CN112430633B - 一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺，在发酵罐培养过程中，通过流加硫酸铵水溶液或/和葡萄糖水溶液补料生产精氨酸，培养至55h结束。本发明工艺操作简单，可控程度高，降低劳动强度的同时，使精氨酸发酵产酸效率得到显著提高。

Description

一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺。
背景技术
精氨酸又称蛋白氨基酸，分子式为C6H14N4O2，分子量为174.20，呈白色菱形结晶或单斜片状结晶，无臭，味苦，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。
精氨酸是人体和动物体中的"半必需"氨基酸，即在人和动物体内合成能力较低，需部分从食物中补充，是维持婴儿生长发育必不可少的氨基酸。精氨酸是配制氨基酸输液、复合氨基酸制剂、头发生长促进剂等的主要成份。精氨酸对血氨升高引起的肝昏迷，对肠道溃疡，血栓形成，神经衰弱和男性无精病等都有治疗效果，在医药工业上具有广泛的用途。
精氨酸的生产方法主要包括：水解法、酶法、化学合成法和微生物发酵法。我国精氨酸生产能力有限，早期主要是采用水解法，但由于水解法产品品质稳定性较差，回收率低，不适合用于大规模生产，逐渐被市场淘汰。微生物发酵法以廉价的碳源和氮源为底物，通过微生物菌体代谢，借助自身产精氨酸的能力，通过葡萄糖发酵直接合成精氨酸。发酵法原料来源成本相对较低，发酵反应条件较温和，生产工艺相对稳定，可控程度高，容易大规模放大生产，因而成为目前生产精氨酸的主要方法。
但是，我国目前发酵法生产精氨酸技术条件不成熟，产酸能力及转化率不高，从而导致发酵法生产精氨酸成本较高，因此，迫切需要新的技术突破和生产工艺，在提高精氨酸的产酸能力及转化率的同时降低生产成本。
发明内容
为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺。
本发明方案是通过下述技术方案实现的：
一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺，其包括如下步骤：
1）在发酵培养至2h时，于发酵罐中以40-100ml/h的流速补料流加硫酸铵水溶液；
2）在发酵培养至4h时，于发酵罐中以0.1-0.3L/h的流速补料流加葡萄糖水溶液，直至发酵结束。
进一步地，
所述工艺包括如下步骤：
1）在发酵培养至2h时，于发酵罐中以80ml/h的流速补料流加硫酸铵水溶液；
2）在发酵培养至4h时，于发酵罐中以0.2L/h的流速补料流加葡萄糖水溶液，直至发酵结束。
优选地，
所述硫酸铵水溶液的配制方法为：将350g硫酸铵与200g谷氨酸钠依次添加到水中，溶解后定容为1L。
优选地，
所述葡萄糖水溶液的配制方法为：将900g结晶糖与3g甜菜碱依次添加到水中，溶解后定容为1L。
优选地，
所述发酵使用的发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，甘油2-6g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素0.004g/L。
所述工艺进一步包括：将大肠杆菌CGMCC No.11674的种子液以8-12%接种量接种于装有50L发酵培养基的规格为100L发酵罐中培养，转速为280-320rpm，温度为33-36℃，pH为7.1-7.3，罐压0.03-0.04mpa，溶氧控制在18%以上，发酵时间为50-60h。
更优选地，所述发酵使用的发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，甘油5-6g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素0.004g/L。
优选地，所述发酵时间为55h。
最优选地，所述发酵使用的发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，甘油5g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素0.004g/L。
本发明技术方案具有以下突出优点及独特性：
本发明根据菌株的理化性质选择不同的辅用碳源，发现，甘油能够刺激大肠杆菌CGMCC No.11674高产精氨酸，最大可提高20%以上，而额外添加蔗糖对大肠杆菌CGMCCNo.11674产精氨酸没有明显影响；可能是甘油的作用并不仅仅是提高碳源的量，而是促进了合成精氨酸的代谢流。
本发明通过流加糖和硫酸铵水溶液方式，达到精准控制发酵过程中残糖值和氨氮值；葡萄糖摄入量对精氨酸发酵具有重要意义，糖浓度过高，不但会使其产量下降，反而增加了生产成本；糖浓度过低，则会抑制菌株生产能力，使其不能发挥最大作用。硫酸铵作为精氨酸发酵的一种氮源，为菌体的核酸和蛋白质提供重要的氮源，适宜的氮源对微生物的生产和产物积累产生重要作用。本发明采用流加硫酸铵水溶液，使其发酵过程中降低代谢副产物积累，从而进一步提高精氨酸的产率，同时降低生产成本。本发明开拓性地将甜菜碱和谷氨酸钠添加到葡萄糖水溶液和硫酸铵水溶液中，适量流加甜菜碱和谷氨酸钠能够提高精氨酸的合成效率，刺激效果持续，添加量较小，降低了成本。
本发明工艺可控制程度高，投入成本小，且精准控制发酵过程，避免造成发酵失控和成本增加，同时降低了劳动强度，整个生产过程简单易操作，十分适用于工业化大生产。
附图说明
图1：发酵培养基组分对精氨酸产量的影响；
图2：葡萄糖水溶液中甜菜碱添加量对精氨酸产量的影响；
图3：硫酸铵水溶液中谷氨酸钠添加量对精氨酸产量的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好的理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本技术方案进行完整的描述。
本发明使用的菌株为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)XJFF-151106S，保藏号为CGMCC No.11674，该菌株由申请人筛选驯化获得，于2015年11月17日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株的主要理 化性质为：能够利用葡萄糖、蔗糖、山梨醇、阿拉伯糖、甘油作为碳源，不能利用肌醇和柠 檬酸；半乳糖苷酶、脲酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶阳性；不产明胶酶、色氨酸脱羧酶 以及精氨酸双水解酶。
实施例1
一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺，包括：
步骤1）将活化后的精氨酸生产菌种大肠杆菌CGMCC No.11674菌液（1×108cfu/ml）接入种子罐中进行种子培养24h得到种子液，培养温度为38℃，pH为6.8，风量为200L/h，转速为350rpm，罐压为0.04mpa。
步骤2）将种子液以12%接种量接种于装有50L发酵培养基的规格为100L发酵罐中培养，转速为280rpm，温度为34℃，pH为7.1（pH值通过氨水调整控制），罐压0.03mpa，溶氧通过交替提高转速和风量控制在18%以上，发酵周期为55h。
发酵过程中流加培养液的流程为：
1）在发酵培养至2h时，于发酵罐中以80ml/h的流速补料流加硫酸铵水溶液；
2）在发酵培养至4h时，于发酵罐中以0.2L/h的流速补料流加葡萄糖水溶液，直至发酵结束。
所述硫酸铵水溶液的配制方法为：将350g硫酸铵与200g谷氨酸钠依次添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min。
葡萄糖水溶液的配制方法为：将900g结晶糖与3g甜菜碱依次添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min。
所述种子培养基组分为：葡萄糖28g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨6g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸镁2g/L，硫酸亚铁0.04g/L，硫酸锰0.04g/L，氯霉素14mg/L，生物素0.003g/L。
所述发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，甘油5g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素0.004g/L。
实施例2
一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺，包括：
步骤1）将活化后的精氨酸生产菌种大肠杆菌CGMCC No.11674菌液（1×108cfu/ml）接入种子罐中进行种子培养24h得到种子液，培养温度为38℃，pH为6.9，风量为200L/h，转速为300rpm，罐压为0.05mpa。
步骤2）将种子液以12%接种量接种于装有50L发酵培养基的规格为100L发酵罐中培养，转速为300rpm，温度为34℃，pH为7.2（pH值通过氨水调整控制），罐压0.04mpa，溶氧通过交替提高转速和风量控制在18%以上，发酵周期为55h。
发酵过程中流加培养液的流程为：
1）在发酵培养至2h时，于发酵罐中以80ml/h的流速补料流加硫酸铵水溶液；
2）在发酵培养至4h时，于发酵罐中以0.2L/h的流速补料流加葡萄糖水溶液，直至发酵结束。
所述硫酸铵水溶液的配制方法为：将350g硫酸铵与200g谷氨酸钠依次添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min。
葡萄糖水溶液的配制方法为：将900g结晶糖与3g甜菜碱依次添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min。
所述种子培养基组分为：葡萄糖28g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨6g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸镁2g/L，硫酸亚铁0.04g/L，硫酸锰0.04g/L，氯霉素14mg/L，生物素0.003g/L。
所述发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，甘油6g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素0.004g/L。
对比例1
一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺，包括：
步骤1）将活化后的精氨酸生产菌种大肠杆菌CGMCC No.11674菌液（1×108cfu/ml）接入种子罐中进行种子培养24h得到种子液，培养温度为38℃，pH为6.8，风量为200L/h，转速为350rpm，罐压为0.04mpa。
步骤2）将种子液以12%接种量接种于装有50L发酵培养基的规格为100L发酵罐中培养，转速为280rpm，温度为34℃，pH为7.1（pH值通过氨水调整控制），罐压0.03mpa，溶氧通过交替提高转速和风量控制在18%以上，发酵周期为55h。
发酵过程中流加培养液的流程为：
1）在发酵培养至2h时，于发酵罐中以80ml/h的流速补料流加硫酸铵水溶液；
2）在发酵培养至4h时，于发酵罐中以0.2L/h的流速补料流加葡萄糖水溶液，直至发酵结束。
所述硫酸铵水溶液的配制方法为：将350g硫酸铵添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min。
葡萄糖水溶液的配制方法为：将900g结晶糖添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min。
所述种子培养基组分为：葡萄糖28g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨6g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸镁2g/L，硫酸亚铁0.04g/L，硫酸锰0.04g/L，氯霉素14mg/L，生物素0.003g/L。
所述发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素0.004g/L。
实施例3
发酵培养基组分对精氨酸产量的影响。
一、在对比文件1的基础上，额外添加不同碳源，包括蔗糖、甘油，添加浓度分别为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，单位为g/L，如图1所示，蔗糖添加对精氨酸产量没有明显影响，而甘油能够提高精氨酸产量，随着甘油浓度的增加，精氨酸的含量随之提高，但随着浓度增加到5g/L时接近峰值，继续增加时，精氨酸的产量没有明显变化。综合考虑产量和成本等因素，当甘油浓度为5g/L时，为最佳添加量。
二、验证葡萄糖水溶液添加量和组分对精氨酸产酸的影响。
通过实验验证葡萄糖水溶液添加量对发酵产酸的影响。分别以不同的流速添加葡萄糖水溶液，随着流加量的增大，精氨酸的含量随之提高，但随着流速继续增加时，精氨酸的产量逐渐开始下降。过高的糖浓度将会抑制菌株的最佳产酸能力，因而当流速为0.2L/h时，为最佳流加糖速率。在该流速的基础上，确定葡萄糖水溶液中甜菜碱添加量对精氨酸的影响，如图2所示，随着甜菜碱的增加，精氨酸的含量随之提高，但随着浓度增加到3g/L时接近峰值，继续增加时，精氨酸的产量没有明显变化。因而选择甜菜碱浓度为3g/L时，为最佳添加量。
三、硫酸铵水溶液添加量和组分对精氨酸产酸的影响。
通过实验验证硫酸铵水溶液添加量对发酵产酸的影响。设置不同梯度的硫酸铵水溶液添加量，当流速为80ml/h时，精氨酸产酸达到最大，氮源的增加促进了菌体生长和产物积累。当硫酸铵流速大于80ml/h时，继续增加流速，精氨酸的产量不在增加，说明80ml/h的流速已满足精氨酸产酸需求。
在该流速的基础上，确定硫酸铵水溶液中谷氨酸钠添加量对精氨酸的影响（甜菜碱浓度设为3g/L），如图3所示，随着谷氨酸钠的增加，精氨酸的含量随之提高，但随着浓度增加到200g/L时达到峰值，继续增加时，精氨酸的产量并没有显著变化。因而选择谷氨酸钠浓度为200g/L时，为最佳添加量。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限值，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。

Claims (5)

1.一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺，所述工艺包括如下步骤：将大肠埃希氏菌CGMCC No.11674的种子液以8-12%接种量接种于装有50L发酵培养基的发酵罐中发酵培养，转速为280-320rpm，温度为33-36℃，pH为7.1-7.3，罐压0.03-0.04Mpa，溶氧控制在18%以上，发酵培养时间为50-60h；
其特征在于：
1）在发酵培养至2h时，于发酵罐中以40-100ml/h的流速补料流加硫酸铵水溶液；
2）在发酵培养至4h时，于发酵罐中以0.1-0.3L/h的流速补料流加葡萄糖水溶液，直至发酵结束；
所述葡萄糖水溶液的配制方法为：将900g结晶糖与3g甜菜碱依次添加到水中，溶解后定容为1L
所述硫酸铵水溶液的配制方法为：将350g硫酸铵与200g谷氨酸钠依次添加到水中，溶解后定容为1L；
所述发酵使用的发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，甘油2-6g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素0.004g/L。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，
1）在发酵培养至2h时，于发酵罐中以80ml/h的流速补料流加硫酸铵水溶液；
2）在发酵培养至4h时，于发酵罐中以0.2L/h的流速补料流加葡萄糖水溶液，直至发酵结束。
3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，甘油5-6g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素4mg/L。
4.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，甘油5g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素4mg/L。
5.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述发酵时间为55h。
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