KR900008247B1 - 새로운 생리활성물질 아르파메닌(Arphamenine)의 제조방법 - Google Patents

새로운 생리활성물질 아르파메닌(Arphamenine)의 제조방법 Download PDF

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타카아키 아오야기
토미오 타케우치
마사 하마다
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자이단호진 비세이부쓰 가가구 겐규카이
이치카와 토쿠지
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Abstract

내용 없음.

Description

새로운 생리활성물질 아르파메닌(Arphamenine)의 제조방법
제1도는 본 발명의 아르파메닌 A의 자외선 흡수 스펙트럼.
제2도는 아르파메닌 A의 적외부 흡수 스펙트럼.
제3도는 아르파메닌 A의 핵자기 공명 흡수 스펙트럼.
제4도는 본 발명의 아르파메닌 B의 자외부 흡수 스펙트럼.
제5도는 아르파메닌 B의 적외부 흡수 스펙트럼.
제6도는 아르파메닌 B의 핵자기 공명 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명은 아미노 펩티다제(perptidase) B에 대하여 효소저해활성을 나타내는 새로운 생리활성물질 아르파메닌(Arphamenine)A 또는 B의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 일본국 혹카이도(化海直)의 토양에서 분리된 박테리아인 BMG 361-CF 4주(株)로 명명한 균을 배양하여, 얻어진 배양물중에 아미노펩티다제 B저해활성을 가진 물질이 존재한다는 것을 발견하였다.
이 효소저해물질의 체취방법에 대하여 검토한 결과 그 물질의 분리에 성공하였고 또 본 물질이 새로운 물질임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 저해물질은 새로운 물질로 아르파메닌으로 명명하였으나 이 아르파메닌은 다음과 같이 2종의 물질, 즉 아르파메닌 A와 B로부터 구성되어 있어 이들의 물성치와 구조식은 각각 다음과 같다.
본 명세서에서 본 물질 또는 아르파메닌은 아르파메닌 A 또는 B, 이들의 양자 혹은 그 혼합물을 의미한다. 본 발명자들은 또 의약으로서 아르파메닌의 유용성에 대해서 검토한 결과 본 물질이 세포성 면역에 대하여 중강작용을 갖고 있으며 또 제암(制癌)작용을 갖고 있다는 것을 발견하였다.
본 물질은 아르기닌-β-나프틸아미드의 아미노펩티다제 B에 의한 분해를 저지하는 효력에 대하여 조사한 결과, 다음에 설명한 시험에서와 같이 항아미노펩티다제 B 활성을 갖고 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 첫째요지는 다음식으로 표시되는 항아미노펩티다제 B활성을 가진 새로운 생리활성물질 아르파메닌 A 및 B 또는 그 염에 있다.
Figure kpo00002
위 식중에서, R은 아르파메닌 A인 경우 수소원자를 나타내며, 아르파메닌 B인 경우 히드록시기를 나타낸다.
본 발명의 아프파메닌 A 및 B는 다음 구조를 갖고 있다.
Figure kpo00003
아르파메닌 A
Figure kpo00004
아르파메닌 B
아르파메닌 A 및 B는 다음 실시예에서와 같이 아르파메닌 생산균의 배양여액을 CM-세파딕스 크로마토그라피등으로 분액시켰으며, 어느것이나 무색 분말로서 얻어질 수 있다.
그 물성은 다음과 같다.
즉, 아르파메닌 A는 융점 117-119℃, 질량분석법으로 얻어진 분자량은 320이다. 원소분석치는 C 53.45%, H 7.11%, N 14.91%, O 14.20%, C 10.49%로, C16H24N4O3·HCl의 분자식이 얻어진다. 아르파메닌 A의 100γ/ml를 함유한 수용액에 있어서의 아르마페메닌 A의 자외부 흡수스펙트럼은 제1도에서와 같으며 λ max 257nm(ε 180)에서 흡수를 나타낸다. 아르파메닌 A의 적외부 흡수스펙트럼(KBr 정)은 제2도에서와 같으며, 3370, 3170, 2950, 1730, 1670, 1560, 1460, 1410, 1320, 1190, 1110, 760, 710cm-1에서 특이한 흡수대를 나타낸다.
아르파메닌 A의 핵자기 공명흡수스펙트럼(IH-NMR)(중수용액 8ppm, 100MHz)은 제3도에서와 같으며, 2.04-2.33(CH2), 2.35-2.72(CH2), 3.34-3.69(CH2×2), 3.69-3.84(CH, CH2), 4.83(CH), 7.82-8.00(C6H5)에서 흡수를 나타낸다.
아르파메닌 B는 융점이 118-120℃, 질량분석법으로 얻어진 분자량은 336이다. 원소분석치는 C 49.30%, H 6.88%, N 13.77%, O 20.82%, Cl 8.73%이고, C16H24N4O·HCl, H2O의 분자식이 얻어진다.
아르파메닌 B의 100γ/ml를 함유한 수용액중 아르마페메닌 B의 자외흡수 스펙트럼은 제4도에서와 같으며 λ max 275nm(ε 1040) 및 λ max 222nm(ε 5500)에서 흡수를 나타낸다. 아르파메닌 B의 적외부 흡수스펙트럼(BKr 정)은 제5도에서와 같으며 3370, 3180, 2960, 1730, 1670, 1560, 1520, 1460, 1420, 1330, 1250, 1180, 1110, 840cm-1에서 특이한 흡수대를 가진다.
아르파메닌 B의 핵자기 공명흡수스펙트럼(중수용액, δppm, 100MHz)은 제6도에서와 같으며, 1.87-2.30(CH2), 2.30-2.62(CH2), 3.14-3.54(CH2×2), 3.54-3.78(CH, CH2), 4.75(CH), 7.30-7.67(C6H4)에서 흡수를 나타낸다.
또, 본 발명의 제2요지는 크로모박테륨속에 속하는 아르파메닌 생산균을 배양하여 본 물질을 배양물중에서 생산, 축적시키고, 또 여기서 본 물질을 채취함을 특징으로하는 새로운 생리활성물질 아르파메닌 A 또는/및 B의 제조방법에 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 아르파메닌 생산균이라는것은 아르파메닌 A 또는 B, 또는 이들양자를 생산하는 균을 의미한다.
본 발명의 아르파메닌 생산에 사용되는 생산균의 1예로는 본 발명자들에 의해 일본국 혹카이도시크쓰호(支笏湖)포로피나이(poropinai)에서 채취한 토양에서 분리시킨 세균 크로모박테륨 비오라세움 BMG 361-CF 4(Chromo-bacter-ium violaceum) 주가 있다.
본 균주는 일본국 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 1982년 5월 4일 보관기탁되어 일본국 미공연균기 제6521호(FERM P-6521)의 기탁번호로 부여되어 보관되어 있다.
상기 균주는 한국과학기술원에 1983년 5월 30일 보관수탁되어 KAIST 83053-09915의 수탁번호로 부여되어 보관되어 있다.
다음에 본 균주의 균학적 성상에 대하여 기술한다.
BMG 361-CF4주의 균학적 성상
(가) 형태
(1) 본 균주의 세포는 간상(稈狀)(rod)으로 크기가 0.8-1.0×2.0-4.0 미크론 정도이다.
(2) 세포의 다형성(多形性)은 특히 확인되지 않음.
(3) 운동성을 가지며 극면모(極鞭毛) 및 측면모(側鞭毛)를 확인하였음.
(4) 포자는 확인되지 않았음.
(5) 그람염색은 음성임.
(6) 항산성(抗酸性)은 갖고 있지 않음.
(나) 각 배지에서의 생육상태(27℃ 배양, 육즙제라틴 천자배양[穿刺培養(bouillon gelatin stab culture)]만으로 20℃ 및 30℃에서 배양)
(1) 육즙한천 평판 배양
생육 코로니(colonies)는 반구형상으로 점점융기하고, 테두리는 평활하고 원형이며, 또 그 표면은 매끄럽고 광택을 가진다.
배양후 17시간 정도에서는 반투명의 코토니이나 차차 불투명하게되고 검(Gum)상을 띠게 된다.
배양후 2일정도부터 코로니는 자색으로되나 확산성(擴散性색소는 확인되지 않았다.
(2) 육즙 한천 사면(斜面)배양
접종선(接種線)에 따라 같이 생육하여 표면은 매끄럽고 광택이 있으며 테두리는 평활하다. 배양후 2일정도부터 한천사면의 저부에서 자색을 띠게되나 용해성 색소는 확인되지 않았음.
(3) 육즙액체 배양
배양후 2일경부터 배지표면에 자색의 링(ring)상 발육을 한다.
배양후 40시간경부터 시험관 저부의 균체증가가 확인되었고 그 균체는 3일경부터 자색을 나타나게 되었음.
(4) 육즙 제라틴 천자배양
30℃ 배양에서는 천자선에 따라 균생육이 확인되며 배양후 3일경부터 액화가 시작되고 그 형태는 튜브상이다. 20℃로 배양할때 배양후 6일경에 액화가 확인되었음.
(5) BCP 밀크배양
배양후 3일경부터 BCP가 청색으로 변화되고 응고가 확인되었음. 다음으로 5일경에는 응고가 끝나 즉시 펩톤화가 시작되고 약 2주간에 완료되었음.
(다) 생리학적 성질(특별히 기재되지 않을때에는 배양온도가 모두 27℃임)
(1) 질산염의 환원 : 질산염에서 아질산염을 생성한다.
(2) 탈질반응(脫窒反應)[구형(驅形)의 방법 : 일본국 長谷川武浴編著 ; 미생물의 분류와 동정(同定), 東京大學出版會, 223면, 1975년)] : 양성, 가스의 발생은 확인되지 않았음.
(3) MR테스트 : 양성(陽性)
(4) VP테스트 : 음성
(5) 인돌의 생성 : 음성
(6) 황화수소의 생성(TSI 한천배지 : 榮硏) : 음성
(7) 전분의 가수분해 : 음성
(8) 구연산의 이용 : Koser의 배지, Christensen의 배지와 함께 생육함.
(9) 무기질소원(질산나트륨, 황산암모늄, 글루타민산나트륨)의 이용 : 어느 무기질소원도 이용하며 생육이 확인되었음.
(10) 색소의 생성[킹(King) A 및 B배지 : 榮硏) : 양배지다같이 약간 황색의 용해성 색소를 확인하였음.
(11) 우레아제(뇨소배지 : 榮硏) : 음성
(12) 옥시다제 : 양성
(13) 카타라제 : 양성
(14) 생육온도, PH의 범위 : 생육온도범위는 12-37℃, 최적온도는 27-30℃ 부근임. 생육 PH범위는 5.0-8.6, 최적 PH는 6.0-7.8이다
(15) 산소에 대한 태도 : 호기성(통성험기성)
(16) O-F 레스트(Hugh Leifson 법에 의함) : 발효형(發酵型)이다.
(17) 당류로부터의 산 및 가스생성(Hugh Leifson)배지를 사용)
D-글루코스, D-프룩토스, 트리할로스로부터 산의 생성이 확인되었음. 단, 다음 19종류의 당(糖)에서는 산의 생성이 확인되지 않았다. L-아리비노스, D-키실로스, D-만노스, D-갈락토스, 맥아당, 설탕, 유당 (乳糖), D-소르비톨, D-만니톨, 이노시톨, 글리세린, 전분, 아도니톨, 셀로비오스, 둘시톨, 이눌린, 멜리비오스, 멜래지토스, 라피노스, 또, 가스의 생성은 어느당에서도 확인되지 않았음.
(18) 카제인의 가수분해
카제인 한천평판(육즙한천에 따로 멸균한 탈지우유를 5% 농도로 가하고 고화(固化)하였음. PH 7.4에서 획선(劃線)배양하여 배앙후 24시간에 카제인의 소화가 확인되었고, 8일경에는 가수분해가 완료되었다.
(19) 자색 색소의 가시부 흡수측정 :
육즙 한천 사면(斜面)배지에 생육한 자색의 균체를 에타놀로 추출하여 가시부 흡수측정을 한 결과, 최대흡수 573nm, 또 최소흡수 430nm을 나타내었다. 또, 10% 황산에타놀중에는 최대흡수 693nm의 녹색용액으로 되었다.
이것은 그 자색색소가 비오라세인(violacein)색소 임을 나타내고 있다. (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, P. 354참조).
이상의 성상을 요약하면 BMG 361-CF4주는 그람음성의 통성 혐기성 간균으로 극편모 및 측편모를 갖고 있다.
또, 코로니는 자색으로 그 색소는 가시부흡수 측정에 의해 비오라세인임이 중명되었다. 이들의 성상을 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8th/ edition으로 검색하면, BMG 361-CF4주는 크로모박테륨(Chromobacterium)속에 속하는 것으로 생각된다. 크로모박테륨, 비오라세움 및 크로모박테륨·리비담(lividum)의 2종이 있으나, BMG 361-CF4주는 전자에 극히 가까운 성질을 나타낸다.
즉, BMG 361-CF4주는 37℃에서 생육하면, 당(糖)으로부터의 산생성 패턴으로 트리할로스에서 산을 생성하며, 아라비노스, 키실로스로부터는 산을 생성하지 않는점, 또 카제인의 가수분해가 확인되는점 등으로부터 크로모박테륨·리비담과 명백하게 구별되었다.
따라서 BMG 361-CF4주를 크로모박테륨·비오라세움(Chromobacterium violaceum) BMG 361-CF4로 확인되었다.
다음으로 본 발명의 방법을 구제적으로 설명한다.
본 발명의 방법을 실시함에 있어서, 아르파메닌 생산균을 배양하는데 쓰이는 영양원으로는 세균의 영양원으로서 공지의 것을 적당히하여 사용할 수 있다.
예로서, 시판되는 글리세린, 글루코스, 락트스, 슈크로스, 전분, 말토스, 당밀등 탄수화물, 지방등을 탄소원으로 하며, 시판되는 펩톤, 육엑스, 콘스팁리커, 면실가루, 땅콩가루, 대두분, 콘글루텐밀, 어분, 효모엑스, N-Z 아민, 카제인, 질산나트륨 질산암모늄, 황산암모늄등을 질소원으로 하고 식염, 연산염, 탄산칼슘, 황산마그네슘등을 무기 영양원으로하여 각각 사용할 수 있다.
기타 필요에 따라 미량의 급속염을 첨가한다. 이들의 본 물질은 아르파메닌 생산균이 이용되며, 또 본물질의 생산을 방해하지 않는것이면 된다.
공지된 세균배양 재료는 모두 사용될 수 있다.
특히 바람직한 배지성분으로서는 탄소원으로서 글리세린, 가용성전분등, 질소원으로서 대두분, 어분, 콘글루텐밀등이 있다. 글리세린 1.5%, 가용성전분 1.5%, 프로리치(prorich) 0.5%, 어분 1.5% 탄산칼슘 0.2%를 함유한 조성배지, 가용성 전분 3%, 프로리치 0.5%, 콘글루텐밀 1.2%, 탄산칼슘 0.2%를 함유한 배지등을 사용하는 것이 바람직하다.
아르파메닌의 대량생산에는 액체배양이 바람직하다.
배양온도에서는 아르파메닌 생산균이 발육하며, 아르파메닌을 생산하는 범위의 온도를 적용할수 있으나 특히 바람직한 배양온도는 25℃-35℃이다. 배양온 보통 본 물질이 배양물중에 생산되며, 충분히 축척할때까지 계속된다.
예로서, 가용성 전분 3%, 프로리치 0.5%, 콘글루텐밀 1.2%, 탄산칼슘 0.2%를 함유한 배지를 멸균한 후 여기에 아르파메닌 생산균의 사면 배양물의 1백금이 량을 접종하여 27℃에서 호기적으로 진탕배양을 하면 배양 8시간부터 52시간에 아르파메닌의 축적이 확인되었다.
아르파메닌은 탱크배양법으로도 진탕배양법과 동일하게 생산된다. 예로서, 570
Figure kpo00005
의 300
Figure kpo00006
의 배지를 넣어 멸균하고 매분 300
Figure kpo00007
의 무균공기를 유입하며, 매분 190회전으로 교반하였다. 이 조건에서 본 물질의 생산은 23시간에서 최고에 달하였다. 아르파메닌의 배양공정 및 정제공정중 추적(追跡)은 다음방법에 의한 항 아미노펩티다제 B활성측정에 의해 실시하였다.
항 아미노 펩티다제 B활성측정은 흡푸수(V.K.HOPPUSU, K.K.MAKINEN, G.G.GLENNER, Archives of Bio chemistry and Biophysics
Figure kpo00008
, 557, 1966)기재 방법의 개량법으로 실시하였다.
즉, 0.002M 아르기닌-β-나프틸아미드 0.25ml에 0.1M트리스-염산완충액(PH 7.0)0.5ml, 검체를 함유한 용액 0.25ml를 가한 혼합용액을 37℃, 3분간 가온한 다음, 흡푸수등의 방법에 의한 효소의 정제법으로, DEAE-셀루로오스로 정제한 마이노펩티다제 B용액을 5μl가하여 37℃에서 30분간 반응시킨다. 그다음 1mg/ml의 농도에 파스트가내트(Fast Garnet)GBC(0-아미노아조톨루엔, 디아조늄염)을 함유시키는 10%의 농도에 계면활성제 투윈 20(Tween 20)을 함유한 1.0M초산 완충액(PH 4.2)1ml를 가하여 실온에서 15분간 방치한다음 525m에서의 흡광도(a)를 측정하였다.
동시에 아르파메닌을 함유하지 않은 완충액만을 사용한 블랭크(blank) 흡광도(b)를 측정하여, 아미노펩티다제 B저해율(阻害率)을 [(b-a)/b]×100에 의해 계산하였다.
이 정량방법으로 0.005㎍/ml의 아르파메닌 A와 0.002㎍/ml의 아르파메닌 B는 아미노펩티다제 B활성을 50%저해하였다(IC50).
아르파메닌은 아르파메닌 생산균의 배양용액중 및 군체중에 존재한다. 아르파메닌을 배양물에서 채취하는데 있어서는 배양여액에서 흡착제에 흡착 및 이탈시키는 방법으로하여 양호한 수율로 채취할수 있다. 흡착제로는 활성탄, 엠버라이트 XAD-4, 다이야이온 HP-20등 유기흡착제, 이온교환수지, 알루미나, 실리카겔 등을 사용할 수 있다.
예로서, 아르파메닌은 엠버라이트 XAD-4에 흡착되어 아세톤수로 용출된다. 예로서 배양여액의 그
Figure kpo00009
량의 엠버라이트 XAD-4를 적당한 컬럼에 넣고, 아르파메닌을 함유한 배양여액을 통과, 흡착시키며, 엠버라이트 XAD-4를 수세시킨 다음 엠버라이트 XAD-4량의 2-4배량의 50% 아세톤수로 용출시킨다.
배양여액중 아르파메닌은 50% 아세톤 수용액중에서 70%이상 용출된다.
이 50% 아세톤 수용액을 감압, 농축 건조함으로써 거친분말을 얻을수 있다. 이온 교환체의 크로마토그라피도 정제에 이용된다.
특히 CM-세라딕스의 크로마토그라피가 유효하며, 식염수의 농도사면(斜面 slope)용출에 의해 아르파메닌 A와 B를 서로 분리할수 있다.
예로서, 엠버라이트 XAD-4에 흡착시켜 아세톤 수용액에 의해 얻어진 거친 분말을 CM-세파딕스크로마토그라피에 처리하고, 식염등 염류 수용액을 써서 용출하여 아르파메닌 A를 함유한 프랙숀(fraction)과 아르파메닌 B를 함유한 프랙숀을 각각 채취하고 여기서 아르파메닌 A와 B를 각각 분리한다.
본 물질의 최종 정재는 세파딕스 LH-20으로 탈염시켜 실시할수 있다. 즉, 다시 구체적으로 설명하면, 상기 KAIST 83530-099153으로 기탁된 크로모박테륨 비오라세움 BMG361-CF4의 아르파메닌 생산균주를 배양한 다음 얻어진 배양액에서 아르파메닌 A와 아르파메닌 B의 혼합액을 회수시키며, 그 회수한 아르파메닌 A와 아르파메닌 B의 혼합물을 CM-세파덱스 컬럼상에서 컬럼크로마토그라피로 처리시키며, 그 CM-세파덱스컬럼을 알칼리금속 클로리드 수용액으로 용출시키고, 아르파메닌 A를 함유한 활성 프랙숀(actlve fraction)과 아르과메닌 B를 함유한 활성프랙숀을 얻도록한 분리프랙숀(separate fraction)의 용출액을 채취(collection)하며, 각각의 활성프랙숀에서 아르파메닌 A와 아르파메닌 B를 별도로 최종회수시키는 공정으로 구성시킴으로써 아르파메닌 A와 B를 분리시킬수 있다.
본 발명의 아르파메닌에 대하여 그 약리작용을 검토하였다.
그 결과, 본 물질이 세포성 면역에 대한 증강효과와 제암작용을 갖고 있음을 확인하였다. 본 발명의 아르파메닌 A, B양 물질의 생물활성에 대한 실시예를 들어 설명한다.
시험예 1
본예는 정상 마우스에 있어서의 세포성 면역에 미치는 효과를 나타낸다.
세포성 면역에 미치는 아르파메닌 A 및 B의 작용을, 양적혈구(羊赤血救 SRBC로함)을 항원으로 하여 마우스의 발바닥에 접종시켜 얻어진 지연형 과민증(遲延型過敏症 D.T.H라함)을 지표로하여 검토하였다(참고문헌 J.Exp.Med 139. 1529-1539, 1974). 즉, SRBC 108개를 0.05ml의 생리식염수에 부유시킨 현탁액을 CDFI(
Figure kpo00010
8주령)마우스의 발바닥피하에 접종하고 동시에 아르파메닌 A 또는 B 5㎎/kg, 0.05㎎/kg 또는 0.005mg/kg를 함유한 수용액를 1회 경구투여하였다. 투여 4일후 다른 발바닥에 나타낸 종창도(腫脹度)(발바닥 두께의 증가)를 캘리퍼스(calipers)로 측정하였다.
공시 화합물을 투여하지 않고 SRBC 및 생리식염수의 피하주사를한 대조동물의 발바닥 비후도(肥厚度)를 100%로 평가하여 이것과 처리한 공시동물의 발바닥 비후도를 비교함으로써 공시화합물의 세포성 면역 증강효과를 판정하였다.
시험결과를 다음표에 표시한다
[표 1]
Figure kpo00011
[표 2]
Figure kpo00012
시험예 2
본 실험에는 담암(擔癌)마우스에 있어서의 세포성 면역에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
(1) 항원으로서 SRBC를 사용한 방법
실험법은 위 시험예 1에 준하는 방법으로 발바닥의 종창도를 측정하여 검토하였으나, 다만 복수성(腹水性)Sarcoma 180종양의 세포 106개를 ip접종한 CDF1마우스를 사용하고 아르파메닌 A의 투여를 항원으로서 SRBC의 감염일로부터 1회/1일, 4일간 연일 ip투여하여 2일후에 SRBC의 2차감염을 한점이 다르다.
시험결과를 다음표에 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00013
(2) 항원으로서 염화피크릴을 사용한 방법
복수성 Sarcoma 180종양의 담암 마우스에 염화피크릴을 항원으로 한 D.T.H 반응에 의한 세포성면역에 미치는 아르파메닌 A의 효과릍 다음 시험법으로 검토하였다. 복수성 Sarcoma 180종양의 세포 106개를 CDF1(♀12주령) 마우스(6마리/군) 복강내에 이식(0일)하여 1일후에 25mm×15mm로 털을 깍은 복부에 6% 염화피크릴에타놀액을 20mm×20mm×2mm로 절단한 탈지면에 0.6ml 함유시켜 감염한다. 8일후 두귀(耳)를 다이얼식 후막계(厚膜計)로 측정하여 그 값을 전치(前値)(a)로 한다. 그다음 10mm×4mm×1mm로 절단한 탈지면에 1% 염화피크릴 오리브액을 함유시켜 양귀에 감염시켜 9일후에 그 양귀의 종창도를 다이얼식 후막계로 측정하여 그 측정치(b)에서 전치(a)를 빼어 그 귀의 두께 증강도(b-a)를 계산하고 이것을 대조균(c)로 한다. 한편, 생리식염수에 용해한 공시화합물을 0.5mg/kg, 0.05mg/kg, 또는 0.005mg/kg의 량으로 Sarcoma 180접종하여 1일후부터 8일후까지 연일 6회/일 경구투여하고 또 대조균과 동일하게 염화피크릴로 감염하여 귀두께 증가도(b'-a')를 측정하고 이것을 처리군(T)로 한다. 대조에 대한 귀두께 증가율(T/C×100)을 계산하여 세포면역 부활성 정도로 하였다. 시험결과를 다음표에 나타낸다.
[표 4]
Figure kpo00014
*P＜0.05
위표 결과에서 0.05mg/kg의 아르파메닌 A 투여균에 의미가 있는 세포면역 불활성이 얻어졌음이 확인되었다.
시험예 3
본 시험에는 에르리히 고형종양에 대한 아르파메닌의 항종양활성을 나타낸다. 복수형 Ehrlich carciooma 종양세포 3×106개를 ddy(♀8주령) 마우스(5마리/군)의 측복부(側服剖) 피하에 이식(0일)하여 생리식염수에 용해한 공시화합물을 1일후에서 15일후에까지 격일로 7회 0.5mg/kg, 0.05mg/kg 또는 0.005mg/kg량으로 하여 경구 투여하였다. 종량이식에서 30일후에 종양사이즈(짧은 직경2×긴직경/2) 및 종양중량을 측정하였다. 그 각각으로부터 대조군과의 비교에 의해 종양 성장억제율(TIR%)를 다음식 C-T/C×100에서 계산하여 TIR%로 항종양효과의 평가를 나타내기 위하여 다음표에 나타낸다. 단, C : 대조군의 종양사이즈 또한 종양중량, T : 처치군의 증양사이즈 또는 종양중량임.
[표 5]
Figure kpo00015
(주) T-데스트에 의해 P＜0.1은,*, P＜0.005는**임
위 표의 결과, 종양사이즈 및 종양중량에 있어서 0.05mg/kg, 0.005mg/kg 아르파메닌 투여군에, 숙주가 있는 종양효과가 얻어졌음이 확인되었다. 이상의 결과로부터 아르파메닌 A, B 두 물질은 정상적인 동물의 세포성 면역능을 증강하며, 또, 담암에 의해 저하한 세포성 면역능율을 부활하고 또 숙주가 있는 항종양 효과를 나타내는 물질임을 확인하였다. 마우스에 대한 급성독성 시험에서는 아르파메닌 A의 250mg/kg iv 투여로, 또 아르파메닌 B의 150mg/kg iv 투여로 사명하는 예는 확인되지 않았으며, 따라서 아르파메닌은 안전한 물질임이 확인되었다. 이와같이 본 발명의 아르파메닌 A 및 B는 단독으로 면역효과를 증강하며, 또 제암효과를 숙주가 있게하여 나타내고 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명 화합물은 면역증강제 및 항종양 면역 부활제로서 유용하며, 또 각종암 화학요법제의 보조약으로서 유용하다.
아르파메닌 A, B를 유효성분으로하는 약제로는 아르파메닌 A 또는 B 또는 양자 혹은 약학적으로 허용되는 염 어느것을 상용(常用) 담체(擔體)와 배합하여 제재할 수 있고, 또 각종의 화학요법제를 혼합하여도 된다. 아르파메닌염의 예로는 아르파메닌의 카르복실기에 약학적으로 허용될 수 있는 양이온, 예로서 나트륨, 칼륨과 같은 알칼리 금속칼슘, 마그네슘과 같은 알칼리토류 금속의 양이온, 암모늄이온과 염(카르복실 레이트)이 있다. 아르파메닌의 구아니딜기, 아미노기에 약학적으로 허용될 수 있는 무기산, 예로서, 염산등 또는 유기산 예로서 초산등 산부가염도 포함된다. 본 발명의 화합물 내지 약제의 투여형태는 경구, 주사, 직장좌제(直腸坐劑)중 어느 것이라도 좋다.
주사제를 조제할 경우 위 유효성분 화합물에 pH 조정제, 완충제, 안정화제, 부형제를 첨가하여 일반법에 의해 냉동 건조를 하고 동결건조를 하여 주사제를 만들수 있고, 도 유효성분 화합물에 pH 조성제, 완충제, 안정화제, 등장제(等張劑), 국마제(局痲劑) 등을 첨가하여 일반법에 의해 피하, 근육내, 정맥내에 쓰이는 주사제를 만들수도 있다. 경구용 고형제제를 조제할 경우 유효성분 화합물에 부형제, 또는 필요에 따라 결합제, 붕괴제, 활택제(滑澤劑), 착색제, 교미제(橋味劑), 교취제(橋臭劑)를 가한다음 일반법에 의해 정제, 피복정제, 과립제, 산제, 캡셀제 등을 만들 수 있다.
경구액상 제재를 조제할경우 유효성분 화합물에 교미제, 완충제, 안정화제, 고취제등을 가하고 일반법에 의해 시럽제 및 드라이시럽제를 만들수 있다. 직장좌약 제재를 조제할 경우에는 유효성분 화합물에 부형제, 또 필요에 따라 계면활성제를 가한다음 일반법에 의해 좌제를 할 수 있다. 아르파메닌의 투여량은 증상에 따라 다르나 성인인 경우에는 1회 아르파메닌으로서 0.02-200mg을 1일 1회 투여하는 것이 좋다.
또 다른 암 화학요법제 또는 면역 증강제와 병용할때에는 암화학요법제 또는 면역 증강제의 통상 사용량에 위 범위내 사용량의 아르파메닌을 병용하면 된다. 다음으로 본 발명의 아르파메닌 제조에 관하여 실시예를 들어 설명하나 본 발명의 이 화학적 성상 및 생산방법, 그 정제방법이 본 발명자에 의해 명백하게 기술되었으므로 본 명세서에 나타낸 방법을 변형할 수도 있으며, 본 발명은 다음에 기재하는 실시예만으로 한정되어 있는 것은 아니다.
실시예 1
아르파메닌 생산균으로서 크로모박테륨, 비오라세움(일본국 미공연균기 제6521호)의 사면배양으로 1백금이량을 취하여 미리 120℃, 20분간의 조건으로 멸균한 500ml 용량의 로터리플라스크에 110ml씩 나누어 주입한 가용성 전분 3%, 프로리치 0.5%, 콘글루텐 밀 1.2%, 탄산칼슘 0.2%로 된 조성을 가진 배지에 접종하였다. 27℃에서 매분 180회전의 배양조건을 사용하여 경시적(經時的)으로 아르파메닌 생산량을 검토한다음 배양 32시간에 아르파메닌 생산량은 피크에 달하였다. 배양 36시간부터 항아민펩티다제 활성 측정으로 평가한 아르파메닌 농도는 서서히 감소하였다. 배양중 배지의 pH변화는 최초시간 7.4, 8시간 7.8, 16시간 7.6, 24시간 7.85, 32시간 8.1, 36시간 8.1, 52시간 8.45이었다.
실시예 2
실시예 1과 동일한 배치와 배양조건에서 크로모박테륨, 비오라세움 BMG 361-CF-4주를 배양하여 얻어진 배양액 9.5
Figure kpo00016
를 염산으로 pH 2로하고 여과조제(하이프로수퍼셀 ; hyflo super cell)를 사용하여 흡인 여과하고 9
Figure kpo00017
의 배양여액을 얻었다. 이 여액의 아미노펩티다제 B저해성(IC50)은 0.05μl/ml이었다.
실시예 3
실시예 2에서 얻어진 배양여액 9
Figure kpo00018
를 NaOH를 사용하여 pH 5로 조정한 다음 엠버라이트 XAD-4, 1
Figure kpo00019
의 컬럼에 흡착시켜 수세한 다음 50% 아세톤수로 용출하고 활성구분 2.3
Figure kpo00020
를 감압하에서 농축 건조하여 19.6g의 거친분말을 얻었다. 이 거친분말의 아미노펩티다제 B저해활성(IC50)은 0.2μg/ml이었다. 다음에 이 거친 분말을 적당량의 0.05M 식염수에 용해하고 500ml의 CM-세파딕스 C-25에 흡착시켜 0.05M 식염수1.5
Figure kpo00021
및 0.05M 구연산 완충액(pH 4.5) 1
Figure kpo00022
로 세척한 다음 그 완충액 2.5
Figure kpo00023
/와 0.55M 식염을 함유한 완충액 2.5
Figure kpo00024
의 그라디엔트(gradient) 용출을 하였다. 이 조작에 의해 용출액을 18ml씩 프랙숀으로 모아 아르파메닌 A는 프랙숀 39에서 59번에, 아르파메닌 B는 프랙숀 60에서 89번에 용출되었다. 각각의 프랙숀은 엠버라이트 XAD-4에 의해 탈염후 응결 건조하여 아르파메닌 A프렉숀에서 188mg(아미노펩티다제 B저해활성 IC50=0.0065μl/ml)의 아르파메닌 A 거친분말을, 또 아르파메닌 B프랙숀에서 79mg(아미노펩티다제 저해활성 IC50=0.0023μg/ml)의 아르파메닌 B 거친분말을 얻었다.
실시예 4
실시예 3에서 얻어진 아르파메닌 A 거친분말 188mg을 적당량의 0.05M 식염수에 용해하고, 1N 염산을 사용하여 pH 2.3으로 조정하고 80ml의 CM-세파딕스 C-25의 컬럼에 흡착시켜 0.07M 식염수 100ml로 세척한 다음 0.07M 식염수 300ml 및 0.5M 식염수 300ml의 그라디엔트용출을 하였다. 이 정제조작에 의해 용출액을 8ml씩 프랙숀으로 모아 아르파메닌 A는 프랙숀 11에서 34번에 용출되었다. 이 용출된 프랙숀 11에서 30번을 농측한다음 1N 염산을 사용하여 pH를 2.3으로 조정하여 500ml의 세파딕스 LH-20의 컬럼에서 물로 용출시켜 탈염하였다. 팔염된 아르파메닌 A 용액을 다우엑스 WGR를 사용하여 pH 5로 조정한 다음 동결 건조시켜 아르파메닌 A의 백색분말 94mg(아미노 펩티다제 B저해활성(IC50=0.0054g/ml)를 얻었다.
실시예 5
실시예 3에서 얻어진 아르파메닌 B프랙숀 79mg을 적당량의 0.05M 식염수에 용해하여 1N 염산을 사용하여 pH 2.3으로 조정하고 100ml의 CM-세파딕스 C-25의 컬럼에 흡착시켜 0.15M 식염수 100ml로 세척한 다음 0.15M 식염수 350ml 및 0.6M 식염수 350ml의 그라디엔트 용출을 하였다.
이 정제조작에 의해 용출액 11ml씩 프랙숀으로 모아 아르파메닌 B는 프렉숀 17에서 30번에 용출되었다. 이 프랙숀을 농축시킨 후 500ml의 세파딕스 LH-20 컬럼에서 0.01N 염산으로 용출하여 탈염시킨다. 아르파메닌 B의 탈염 프랙숀을 다우엑스 WGR을 사용하여 pH 5로 조정한 다음 동결 건조함으로써 아르파메닌 B의 백색분말 32ml(아미노 펩티다제 B저해활성 IC50=0.0020μg/ml를 얻었다.
실시예 6
500ml 용량의 플라스크에 글리세린 1.5%, 가용성 전분 1.5%, 프로리치 0.5%, 어분 1.5%, 탄산칼슘 0.2% 및 소포제(KM-72) 0.05%로 된 배지 80ml를 주입하고 120℃, 15분간 멸균하여 냉각후 크로모박테륨 비오라세움 BMG 361-CF 4주(일본국 미공연기제6521호)를 사면배지에 배양한 것을 1백금이량 접종하였다. 28℃에서 24시간 매분 135왕복 진탕배양을 하고 이것을 1차 종모로 하였다. 다음에 100
Figure kpo00025
용량의 탱크에 글리세린 1.5%, 가용성전분 1.5%, 프로리치 0.5%, 가다랭이엑스(bonito extract) 1.74%, 탄산칼슘 0.2% 및 소포제(KM-72) 0.05%로된 배지 50
Figure kpo00026
를 넣어 120℃, 30분 멸균하고 냉각한후 1차 종료 80ml를 접종하였다. 매분 50
Figure kpo00027
의 멸균 공기를 넣으면서 매분 200회전 교반으로 28℃, 24시간 배양하여 이것을 2차 종묘로 하였다. 그다음 570
Figure kpo00028
용량의 탱크에 가용성 전분 3.0%, 프로리치 0.5%, 글루텐밀 1.2%, 탄산칼균 0.2% 및 소포제(KM-72) 0.05%로 된 배지 300
Figure kpo00029
를 넣고 120℃, 30분간 멸균하여 냉각한 다음, 2차종모를 6
Figure kpo00030
가하였다. 통기량을 매분 300
Figure kpo00031
, 교반은 매분 190회전으로 하여 28℃, 24시간 배양하였다. 배양액을 황산으로 사용하여 pH 2로하고 여과조제(하이프로스파셀)를 사용하여 흡인 여과하였다. 여액을 NaOH를 사용하여 pH 6으로 조정한 후 다시 흡인 여과하여 여액 185
Figure kpo00032
를 얻었다. 이 여액의 아미노펩티다제 B저해활성은 IC50=0.17μg/ml이었다. 위 여액 185
Figure kpo00033
에 크로마토용 카본 10
Figure kpo00034
를 가하여 2시간 교반하였다. 다음에 200메쉬체로 카본을 분리하였다. 카본을 50
Figure kpo00035
의 물론 세척한 다음 염산으로 pH 2로 조정한 50% 아세톤수 80
Figure kpo00036
중에 넣어 2시간 교반하고 추출하였다. 이것을 바스켓형 원심분리기에 의해 카본을 제거하고 추축액을 농축하여 3.54
Figure kpo00037
의 농축액을 얻었다. 이 농축액의 아미노펩티다제 B저해활성은 IC50=0.0063μg/ml이었다.
실시예 7
실시예 6에서 얻어진 농축액 3.54
Figure kpo00038
를 2N NaOH를 중화하였다. 이때 액량은 5.35로 되었다. 이것을 엠버라이트 XAD-4 1.7
Figure kpo00039
의 컬럼에 흡착시켜 수세한 다음 50% 아세톤수 12
Figure kpo00040
로 추출하고 활성 프랙숀분 7
Figure kpo00041
를 감압하에서 농축하여 280ml의 농축액을 얻었다. 이 농축액의 아미노 펩티다제 B저해활성은 IC50=0.01μg/ml이었다. 다음에 이 여액을 1.7
Figure kpo00042
의 CM-세파딕스 컬럼에 흡착하고 0.05M 식염수 6
Figure kpo00043
및 2.05M구연산완충액(PH 4.5) 2
Figure kpo00044
로 세척시킨 다음 동 완충액 6
Figure kpo00045
와 0.6M 식염을 함유한 완충액 6
Figure kpo00046
의 그라디엔트 용출을 하였다. 이 조작에 의해 용출액을 200ml씩 프렉숀으로 모아 아르파메닌 A는 프랙숀 30에서 39번에, 아르파메닌 B는 프렉숀 42에서 52번에 용출하였다. 각각의 프랙숀은 농축후 엠버라이트 XAD-4에 의해 탈염하여 아르파메닌 A 프랙숀의 85ml(IC50=0.00058μg/ml), 아르파메닌 B 프랙숀의 43ml(IC50=0.0003μg/ml)를 얻었다.
실시예 8
실시예 7에서 얻어진 아르파메닌 A 프렉숀의 85ml를 바이오겔 P-2(바이오래드사 제품) 240ml의 컬럼에 흡착시켜 2.5
Figure kpo00047
의 물 및 20% 메타놀수 1
Figure kpo00048
로 컬럼을 수세한 후 0.001M 식염수로 용출하였다. 용출액을 18ml씩 프랙숀으로 모아 프랙숀 7에서 81번에 아르파메닌 A가 확인되었다. 이 프랙숀을 농축하여 엠버라이트 XAD-4로 탈염한 다음 동결 건조하였다. 이것에 의해 아르파메닌 B의 담황색 분말 1.48g을 얻었다. 이 분말의 아미노 펩티다제 B저해활성은 IC50=0.030μg/ml이었다.
실시예 9
실시예 7에서 얻어진 아르파메닌 B 프랙숀 43ml를, 바이오겔 P-2(바이오래드사 제품) 240ml의 컬럼에 흡착시켜 2
Figure kpo00049
의 물 및 20% 메타톨수 1
Figure kpo00050
로 컬럼을 세척한 다음 0.005M 식염수로 용출하였다. 용출액을 18ml씩 프팩숀으로 모아 프랙숀 6에서 25번에 아르파메닌 B가 확인되었다. 이 프랙숀을 농축한 다음 엠버라이트 XAD-2로 탈염한 후 동결 건조하였다. 이것에 의해 아르파메닌 B의 담황색의 분말 1.89g을 얻었다. 이 분말의 아미노펩티다제 B저해활성은 IC50=0.19μg/ml이었다.

Claims (3)

  1. 크로모박테륨(Chromobacterium)속의 아르파메닌 생산균주(KAIST 830530-09915)를 탄소 및 질소원함유 배양액중에서 충분한 시간동안 배양시켜 아르파메닌(Arphamenine)을 그 배양액중에서 생산, 축적시킴을 특징으로 하는 새로운 생리활성 물질 아르파메닌의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양액에서 아르파메닌을 회수시키는 공정을 더 구성시킴을 특징으로 하는 새로운 생리활성 물질 아르파메닌의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 KAIST 83530-099153으로 기탁된 크로모박테륨 비오라세움 BMG 361-CF4의 아르파메닌 생산균주를 배양한 다음 얻어진 배양액에서 아르파메닌 A와 아르파메닌 B의 혼합액을 회수시키며, 그 회수한 아르파메닌 A와 아르파메닌 B의 혼합뭍을 CM-세파덱스 컬럼상에서 컬럼크로마로그라피로 처리시키며, 그 CM-세파덱스컬럼을 식염수로 용출시키고, 아르파메닌 A를 함유한 활성 프랙숀(active fraction)과 아르파메닌 B를 함유한 활성프랙숀을 얻도록한 분리프랙숀(separate fraction)의 용출액을 채취(collection)하며, 각각의 활성프랙숀에서 아르파메닌 A와 아르파메닌 B를 별도로 최종 회수시키는 공정으로 구성함을 특징으로 하는 새로운 생리활성 물질 아르파메닌의 제조방법.
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