JPS58212791A - 新生理活性物質アルフアメニン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアミノペプチダーゼＢに対して酵素阻害活性を
示す新規生現活性物質アルファメニン（Ａｒｐｈａｍ＠
ｎ１ｎｅ　）　Ａ又はＢに関し、またその製造法ならび
Ｋそれを有効成分として含有する薬剤、特に免疫増強剤
に関するものである。

本発明者らは北海道の土壌よシ分離したノ童クチリアで
あってＢＭＧｊ６１−ＣＦ４株と名付けた菌を培養し、
得ら扛る培養物中にアンノペプテダーゼＢ阻害活性を肩
する物質が存在することを見出した。その酵素阻害物質
の採取方法について検討し、その物質の単離に成功し、
また本物質が新規物質であることを確認して本発明を完
成した。

本阻害物質は新規な物質であシ、アルファメニン（Ａｒ
ｐｈａｍ＠ｎｌｎ・）と命名されたが、このアル７、　
アメニンは後記のごとく２種類の物質、即ち、アルファ
メニンＡとＢから構成されておシそれらの物性値と構造
式はそれぞれ後記の通りである。

本明細書において、本物質又はアルファメニンとは、ア
ルファメニンＡ又はＢ又はこれらの両者ついて検討して
本物質が細胞性免疫に対して増強作用を有すること及び
さらに制癌作用をも有することを見出した。　　　　　
′ 本物質は、アルギニン−β−ナフチルアミドのア電ノペ
プチ〆−ゼＢによる分解を阻止する効力について調べた
結果、後述の試験例に示さ扛るごとく、抗アミノペプチ
ダーゼＢ活性を有することが確認された。

従って、第１の本発明の要旨とブるところは次の一般式
： Ｃ式中、ＲはアルファメニンＡの場合にＬ水素を示し、
アルファメニンＢの場合には水酸基を示す〕で表わされ
る抗アミノペ！チダーゼＢ活性を有する新生理活性物質
アルファメニンＡ及びＢ又はその塩にある。

本発明のアルファメニンＡならびにＢは夫々に次の構造
を有する。

）Ｉ２Ｎ　　　　　ＮＨ アルファメニンＡ アルファメニンＡ及びＢは、後記の実施例に示すごとく
、アルファメニン生産菌の培養Ｆ液をＣＭ−セファデッ
クス　クロマトグラフィー等で分画することにより、い
ずｎも無色の粉末として取得できる。その物性は次の通
りである。

即ち、アルファメニンＡは融点１１７〜１１９６Ｃ１質
量分析法で得ら扛る分子：５１３２０である。

元素分析値はＣ５３，４５憾、）１７．１１憾、　　Ｎ
　１４．’？１チ、　　０１４．２０％、　　Ｃ／　Ｉ
ｏ、４’？％であり、ＣＩ　６Ｈ２４Ｎ４０３・ＨＣ／
の分子式を得る。アルファメニンＡの１００γ／−を含
む水溶液におけるアルファメニンＡの紫外部吸収スペク
トルは添付図面の第１図に示す通りであυ、λｍａｘ　
２５７　ｎｒｎ　（ε１８０）Ｋ吸収を示ｊ６アルフア
メニンＡの赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム錠）は
記２図に示す通りであり、３３７０、３＋７０．２９５
０．　＋７３０．１６７０．１５６０．１４６０゜１４
１０、１３２０．１１９０．１１１０．７６０．７１０
ｃｒｎＫ特異吸収帯を示す。アルファメニンＡの核磁気
共鳴吸収スペクトル（Ｈ−ＮＭＲ）　（重水溶液δｐｐ
ｍ　＊１００　ＭＩＸｘ　）は第３図に示す通ルであり
、２．０４〜２．３３　（ＣＨ２）　、　２．３５〜２
．７２　（ＣＩ（２）　、　３．３４〜３．６９　　（
ＣＨ２ｘ　２　　）、３−６９〜３．８４　　（ＣＨ，
ＣＨ２）＋４．８３　（ＣＨ）　、　　７．８２〜８．
００　（Ｃ６Ｈ５）　　に吸収を示す。

アルファメニンＢは融点１１８〜＋２０’ｃ・質量分析
法で得ら扛る分子量３３６である。元素分析値はＣ４９
，３０％、Ｈ６，８８％、　　Ｎ　１３．７７％、０２
０．８２％、Ｃ／Ｌ７３％　であり、Ｃｌ４Ｈ２４Ｎ４
０４・ＨＣ／・Ｈ２０の分子式を得る。

アルファメニンＢのＢｏｏｒ／ｄを含む水溶液中のアル
ファメニンＢの紫外部吸収スペクトルは添付図面の第４
図に示す通りであり、λｍａｘ　　２７５ｎｍ　（ｇ　
１０４０　）及びλｒｎａｘ　２２２　ｎｍ　（ｇ　５
５００　）　に吸収を示す。アルファメニンＢの赤外部
吸収スペクトル（臭化カリウム錠）は第５図に示す通り
であり、３３７６、３１ｇｏ、　２９６０．１７３０．
１６７０．　　＋５６０゜１５２０、１４６０．　＋４
２０．１３３０．１２５０．１＋６０．１１１０゜８４
０σ　に特異吸収帯を有する。アルファメニンＢの核磁
気共鳴吸収スペクトル（重水溶液、δｐｐｍ、　１００
　ＭＨｚ　）　　は第６図に示す通シであル、１．８７
〜２．３０　（ＣＨ２）、　２．３０〜２．６２　（Ｃ
Ｈ２）　。

３＝１４〜３−５４　　（ＣＨ２ｘ　　２　　）、３．
５４〜３．７８　　（ＣＨ。

ＣＨ２）、　４・７５　（ＣＨ）、　７．３０〜７．６
７　（Ｃ６Ｈ４）に吸収を示す。

また、第２の本発明の要旨は、クロモバクテリウム属に
属するアルファメニン生産菌を培養して本物質を培養物
中に生産、蓄積させ、さらにそｎより本物質を採取する
ことを特徴とする新規生理活性物質アルファメニンＡ又
は／及びＢの製造法にある。

本発明の方法において、アルファメニン生産菌とはアル
ファメニンＡ又はＢ又はこれら両者を生産する菌を意味
する。本発明のアルファメニンの生産に使用される生産
菌の一例には、本発明者らによって北海道、支勿湖ボロ
ピナイで採取した土壌より分離された細菌クロモバクテ
リウム・ビオラセウムＢ　Ｍ　Ｇ　３６　ｌ　−ＣＦ　
４　（Ｃｈｒｏｍｏｂａ＊ｔ＠ｒ−１ｔ＋ｍ　ｖｉｏｌ
ａｓ・ａｍ　）株がある。本菌株は工業技術院微生物工
業技術研究所に昭和５７年５月４日保管委託し、機工研
菌蚕第６５２１号（ＦＥＢＭ　Ｐ−６５２１）の受託番
号が付されて保管さｎている。

以下にこの菌株の菌学的性状について記述する。

ＢＭＧ　３６＝ｌ−ＣＦ４株の菌学的性状（ａｔ形態 （１）　　本菌株の細胞は桿状で、大きさがＯ０ｇ〜１
・０×２・０〜４・０ミクロン位である。

（２）　　細胞の多形性は特にみとめられない。

（３）運動性を有し、極鞭毛及び側鞭毛を認める。

（４）　　胞子社認められない。

（５）ダラム染色祉陰性である。

（６）抗酸性を有しない。

（ｂ）　　各培地における生育状］！１（２７°Ｃ培養
、肉汁ゼラチン穿刺培養のみ２０°Ｃ及び３０’Ｃ培養
）（１）　　肉汁寒天平板培養 生育コロニーは、半球形状にやや隆起し、辺縁は平滑、
円形であり、また、その表面は清らかで光沢を有する。

培養後１７時時間上半透明のコロニーであるが、次第に
不透明にな９、ゴム状を呈するようになる。培養後２日
目頃からコロニーは紫色になるが、拡散性色素は認めら
ｎない。

（２）　　肉汁寒天斜面培養 接種線にそって一様に生育し、表面は清らかで光沢が有
り１辺縁は平滑である。培養後２日目頃よシ、寒天斜面
の底部から紫色を呈するようになるが、溶解性色票Ｆｉ
認められない。

（３）　　肉汁液体培養 培養後２日目頃から、培地表面に紫色のリング状の発育
をする。培養後４０時時間上り、試験管底部の菌体の増
加が認められ、その菌体＃−ｉ３日目頃から紫色を呈す
るようになる。

（４）　　肉汁ゼラチン穿刺培養 ３０ｃＣ培養では、穿刺線にそって菌の生育が認められ
、培養後３日目頃から液化が始まり、その型り管状であ
る。２０°Ｃ培養の場合、培養後６日目で液化が紹めら
れた。

（５）ＢＣＰξルク培養 培養後３日目からＢＣＰが青変し、凝固が認められた。

次いで５日目には凝固が完了し、直、・ちにペグトン化
が始まり、約２週間で完了した。

（ｃ）　　生理学的性質（％に記さない限り、培養温度
はすべて２７°Ｃ） （１）　　硝酸塩の還元：硝酸塩から亜硝酸塩を生成す
る。

（２）　　脱窒反応（駒形らの方法：長谷用武治編著；
微生物の分類と同定、２２３頁・東京大学出版会、　　
１９７５年）：陽性、ガスの発生はみとめられない。

（３）ＭＲテスト：陽性 （４）ＶＰテスト：＠性 （５）　　インドールの生成：陰性 （６）硫化水素の生成（Ｔ８　］寒天培地１栄研）：陰
性 （７）　　デンプンの加水分解：陰性 （８）　　クエン酸の利用：Ｋｏｓ＠ｒの培地＋　　Ｃ
ｈｒｌｍ−１＠ｎｓ＠ｎ　　の培地ともに生育する。

（９）無機窒素源（硝酸ジ−トリウム。硫酸アンモニウ
ム伊　グルタミン酸ソーダ）の利用：いずれの無機窒素
源も利用し、生育が認められた。

（１０）色素の生成（キングＡ及びＢ培地；栄研）二両
培地共に、はんのわずかな黄色の溶解性色素を認めた。

（１１）　　ウレアーゼ（尿素培地；栄研）：陰性（＋
２）　　オキシダーゼ：陽性 に３）　　カタラーゼ：陽性 （１４）　　生育温度、ｐｉ（の範囲：生育温度範囲は
１２〜３７°Ｃ１最適温度は２７〜３０’Ｃ付近である
。生育ｐ）Ｉｇ興は、５．０〜８．６．最適−は６・Ｏ
〜７・８である。

（＋５）　　＃素に対する態度：好気性（通性嫌気性〕 （＋６）　　０−Ｆテスト（ｌ（ｕｇｈ　Ｌ＠ｉｆｍｏ
ｎ　法による）：発酵型である （１７）糖類からの酸及びガスの生成（ＨｕｇｈＬ・１
ｆｓｏｎの培地を使用）：Ｄ−グルコース。

Ｄ−７ラクトース、トレハロースから酸の生成が認めら
れた。但し、下記の１９種類の糖からは酸の生成が認め
られなかった。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、
Ｄ−ガラクトース、麦芽糖。

シヨ糖、乳糖、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、イノ
ジット、グリセリン、デンプン、アドニトール、セロビ
オース、ズルシット、イヌリン、メリピオース、メレ・
ゾトース、ラフィノース。

さらに、ガスの生成れ、いずれの糖からも認められなか
った。

（１８）　　カゼインの加水分解： カゼイン寒天平板（肉汁寒天に別に滅菌した脱脂牛乳を
５チ濃度に加え、同化した。

Ｐ）（７，４）に画線培養し、培養後２４時間でカゼイ
ンの消化が認められ、８日目には加水分解が完了した。

（＋９）紫色色素の可視部吸収測定： 肉汁寒天斜面培地に生育した紫色の菌体を、エタノール
で抽出し、可視部吸収測定をおこなった結果、最大吸収
５７３　ｎｍ、最小吸収４３０　ｎｍ　を示した。又、
１〇−硫酸工名ノール中で社最大吸収６９３　ｎｍ　の
緑色溶液となった。これは、この紫色色素がビオラセイ
ン（マ１・１ａ＠＠ｉｎ　）色素であることを示してい
る（　Ｂ＠ｒｇ＠ｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤ＠ｔ＠
ｒｍｌｎａｔｌｖ＊　Ｂａｅｔ＠ｒ１ｏ１ｏｇｙ、　８
　ｔｈ　＠ｄｌ−１１・ｎ、　ｐ−３５４参照）。

以上の性状を要約すると、ＢＭＧ　３６１−ＣＦ４株は
ダラム陰性の通性嫌気性桿菌で極鞭毛及び側鞭毛を有す
る。又、コロニーは紫色で、この色素は、可視部吸収測
定よりピオラセインであることが証明された。これらの
性状をＢ＠ｒｇ＠ｙ’ｍ　ＭａｎｔＩ−ａｌ　ｏｆ　Ｄ
＠ｔ＠ｒｍｌｎａｔｉｖｖ　Ｂｍｅｔ＠ｒｉｏｌｏｇｙ
　ｇ　ｔｈ　＠ｄｌｔ−畳ｏｔｓで検索すると、１ＭＧ
３６１−ＣＦ’４株は、クロモノ奇クテリウム（Ｃｈｒ
ｅｍｏｂｍｅｔ＠ｒｌｔ＋ｍ　）属に属すると考えられ
る。クロモバクテリウム属には、クロモ／者りテリウム
・ピオラセウム及びクロモバクテリウム・リピ〆ムの２
種があるが、１ＭＧ３６１−ＣＦ４株は両者に極めて近
い性質を示す。

す表わち１ＭＧ３６１−ＣＦ４株は、３７°Ｃで生育す
ること、糖からの酸生成パターンでトレハ四−スから酸
を生成し、アラビノース、キシロースからは酸をつくら
ない点、またカゼインの加水分解が認めらｎること等か
ら、クロモバクテリウム・リビダムと明らかに区別さｎ
た。よってＩＩＭＧ３６１〜ＣＦ４株をクロモバクテリ
ウム・ピオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｅｔ＠ｒｌｕｍ
　ｖｉｏｌｔｓ＠ｔ＋ｍ　）　Ｂ　Ｍ　Ｇ３６＋−ＣＦ
４と同定する。

次に本発明の方法を具体的に説明する。

本発明の方法を実施するに邑っで、アルファメニン生産
菌を培養するに用いる栄養源としては、細菌の栄養源と
して公知のものを適宜使用できる。

例えば、市販されているグリセリン、ダルコース。

ラクトース′、シュクロース、デングン、マルトース、
糖蜜などの炭水化物、脂肪などを炭素源としテ、市販さ
れているペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー
、綿実粉、落花生粉、大豆粉・コーングルテン建−ル、
魚粉、酵母エキス、　　Ｎ　−２１ずン、カゼイン、硝
酸ナトリウム−硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムな
どを窒素源として、食塩、燐酸塩、炭酸カルシウム、Ｒ
酸マグネシウムなどを無機の栄養源としてそｎぞれ使用
できる。

その他必ＷＫ応じて微量の金属塩を添加する。これらの
ものは、アルファメニン生産菌が利用し、また本物質の
生産を妨害しないものであればよい。

公知の細菌の培養材料はすべて使用できる。特に好まし
い培地成分としては、炭素源としてグリセリン・可溶性
デンプンなど、窒素源として、大豆粉、魚粉、コーング
ルテンミールなどがある。グリセリント５チ・可溶性デ
ンプン１，５チ、プロリッチ０・５チ、魚粉１・５幡、
炭駿カルシウム０・２％を含む組成の培地、可溶性デン
プン３優、プロリッチ０・５優、コーングルテンミール
１，２カルシウム０・２優を含む培地などを用いるのが
好ましい。

アルファメニンの大金生産には液体培養が好まし．、い
。培養温度としては、アルファメニン生産菌が発育し、
アルフ゛□デメニンを生産する範囲ノ温度を適用し得る
が、特に好ましい培養塩度は２　５ｅＣ〜３５°Ｃであ
る。培ｇＩは普通は本物質が培養物中に生産され、充分
に蓄積するまで継続される。

例えは、可溶性デンプン３チ，プロリッチ０．　５係．
コーングルテンミールト２％．炭酸カルシウム０・２チ
を含む培地を滅菌したのち、これにアルファメニン生産
菌の斜面培養物の一白金耳量を接種し、２７°Ｃで好気
的に振盪培養を行なったところ、培ｇ！ｇ時間目から５
２時間目にアルファメニンの蓄積が認められた。アルフ
ァメニンはタンク培養法でも振盪培養法と同様によく生
産される。

例えば、５７０ｔの醗酵槽に３００ｔの培地を入れて滅
菌し、毎分３００ｔの無菌空気を通気し、毎分１９０回
転で攪拌した。この条件で本物質の生産は２３時間で最
高に達した。

アルファメニンの培養工程ならびに精製工程中での追跡
は・次Ｑ方法による抗アミノペプチダーゼＢ活性の測定
に基づいて行った。

抗アきノベゾチメーゼＢ活性の測定はホップス（　Ｖ．
に、ＨＯＰＰＵＢＵ，　Ｋ．に、ＭＡＫＩＮＥＮ，　Ｇ
．Ｇ．ＧＬＥＮＮＥＲ。

Ａｒｃｈｊｖｅｓ　ｏｆ　Ｂ１ｏｅｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ　
ａｎｄ　Ｂｌ＊ｐｈｙｍｌｅｓ　ＩＩＬ５５７、　１９
６６　）記載の方法の改良法で行った。部ち、０、００
２　Ｍアルギニン−β−ナフチルアミド０．２５ｄＫＯ
−７Ｍトリス−塩酸緩衝液（β１７・０）０・５−１検
体を含む溶液０・２５＃！／を加えた混合溶液を３７０
０、３分間加温した後、ホップスらの方法によるｒＩＩ
累の精製法で，　ＤＥＡＥ−セルロースでＮ輿したアミ
ノペ！テダーゼＢ溶液を５μを加え３７°Ｃで３０分間
反応したのち、１ツ／−の濃度にファストガーネットＧ
ＢＣ（オルトアミノアゾトルエン、ジアゾニウム塩）を
含み、１０％の濃度に界面活性剤ツイーン２　０　（　
Ｔｗ・・ｎ２０〕　を含む１・ＯＭＷＰ．酸緩衝液（−
４・２）１ｄを加え、室温に１５分放ｉ′後５　２　５
　ｎｍ　　における吸光度（ａ）を測定した。

同時にアルファメニンを含まない緩衝液のみを用いた盲
検の吸光度（ｂ）を測定し、アミノペグテダーゼＢ阻害
率を［（ｂ−ａ）／ｂ］ｘ＋ｏｏによシ計算した。この
定量方法で０．ＯＯ５μｇ　／　ａｎｌ　のアルファメ
ニンＡ及び０．００２μキ／−のアルファメニンＢはア
ｉノペ！チダーゼＢ活性を５ｏチ阻害（　ＩＣｇｏ　）
　　した。

アルファメニンはアルファメニン生産菌の培養液中及び
菌体中に存在する。アルファメニンを培養物から採取す
るに当っては、培養炉液から吸着剤に吸着および脱離さ
せる方法で好収率に採取できる。吸着剤としては活性炭
、アンバーライトＸＡＤ−４，ダイヤイオンＨＰ−２０
゛等の有機吸着剤。

イオン交換樹脂、アルミナ、シリカゲルなどが使用でき
る。例えば、アルファメニンはアンバーライ）ＸＡＤ−
４で吸着さハ、アセトン水で溶出される。例えば培養炉
液のｌ／ｌｏｌのアンバーライ）ＸＡＤ−４を適当なカ
ラムに詰め、アルファメニンを含む培養ｐ液を通過吸着
せしめ、アンバーライトＸＡＤ−４を水洗したのち、ア
ンバーライ）ＸＡＤ−４ｉの２〜４倍量の５０％アセト
ン水テ溶出される。培養Ｆ液中のアルファメニンは、５
０チアセトン水溶液中に７０係以上溶出される。

この５０チアセトン水溶液を減圧濃縮乾固することによ
り粗粉末を得ることができる。

イオン交換体のクロマトグラフィーも精製に用いられる
。特に、ＣＭ−セファデックスのクロマトグラフィーが
有効であり、食塩水の濃度こう配溶出によルアルファメ
二ンＡとＢとを相互に分離することができる。例えは、
アンバーライトＸＡＤ−４に吸着、アセトン水溶出帆よ
って得られた粗粉末をＣＭ−セファデックス　クロマト
グラフィーにかけ、食塩などの塩類の水溶液を用いて溶
出シ、アルファメニンＡを含有するフラクションとアル
ファメニンＢを含むフラクションを別々に採取し、それ
からアルファメニンＡとＢをそれぞれ単離する。

本物質の最終的な精製はセファデックスＬ　Ｈ−２０で
脱塩することにより実施できる。

本発明のアルファメニンについてその薬理作用を検討し
た。その結果、本物質が細胞性免疫に対する増強効果と
制癌作用を有していることが見出された。

本発明のアルファメニンＡ、　　Ｂ両物質の生物活性に
ついて試験例を挙げて説明する。

試験例１ 本例は正常マウスにおける細胞性免疫に及ぼす効果を示
す。

細胞性免疫に及ばずアルファメニンＡ及びＢの作用を、
羊赤血球（８ＲＢＣと略）を抗原としてマウス足踏に接
種して得られる遅地型過敏症（Ｄ、Ｔ、Ｈと略）を指標
（参考文献Ｊ、　ＥｘｐｏＭｅｄ、１３９．１５２９〜
１°５３ｑ、　＋９７４　）　　として検討し７た。

即ち、５ＲＢＣ１０個を０．０５ｄの生理食塩水に浮遊
させた懸濁液をＣＤＦ＋　（雌性８週令）マウスの足龜
皮下に接種し、これと同時に、アルファメニンＡ又はＢ
のｓ＊／に９．　　ｏ、ｓ岬／ゆ、０・０５岬／ｋｙ又
はｏ、ｏｏｓｖ／ｌｖを含有する水溶液を一１回経口投
与した。投与４日後、他の一方の足踏に、８ＲＢＣ１０
個を０．０５ｄの年理食塩水に浮遊させた懸濁液を皮下
投与して二次感作させた。その与しないで８ＲＢＣ及び
生理食塩水の皮下注射を受けた対照動物の足鵠肥厚度を
１００９６と評価し、これと処理した供試動物の足踏肥
厚塵を比較することによシ供試化合物の細胞性免疫増強
効果を判定した。試験結果を次表に示す。

第　　１　　表 第　　２　　表 試験例２ 本例は担癌マウスにおける細胞性免疫に及ぼす効果を示
す。

（１）　　抗原として５ＲＢＣを用いる方法試験法は前
記の試験例１に準する方法で足踵の腫張度を測定して検
討したが、但し腹水性Ｓａｒｅ−ｏｍａ　１８０Ｍｍの
細胞１０　　個をｉｐ　　接種したＣＤＦ　＋マウスを
用いたこと及びアルファメニンＡの投与を抗原としての
５ＲＢＣの感作日がら１回／日、４日間連日ｉｐ　　投
与し、その２８後に５ＲＢＣの二次感作を行った点が異
る。試験結果を次表に示ブ。

第　　３　　表 （２）　　抗原として塩化ビクリルを用いる方法腹水性
Ｓａｒｅａｍａ　１８０腫瘍の担癌マウスにおける塩化
ビクリルを抗原としたり、　Ｔ、　Ｈ反応による細胞性
免疫に及は丁アルファメニンＡの効果を下記の試験法で
検電した。

腹水性Ｓａｒｅｏｍａ　１８０１Ｂｉ瘍の細胞の１０　
　個をＣＤＦ　＋（雌性１２週令）マウス〔６匹／群〕
の腹腔内に移植（０日）シフ、１日後に２５軍頂×１５
０に刺毛した腹部へ６％塩化ビクリルエタノール液を２
０ｗｘ２Ｑｅ＋ｍｘ２ｎｉのカット脱脂綿にＯ−６ｔｔ
１含ませて感作する。８日後に両耳をダイアル式厚さ計
で測定し、その値を前値（ａ）とする。その後１０ｗＸ
４＋＋ｎｎＸ１ｗ＋のカット脱脂綿に１係塩化ピクリル
オリーブ液を含ませて両耳を感作し、９日後にその両耳
のＲ張度をダイアル式厚さ計で測定し、この測定値（ｂ
ｌから前値（ａ）を差し引いてこの耳厚増加度）、９．
０．０５＃ｖ／に９又は０．００５１ｒｑ／ｍの量で、
Ｓａｒｅ−ｏｍａ　１８Ｑ接種ヒ’Ｅ−１日後から８日
後までに連日６回７日経口投与し且つ対照群と同様に塩
化ビクリルで感作をして耳厚増加度（ｂ’−ａ’）を測
定して、これを処置群（Ｔ）とする。対照に対する耳厚
増加ホ（Ｔ／ＣＸｌ０Ｑ）を算出し、細胞免疫賦活性の
程度とした。試験結果を次表に示す。

第　　４　　表 ＊　ｐ　＜　ｏ、ｏｓ 上表の結果から、０−０５■／睦のアルファメニンＡ投
４群に有意な細胞免疫賦活性が得られたことが認めらｔ
’した。

試験例３ 本例ｔ；ｔ：　ｚ−ルリッヒ固形腫瘍に対するアルファ
メニンの抗腫瘍活性を示す。

腹水性Ｅｈｒｌｉｃｈ　ｃａｒｅｉｎｏｍａ腫癌の細胞
３ＸＩＯ’個をｄｄｙ　（雌性６退会）マウス（５匹／
群）の側腹部皮下に移植（０日）シ、生理食塩水に溶解
した供試化合物を１日後から１５日後まで隔）日に７回
ｏ・ｓａｙ／ｋｇ、　　０−０”ｗｙ／ｈ又はｏ、ｏｏ
ｓ　ｗｅ　／　ｋｇの量で経口投与した。腫瘍移植より
３０日後にＲ瘍すイズ（短径Ｘ長径／２）および腫瘍重
量を測定した。それぞれから対照群との比較にょシ腫瘍
成長抑制御Ｋ（Ｔ　Ｉ　１％　）を次式Ｃ−Ｔ／ＣＸ１
００〔但しＣ：対照群の腫瘍サイズあるいｉｌｌ、腫瘍
重量。

Ｔ：処置群の腫瘍サイズあるいは腫瘍ＩＩＬ景である〕
によシ算出し、ＴＩＲ％を抗腫瘍効果の評価のため次表
に示した。

上表の結果、腫瘍サイズおよび腫瘍重量において、０．
０５〜／ｋｇ、　　０．００５岬／ゆアルファメニン投
与群に、宿主介在的抗腫瘍効果が得られたこと′が認め
られる。

以上の結果より、アルファメニンＡ・　Ｂの両物質は正
常動物の細胞性免疫能を増強し、かつ担癌により低下し
た細胞性免疫能を賦活し、さらに宿主介在的抗腫瘍効果
を奏する物質であると認められる。

マウスに対する急性毒性試験では、アルファメニンＡの
２　ｓ　ｏ　ｙｖ／ｋｇのＩマ投与で、またアルファメ
ニンＢの１５０ｓｖ／に９のｌマ投与で死亡例は認めら
れない。従って、アルファメニンは安全な物質であると
認めらｎる。

このように本発明のアルファメニンＡおよびＢは単独で
免疫効果を増強し、また制癌効果を宿主介在的に奏する
ことが認められる。従って本発明化合物は免疫増強剤お
よび抗＠瘍免疫賦活剤として有用であシ、あるいは各種
癌化中療法剤の補助薬として有用である。

アルクアメ。二ンＡ、　　Ｂを有効成分とする上記薬剤
としては、アルファメニンＡまたはＢまたは両者、ある
いはその薬学的に許容される塩のいづれかを、常用の担
体と配合して製剤でき、更には、例えばナトリウム、カ
リウムの如きアルカリ金属カルシウム、マグネシウムの
如きアルカリ土類金属の陽イオン、アンモニウムイオン
との塩（カルがキシレート）がある。アルファメニンの
グアニジル基、アミノ基におりる薬学的に許容できる無
機酸１例えは塩酸など又は有機酸例えば酢酸などとの酸
付加塩も包含さｎる。

本発明の化合物乃至薬剤の投与形態は経口、注射、直腸
平削のいずれでもよい。注射剤を請判する場介は上記有
効成分化合物にβ１調整剤、緩衝剤、安定化剤、賦形剤
を添加し常法により、凍結乾燥を行い、凍結乾燥注射剤
を作ることができ、また有効成分化合物にＰＨＭ整剤１
緩衝剤、安定化剤等張剤、局麻剤等を添加し、常法によ
シ皮下、筋肉内、静脈内用注射剤を作ることもできる。

経口用固形製剤を調製する場合は有効成分化合物に賦形
剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色
剤、矯味剤、矯臭剤を加えた後、常法により、錠剤、杉
覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤停を作ることができ
る。

経口液状制剤を調製する場合には有効成分化合物に矯味
剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて、常法によシ
シロップ剤、およびドライシロップ剤を作ることができ
る。

直腸坐薬與剤を調製する場合には有効成分化合物に賦形
剤、更に必要に応じて、界面活性剤を加えた後、常法に
よシ平削とすることができる。

アルファメニンの投与量は症状により異なるが、成人で
Ｖｉ１回アルファメニンとして０・０２〜２００ηを１
日１回投与するのがよい。又他の癌化学療法剤または免
疫増強剤と併用するときは癌化学療法剤または免疫増強
剤の通常の使用貴に上記の範囲内の量のアルファメニン
を併用すればよい。

次に本発明のアルファメニンの製造に関して実施例を示
すが、本物質の理化学的性状ならびに生産方法、その精
製法が本発明者らによって明らかにされたので、本明細
書に示さ扛た方法を修飾することは容易であり、本発明
は以下に１軟する実施例のみに限定されるものではない
。

実施例１ アルファメニン生産菌としてクロモバクテリウム・ビオ
ラセクムＢＭＧ３６１−ＣＦ４（機工研菌寄第６５２１
号）の剰面培養から一白金耳鴛をとり、あらかじめ１２
０°Ｃｌ２Ｏ分間のφ件で滅菌した５０〇−容量のロー
タリーフラスコに、１１０ｄづつ分注し、た可溶性デン
プン３チ、プロリツチ０・５係、コーングルテンミール
ト２優、炭酸カルシウム０・２チからなる組成を有する
培地に接種した。２７’Ｃにおいて毎分１８０回転の培
養条件を用い、経時的にアルファメニン産生量を検討し
たところ、培養３２時間目にアルファメニン産生量Ｌピ
ークに達した。培Ｉｆ！３６時間目から、抗ア電７−ｅ
　ｆテダーゼＢ活性の測定で評価したアルファメニン濃
度は徐々に減少した。培養中の培地の声変化は、始発７
−４．８時間目７・８・　１６時間目７・６．２４時間
目７・８５．３２時間目８・１．３６時間目８・１．５
２時間目ｇ・４５であった。

実施例２ 実施例１と同様の培地と培養条件でクロモバクテリウム
・ビオラセウムｎＭｃ；３６＋−ｃｒｔ株を培養して得
られた培養液９・５ｔを塩酸で…２とシ、濾過助剤（ハ
イフロスーツ母−セル）ヲ用いて吸引濾過し９ｔの培養
Ｆ液を得た。このｐ液のアミノイゾチ〆−ゼＢ［ｌ活性
（ＩＣ６０）　　ｈ　Ｏ・０５μｔ／ｄであった。

実施例３ 実施例２において得られた培養ｐ液９ｔを水酸化ナトリ
ウムで−１５に調整後、アンー童−ライトＸＡＤ−４１
ｔのカラムに吸着させ、水洗後５０チアセトン水で溶出
し、活性区分２・３ｔを減圧下で濃縮乾固し、１９・６
１！の粗粉末を得た。この粗粉末のアミノペプチダーゼ
Ｂ阻害活性（ＩＣ５ｏ　）は０・２μｌｌ　／　ｖｒｌ
であった。

°次に、この粗粉末を適当量の０．０５Ｍ食塩水に溶か
し、５００−のＣＭ−セファデックスＣ−２５に吸着さ
せ、０・０５Ｍ食塩水１・５を及び０．０５Ｍクエン酸
緩衝液（ｍ４．５）Ｉｔで洗ったのち、同緩衝液２・５
ｔと０・５５Ｍ食塩を含む同緩衝液２・５ｔのダラシエ
ンド溶出を行った。この操作により溶出液をｌｉｄづつ
のフラクションで集めてアミノイプチメーゼＢ阻害活性
フラクション３９゜から５９番に、アルファメニンＢは
フラクション６０から８９番に溶出された。それぞ扛の
分画はアンバーライ）ＸＡＤ−４によって脱塩後、凍結
乾燥して、アルファメニン人分画から１８８■（アミノ
ペプチダーゼＢ阻害活性ＩＣｇｏ　−０，００６５μｙ
／−）のアルファメニンＡ粗粉末を、またアルファメニ
ンＢ分画から７９Ｈ１＜アずノー〇ブチダーゼＢ阻害活
性ＩＣｇｏ　−０，００２３μｇ／−）のアルファメニ
ンＢ粗粉末を得た。

実施例４ 実施例３で得られたアルファメニンＡ粗粉末１８８岬を
適当量の０・０５Ｍ食塩水に溶かし、１Ｎ塩酸でｐＨ２
・３に調整し、８０ｄのＣＭ−セファデックスＣ−２５
０カラムに吸着させ、０．０７Ｍ食塩水＋００−で洗っ
たのち、０・０７Ｍ食塩水３００ｄ及び０・５Ｍ食塩水
３００ｄのグラジェント溶出を行った。この精製操作に
より溶出液を８ｍｅづつのフラクションで集めてアルフ
ァメニンＡはフラクション１１から３４香に溶出された
。この溶出されたフラクション１１かも３０番を濃縮後
、田を２・３ＫＩＮ塙酸で調整し、５００−のセファデ
ックスＬ　Ｈ−２０のカラムから水で溶出することニヨ
リ脱塩した。脱塩さｎたアルファメニンＡ溶液をダウエ
ックスＷＧＲでｐＨ５に調整後、凍結乾燥することによ
りアルファメニンＡの白色粉末９４〜（アミノペプチダ
ーゼＢ阻害活性（工Ｃ６゜−０，００５４μ９／−１）
を得た。

実施例５ 実施例３で得ら扛たアルファメニンＢ分画７９岬を適尚
１の０−０５Ｍ食塩水に溶かし、ＩＮ塩酸でｐＨ２・３
に調整し、ｌｏｏ＃Ｉ７！のＣＭ−セファデックスＣ−
２５の力２ムに吸着させ、０・１５Ｍ食塩水１００ｄＴ
洗ツタノち、Ｏ，１５Ｍ食塩水３５０ｄ及び０・６Ｍ食
塩水３５０ｄのグラジェント溶出を行った。この精製操
作によシ、溶出液１１−づつのフラクションで集めてア
ルファメニンＢｄフラクション１７から３０番に溶出さ
れた。この分画を濃縮ｆｋ　５００　ｔｒｔのセファデ
ックスＬＨ−２０のカラムから０−０１Ｎ塩酸で溶出し
て脱塩した。

アルファメニンＢの脱塩分画をダウエックスＷＧＲを用
いて−５に調整後、凍結乾燥することによリアルファメ
ニンＢの白色粉末３２〜（アミノ４！デダーゼＢ阻害活
性ＩＣ５０−０，００２０μ！！／　ｄ）を得た。

実施例６ ５００ｍ容の坂ロフラスコにグリセリン１．５チ、可溶
性デンゾント５％、プロリッチ０・５％、魚粉１・５俤
、炭酸カルシウム０・２％及び消泡剤（ＫＭ−７２）０
・０５係から成る培地８０ｐｔｌを注入し、１２０°０
１１５分間滅菌し、今後クロモバクテリ　　　　ニウム
・ビオラセウムＢＭＧ３６１−ＣＦ４株（機工研菌寄第
６５２１号）を斜面培地に培養したものを一白金耳Ｙ接
ａｊ　した。２８°Ｃで２４時間、毎分１３５往復の振
盪培養を行ない、こｎを一次種母とした。

次に１００１容のタンクにグリセリン１．５ｉ′可溶性
デンプント５％、プロリッチ０・５％、カッオニキス１
．７４１炭酸カルシウム０・２チ及び消泡剤（ＫＭ−７
２）０・０５チから成る培地５０ｔを入れ１２０°０．
３０分間滅菌し、冷接、−次種母Ｓｏｄを接種した。毎
分５０ｔの滅菌空気を通気しながら、毎分２００回転の
攪拌で２８°Ｃ１２４時間培養を行ない、これを二次種
母とした。

次に、５７０を容のタンクに可溶性デンプン３．０％、
プロリッチＯ，ＳＳ、グルデンミールト２チ、炭酸カル
シウム０・２チ及び消泡剤（ＫＭ−７２）０・０５％か
らなる培地３００ｔを入れ、１２０°Ｃ３０分間滅菌し
、冷接、二次種母を６を加えた。通気量毎分３００　ｔ
１攪拌毎分１９０回転で２８ｃＣ，２４時間培養を行っ
た。培養液を硫酸でｐＨ２とし、濾過助剤〔ハイクロス
−パーセル〕を用いて吸引濾過した。ろ液を水酸化ナト
リウムでｐｌ′（６に調整後、再度吸引濾過してｖ３液
１８５ｔを得た。このＦ液のアミノ滅プチメーゼＢ！Ｉ
１１害活性はＩＣ６０＝　Ｏ−１７ｐｉ　／−であった
。

上記のＰ液１８５ｔにクロマト用カーボン１０ｔを加え
２時間攪拌した。次に２００メツシユの篩でカーボンを
分離した。カーボンを５０１の水で洗った抜塩酸でｐＨ
１２に調整した５０％アセトン水８０Ｌ中に入れ、２時
間攪拌し抽出した。これをバスケット型遠心分離機によ
りカーがンを除き、抽出液を濃縮し、３．５４１の濃縮
液を祠た。この濃縮液のアミノペプチダーゼＢ阻害活性
はＩＣｓ。

−０，００６３μｔ　／　ａｒｔであった。

実施例７ 実施例６で得られたｆＡ縮液液３５４ｔを２規定の水酸
化す）　ＩＪウムで中和した。この時液量は５．３５６
となった。こ扛をアンバーライトＸＡＤ−４１・７ｔの
カラムに吸着させ、水洗後５０係アセトン水＋２７．で
溶出し、活性画分７ｔを減圧下で濃縮し、２８０ｔｔｌ
の濃縮液を得た。この濃縮液のアミノペプチダーゼＢ阻
害活性ｔｄ　ＩＣ５ｏ　＝　０．０１μｔ／　ｍｅであ
った。。次に、この液を１・７ｔのＣＭ−センアデツク
スのカラムに吸着し、０．０５Ｍ食塩水６を及び０・０
５Ｍクエン酸緩衝液Ｃｍ４．５）２ｔで洗ったのち、同
緩衝液６ｔと０・６Ｍの食塩を含む同緩衝液６ｔのグラ
ジェント溶出を行った。この操作により溶出液を２００
　ｍｅずつのフラクションで集めてアルファメニン人け
７ラクシヨン３゜から３９番に、アルファメニンＢはフ
ラクション４２から５２１１に溶出された。それぞれの
分画は濃縮後アンバーライ）ＸＡＤ−４によって脱塩し
アルファメニン人分画の８５　ｄ　（ＩＣ５ｏ　−０，
０００５２μｌ　／　ｐｎｌ　）、　アルファメニンＢ
分画の４３−（ＩＣｇｏ　−０，０００３１μｔ／ｇ）
を得た。

実施例８ 実施例７で得らｎたアルファメニン人分画の８５−をバ
イオグルＰ−２（）々イオラッド社）２４９−のカラム
に吸着させ、２．５６の水及び２０％メタノール水ＩＬ
でカラムを洗った後、０・００１Ｍ食塩水で溶出した。

溶出液を１６ｄづつのフラクションで集め、フラクショ
／７から６１番にアルファメニンＡが認められた。この
分画を濃縮し、アンノ々−ライ）ＸＡＤ−２で脱塩後、
凍結乾燥した。こｎにより、アルファメニンＡの淡黄色
の粉末１・４８ｇを得た。この粉末のアミノベデチメー
ゼＢ阻害活性はＩＣ５０＝　０．０３０μＩ／ｄ、であ
った。

実施例９ 実施例７で得られたアルファメニンＢ分画の４３ｍを、
バイオグルＰ−２（バイオランド社）２４０ｍのカラム
に吸着させ、２ｔの水及び２０憾メタノール水ＩＬでカ
ラムを洗った後０．００５　Ｍの食壌水で溶出した。溶
出液を＋ｇ＠ｌづつの７ラクシヨンで集め、クラクショ
ン６から２５番にアルファメニンＢが認められた。この
分画を濃縮後アンノぐ一ライ）ＸＡＤ−２で脱塩後、凍
結乾燥した。これによシ、アルファメニンＢの淡黄色の
粉末１・８９Ｉを得た。この粉末のアミノベプチ！−ゼ
Ｂ阻害活性はＩＣｇｏ　＝　０−０１９１１９　／　ｓ
ｎｅであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のアルファメニンＡの紫外部吸収スペク
トル、第２図はアルファメニンＡの赤外部吸収スペクト
ル、第３図はアルファメニンＡの核磁気共鳴吸収スペク
トルを示す。第４図は本発明のアルファメニンＢの紫外
線吸収スイクトル。 第５図はアルファメニンＢの赤外部吸収スペクトル、第
６図はアルファメニンＢの核磁気共鳴吸収ス４クトルを
示す。 手続補正書（自発） 昭和５７年１０月　２１日 特許庁長官殿 ■、事件の表示 昭和５７　　年特許願第９６２７６号 ２、発明の名称 新生理活性物質アルファメニン及びその製造法３、補正
をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 任　所　　東京部品用区上大崎３丁目１４番２３号４、
代理人 〒１０５　　住所　東京都港区西新橋１丁目１番１５号
物産ビル別館　電話（５９１）　０２６１５、補正の対
象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）　　明細書第２頁１５行の「現」を「理」と補正
する。 （２）同第１３頁１３行の「同化」を「固化」と補正す
る。 （３）　　同第３４頁８行の「アミノペプチダーゼＢ阻
害活性」を削除して「アルファメニンＡは」を挿入する
。 手続補正書（自発） 昭和５８年９月　７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５７　　年特許願第９６２７６号 ２、発明の名称 １新生理活性物質アルフアメニン及びその製造法３、補
正をする者 事件との関係　　　　　特ｒ「出願人 任　所　　東京部品用区上大崎３丁目１４番２３号４、
代理人 〒１０５　　住所　東京都港区西新橋１丁目１番１５号
物産ビル別館　電話（５９１）　０２６１５、補正の対
象 明細壱の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）　　明細書第２９頁９行と１０行との間に次の記
載を挿入する。 「また、アルファメニンＡ及びＢは実験的アレルギー性
脳を髄炎の治療薬としても効果があると認められた。」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １１次の一般式： （式中、ＲはアルファメニンＡの場合には水素を示し、
   アルファメニンＢの場合には水酸基を示−ｊ）で表わさ
   れる抗アンノーｅ、ｓチメーゼＢ活性を有する新生理活
   性物質アルファメニンＡ及びＢ又はその塩。 ２、クロモバクテリウム属に属するアルファメニン生産
   菌を培養してアルファメニンム又＃ｉＢ又はその両者を
   培養液中に生産、蓄積させ、千ｎによシアルファメニン
   Ａ又はＢ又はその両者を採取することを特徴とする新生
   理活性物質アルファメニンＡ又は／及びＢＯＪＩＩ造法
   。 ８、アルファメニン生産菌株としてクロモバクテリウム
   ・ビオラセウムＢＭＧ３６１−ＣＦ４（機工研菌寄第６
   ５２１号〕を使用する特許請求の範囲第２項に記載の方
   法。 ４、新生理活性物質アル歩アメニンＡ又はＢ又はこｎら
   両者又はこれらの塩を有効成分として含有することを特
   徴とする免疫増強剤。