FI71765C - Foerfarande foer framstaellning av arfamenin. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av arfamenin. Download PDFInfo
- Publication number
- FI71765C FI71765C FI832007A FI832007A FI71765C FI 71765 C FI71765 C FI 71765C FI 832007 A FI832007 A FI 832007A FI 832007 A FI832007 A FI 832007A FI 71765 C FI71765 C FI 71765C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- arfamenine
- culture
- fractions
- solution
- liters
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
- C07C279/04—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
- C07C279/12—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
1 71765
Menetelmä arfameniinin valmistamiseksi
Keksinnön kohteena on menetelmä kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi 5
H N ^NH
r • λ nh Ti
1 I
CH»
I 2 7 I
10 CH» 1
I 2 CH
CH» 0 I z
I 2 n I
H^N-CH-C-CH2-CH-COOH
jossa R on vety (arfameniini A) tai hydroksyyli (arfame-15 niini B). Yhdisteet voivat olla myös suolojen muodossa.
Kaavan I mukaisen uuden farmaseuttisesti aktiivisen aineen, arfameniinin, on todettu aktiivisesti lisäävän soluvälitteistä immuuniutta ja olevan syövänvastainen aine. Erityisesti sen on todettu tehokkaasti estävän arginiini- -naf-20 tyyliamidin hajoamista aminopeptidaasi B:n vaikutuksesta.
Arfameniinilla tarkoitetaan tässä arfameniini A:ta tai arfameniini B:tä tai molempia näitä yleisesti tai seosta, joka sisältää molempia.
Arfameniini A:11a on sp. 117-119°C ja molekyylipai-25 no (määritys massaspektrometrillä) 320. Alkuaineanalyysi, C 53,45 %, H 7,11 %, N 14,91 %, O 14,20 %, Cl 10,49 %, osoittaa molekyylikaavan olevan C16H24N4°3.HCl. Arfameniini A:n vesiliuoksen (100 pg/ml) UV-absorptiospektri nähdään kuviossa 1, joka osoittaa absorption \ olevan 257 nm 30 ( 180). Arfameniini A:n infrapuna-absorptiospektri KBr- menetelmällä nähdään kuviossa 2; siinä on tyypilliset ab-sorptiovyöt kohdissa 3370, 3170, 2950, 1730, 1670, 1560, 1460, 1410, 1320, 1190, 1110, 760, 710 cm"1. Kuviossa 3 on ydinmagneettinen resonanssispektri (1H-NMR) (liuos raskaas-35 sa vedessä, S , 100 MHz), absorptiot: 2,04-2,33 (CH2), 2,35-2,72 (CH2), 3,34-3,69 (CH2 x 2), 3,69-3,84 (CH, CH2), 4,86 (CH) ja 7,82-8,00 (CcHc).
O O
2 71765
Arfameniini B:n sp. on 118-120°C ja molekyylipai.no (määritys massaspektrometrillä) 336. Alkuaineanalyysi, C 49,30 %, H 6,88 %, N 13,77 %, O 20,82 % ja Cl 8,73 %, osoittaa molekyylikaavan olevan C^ 5H24N4°4 «HCl.I^O. Arfa- 5 meniini B:n vesiliuoksen (100 pg/ml) ultravioletti-absorp- tiospektri nähdään kuviossa 4, joka osoittaa absorption A olevan 275 nm ( / 1040) ja A 222 nm ( f, 5500). max J max ^
Arfameniini B:n infrapunaspektri KBr-menetelmällä nähdään kuviossa 5; siinä on tyypilliset absorptiovyöt kohdissa 10 3370, 3180, 2960, 1730, 1670, 1560, 1520, 1460, 1420, 1330, _ 1 1250, 1180, 1110 ja 840 cm . Kuviossa 6 on ydinmagneettinen resonanssispektri (liuos raskaassa vedessä, S , 100 MHz), absorptiot: 1,87-2,30 (CH2), 2,30-2,62 (CH2), 3,14-3,54 (CH2 x 2), 3,54-3,78 (CH, CH2) , 4,75 (CH) , 7,30-7,67 (C6H4)<S . 15 Keksinnön mukaiselle menetelmälle arfameniini A:n ja/ tai arfameniini B:n valmistamiseksi on tunnusomaista, että viljellään Chromobacterium violaceum BMG361-CF4 mikro-organismia tunnettujen ravinteiden läsnäollessa ja että kaavan I mukainen yhdiste otetaan talteen viljelyväliaineesta.
20 Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään siis
Chromobacterium violaceum BMG361-CF4 kantaa, joka eristettiin maanäytteestä, joka koottiin Propinai'sta Shikotsu-järven rannalta, Hokkaidossa, Japanissa. Tämä kanta talletettiin 0.4.05.1982 talletuslaitokseen The Fermentation 25 Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japna, talletusnumerolla 6521 (FERM P-6521).
Edellä mainitun kannan mikrobiologiset tunnukset ovat seuraavat: 30 a) Morfologiset tunnusmerkit 1) Solun muoto ja koko: sauva, noin 0,8-1,0 pm x 2,0-4,0 pm.
2) Pleomorfismi: ei pleomorfinen.
3) Liikkuvuus/värekarvat: liikkuva/polaarisia ja lateraalisia värekarvoja.
35 4) Itiönmuodostus: ei muodosta itiöitä.
5) Gram-värjäys: negatiivinen 6) Haponkestävyys: negatiivinen.
11 3 71765 b) Viljelyominaisuudet erilaisilla viljelyväliaineil-o la (viljely 27 C:ssa, lihaliemi-gelatiini-pistoviljelmässä vain 20°C:ssa ja 30°C:ssa).
1) Lihaliemi-agarlevyviljelmä: 5 Kasvaneet pesäkkeet olivat jonkin verran koholla olevia puo-lipallonmuotoisia, ja niiden rajat olivat selvät ja pyöreät. Pinnat olivat sileät ja kiiltävät. Noin 17 tunnin viljelyn jälkeen pesäkkeet olivat läpikuultavia, mutta muuttuivat sitten asteittain läpikuultamattomiksi ja ulkonäöltään kumimai-10 siksi. Noin toisena viljelypäivänä pesäkkeet muuttuivat purp-puranvärisiksi, mutta eivät tuottaneet diffundoituvia pigmenttejä.
2) Lihaliemi-agarvinopintaviljelmä:
Pesäkkeet kasvoivat tasaisesti pitkin ymppäyslinjaa. Pinnat 15 olivat sileät ja kiiltävät ja reunat olivat sileät. Viljelyn toisena päivänä agarvinopinnan pohjalla olevat pesäkkeet kehittivät purppuraväriä, mutta liukenevia pigmenttejä ei havaittu.
3) Lihaliemi-nesteviljelmä: 20 Noin toisena viljelypäivänä havaittiin viljelyväliaineen pinnalle muodostuneita rengasmaisia pesäkkeitä. Noin 40 tunnin viljelyn jälkeen kannan solujen määrä koeputken pohjalla lisääntyi. Noin kolmantena viljelypäivänä solut muuttuivat purppuranvärisiksi.
25 4) Lihaliemi-gelatiinipistoviljelmä
Viljelylämpötilassa 30°C solut kasvoivat pitkin pistolinjaa. Noin kolmantena viljelypäivänä viljelyväliaine nesteytyi ja nesteytynyt pinta oli putkenmuotoinen. Viljeltäessä 20°C: ssa nesteytyminen tapahtui kuudentena viljelypäivänä.
30 5) BCP-maitoviljelmä:
Kolmen viljelypäivän jälkeen BCP muuttui siniseksi ja väliaine koaguloitui. Viidentenä viljelypäivänä koaguloituminen oli täydellinen ja peptonoituminen alkoi välittömästi. Pep-tonoituminen oli täydellinen noin 2 viikossa.
35 c) Fysiologiset tunnusmerkit (viljelylämpötila oli 27°C, jollei muuta ilmoiteta).
1) Nitraattien pelkistyminen; nitraateista muodostui nit- 4 71765 riittejä.
2) Denitrifikaatio (menetelmä: Komagata et ai., toimittaja: Takeharu Hasegawa: Classification and Identification of Microorganisms, sivu 223, Tokyo University Publisher, 1975): 5 positiivinen, ei kaasunkehitystä.
3) MR-koe: positiivinen.
4) VP-koe: negatiivinen.
5) Indolin tuottaminen: negatiivinen.
6) Rikkivedyn tuottaminen (TSI-agarväliaine, valmistaja 10 Eiken, Japani): negatiivinen.
7) Tärkkelyksen hydrolyysi: negatiivinen.
8) Sitruunahapon hyväksikäyttö: positiivinen Koser-väli-aineella ja Christensen-väliaineella.
9) Epäorgaanisen typpilähteen hyväksikäyttö (natriumsulfaat-15 ti, ammoniumsulfaatti ja natriumglutamaatti): käytti kaikkia epäorgaanisia typpilähteitä kasvuun.
10) Pigmentin muodostus (King A ja B väliaineet, valmistaja: Eiken): kummallakin väliaineella muodostui vähäisiä määriä keltaista liukenevaa pigmenttiä.
20 11) Ureaasi (ureaväliaine, valmistaja Eiken): negatiivinen.
12) Oksidaasi: positiivinen.
13) Katalaasi: positiivinen.
14) Kasvulämpötila- ja pH-alueet: kasvoi 12-37°C:ssa, edullisimmin noin 27-30°C:ssa. Kasvoi pH-alueella 5,0-8,7, edulli- 25 simmin 6,0-7,8.
15) Hapentarve: aerobinen (fakultatiivisesti anaerobinen).
16) O-F-koe (menetelmä: Hugh ja Leifson): fermentatiivinen.
17) Happojen ja kaasujen muodostus sakkarideista (Hugh-Leifson-viljelmä): happoja muodostui D-glukoosista, D-fruk- 30 toosista ja trehaloosista. Happoja ei muodostunut seuraa-vista 19 sakkaridista: L-arabinoosi, D-ksyloosi, D-mannoo-si- D-galaktoosi, maltoosi, sakkaroosi, laktoosi, D-sorbi-toli, D-mannitoli, inositoli, glyseroli, tärkkelys, adoni-toli, sellobioosi, dulsitoli, inuliini, melibioosi, meletsi-35 toosi ja raffinoosi. Yksikään sakkarideista ei muodostanut kaasuja.
18) Kaseiinin hydrolyysi: mikro-organismista tehtiin sively- 71765 viljelmä kaseiiniagarlevyllä (pH 7,4), joka oli valmistettu lisäämällä steriloitua rasvatonta maitoa 5 %:n konsent-raatioksi lihaliemi-agariin. 24 tunnin viljelyn jälkeen kaseiini alkoi hajota ja sen hydrolyysi oli täydellinen 8.
5 viljelypäivänä.
19) Purppuran pigmentin näkyvä spektri: lihaliemiagarilla kasvaneet purppuranväriset solut uutettiin etanolilla, ja uutteen spektri näkyvän valon alueella mitattiin. Maksimi-absorptio oli kohdassa 573 nm ja minimi-absorptio 430 nm.
10 Kun pigmentti liuotettiin 10-%:seen etanoli-sulfaattiseok- seen, saatiin vihreä liuos, jonka maksimi-absorptio oli kohdassa 693 nm. Tämä osoitti purppuranvärisen pigmentin olevan violakeiini-pigmenttiä (katso Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. painos, sivu 354).
15 Edellä mainittujen ominaisuuksien yhteenveto: BMG361-CF4 on gram-negatiivinen fakultatiivisesti anaerobinen bacillus-kanta, jossa on polaarisia ja lateraalisia vä-rekarvoja. Sen pesäkkeet sisältävät purppurapigmenttiä, joka näkyvän valon spektrin perusteella on violakeiinia. Nämä 20 ominaisuudet saatiin tutkimuksissa noudattaen teoksen Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology 8. painos, ohjeita, ja tulosten perusteella BGM361-CF4 kanta kuuluu sukuun Chromo-bacterium. Chromobacterium käsittää kaksi lajia: C.violaceum ja C.lividum. BMG361-CF4 kantojen ominaisuudet olivat hyvin 25 samankaltaiset kuin ensin mainitulla lajilla. Yksityiskohdittain erot olivat seuraavat: BMG361-CF4 kanta erosi C.lividum lajista sen kasvaessa 37°C:ssa, haponmuodostus sakka-rideista oli erilainen (haponmuodostus trehaloosista, arabi-noosista tai ksyloosista ei haponmuodostusta), kaseiinin hyd-30 rolyysi oli erilainen jne. Näin ollen BMG361-CF4 kanta identifioitiin Chromobacterium violaceum BMG361-CF4:ksi.
Seuraavassa kuvataan keksinnön mukaista menetelmää yksityiskohdittain. Haluttaessa keksinnön mukaisessa menetelmässä arfameniiniä tuottavan mikro-organismin viljelyyn 35 voidaan käyttää tunnettuja bakteerien viljelyssä käytettyjä ravinteita. Esimerkkejä hiililähteistä ovat kaupallisesti saatavat rasvat ja hiilihydraatit, kuten glyseroli, glukoosi, laktoosi, sakkaroosi, tärkkelysä maltoosi ja me- 6 71765 lassi. Esimerkkejä typpilähteistä ovat kaupalliset tuotteet, kuten peptoni, lihauute, maissin liuotusliemi, puuvilla-siemenjauho, maapähkinäjauho, soijapapujauho, maissiglutee-nijauho, kalajauho, hiivauute, N-Z-amiini, kaseiini, nat-5 riumnitraatti, ammoniumnitraatti ja ammoniumsulfaatti.
Esimerkkejä epäorgaanisista ravinteista ovat natriumklori-di, fosfaatit, kalsiumkarbonaatti ja magnesiumsulfaatti. Haluttaessa voidaan lisätä hivenainemääriä muita metalli-suoloja.
10 Kaikkia näitä aineksia voidaan käyttää silloin, kun arfameniinia tuottava mikro-organismi pystyy käyttämään niitä hyväkseen ja kun ne eivät häiritse arfameniinin tuotantoa.
Bakteerien viljelyssä käytettyjä tunnettuja mate-15 riaaleja voidaan käyttää. Erityisen edullisia viljelyväli-aineiden aineosia ovat hiililähteet: glyseroli ja liukoinen tärkkelys, typpilähteet: soijapapujauho, kalajauho ja mais-sigluteenijauho. Esimerkkeinä edullisista viljelyväliaineis-ta ovat viljelyväliaine, joka sisältää 1,5 % glyserolia, 20 1,5 % liukoista tärkkelystä, 0,5 % Prorichia, 1,5 % kala- jauhoa ja 0,2 % kalsiumkarbonaattia, ja viljelyväliaine, joka sisältää 3 % liukoista tärkkelystä, 0,5 % Prorichia, 1,2 % maissigluteenijauhoa ja 0,2 % kalsiumkarbonaattia.
Arfameniinimassatuotantoon käytetään edullisesti 25 nesteviljelmää. Viljelylämpötila voidaan valita laajalta lämpötila-alueelta, jolla arfameniinia tuottava mikro-organismi kasvaa ja tuottaa arfameniinia. Erityisen edullinen lämpötila on 25-35°C. Viljelyä jatketaan tavallisesti, kunnes riittävä määrä arfameniinia on muodostunut viljelyväli-30 aineeseen.
Esimerkiksi viljelyväliaine, joka sisälsi 3 % liukoista tärkkelystä, 0,5 % Prorichia, 1,2 % maissigluteeni-jauhoa ja 0,2 % kalsiumkarbonaattia, steriloitiin ja ympättiin sitten silmukallisella arfameniinia tuottavan mikro- 35 organismin vinopintaviljelmää. Ymppiä viljeltiin aerobisesti 7 71765 ravistusviljelmänä 27°C:ssa. 8-52 tunnin viljelyn jälkeen todettiin arfameniiniä muodostuneen tyydyttävästi. Arfa-meniiniä voidaan tuottaa viljelemällä yhtä hyvin tankissa kuin ravistusviljelmänä. Esimerkiksi 300 litraa vil-5 jelyväliainetta steriloitiin fermenttorissa ja viljely suoritettiin sekoittaen 190 rpm ja ilmastaen johtamalla steriloitua ilmaa 300 1/min. Näissä olosuhteissa arfameniini saavutti maksimitason 23 tunnissa.
Arfameniinin muodostumista viljelyn aikana ja puh-10 distuksessa seurattiin määrittämällä inhibitioaktiviteetti aminopeptidaasi B:n suhteen seuraavasti:
Arfameniinin aminopeptidaasi B:tä inhiboiva aktiviteetti määritettiin modifioimalla menetelmä, jonka ovat esittäneet V.K. Hoppusu, K.K. Mäkinen ja G.G. Glenner, 15 Archives of Biochemistry and Biophysics 114 (1966) 557.
Menetelmä suoritettiin lisäämällä 0,5 ml 0,1-m tris-hydro-kloridipuskuriliuosta (pH 7,0) ja 0,25 ml näytettä sisältävää liuosta 0,25 ml:aan 0,002-m arginiini- /5-naftyyliami-diliuosta. Liuosseosta kuumennettiin 37°C:ssa 3 minuuttia.
2 0 Kuumennettuun liuokseen lisättiin 5 ^,ul aminopeptidaasi B:n liuosta, joka oli puhdistettu DEAE-selluloosalla ent-syymipuhdistusmenetelmällä, jonka ovat kuvanneet Hoppusu et ai. Seos sai reagoida 30 minuuttia 37°C:ssa, sitten reaktioseokseen lisättiin 1 ml 1,0-m etikkahappopuskuria 25 (pH 4,2), joka sisälsi 1 mg/ml Fast Garnet GBC:tä (o-amino-atsotolueeni, diatsoniumsuola) ja 10 % pinta-aktiivista "Tween 20". Seos sai seistä huoneen lämpötilassa 15 minuuttia, sitten mitattiin absorbanssi a) 525 nmrssä. Samanaikaisesti mitattiin absorbanssi 30 b) sokeakokeesta, joka oli valmistettu käyttäen arfameniinia sisältämätöntä puskuriliuosta.
Aminopeptidaasi B:n inhibitio-% laskettiin yhtälöstä -- . 100. Tämän menetelmän mukaan 0,005 ,ug/ml arfameniini b 7 35 A:ta ja 0,002 ^ug/ml arfameniini B:tä inhiboi 50-%:sesti ami- 8 71765 nopeptidaasi B:n aktiivisuutta (IC^-q) .
Arfameniinia on arfameniinia tuottavan mikro-organismin viljelyn jälkeen sekä viljelyväliaineessa että mikro-organismin soluissa. Arfameniini voidaan ottaa tal-5 teen hyvällä saannolla adsorboimalla viljelyväliaineen suo-dos adsorbentille ja eristämällä arfameniini adsorbaatista. Esimerkkejä adsorbenteista ovat orgaaniset adsorbentit, kuten aktivoitu hiili, Amberlite XAD-4 ja Diaion HP-20 ionin-vaihtohartsit, aluminiumoksidi ja silikageeli. Arfameniini 10 adsorboidaan esimerkiksi Amberlite XAD-4:lie ja eluoidaan asetonin vesiliuoksella. Erityisesti tämä suoritetaan täyttämällä sopiva kolonni Amberlite XAD-4:n määrällä, joka on 1/10 viljelysuodoksen määrästä viljelyn jälkeen. Arfameniinia sisältävä suodos lasketaan kolonnin lävitse, jolloin 15 arfameniini adsorboituu. Amberlite XAD-4-kolonni pestään vedellä ja eluoidaan asetoni-vesiseoksella 1:1 käyttäen elu-ointiin liuosta 2-4-kertaisesti Amberlite-XAD-4:n määrä. Eluaatti sisältää yli 70 % viljelysuodokseen sisältyneestä arfameniinista. Saatu eluaatti haihdutetaan kuiviin 20 alennetussa paineessa, jolloin saadaan jauhemaista arfa-meniini-raakatuotetta.
Myös puhdistukseen voidaan käyttää ioninvaihto-hartsia. Erityisesti kromatografointi CM-Sephadexilla on tehokas, ja sen avulla on mahdollista gradienttieluoimalla 25 käyttäen natriumkloridin vesiliuosta erottaa toisistaan arfameniini A ja B. Esimerkiksi raakajauhe, joka on saatu adsorboimalla Amberlite XAD-4:lie ja eluoimalla asetoni-vesiliuoksella, kromatografoidaan CM-Sephadexilla. Kolonni eluoidaan suolan, kuten natriumkloridin veisliuoksella ja 30 fraktioista otetaan erikseen talteen arfameniini A:ta sisältävät ja arfameniini B:tä sisältävät fraktiot. Sitten liuoksista eristetään arfameniini A ja B.
Arfameniinin lopullinen puhdistus voidaan suorittaa suolanpoistolla käyttäen Sephadex LH-20:ä.
35 Kaavan I mukaisen arfameniinin farmakologiset vai- 9 71765 kutukset tutkittiin. Yhdisteiden todettiin potensoivan soluvälitteistä immuuniutta ja olevan syövänvastaisia aineita.
Kaavan I mukaisten yhdisteiden, arfameniini A:n ja B:n biologisia vaikutuksia kuvataan seuraavissa koe-5 esimerkeissä.
1. Vaikutus soluvälitteiseen immuuniuteen normaalilla hiirellä
Arfameniini A:n ja B:n vaikutusta soluvälitteiseen immuuniuteen tutkittiin käyttäen sen osoittamiseen viiväs-10 tynyttyyppistä yliherkkyyttä (lyhennetään D.T.H.), jonka lampaan punaiset verisolut antigeeninä (lyhennetään SRBC) tuottavat hiiren jalan anturassa (katso J. Exp. Med. 139, 1529-1539, 1974).
Q
Suspensio, joka sisälsi 10 SRBCrtä 0,05 ml:ssa fy-15 siologista suolaliuosta ruiskutettiin ihonalaisesti CDF·^-hiirien (naaras, 8 viikkoa) yhden jalan anturaan. Samanaikaisesti hiirille annettiin oraalisesti yhtenä annoksena vesiliuosta, joka sisälsi 5, 0,5, 0,05 tai 0,005 mg/kg arfameniini A:ta tai B:tä. 4 vuorokauden kuluttua tästä käsit-20 telystä toisen jalan anturaan ruiskutettiin ihonalaisesti sekundaarisen herkistymisen saamiseksi suspensio, joka si- g sälsi 10 SRBCrtä 0,05 mlrssa fysiologista suolaliuosta.
24 tuntia myöhemmin anturan turpoaminen (anturan paksuuden lisääntyminen) mitattiin länkiharpilla. Kontrollieläi-25 millä, jotka saivat ihonalaisena injektiona SRBCrtä fysiologisessa suolaliuoksessa ilman koeyhdisteen antamista, jalan anturan lisääntynyttä paksuutta merkittiin 100 %rksi. Käsiteltyjen eläinten anturan paksuuden kasvua verrattiin käsittelemättömien eläinten anturan paksuuden kasvuun ja 30 siitä laskettiin edellisen suhde jälkimmäiseen (100 %), mistä saatiin koeyhdisteen potensoiva vaikutus soluvälitteiseen immuuniuteen. Tulokset nähdään seuraavissa taulukoissa.
10 71 765
Taulukko 1
Koeyhdiste Annos Anturan paksuuden Suhde kontrolli- (mg/kg) lisääntyminen arvoon (%) _ (x 0,1 mm) __
Arfameniini A 5 10,4 + 0,77 125 D — 0,5 11,5 + 1,29 .139 0,05 13,0 + 0,97 157 0,005 11,9 +1,00 143
Bestatiini 0,5 12,5+1,24 151 10 Kontrolli 8,3+0,97 100
Vertailuyhdiste
Taulukko 2 15 Koeyhdiste Annos Anturan paksuuden Suhde kontrolli- (mg/kg) lisääntyminen arvoon (%) _(x 0,1 imi)_
Arfameniini B 5 13,7+1,77 157 0,5 14,7 + 1,74 169 2Q 0,05 14,0 + 1,33 161 0,005 12,4 + 1,40 143
Bestatiini x) 0,5 13,0+1,13 149
Kontrolli 8,7 + 1,48 100 25 Vertailuyhdiste 2. Vaikutus soluvälitteiseen immuuniuteen hiirillä, joilla on syöpä 1) Menetelmät, joissa käytetään SRBCrtä antigeeninä 30 Jalan anturan turpoamista hiirillä tutkittiin sa moin kuin esimerkissä 1, paitsi että CDF,-hiiret saivat 6 ^ intraperitoneaalisesti 10 Ascites Sarcoma 180 solua ja arfameniini A:ta intraperitoneaalisesti kerran vuorokaudessa 4:nä peräkkäisenä päivänä alkaen sinä päivänä, jona 35 herkistäminen SRBCrllä suoritettiin, ja kaksi päivää myöhemmin hiirille annettiin SRBCrtä sekundaarisen herkistymisen saamiseksi. Tulokset nähdään taulukossa 3.
11 71765
Taulukko 3
Koeyhdiste Annos Anturan Suhde kontrolli- (mg/kg) paksuuden arvoon (%) lisääntyminen (x 0,1 5__mm)_(
Arfameniini A 5 5,8+1,19 129 0,5 6,7 + 1,03 149 0,05 6,5 + 1,29 144 0,005 5,9 + 0,79 131 10 Bestatiini x^ 5 6,0 + 0,96 133
Kontrolli 4,5 + 0,74 100
Vertailuyhdiste 2) Menetelmä, jossa käytetään pikryylikloridia 15 antigeeninä
Arfameniini A:n vaikutusta sellaisten hiirien soluvälitteiseen immuuniuteen, joilla on Aschites Sarcoma 180, tutkittiin seuraavalla tavalla tehden havaintoja antigeeninä käytetyn pikryylikloridin aiheuttamasta 20 D.T.H.-reaktiosta. 10 Ascites Sarcoma 180 solua siirrettiin intraperitoneaalisesti 12 viikon ikäisiin CDF^-naaras-hiiriin (6 hiirtä/ryhmä). Siirtämispäivä merkittiin päiväksi 0. Päivänä 1 karvattomaksi ajeltu vatsan alue (25 x 15 mm) herkistettiin 0,6 ml:11a 6-%:ista pikryylikloridin 25 etanoliliuosta, joka oli absorboitu puuvillapalasella (20 x 20 x 2 mm). Päivänä 8 kummankin korvalehden paksuus mitattiin mittakellolla peruslinja-arvon (a) saamiseksi. Sitten molemmat korvalehdet herkistettiin l-%:sella pikryylikloridin oliiviöljyliuoksella absorboituna puuvilla-30 vanukappaleelle (10 x 4 x 1 mm). Päivän 9 herkistettyjen korvalehtien turvotus mitattiin mittakellolla arvon (b) saamiseksi. Vähentämällä peruslinja-arvo (a) arvosta (b) saatiin kontrolliryhmän korvalehtien paksuuden lisääntyminen (b-a) .
12 71 765
Koe-eläimille annettiin oraalisesti 0,5, 0,05 tai 0,005 mg/kg koeyhdistettä liuotettuna fysiologiseen suolaliuokseen 6 kertaa vuorokaudessa peräkkäisinä päivinä alkaen päivästä 1 päivään 8 asti, ja pikryyli-5 kloridi herkistäminen suoritettiin samalla tavalla kuin kontrolliryhmällä. Molempien korvalehtien paksuuden lisääntyminen (b'-a') määritettiin samalla tavalla kuin kontrolliryhmällä.
Käsitellyllä ryhmällä ja kontrolliryhmällä saatujen 10 arvojen korvalehtien paksuuden lisääntyminen) suhde laskettiin seuraavasti: .(h-’-TA'J. · loo (b-a) 15 jossa yhtälössä kontrolliryhmän arvoksi merkittiin 100 %, ja näin määritettiin koeyhdisteen aktiviteetti soluvälitteisen immuuniuden potensoijana. Tulokset nähdään taulukossa 4.
20 Taulukko 4
Koeyhdiste Annos Korvalehtien Suhde kontrolli- (mg/kg) paksuuden arvoon (%) lisääntyminen ——-— --——t
Arfameniini A 0,5 6,05 + 0,97 136,0 25 -"- 0,05 7,40 + 0,72 x) 166,3 0,005 6,40 + 0,63 143,8
Kontrolli xx) 4,45+2,36 100,0 X) P<0,05 XX ) 30 Fysiologinen suolaliuos
Edellä olevat tulokset osoittavat, että arfameniini A:n annos 0,05 mg/kg potensoi koeryhmän soluvälitteistä immuuniutta merkitsevästi.
3. Arfameniinin kasvaimenvastainen aktiviteetti Ehrlich'in kiinteää kasvainta vastaan 13 71 765
Kahdeksan viikon ikäisiin ddY-naarashiiriin (5 hiirtä/ryhmä) istutettiin ihonalaisesti kupeeseen 3 x 10° Ehrlich askiittikarsinoomasolua. Istuttamispäivä merkittiin päiväksi 0. Senjälkeen eläimille annettiin 5 oraalisesti koeyhdistettä 0,5, 0,05 tai 0,005 mg/kg fysiologisessa suolaliuoksessa joka toinen päivä kaikkiaan 7 kertaa alkaen päivästä 1 päivään 15 asti. Päivänä 30 kasvaimen koko (lyhempi halkaisija x pitempi halkaisija/2) ja paino mitattiin. Käsitellyllä ryhmällä saatuja tulok-10 siä verrattiin kontrolliryhmällä saatuihin tuloksiin, ja siitä laskettiin yhdisteen kasvainta ehkäisevä suhde (TIR, %) seuraavalla yhtälöllä: — x 100
15 C
jossa C on kontrolliryhmän kasvaimen koko tai paino ja T on käsitellyn ryhmän kasvaimen koko tai paino.
Koeyhdisteen kasvaimenvastaista tehoa osoittava TIR (%) nähdään seuraavassa taulukossa: 20
Taulukko 5
Koeyhdiste Annos Kasvaimen TIR (%) Kasvaimen TIR (%) (mgAg) keskimää- keskim.
räinen koko paino, (g) __(inn^)_ 25 Arfameniini A 0,5 4467 + 4311 15,8 2,62 + 1,90 1,9 0,05 3120 + 3584 41,2 1,66 + 1,50 37,8 0,005 2378 + 3138 55,2 1,62 + 1,44 39,3
Bestatiini 0,05 2089 + 1946x) 60,6 1,47 + 0,92^44,9 (vert.yhdiste) 30 Kontrolli - 5305 + 2027 0 2,67+0,84 0 X) P < 0,1 (T-koe) ^ P < 0,05 (T-koe) 14 71 7 6b
Edellä olevat tulokset osoittavat, että arfa-meniini A:n annokset 0,05 ja 0,005 mg/kg saivat aikaan isäntävälitteisen kasvaimen vastaisen vaikutuksen niiden pienentäessä kasvaimen kokoa ja painoa.
5 Arfamiini A:n ja B:n on siten osoitettu poten soivan normaalieläinten soluvälitteistä immuuniutta, moduloivan syövän alentama soluvälitteistä immuuniutta ja vaikuttavan isäntäeläimeen kasvaintenvastaisesti.
Hiirillä suoritetut akuutin myrkyllisyyden kokeet 10 osoittivat, ettei arfameniini A i.v. annoksena 250 mg/kg aiheuttanut kuolemaa eikä arfameniin B i.v. annoksena 150 mg/kg. Arfameniinia voidaan siten pitää turvallisena aineena.
Kuten edellä kuvattiin, kaavan I mukaiset arfa-15 meniini A ja B molemmat erikseen annettuina parantavat immuuniutta ja ovat tehokkaita isäntävälitteisiä karsino-staattisia aineita. Nämä yhdisteet ovat siten käyttökelpoisia immunopotensoivina ja kasvaintenvastaisina immu-nomoduloivina aineina tai erilaisten kemoterapeuttisten 20 aineiden adjuvantteina syöpätautien käsittelyssä.
Arfameniinia aktiiviaineena sisältäviä lääkkeitä voidaan valmistaa sekoittamalla arfameniini A:ta tai B:tä tai molempia tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja tavanomaisten kantaja-aineiden kanssa ja haluttaes-25 sa muiden erilaisten kemoterapeuttisten aineiden kanssa. Esimerkkejä arfameniinisuoloista ovat arfameniinin karb-oksyyliryhmän ja farmaseuttisesti hyväksyttävien kationien väliset suolat, esimerkiksi ammoniumionien tai alkali-metalli-ionien, kuten natrium- tai kaliumionien, ja maa-30 alkalimetalli-ionien, kuten magnesium- tai kalsiumionien muodostamat suolat (so. arfameniinikarboksylaatit). Muita esimerkkejä ovat happoadditiosuolat, jotka on muodostettu saattamalla arfameniinin guanidyyli- tai aminoryhmä reagoimaan farmaseuttisesti hyväksyttävän epäorgaanisen hapon, 35 kuten kloorivetyhapon, tai orgaanisen hapon, kuten etikka- 71765 hapon kanssa. Kaavan I mukaisia yhdisteitä tai lääkkeitä voidaan antaa oraalisesti, injektoimalla tai peräpuikkoina. Lyofilisoituja injektiovalmisteita voidaan valmistaa lisäämällä pH:n säätöaineita, puskureita, 5 stabilointiaineita ja laimennusaineita aktiivista aineosaa sisältävään yhdisteeseen ja kylmäkuivaamalla seos tavanomaisella tavalla. Injektiovalmisteita ihonalaiseen, lihaksensisäiseen tai suonensisäiseen antoon voidaan valmistaa lisäämällä pH:n säätöaineita, puskureita, stabi-10 lointiaineita, isotoniseksi tekeviä aineita ja paikallispuudutusaineita aktiivista ainetta sisältävään yhdisteeseen ja noudattamalla tavanomaisia valmistusmenetelmiä.
Oraalisten kiinteiden valmisteiden valmistukseen aktiiviseen aineosaan voidaan lisätä täyteaineita ja ha-15 luttaessa hajoamista edistäviä, voitelu- ja väriaineita, makua ja hajua parantavia aineita, minkä jälkeen seos muodostetaan tableteiksi, päällystetyiksi tableteiksi, rakeiksi, jauheiksi tai kapseleiksi tavallisin menetelmin.
Oraalisten nestevalmisteiden valmistamiseen käy-20 tetään aktiiviaineen lisänä makua parantavia aineita, puskureita, stabilointiaineita ja hajua parantavia aineita, ja seos valmistetaan siirapeiksi tai kuiviksi siirapeiksi tavanomaisin menetelmin.
Peräpuikkoja valmistetaan tavallisella tavalla li-25 säämällä aktiiviseen aineosaan täyteaineita ja haluttaessa pinta-aktiivisia aineita.
Arfameniinin annos vaihtelee oireista riippuen, jolloin aikuisen annos on tavallisesti 0,02-200 mg arfamenii-nia vuorokaudessa. Kun samanaikaisesti syöpää hoidetaan 30 muilla kemoterapeuttisilla aineilla tai immuunipotensoi-villa aineilla, niin arfameniinia voidaan antaa mainitun suuruisina annoksina yhdessä näiden lääkkeiden tavallisten annosten kanssa.
Seuraavissa esimerkeissä kuvataan yksityiskohtai-35 semmin keksinnön mukaista menetelmää arfameniinin tuotta- 1 6 71 765 miseksi.
Esimerkki 1
Arfameniinia tuottavan mikro-organismin, Chromobacterium violaceum BMG361-CF4 (tallennettu laitokseen Fermen-5 tation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industrial Trade and Industry of Japan numerolla 6521) vinopintaviljelmästä otettiin silmu-kallinen soluja. Soluilla ympättiin viljelyväliaine, joka sisälsi 3 % liukoista tärkkelystä, 0,5 % Prorichia, 1,2 % 10 maissigluteenijauhoa ja 0,2 % kalsiumkarbonaattia. Viljely-väliaine oli steriloitu 120°C:ssa 20 minuuttia ja sitä lisättiin 110 ml 500 ml:n ravistussiljelypulloihin. Ympättyä viljelyainetta inkuboitiin 27°C:ssa kierrosnopeudella 180 rpm ja arfameniinin muodostumista seurattiin koko ajan. Ar-15 fameniinin saanto oli maksimaalinen 32 tunnin viljelyn kuluttua. 36 tunnin kuluttua viljelyn alkamisesta arfameniini-konsentraatio määritettynä anti-aminopeptidaasi B-aktiivisuu-den perusteella alkoi asteittain alentua.
Viljelyväliaineen pH oli viljelyn alkaessa 7,4, 8 tun-20 nin kuluttua 7,8, 16 tunnin kuluttua 7,6, 24 tunnin kuluttua 7,85, 32 tunnin kuluttua 8,1, 36 tunnin kuluttua 8,1 ja 52 tunnin kuluttua 8,45.
Esimerkki 2
Chromobacterium violaceum kantaa BMG361-CF4 viljeltiin 25 samoissa olosuhteissa ja samassa viljelyväliaineessa kuin esimerkissä 1. 9,5 litraa viljelyn jälkeen saatua viljely-väliainetta säädettiin kloorivetyhapolla pH-arvoon 2 ja imu-suodatettiin käyttäen suodatusapuainetta (Hyflo Super Cell), jolloin saatiin 9 litraa suodosta. Suodoksen aminopeptidaa-30 si B inhibitioaktiviteetti (IC^Q) oli 0,05 yul/ml.
Esimerkki 3 9 litraa esimerkissä 2 saatua suodosta säädettiin nat-riumhydroksidilla pH-arvoon 5 ja adsorboitiin 1 litran Amber lite XAD-4 kolonniin. Adsorbaatti pestiin vedellä ja elu-35 oitiin sitten 50-%:sella asetonin vesiliuoksella. 2,3 litraa aktiivista fraktiota haihdutettiin ja kuivattiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 19,6 g jauhemaista raaka- 17 71765 tuotetta. Raakatuotteen aminopeptidaasi B inhibitioaktivi-teetti (IC^q) oli 0,2 jug/ml. Raakatuote liuotettiin sopivaan määrään 0,05-m natriumkloridin vesiliuosta, ja liuos adsorboitiin 500 ml:Ile CM-Sephadex C-25 hartsia. Adsor-5 baatti pestiin 1,5 litralla 0,05-m natriumkloridin vesiliuosta ja 1 litralla 0,05-m sitraattipuskuria (pH 4,5) ja sitten suoritettiin gradienttieluointi käyttäen 2,5 litraa samaa puskuriliuosta, joka sisälsi 0,55-m natriumkloridia. Elu-aattia kerättiin 18 ml:n fraktioina. Arfameniini A:ta saa-10 tiin fraktioissa 39-59 ja arfameniini B:tä fraktioissa 60-89. Arfameniini A:ta sisältävistä fraktioista poistettiin suola Amberlite XAD-4:llä, ja fraktiot kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 188 mg epäpuhdasta arfameniini A jauhetta (aminopeptidaasi B inhibitioaktiviteetti IC^q = 0,0065 ^jg/ml) . Ar-15 fameniini B:tä sisältävistä fraktioista saatiin epäpuhdasta arfameniini B jauhetta 79 mg (aminopeptidaasi B inhibitioaktiviteetti = 0,0023 yug/ml) .
Esimerkki 4
Esimerkissä 3 saatu 188 mg epäpuhdasta arfameniini A 20 jauhetta liuotettiin sopivaan määrään 0,05-m natriumkloridin vesiliuosta ja liuoksen pH säädettiin 1-n kloorivetyhapolla 2,3:ksi. Liuos adsorboitiin 80 ml:n CM-Sephadex C-25 kolonniin ja pestiin 100 ml:lla 0,07-m natriumkloridin vesiliuosta. Adsorbaatille suoritettiin gradienttieluointi käyttäen 25 300 ml 0,07-m natriumkloridin vesiliuosta ja 300 ml 0,5-m natriumkloridin vesiliuosta. Kerättiin 8 ml:n fraktioita ja arfameniini A:ta oli fraktioissa 11-34. Fraktiot 11-30 konsentroitiin, pH säädettiin 1-n kloorivetyhapolla 2,3:ksi. Suolan poistamiseksi konsentraatti eluoitiin vedellä 500 ml:n 30 Sephadex LH-20 kolonnista. Arfameniinin suolattomaksi tehty liuos säädettiin pH-arvoon 5 Dowex WGR:llä ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 94 mg valkoista jauhemaista arfameniini A:ta (aminopeptidaasi B inhibitioaktiviteetti ICj-q = 0,0054 yug/ml) .
Esimerkki 5 35 Esimerkissä 3 saatu 79 mg epäpuhdasta arfameniini B: tä liuotettiin sopivaan määrään 0,05-m natriumkloridin vesi-liuosta. Liuoksen pH säädettiin 1-n kloorivetyhapolla 2,3:ksi is 71765 ja liuos adsorboitiin 100 ml:n CM-Sephadex C-25 kolonniin. Adsorbaatti pestiin 100 ml:11a 0,15-m natriumkloridin vesi-liuosta, sitten suoritettiin gradienttieluointi käyttäen 350 ml 0,15-m natriumkloridin vesiliuosta ja 350 ml 0,6-m 5 natriumkloridin vesiliuosta. Eluaattia koottiin 11 ml:n fraktioina, ja arfameniini B:tä oli fraktioissa 17-30. Nämä fraktiot konsentroitiin ja eluoitiin 500 ml:n Sephadex LH-20 kolonnissa suolan poistamiseksi 0,01-n kloorivetyhapolla. Suolattomaksi tehdyt arfameniini B:tä sisältävät fraktiot 10 säädettiin pH-arvoon 5 Dowex WGR:llä ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 32 mg valkoista jauhemaista arfameniini B:tä.
Sen aminopeptidaasi B inhibitioaktiviteetti IC^q oli 0,0020 yug/ml.
Esimerkki 6 15 500 ml:n Sakaguchi-pulloon pantiin 80 ml viljelyväli- ainetta, joka sisälsi 1,5 % glyserolia, 1,5 % liukoista tärkkelystä, 0,5 % Prorichia, 1,5 % kalajauhoa, 0,2 % kalsiumkar-bonaattia ja 0,05 % vaahdonestoainetta (KM-72). Viljelyväli-aine steriloitiin 15 minuuttia 120°C:ssa, jäähdytettiin ja 20 siihen ympättiin silmukallinen vinopintaviljelmällä viljeltyä Chromobacterium violaceum BMG361-CF4 kantaa (tallennettu laitokseen Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan numerolla 6521). Ympättyä väliainetta ra-25 vistusviljeltiin 28°C:ssa 24 tuntia ravistustiheydellä 135 kertaa minuutissa. Näin saatiin ensimmäinen ymppi.
100 litran tankkiin pantiin 50 litraa viljelyväliai-netta, joka sisälsi 1,5 % glyserolia, 1,5 % liukoista tärkkelystä, 0,5 % Prorichia, 1,74 % bonitouutetta, 0,2 % kal-30 siumkarbonaattia ja 0,05 % vaahdonestoainetta (KM-72). Vil-jelyväliaine steriloitiin kuumentamalla 120°C:ssa 30 minuuttia, se jäähdytettiin ja ympättiin 80 ml:11a primaariymppiä. Ympättyä väliainetta viljeltiin 24 tuntia 28°C:ssa sekoittaen kierrosluvulla 200 rpm ja johtaen steriloitua ilmaa 50 1/ 35 min, jolloin saatiin toinen ymppi.
300 litraan viljelyväliainetta, joka sisälsi 3,0 % liukoista tärkkelystä, 0,5 % Prorichia, 1,2 % maissigluteeni- 19 71 765 jauhoa, 0,2 % kalsiumkarbonaattia ja 0,05 % vaahdonesto-ainetta (KM-72), steriloitiin 570 litran tankissa 120°C:ssa 30 minuuttia, jäähdytettiin ja ympättiin 6 litralla toista ymppiä. Ympättyä viljelyväliainetta inkuboitiin 28°C:ssa 24 5 tuntia sekoittaen kierrosnopeudella 190 rpm ja johtaen steriloitua ilmaa 300 1/min. Viljelyn päätyttyä viljelyväliai-neen pH säädettiin rikkihapolla arvoon 2 ja väliaine imusuo-datettiin, jolloin saatiin 185 1 suodosta. Suodoksen amino-peptidaasi B inhibitioaktiviteetti IC,-q oli 0,17 ^il/ml.
10 10 litraa kromatografialaatua olevaa hiiltä lisättiin 185 litraan saatua suodosta ja seosta sekoitettiin 2 tuntia. Hiili erotettiin seoksesta 200 meshin seulalla. Hiili pestiin 50 litralla vettä ja lisättiin 80 litraan 50-%:sta asetonin vesiliuosta, jonka pH oli säädetty kloorivetyhapolla 15 arvoon 2. Seoksen uuttamiseksi sitä sekoitettiin 2 tuntia.
Hiili poistettiin linkoamalla korilingolla ja uute konsentroitiin 3,54 litraksi. Konsentraatin aminopeptidaasi B inhibitioaktiviteetti oli 0,0063 ^il/ml.
Esimerkki 7 20 Esimerkissä 6 saatu 3,54 litraa konsentraattia neutra loitiin 2-n natriumhydroksidilla, jolloin saatiin 5,35 litraa nestettä. Se adsorboitiin 1,7 litran Amberlite XAD-4 kolonniin ja pestiin vedellä. Kolonni eluoitiin 12 litralla 50-%:sta asetonin vesiliuosta, ja saatu 7 litraa aktiivista 25 fraktiota konsentroitiin alennetussa paineessa 280 ml:ksi.
Konsentraatin aminopeptidaasi B inhibitioaktiviteetti ICj-q oli 0,01 yul/ml. Konsentraatti adsorboitiin sitten 1,7 litran CM-Sephadex-kolonniin ja pestiin 6 litralla 0,05-m natrium-kloridiliuosta ja 2 litralla 0,05-m sitraattipuskuria (pH 30 4,5). Pestylle adsorbaatille suoritettiin gradienttieluoin- ti 6 litralla samaa puskuriliuosta, joka sisälsi 0,6-m nat-riumkloridia. Tällöin kerättiin 200 ml:n fraktioita. Arfame-niini A:ta esiintyi fraktioissa 30-39 ja arfameniini B:tä fraktioissa 42-52. Tuotteita sisältävät fraktiot konsentroi-35 tiin ja niistä poistettiin suola Amberlite XAD-4:llä, jolloin saatiin 85 ml arfameniini A fraktiota (ICj-q = 0,0058 jil/ml) ja 43 ml arfameniini B fraktiota (IC^q = 0,0031 yul/ml).
71765 20
Esimerkki 8 85 ml esimerkissä 7 saatua arfameniini A fraktiota adsorboitiin 240 ml:n Biogel P-2 kolonniin (Bio-lad'in tuote). Kolonni pestiin 2,5 litralla vettä ja 1 litralla 20 %: 5 sta metanolin vesiliuosta ja eluoitiin 0,001-m natriumklori-din vesiliuoksella. Eluaattia koottiin 18 ml:n fraktioina. Arfameniini A:ta oli fraktioissa 7-81. Nämä fraktiot konsentroitiin, niistä poistettiin suola Amberlite XAD-4:llä, ja ne kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 1,48 g arfameniini A:ta vaa-10 leankeltaisena jauheena. Jauheen aminopeptidaasi B inhibitio-aktiviteetti (IC5Q) oli 0,030 μg/ml.
Esimerkki 9 43 ml esimerkissä 7 saatu arfameniini B fraktiota adsorboitiin 240 ml:n Biogel P-2 kolonniin (Bio lad'in tuote). 15 Kolonni pestiin 2 litralla vettä ja 1 litralla 20-%:sta metanolin vesiliuosta ja eluoitiin sitten 0,005-m natriumklo-ridin vesiliuoksella. Eluaattia koottiin 18 ml:n fraktioina ja arfameniini B:tä oli fraktioissa 6-25. Nämä fraktiot konsentroitiin, niistä poistettiin suola Amberlite XAD-4:llä 20 ja ne kylmäkuivattiin. Saatiin 1,89 g arfameniini B:tä vaaleankeltaisena jauheena. Jauheen aminopeptidaasi B inhibitio-aktiviteetti (IC^q) oli 0,019 yug/ml.
Piirrosten kuvaus:
Kuviossa 1 on kaavan I mukaisen arfameniini A:n ult-25 raviolettiabsorptiospektri.
Kuviossa 2 on arfameniini A:n infrapuna-absorptio-spektri.
Kuviossa 3 on arfameniini A:n ydinmagneettinen re-sonanssispektri.
30 Kuviossa 4 on kaavan I mukaisen arfameniini B:n ult- raviolettiabsorptiospektri.
Kuviossa 5 on arfameniini B:n infrapuna-absorptio-spektri.
Kuviossa 6 on arfameniini B:n ydinmagneettinen re-35 sonanssispektri.
ti
Claims (2)
1. Menetelmä kaavan I mukaisen yhdisteen 5 Η2Ν\,/ΝΗ f Γ O ,o 'H2 I
10 CH_ CH_ I 2 2 CH- O I 2 " H2N-CH-C-CH2“CH-COOH jossa R on vety tai hydroksyyliryhmä, valmistamiseksi, 15 tunnettu siitä, että viljellään Chromobacterium violaceum BMG361-CF4 mikro-organismia tunnettujen ravinteiden läsnäollessa ja että kaavan I mukainen yhdiste otetaan talteen viljelyväliaineesta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että käytetään nestemäistä viljelmää ja että kaavan I mukaiset yhdisteet otetaan talteen viljelyväliaineesta adsorboimalla viljelyväliaineen suodos tavanomaiselle adsorbentille ja eristämällä halutut yhdisteet adsor-baatista.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9627682 | 1982-06-07 | ||
| JP57096276A JPS58212791A (ja) | 1982-06-07 | 1982-06-07 | 新生理活性物質アルフアメニン及びその製造法 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI832007A0 FI832007A0 (fi) | 1983-06-03 |
| FI832007L FI832007L (fi) | 1983-12-08 |
| FI71765B FI71765B (fi) | 1986-10-31 |
| FI71765C true FI71765C (fi) | 1987-02-09 |
Family
ID=14160605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI832007A FI71765C (fi) | 1982-06-07 | 1983-06-03 | Foerfarande foer framstaellning av arfamenin. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4595698A (fi) |
| EP (1) | EP0096356B1 (fi) |
| JP (1) | JPS58212791A (fi) |
| KR (1) | KR900008247B1 (fi) |
| AT (1) | ATE37393T1 (fi) |
| CA (1) | CA1201992A (fi) |
| DE (1) | DE3378058D1 (fi) |
| DK (1) | DK257083A (fi) |
| ES (1) | ES523022A0 (fi) |
| FI (1) | FI71765C (fi) |
| HU (1) | HU191849B (fi) |
| NO (1) | NO165200C (fi) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS606647A (ja) * | 1983-06-17 | 1985-01-14 | Microbial Chem Res Found | アルフアメニン及びその関連化合物と合成法 |
| JPS6034190A (ja) * | 1983-08-05 | 1985-02-21 | Microbial Chem Res Found | アルフアメニンの高収率製造法 |
| JPS61204170A (ja) * | 1984-09-03 | 1986-09-10 | Microbial Chem Res Found | アルフアメニン関連化合物と免疫賦活剤 |
| JPH05279374A (ja) * | 1992-03-31 | 1993-10-26 | Sawao Murao | スイダトレスチン及びその製造方法 |
| JPH06247964A (ja) * | 1993-02-22 | 1994-09-06 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 新規生理活性物質ｈｓ−１及びその製造方法 |
| BR112012021846B1 (pt) | 2010-03-12 | 2020-12-08 | Council Of Scientific & Industrial Research | processo para produção de violaceína e deoxiviolaceína contendo pigmento bioativo de chromobacterium sp. (mtcc 5522) |
| CN112430633B (zh) * | 2020-11-02 | 2023-05-09 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3824267A (en) * | 1971-08-19 | 1974-07-16 | Ono Pharmaceutical Co | Thiolesters of guanidino organic acids |
| DE2359544A1 (de) * | 1973-11-29 | 1975-10-30 | Hoechst Ag | Cephemderivate und verfahren zu ihrer herstellung |
| US3994965A (en) * | 1974-08-09 | 1976-11-30 | Pfizer Inc. | D-N-(guanylureidoacetyl)-α-aminophenyl acetic acid and D-N-(guanylureidoacetyl)-α-aminophenyl acetyl chloride |
| US4105789A (en) * | 1976-05-10 | 1978-08-08 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Carboxyalkylacylamino acids |
| JPS6026099B2 (ja) * | 1977-09-21 | 1985-06-21 | 財団法人微生物化学研究会 | ペプチド、その酸附加塩およびその製造法 |
| JPS5832592B2 (ja) * | 1979-01-31 | 1983-07-14 | 財団法人微生物化学研究会 | 新抗生物質バクトロポンおよびその製造法 |
-
1982
- 1982-06-07 JP JP57096276A patent/JPS58212791A/ja active Granted
-
1983
- 1983-06-01 DE DE8383105416T patent/DE3378058D1/de not_active Expired
- 1983-06-01 AT AT83105416T patent/ATE37393T1/de active
- 1983-06-01 EP EP83105416A patent/EP0096356B1/en not_active Expired
- 1983-06-02 CA CA000429549A patent/CA1201992A/en not_active Expired
- 1983-06-02 US US06/500,396 patent/US4595698A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-06-02 KR KR1019830002470A patent/KR900008247B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-06-03 FI FI832007A patent/FI71765C/fi not_active IP Right Cessation
- 1983-06-06 DK DK257083A patent/DK257083A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-06-06 NO NO832046A patent/NO165200C/no unknown
- 1983-06-06 ES ES523022A patent/ES523022A0/es active Granted
- 1983-06-06 HU HU832020A patent/HU191849B/hu unknown
-
1985
- 1985-12-16 US US06/809,215 patent/US4859593A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8503029A1 (es) | 1985-02-01 |
| EP0096356B1 (en) | 1988-09-21 |
| DK257083D0 (da) | 1983-06-06 |
| US4859593A (en) | 1989-08-22 |
| DK257083A (da) | 1983-12-08 |
| EP0096356A3 (en) | 1985-06-12 |
| NO165200C (no) | 1991-01-16 |
| DE3378058D1 (en) | 1988-10-27 |
| KR840005169A (ko) | 1984-11-05 |
| FI832007A0 (fi) | 1983-06-03 |
| EP0096356A2 (en) | 1983-12-21 |
| ES523022A0 (es) | 1985-02-01 |
| JPH022593B2 (fi) | 1990-01-18 |
| HU191849B (en) | 1987-04-28 |
| NO832046L (no) | 1983-12-08 |
| US4595698A (en) | 1986-06-17 |
| ATE37393T1 (de) | 1988-10-15 |
| KR900008247B1 (ko) | 1990-11-06 |
| FI71765B (fi) | 1986-10-31 |
| NO165200B (no) | 1990-10-01 |
| CA1201992A (en) | 1986-03-18 |
| JPS58212791A (ja) | 1983-12-10 |
| FI832007L (fi) | 1983-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0055069B1 (en) | Derivatives of actaplanin | |
| KR850001503B1 (ko) | 항생물질 A-4696인자B_1,B_2,B_3,C_1a,C_3 및 E_1의 제조방법 | |
| CZ138194A3 (en) | Lipopeptides produced by bacteria of actinoplanes strain exhibiting pharmacological activity, processes of their preparation and their use | |
| EP0010421B1 (en) | Mixture of antibiotics designated by a-21978, process for its production, their pharmaceutical compositions and producing microorganism | |
| JPH0637508B2 (ja) | 抗生物質Ａ４０９２６複合体およびその純粋な因子ＰＡ、ＰＢ、Ａ、ＢおよびＢｏ | |
| KR870001373B1 (ko) | 항생물질 BMG 162-aF2의 제조방법 | |
| FI71765C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av arfamenin. | |
| US5013550A (en) | Antibiotics called "chloropolysporins B and C", a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use | |
| EP0287110B1 (en) | Glycopeptide antibiotics pa-45052 | |
| IE841760L (en) | Antibiotics produced by kibdelosporangium aridum | |
| JPS6244553B2 (fi) | ||
| CA2012013C (en) | Antitumor antibiotic bmy-41339 | |
| US4906618A (en) | Prophylactic and therapeutic agent against swine dysentery | |
| US4670260A (en) | Antibiotic for animal feeds | |
| US4777160A (en) | BU-2867T peptide antibiotics | |
| AU645372B2 (en) | A peptide compound isolatable from the genus verticimonosporium | |
| US4916063A (en) | BU-2867T peptide antibiotics | |
| US4463092A (en) | Process for production antibiotic A53868 | |
| KR830002817B1 (ko) | 생물학적으로 활성인 fr-900156물질의 제조방법 | |
| IE913058A1 (en) | Antibiotic ge1655 complex and its factors a, b, and c | |
| JPH01240196A (ja) | 新規グリコペプチド系抗生物質ｐａ−４５０５２ | |
| US4797280A (en) | Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 | |
| EP0253245A2 (en) | Biologically active peptides TAN-866 | |
| KR830001069B1 (ko) | A-21978 항생제의 제조방법 | |
| ZA200206795B (en) | Pluraflavins and derivatives thereof, process for their preparation and use thereof. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: MICROBIAL CHEMISTRY RESEARCH FOUNDATION |