利要求7所述免疫原性组合物，其特征在于，其中所述第一多肽是选自由SEQIDNOS：3-8所示的多肽，第二多肽是选自由SEQIDNOS：10-14所示的多肽。
9.根据权利要求7所述免疫原性组合物，其特征在于，其中所述人工连接子是选自由SEQIDNOS：23和24所示的连接子。
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Applications Claiming Priority (1)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105974119A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-09-28 | 吉林大学 | G种肠道病毒直接免疫荧光试剂及其试剂盒 |
| CN108148119A (zh) * | 2018-01-09 | 2018-06-12 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种环六肽化合物及其在制备抗肠道病毒药物中的应用 |
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2015
- 2015-01-19 CN CN201510025505.8A patent/CN105085671B/zh active Active
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| CN105974119B (zh) * | 2016-06-21 | 2018-03-09 | 吉林大学 | G种肠道病毒直接免疫荧光试剂及其试剂盒 |
| CN108148119A (zh) * | 2018-01-09 | 2018-06-12 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种环六肽化合物及其在制备抗肠道病毒药物中的应用 |
| CN108148119B (zh) * | 2018-01-09 | 2021-03-09 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种环六肽化合物及其在制备抗肠道病毒药物中的应用 |
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