HU191849B - Process for preparing compounds with pharmaceutical activity and compositions containing such compounds by means of a new chromobacterium violaceum strain - Google Patents
Process for preparing compounds with pharmaceutical activity and compositions containing such compounds by means of a new chromobacterium violaceum strain Download PDFInfo
- Publication number
- HU191849B HU191849B HU832020A HU202083A HU191849B HU 191849 B HU191849 B HU 191849B HU 832020 A HU832020 A HU 832020A HU 202083 A HU202083 A HU 202083A HU 191849 B HU191849 B HU 191849B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- arphamenine
- culture
- compound
- chromobacterium violaceum
- strain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
- C07C279/04—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
- C07C279/12—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű vegyületek - a képletben R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport és gyógyászatilag elfogadható sóik előéllitására.
A találmány szerinti eljárást úgy végzik, hogy Chromobacterium violaceum fajhoz tartozó mikroorganizmus törzset ismert tápanyagok jelenlétében tenyésztenek, és a képződött (I) általános képletű vegyületet a tápközegből kinyerik.
A találmány szerinti eljárással előállított anyag gyógyszerkészítménnyé alakítva sejtközvetitett immunitást fokozó és rákellenes hatású anyag.
H2N .NH \z í
NH
H2N-CH-C—CH2—CH—COOH j 191849
A találmány tárgya eljárás új, gyógyászati hatású anyag, az Arphamenine előállítására, új Chromobacterium violaceum BMG 361-CF4 mikroorganizmus törzsből való tenyésztés útján, valamint eljárás ezeket hatóanyagként tartalmazó immunitást fokozó és rákellenes gyógyszerkészítmények előállítására.
Azt találtuk, hogy az Arphamenine, amely Arphamenine A-t és Arphamenine B-t, vagy ezek keverékét jelenti, se jtkóz veti tett immunitást fokozó és rákellenes hatáeú anyag. Továbbá azt találtuk, hogy az Arphamenine különösen hatásosan gátolja az arginin-β-naftilamid aminopeptidáz B-vel való lebontását.
A találmány szerinti eljárással előállított új Arphamemine-t valamint sóit az (I) általános képlettel Írjuk le, amely képletben R jelentése Arphamenine A esetében hidrogénatom és Arphamenine B esetében hidroxilcsoport.
Az Arphamenine A-t és B-t Arphamenine-t termelő baktériumok tenyésztésével, majd a tápközeg szűrésével és frakcionálásával nyerjük, színtelen por formájában. A frakcionálást kromatografálással végezhetjük, például CM-Sephadex tölteten. A kapott frakciók tulajdonságai a következők:
Arphamenine A: olvadáspont 117-119 °C, molekulasúly tömegspektrometriával meghatározva: 320; elemanalizie C1eH2.1N4O3.HCl összegképletű vegyűletre: C=53,45%, H=7,ll%, N=14,91%, 0=14,20%, 01=10,49%;
UV spektrum λ·»: 257 nm (ε 180), 100 κ/ml Arphamenine A tartalmú vizes oldatban mérve (abszorpciós görbe 1. ábra);
IR spektrum (KBr) karakterisztikus sávjai: 3370, 3170, 2950, 1730, 1670, 1560, 1460, 1410, 1320, 1190, 1110, 760 és 710 cm-1 (abszorpciós görbe 2. ábra); ^-NMR spektrum - (nehéz viz, é, 100 MHz): 2,04-2,33 (CHz), 2,35-2,72 (CHz), 3,34-3,69 (CHzx2), 3,69-3,84 (CH, CHz), 4,83 (CH), és 7,82-8,00 (CeHs) (abszorpciós spektrum 3. ábra).
Arphamenine B: olvadáspont: 118°-120 °C; molekulasúly tömegepektrometriával meghatározva: 336; elemanalizis a Ci6H24N4O4.HCl.H2O összegképletű vegyűletre: C=49,30%, H=6,88%, N=13,77%, 0=20,82%, Cl=8,73%.
UV spektrum λ·»: 275 nm (ε 1040), ée λ·βχ: 222 nm (ε 5500) 100 ϊ/ml Arphamenine B tartalmú vizes oldatban mérve (abszorpciós spektrum 4. ábra); IR spektrum (KBr): karakterisztikus sávjai: 3370, 3180, 2960, 1730, 1670, 1560, 1520, 1460, 1420, 1330, 1250, 1180, 1110 és 840 cm*1 (abszorpciós görbe 5. ábra); NMR spektrum (nehéz viz, S, 100 MHz): 1,87-2,30 (CHz), 2,30-2,62 (CHz), 3,14-3,54 (CHzx2), 3,54-3,78 (CH,CH2), 4,75 (CH),
7,30-7,67 (CdU).
A találmány szerinti eljárásban az Arphamenine-t termelő mikroorganizmus olyan mikroorganizmust jelent, amely képes Arphamenine A-t vagy Arphamenine B-t, vagy mindkettőt termelni. Ilyen mikroorganizmus törzsre példa a Chromobacterium violaceum BMG 361-CF4 törzs, amelyet a Poropinai-i Shikotsu tó (Hokkaido, Japán) partjának talajából izoláltunk, és a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan intézménynél 1982-ben, 6521 szám alatt helyeztünk letétbe (FERM P-6521). Ez a törzs újból deponálva lett FERM BP-286 letéti számon.
A fenti mikroorganizmus törzs mikrobiológiai jellemzői a következők:
(a) morfológiai jellemzők (1) sejt formája és mérete: pálcika; kb. 0,8-1,0 mikron x 2,0-4,0 mikron (2) pleomer fizmus: nem pleomorf (3) motilitás(flagelláció: motilis) poláris és laterális flagella (4) spóraképződés: nem spórásodé (5) Gram-festés: negatív (6) savállóság: negatív (b) tenyészet jellemzői különböző közegekben (tenyésztés hőmérséklete 27 °C, 20 °C és 30 °C /csak húsleves-zselatin szúrt tenyészetnél/):
(1) húsleves-agar lemeztenyészet:
A képződő kolóniák kissé félgömb alakúak, széleik simák és köralakúak, a felület sima és fényes. A tenyésztés 17. órája után a kolóniák áttetezöek, majd fokozatosan opakká válnak és megjelenésük gumiszerű. A tenyésztés második napján színük bíborra változik, de diffundáló pigment nem képződik.
(2) Húsleves-agar ferde tenyészet
A kolóniák növekedése a beoltás mentén egyenletes. A felület sima és fényes, a szélek simák. A tenyésztés második napján a tápközeg alján színük bíborra változik, de oldható pigment nem figyelhető meg.
(3) Húsleves folyékony tenyészet
A tenyésztés második napján a tápközeg felszínén biborszlnü gyúrűalakú kolóniák képződnek. 40 óra elteltével az edény alján a törzs sejtek száma növekszik és szinük a harmadik napon bíborra változik.
(4) Húsleves-agar szúrt tenyészet °C-os tenyésztési hőmérsékleten a sejtek a szúrás mentén növekednek, a tenyésztés harmadik napján a közeg elfolyósodik és az elfolyósodó rész csöalakú. 20 °C-os tenyésztési hőmérsékleten az elfolyósodás a hatodik napon figyelhető meg.
(5) BCP tejtenyészet (Brom Cresol Purple-milk)
A tenyésztés harmadik napján a BCP megkékül és a közeg koagulál. Az ötödik napon a koaguláció befejeződik és azonnali peptonizáció indul meg, amely két hét alatl fejeződik be.
(c) Fiziológiai jellemzők (a tenyésztés hőmérséklete minden esetben 27 °C volt, ettől eltérő hőmérséklet eeetén azt külön megjelöljük) (1) nitrát redukció: nitrátból nitrit-kópződés (2) denitrifikáció (módszer: Komagata és mtársai szerkesztésében Takeharu Hasegawa;) Classification and Identification of Microorganisms, 223. oldal, Tokyo University Kiadó, 1975); pozitív, gázképződés nincs (3) MR-teszt: pozitív (0,5% glükóz, 0,7% pepton és 0,5% NaCl összetételű közegben pH=7,5) (4) VP-teszt: negatív (közeget lásd (3) pontnál) (5) indol képződés: negatív (6) hidrogén-szulfid képződés [TSI (Triple Sugár írón Agár) Agár Médium,/ Eiken, Japán gyártmány]: negatív (7) keményítő hidrolízis: negatív (8) citromsav felhasználás: pozitív, Kóser citrát/ és Christensen/ agar közegen (9) szervetlen nitrogénforrás felhasználás (nátrium-szulfát, ammónium-szulfát és nátrium-glutamát): bármilyen szervetlen nitrogénforrás felhasználható a tenyésztésnél (10) pigment-képződés (King A és King B közeg, Eiken gyárt): igen csekély mennyiségű sárga pigment képződik mindkét közegen (11) ureáz (Uria közeg, Eiken gyártm.): negatív (12) oxidáz: pozitív (13) kataláz: pozitív (14) tenyésztés hőmérséklete és pH tartománya: hőmérséklet: 12° és 37° között, különösen előnyösen 27° és 37° között, pH: 5,0 és 8,6 pH érték között, különösen előnyösen 6,0 és 7,8 pH érték között (15) oxigénszükséglet: aerob (esetleg anaerob) (16) O-F teszt: fermentativ (Hugh és Leifson módszere szerint) (0,2% pepton, 0,5% K2H.PO4, 0,03% agar és 0 0,008% brómtimol kék tartalmú közegben, pH=7,l) (17) sav és gázképződés szacharidokból (Hugh és Leifson kultúra): sav képződik: D-glukozból, D-fruktőzból és trehalózból, nem képződik sav: L-arabinózból, D-xilózból, D-mannózból, D-galaktózból, maltózból, szacharózból, laktózból, D-szorbitból, D-mannitból, inozitból, glicerinből, keményítőből, adonitból, cellobiózból, dulcinból, inulinból, melibiózból, melezitózból és raffinózból.
Egyik szacharidból sem képződik gáz.
(18) kazein hidrolízise: a mikroorganizmusokat kazein-agar szalag tenyészetben tenyésztettük (pH 7,4), amelyet úgy készítettünk, hogy húsleves-agarhoz fölözött tejet adtunk 5% koncentrációban, majd a keveréket megszilárdítottuk. 24 óra elteltével a kazein elemésztödótt és hidrolízise a tenyésztés 8. napján teljesen befejeződött.
(19) bibor pigment mérése a látható spektrumban: a húsleves-agar ferde tenyészetben tenyésztett bíbor sejteket etanollal extraháltuk, és meghatároztuk az extraktumok abszorpciós spektrumát a látható tartományban: abszorpciós maximum: 573 nm, abszorpciós minimum: 430 nm.
A pigmenteket 10%-os etanol-szulfátban oldva zöld színű oldat képződik, amelynek abszorpciós maximuma 693 nm. Ez azt mutatja, hogy a bibor pigment violacein pigment (lásd Bérgey's Manual of Determinative Bacterology, 8 kiadás, /p 354. oldal/).
összegezve a fentiekben felsorolt jellemzőket, azok azt mutatják, hogy a BMG361-CF4 Gram-negatív, fakultatíve anaerob baktérium, poláris és laterális flagellákkal. A kolóniák bibor pigmentet tartalmaznak, amelyekről a látható spektrumban végzett méréssel kimutattuk, hogy az violacein. A fenti tulajdonságok meghatározását a Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8. kiadás alapján végeztük, és az eredmények azt mutatják, hogy a BMG361-CF4 törzs a Chromobacterium nemhez tartozik. Ez a nem két fajt foglal magában, nevezetesen a C. violaceum-ot és a C. lividum-ot. A BMG361-CF4 törzs tulajdonságai nagyon hasonlóak a C. violaceum faj törzseihez. Pontosabban a BMG 361-CF4 törzs tisztán megkülönböztethető a C. lividumtól, 37°-os tenyésztési hőmérséklete, szacharidokból való savképzése (savat képez trehalózból, nem képez savat arabinózból és xilózból) kazein hidrolízise, stb. alapján. Ennek megfelelően a BMG361-CF4 törzset Chromobacterium violaceum BMG361-CF4 törzsként azonosítottuk.
A találmány szerinti eljárásnál az Arphamenine-termelő mikroorganizmusok tenyésztése során az ismert tápanyagokat alkalmazhatjuk. így például szénforrásként bármely kereskedelmi forgalomban beszerezhető szénforrás használható, igy például zsirok és szénhidrátok, mint glicerin, glükóz, laktóz, szacharóz, keményítő, mai tóz, vagy melasz. Nitrogénforrásként alkalmazhatunk peptont, hús-extraktumot, kukoricalekvárt, gyapotmag-lisztet, földimogyoró-lisztet, szójabablisztet, kukorica-sikér-lisztet, hal-liaztet, élesztó-extraktumot, N-Z-amint/ (gyártó: Wako, Osaka, Japán), kazeint, nátrium-nitrátot, ammónium-nitrátot és ammónium-szulfátot. Szervetlen tápforrásként nátrium-klorid4 foszfátokat,kalcium-karbonátot és magnéziumszulfátot. Ha szükséges nyomnyi mennyiségben más fémsók is alkalmazhatók.
A fenti anyagok bármelyikét a tenyésztés során addig alkalmazhatjuk, amig segítik és 5 nem gátolják az Arphamenine termelést.
A találmány szerinti eljárásnál bármely, a baktériumok tenyésztésénél alkalmazott Anyag használható. Különösen előnyős komponensei a tápközegnek szénforrásként a glicerin és 10 az oldható keményítő, nitrogénforrásként a szójabab-liszt, a hal-liszt és a kukorica-sikér-liszt.
A tápkőzeg tartalmazhat például 1,5% glicerint, 1,5% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, 15 (beszerezhető: Ajinomto, Daza Morotomitsu 453 Saga, Japán) 1,5% hal-lisztet és 0,2% kalcium-karbonátot. Egy másik összetétel szerint 3% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t,
1,2% gabona-sikér-lisztet és 0,2% kalcium- 20 -karbonátot.
A találmány szerinti eljárásnál előnyös a folyékony tápközeg, a nagyobb mennyiségű Arphamenine termelése érdekében. Á tenyésztés hőmérsékletét aszerint választjuk 25 meg, hogy az az Arphamenine termelést elősegítse. Előnyös a 25° és 35 °C közötti hőmérséklet. A tenyésztést általában addig végezzük, amig megfelelő mennyiségű anyag halmozódik fel a tápközegben. 30
A tenyésztést például a következők szerint végezzük: a 3% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, 1,2% kukorica-sikér-lisztet és 0,2% kalcium-karbonátot tartalmazó tápközeget sterilizáljuk, majd kacsnyi mennyiségű Arp- 35 hamenine-termelő mikroorganizmus ferde tenyészetével beoltjuk. A beoltást aerob körülmények között rázótenyészetben 27 °C-on végezzük. 8-52 óra elteltével az Arphamenine felhalmozódik. Az Arphamenine előállítását si- 40 kérésén végezhetjük rázótenyésztésen kívül tanktenyésztéssel is. Ebben az esetben például 300 liter tápközeget egy 570 literes fermentációs tartályba helyezzük, sterilizáljuk és a tenyésztést 190 fordulat/perc keverés 45 mellett 300 1/perc steril levegő adagolásával végezzük. Ilyen feltételek mellett az Arphamennine képződés 23 óra alatt éri el a maximumát.
A tenyésztés, valamint tisztítás során az 50 Arphamenine-t az amino-peptidáz B-vel szemben kifejtett inhibíciós hatásának mérésével határozzuk meg, V.K. Hoppusu, K.K. Makinen és G.G. Glenner (Archives of Biochemistry and Biophysics 114, (1966), 557) módosított 55 eljárása szerint, a következőképpen: 0,5 ml 0,1 mólos triez-hidroklorid pufferoldatot (pH 7,0) és 0,25 ml vizsgálandó anyagot tartalmazó oldatot 0,25 ml 0,002 mól töménységű arginin-0-naftilamidhoz adagolunk, majd a keve- 60 réket 37 °C-on 3 percig melegítjük. A meleg oldathoz 5 jul aminopeptizád B oldatot adunk, amelyet előzőleg a Hoppusu és mtsai. által leirt enzim-tisztitási módszer szerint DEAE-cellulózzal tisztítottunk. A keveréket 30 percen 65
át 37 °C-on hagyjuk állni, majd hozzáadunk 1 ml 1,0 mólos ecetsav-puffert (pH 4,2), amely még 1 mg/ml mennyiségben Fást Garnet GBC-t (o-amino-azotoluol diazoniumsó) és 10% mennyiségű Tween 20 felületaktív anyagot tartalmaz. Az igy kapott keveréket 15 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd megmérjük az abszorpcióját 525 nm-en (a). Egyidejűleg a vakpróba - Arphamenine-t nem tartalmazó pufferoldat - abszorpcióját is meghatározzuk, (b). Az aminopeptidáz B százalékos inhibicióját a((b-a)/b)xl00 egyenlet alapján határozzuk meg. Az előzőek szerint eljárva, 0,005 Mg/ml Arphamenie A és 0,002 Mg/ml Arphamenie B egyaránt az aminopeptidáz B hatásának 50%-os csökkenését okozza (ICso).
Az Arphamenine a tenyésztés után egyaránt megtalálható a tápközegben és az Arphamenine-termelő mikroorganizmus sejtjeiben. Az Arphamenine kinyerését jó hozammal végezhetjük, ha a tenyészet szúrletét egy adszorbensen adszorbeáljuk, majd arról leválasztjuk. Adszorbensként alkalmazhatunk például aktív szenet, Amberlite XAD-4 és Diaion HP-20 ioncserélő gyantákat, aluminium-oxidot vagy szilikagélt. Például Amberlite XAD-4 alkalmazásánál a következőképpen járunk el: egy megfelelő oszlopot megtöltünk Amberlite XAD-4 gyantával (mennyisége 1/10 a tenyészetszúrlet mennyiségére számítva), majd a tenyészet szűrletét átengedjük az oszlopon. Az adszorbeálódott anyag eltávolítására az oszlopot először vízzel mossuk, majd az eluálást 50%-os vizes acetonnal végezzük, amelynek mennyisége 2-4-szerese a gyanta menynyiségének. Az igy nyert eluátum a tenyészet szűrletében lévő Arphamenine mennyiségnek több mint 70%-át tartalmazza. Az eluátumot végül csökkentett nyomáson beszáritjuk, igy a nyers Arphamenine-t por formájában kapjuk.
Az ioncserélő gyantákkal végzett kromatografálást tisztítás céljára is felhasználhatjuk. Különösen a CM-Sephadex-en végzett kromatografálás hatásos, mivel ez lehetővé teszi az Arphamenine A és Arphamenine B elválasztását vizes nátrium-kloriddal végzett eluálással. Ha például az Amberlite XAD-4 gyantával adszorbeált és vizes acetonnal eluált anyagot CM-Sephadexen kromatografáljuk, majd az oszlopról az eluálást vizes sóoldattal, mint például nátrium-klorid-oldattal végezzük, külön öeszegyújthetők az Arphamenine A és Arphamenine B frakciók.
A találmány szerinti eljárással előállított anyag végsó tisztítását Sephadex LH-20-szal történő sótalanitással végezzük.
A találmány szerinti eljárással előállított Arphamenine-nek megvizsgáltuk a gyógyászati hatását, és azt találtuk, hogy erósiti a sejtközvetített immunitást és rákellenes hatása van.
A találmány szerint eljárással előállított Arphamenine A és B anyagokon végzett bio-49 lógiai vizsgálatokat a kővetkező példákban ismertetjük.
J. A sejtközvetltett immunitásra kifejtett hatás normál egereknél
Az Arphamenine A és B sejtközvetltett immunitásra kifejtett hatását a késletetett típusú hiperszenzibilitás (delayed-type hypersensitivity, DTH) meghatározásával vizsgáltuk. Ezt birka vörösvérsejtek (shelp red blood cells, SRBC) mint antigének, egerek lábába való beoltásával idéztük elő. (Lásd J. Exp. Med. 139, /1974/, 1529-1539).
0,05 ml fiziológiás sóoldatban 10® SRBC-t (beszerezhetők: Charles River Japan Inc., Kanagana, Japán) szuszpendáltunk és szubkután, 8 hetes nőstény CDPi egerek) egyik lábába injekcióztuk. Ezzel egyidejűleg vizes
1.
oldat formájában 5, 0,5, 0,05 vagy
0,005 mg/kg mennyiségű adagokban Arphamenine A-t vagy B-t adagoltunk orálisan a kísérleti állatoknak. 4 nap elteltével 0,05 ml 5 fiziológiás sóoldatban szuszpendált 108 SRBC-t injekcióztunk az egerek másik lábába másodlagos szenzitizálás előidézésére. 24 óra után mérőkörzővel megmértük az állatok mancsain jelentkező duzzanatot (a mancsok megvastagodását). A kontroll állatoknak szubkután SRBC fiziológiás sóoldattal készült szuszpenzióját adagoltuk, de nem adtunk vizsgálandó anyagot. Ezeknél az állatoknál mért duzzanat értékét 100%-nak vettük. A sejtközvetített immunitást fokozó hatás jnegállapitására a kezelt állatoknál mért duzzanot értékét viszonyítottuk a kontroll állatoknál mért duzzanat értékéhez. (100%). A kapott eredményeket a kővetkező 1. és 2. táblázat20 bán foglaljuk össze.
Táblázat
| Vizsgált vegyűlet | Adag (mg/kg) | Mancsok megnövekedett vastagsága (x 0,1 mm) | Kontrolihoz viszonyított arány (%) |
| Arphamenine A | 5 | 10.4i0.77 | 125 |
| u.a. | 0.5 | 11.511.29 | 139 |
| u.a. | 0.05 | 13.0i0.97 | 157 |
| u.a | 0.005 | 11.911.00 | 143 |
| Bestatin* | 0.5 | 12.511.24 | 151 |
| Kontroll | 8.310.97 | 100 |
* összehasonlító vegyűlet
2. Táblázat
| Vizsgált vegyűlet | Adag (mg/kg) | Mancsok megnövekedett vastagsága (x 0,1 mm) | Kontrolihoz viszonyított arány (X) |
| Arphamenine B | 5 | 13.7il.77 | 157 |
| u.a. | 0.5 | 14.7+1.74 | 169 |
| u.a. | 0.05 | 14.0ll.33 | 161 |
| u.a. | 0.005 | 12.411.40 | 143 |
| Bestatin* | 0.5 | 13.0il.13 | 149 |
| Kontroll | 8.7+1.48 | 100 i |
* összehasonlító vegyűlet
2. Sejtközvetített immunitásra kifejtett hatás rákos egereknél (1) SRBC alkalmazása mint antigén
Az egerek talpán lévő duzzanatok vizsgálaténál az 1. példánál leírtak szerint jártunk el, kivéve, hogy az CDFi egereknek intraperitoneálisan 10® mennyiségű Ascites Sarcoma 180 tumor sejtet adagoltunk és az Arphame65 nine A-t az SRBC-vel történt szenzitizálás
-5geztünk.
Az eredményeket a következő 3. táblázatban foglaltuk össze.
napjával kezdődően négy napon keresztül, naponta egy alkalommal intraperitoneálisan adagoltuk, majd két nappal később újabb adag SRBC-vel másodlagos szenzitizálást vé3. Táblázat
| Vizsgált vegyület | Adag (mg/kg) | Mancsok megnövekedett vastagsága (x 0,1 mm) | Kontrolihoz viszonyított arány (%) |
| Arphamenine A | 5 | 5.8±1.19 | 129 |
| u.a. | 0.5 | 6.7H.03 | 149 |
| u.a. | 0.05 | 6.5H.29 | 144 |
| u.a. | 0.005 | 5.910.79 | 131 |
| Bestatin* | 5 | 6.0±0.96 | 133 |
| Kontroll | 4.510.74 | 100 |
* összehasonlító vegyület (2) Pikril-klorid alkalmazása mint antigén Aecitee Sarcoma 180 sejtekkel fertőzött egereknél az Arphamenine A sejtközvetitett immunitásra kifejtett hatását a pikril-kloriddal előidézett DTH meghatározásával, a következőképpen végeztük.
10* db Ascites Sarcoma 180 sejtet intraperitoneálisan tranezplantáltunk 12 hetes nőstény CDFi egerekbe (6 egér/csoport). A transzplantáció napját o-val jelöltük. Ezután az 1. napon az állatok hasán 25X15 mm-es leborotvált területet 0,6 ml 6%/os etanolos pikril-klorid oldattal átitatott 20x20 x 2 mm-es pamut-darabbal szenzitizáltunk, majd a 8. napon mérőórával megmértük az állatok mindkét fülcimpájának vastagságát (a). Ezután 1%-os oliva-olajos pikrin-klorid-oldattal átitatott 10x4x1 mm-es pamutdarabbal az állatok mindkét fülét szenzitizáltuk majd a 9. napon mérőórával mértük a duzzanatot (b). Ily módon a kontroll állatok füleinek vastagodását a két érték különbsége (b-a) alapján határoztuk meg.
A fenti eljáráshoz hasonlóan határoztuk meg a fülvastagodást a 0,5, 0,05 vagy
0,005 mg/kg mennyiségű fiziológiás sóoldatban oldott vizsgálandó anyaggal kezelt álla3θ toknál is. Az anyagot orálisan adagoltuk, naponta 6 alkalommal az 1-8. napokon. A 9. napon a szenzitizálást is a fentiek szerint végeztük. A kezelt állatok fülvastagodását a(b’-a') összefüggés alapján határoztuk meg.
A kezelt és kontroll állatoknál mért érté(b‘-a’) keket a — —— x 100 összefüggés (b-a) alapján egymáshoz viszonyítva (a kontroll állatoknál mért értékeket 100%-nak véve), a vizsgált anyagnak a sejtközvetitett immunitásra kifejtett hatásét jellemző számot kaptunk. Az eredményeket a következő 4. táblá45 zatban foglaltuk össze.
4. Táblázat
| - | Vizsgált vegyület | Adag (mg/kg) | Fülek megnövekedett vastagsága (x 0,1 mm) | Kontrolihoz viszonyított arány (%) |
| • | Arphamenine A | 0.5 | 6.05+0.97 | 136.0 |
| u.a. | 0.05 | 7.4010.72* | 166.3 | |
| u.a. | 0.005 | 6.4010.63 | 143.8 | |
| < | Kontroll** | 4.4512.36 | 100.0 |
* p<0,05 ** Fiziológiás sóoldat
-613
A
A fenti eredményekből kitűnik, hogy 0,05 mg/kg Arphamenine A adagolásával jelentős sejtközvetitett immunitást növelő hatást értkünk el.
3. Arphamenine rákellenes hatásának vizsgálata
Ehrlich tumor esetén
10® db Ehrlich ascitea carcinoma tumor sejtet szubkután 8 hetes, nőstény ddY egerek (Charles River Inc., Japán) farába tranezplantáltunk. A transzplantáció napját. (15 o-val jelöltük. Ezt követően 0,05, 0,005 mg/kg fiziológiás sóoldatban oldott vizsgálandó anyagot adagoltunk orálisan az állatoknak, az adagolást minden második pon, az 1. nappal kezdődően a 15. napig gezve. A 30. napon meghatároztuk a daga tok nagyságát (kisebb átmérő2 χ nagy<
átmérő/2) és súlyát. A daganat-gátló hat (tumor inhibition rate, TIR) százalékosan kővetkező összefüggéssel számítottuk ki:
C-T
TIR%=- x 100
C amelyben C a kontroll állatok daganataid súlyát és méretét, T a kezelt állatok dagant tainak súlyát és méretét jelenti.
A vizsgálati eredményeket a következő í táblázatban foglaltuk össze.
5. Táblázat
| Vizsgált vegyület | Adag (mg/kg) | Daganat átlagos mérete (mm3) | TIR (X) | Daganat átlagos súlya (g) | TIR (X) |
| Arphamenine A | 0.5 | 446714311 | 15.8 | 2.6211.90 | 1.9 |
| U.éU | 0.05 | 312013584 | 41.2 | 1.66H.50 | 37.8 |
| u.a. | 0.005 | 237813138 | 55.2 | 1.62H.44 | 39.3 |
| Bestatin | 0.05 | 208911948* | 60.6 | 1.4710.92** | 44.9 |
| (összehasonlító | |||||
| vegyület) | |||||
| Kontroll | - | 530512027 | 0 | 2.6710.84 | 0 |
* P 0,1 (T-teszt) ** P 0,05 (T-teszt)
A fenti eredmények azt mutatják, hogy az Arphamenine A 0,05 és 0,005 mg/kg dózisnál gazdaközvetitett antitumor hatást mutat.
Ily módon az Arphamenine A-ról és B-ről bizonyítható, hogy sejtközvetitett immunitást fokozó hatásuk van normál állatoknál, befolyásolják a rákos daganatok által elnyomott sejtközvetitett immunitást és gazdaközvetitett antitumor hatásúak.
Egereken végzett akut mérgezőhatás vizsgálataink azt mutatták, hogy az Arphamenine A 250 mg/kg iv dózisban, és az Arphamenine B 150 mg/kg iv dózisban nem halálos, Így mindkettő veszélytelen anyagnak tekinthető.
Mint a fentiekből kitűnik, az Arphamenine A és B önmagában adagolva fokozza az immunitást és gazdaközvetitett antitumor hatású, így e vegyületek alkalmasak iramunopofcenciálö és rákkal szembeni immunitást befolyásoló hatás kifejtésére, vagy alkalmasak rákos betegségeknél alkalmazott különböző kemoterápiás szerek hatásának fokozására.
Az Arphamenine-t hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállításánál az Arphamenine A-t vagy B-t vagy mindkettőt, vagy gyógyászatilag elfogadható sóit a szokásos hordozóanyagokkal és kívánt esetben további különböző kemoterápiás szerekkel keverjük össze. Az Arphamenine sói alatt értjük az Arphamenine-karboxilátokat, azaz azokat a sókat, amelyeket az Arphamenine karboxilcsoportja gyógyászatilag elfogadható kationokkal, mint például ammóniumionokkal vagy alkálifém-ionokkal, mint például nátrium- vagy káliumionokkal, vagy alkálíföldfém-ionokkal, mint például kalcium- vagy magnéziumionokkal képez, valamint a savaddiciós sókat, amelyek az Arphamenine guanidilvagy aminocsoportja és gyógyászatilag elfogadható szervetlen - mint például sósav vagy szerves - mint például ecetsav - savak között képződnek.
A találmány szerint előállított vegyületeket vagy készítményeket orális-, injekciózható- vagy végbélkúp-készítmények formájában alkalmazhatjuk.
A liofilizált injekciók készítésénél a hatóanyagot ρΗ-beállitó-, puffer-, stabilízálóvagy kötőanyagokkal keverjük el, majd a keveréket ismert módon fagyasztva szárítjuk. Szubkután-, intramuszkuláris- vagy intravé8
-715 nás injekciók készítésénél a hatóanyagot pH-beállitó-, puffer-, stabilizáló-, izotoniásvagy helyi érzéstelenltó-anyagokkal keverjük el, majd a továbbiakban az ismert módszerek szerint járunk el.
Orális készítmények előállításánál a hatóanyagokhoz kötőanyagot és kívánt esetben dezintegráló-, Íz- és szagjavitó anyagokat adagolunk, majd a keveréket ismert módon tablettákká, bevonatos tablettákká, granulá- 10 tumokká, porokká vagy kapszulákká alakítjuk.
Orális adagolású folyadék-készítmények előállításánál a hatóanyaghoz iz- és szagjavitó-, puffer- és etabilizáló-anyagokat adagolunk, majd a keveréket ismert módon szirup vagy száraz szirup készítménnyé alakítjuk.
Végbélkúpok készítésénél a hatóanyagot kötőanyagokkal és kívánt esetben felületaktív anyagokkal elkeverve, iemert módon alakítjuk kúpkészitményekké.
Az Arphamenine dózisa a szimptomáktól függően változhat, felnőtt adagja általában 0,02-200 mg naponta. Ha más rákellenes vagy immunitást fokozó kemoterápiás szerrel együttesen kerül alkalmazásra, az Arphamenine-t a fenti mennyiségben kombináljuk az emlitett gyógyszerekre szokásosan előirt mennyiséggel.
A találmány szerinti eljárást a kővetkező példákban részletesen ismertetjük, anélkül, hogy azt azokra korlátoznánk, mivel a példák alapján világosan ismertetett előállítási és tisztítási eljárások bárki számára lehetővé tennék az eljárás módosítását.
1. példa
Az Arphamenine-termeló Chromobacterium violaceum BMG361-CF4 mikroorganizmus (régi deponálási szám FERM-p-6521, új deponálási szám: FERM-BP 286, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan) ferdetenyészetből kacsnyi mennyiséggel beoltjuk a 3% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, 1,2% kukorica-6Íkér-lisztet és 0,2% kalcium-karbonátot tartalmazó tápközeget, majd azt 120 °C hőmérsékleten 20 percig sterilizáljuk és 110 ml-es mennyiségét 500 ml-es rázó lombikba helyezzük. A tenyésztést 27 °C hőmérsékleten 180 percenkénti fordulat mellett végezzük, figyelve a. képződő Arphamenine mennyiségét. Az Arphamenine-hozam 32 óra elteltével maximális. 36 óra után az Arphamenine koncentráció csökken (anti-aminopeptidáz B hatás alapján meghatározva).
A tenyésztés alatt a tápközeg pH-értéke induláskor 7,4, 8 óra elteltével 7,8, 16 óra elteltével 7,6, 24 óra elteltével 7,85, 32 óra elteltével 8,1, 36 óra elteltével 8,1 és 52 óra elteltével 8,45.
2. példa
A Chromobacterium violaceum BMG361-CF4 törzset az 1. példánál leirt tápközegben és az ott ismertetett módon tenyésztjük, majd 9,5 1 tenyészet pH-ját sósavval 2-es értékre beállítjuk, és leszívatással szűrjük (Hyflo Super Cell-en). Ily módon 9 liter szűrletet kapunk, amelynek amínopeptidáz B-gátló hatása (ICso): 0,05 pl/ml.
3. példa
A 2. példa szerint nyert 9 liter tenyészetszűrlet pH értékét 5-re állítjuk be nátrium-hidroxid segítségével, majd 1 literes Amberlite XAD-4 töltetű oszlopon kromatografáljuk. Utána az oszlopot először vízzel mossuk,
2θ majd 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. A 2,3 liter aktív frakciót betöményítjük, csökkentett nyomáson szárítjuk. Ily módon 19,6 g nyers por-terméket kapunk, amelynek aminopeptidáz B-gátló hatása 0,2 pg/ml. Ezután a
2® port megfelelő mennyiségű 0,05 mólos vizes nátrium-klorid oldatban oldjuk és 500 ml CM-Sephadex c-25-οη kromatografáljuk. Ezután adszorbenst 1,5 liter 0,05 mólos nátrium-klo_ rid oldattal és 1 liter 0,05 mólos citrát-pufferral (4,5 pH-ás) átmossuk, majd 2,5 liter fenti puffer-oldattal valamint 2,5 liter 0,55 mólnyi nátrium-kloridot is tartalmazó fenti puffer-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 18 ml-es frakciókban gyűjtjük. Az Arphamenine
A-t a 39-59. frakciók, az Arphamenine B-t a 60-89. frakciók tartalmazzák. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, Amberlite XAD-4-gyel sótalanitjuk, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon az Arphamenine A frakciókból 188 mg nyers Arphamenine A port nyerünk, amelynek amínopeptidáz B-gátló hatása ICso: 0,0065 pg/ml. Az Arphamenine B frakciókból 79 mg Arphamenine B por nyerhető, aminopeptidáz B-gátló hatása 0,0023 pg/ml.
4. példa
A 3. példa szerint előállított Arphamenine
A port megfelelő mennyiségű 0,05 mólos vizes nátrium-klorid oldatban oldjuk és pH értékét 1 n sósavval 2,3-ra állítjuk be. Ezután az oldatot 80 ml-es CM-Sephadex C-25 töltetű oszlopon kromatografáljuk, majd 100 ml 0,07 mólos vizes nátrium-klorid oldattal átmossuk. Az eluálást 300 ml 0,07 mólos vizes nátrium-klorid oldattal átmossuk. Az eluálást 300 ml 0,07 mólos és 300 ml 0,5 mólos nátrium-klorid oldattal végezzük. Az eluátumot 8 ml-es θθ frakciókban gyűjtjük. Az Arphamenine A-t a 11-34. frakciók tartalmazzák. A 11-30. frakciókat összegyűjtjük, és pH értékét 1 n sósav oldattal 2,3-ra állítjuk be. Az így nyert anyagot Sephadex LH-20 töltetű 500 ml-es oszlopon kromatografáljuk, majd vízzel eluál9
-817 juk. Az igy sótalanitott Arphamenine oldat pH-ját Dowex WGR-rel 5-öe értékre állítjuk be, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon 94 mg Arphamenine A-t nyerünk fehér por formájában, aminopeptidáz B-gátló hatása, ICso: 0,0054 ug/ml.
5. példa
A 3. példa szerint előállított Arphamenine B anyagból 79 mg-ot megfelelő mennyiségű 0,05 mólos vizes nátrium-klorid oldatban oldunk, pH-ját 1 n sósavval 2,3-ra állítjuk be, majd CM-Sephadex C-25 töltetű oszlopon kromatografáljuk és végül 100 ml 0,15 mólos vizes nátrium-klorid oldattal átmossuk. Az eluálást 350 ml 0,15 mólos nátrium-klorid oldattal és 350 ml 0,6 mólos nátrium-klorid oldattal végezzük. Az eluálásnál 11 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az Arphamenine B-t a 17-30. frakciók tartalmazzák. Ezeket a frakciókat összegyűjtjük, Sephadex LH-20 töltetű oszlopon sótalanitjuk, az eluálást 0,01 n sósav oldattal végezve. A tisztított Arphamenine B frakciókat tartalmazó oldat pH-ját Dowex WGR-rel 5-re állítjuk be, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon 32 mg Arphamenine B-t nyerünk fehér por formájában, aminopeptidáz B-gátló hatása, ICso: 0,0020 ug/ml.
6, példa
500 ml-es Sakaguchi edénybe 80 ml 1,5% glicerint, 1,5% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, 1,5% hallisztet, 0,2% kalcium-karbonátot és 0,05% habzásgátló (KM-72) anyagot (gyártó: Shinetsu Kagaku, Tokió, Japán) tartalmazó tápközeget helyezünk, majd 120 °C-on 15 percig sterilizáljuk. Ezután lehűtjük, és kacsnyi mennyiségű Chromobacterium violaceura (régi deponálási szám FERM-P 6521, új deponálási szám: FERM-BP-286, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan) ferdetenyészettel beoltjuk. A primer oltóanyag előállítása érdekében a rázótenyésztést 28 °C hőmérsékleten 24 órán át végezzük, percenként 135 rázással.
100 literes tartályba 50 liter, 1,5% glicerint, 1,5% oldható keményítőt, 0,5 Prorich-t, 1,74% bonito extraktumot, (beszerezhető: Yaizo Suisan Kagaku, Shizuoka, Japán) 0,2% kalcium-karbonátot és 0,05% habzásgátló anyagot (KM-72) tartalmazó tápközeget helyezünk, 120 °C-on 30 percig sterilizáljuk, lehűtjük, majd 80 ml fenti primer oltóanyaggal beoltjuk. A beoltott tápközeget 24 órán át 28 °C-on tenyésztjük, 200 fordulat/perc forgatás és 50 liter/perc steril levegő adagolása mellett. Ily módon nyerjük a szekunder oltóanyagot.
300 liter 3% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, 1,2% kukorica-sikér-lisztet, 0,2% kalcium-karbonátot és 0,05% habzásgátló anyagot (KM-72) tartalmazó tápközeget 570 literes tankba helyezünk, 120 °C hőmérsékleten 30 percig sterilizáljuk, lehűtjük, majd 6 liter fenti szekunder oltóanyaggal beoltjuk és a tenyésztést 28 °C hőmérsékleten 24 órán át 19Ó fordulat/ percnél végezzük. A tenyésztés után a tenyészet pH-ját kénsavval 2-es értékre állítjuk be, és leszívatással (Hyflo-Super Cell-en) leszűrjük. A szűrlet pH-ját nátrium-hidroxiddal 6-ra állítjuk be, majd ismét szűrjük. Az Így kapott szűrletet aminopeptidáz B-gátló hatása, ICso: 0,17 ug/ml.
185 liter fenti szűrlethez 10 liter aktív szenet (kromatográfiás tisztaságú) adunk, az anyagot 2 órán át keverjük, majd az aktív szenet leszűrjük (200 mesh lyukbőségű szitán). Az aktív szenet ezután 50 liter vízzel mossuk, majd hozzáadunk 80 liter sósavval 2-es ρΗ-ra beállított 50%-os vizes aceton oldatot. A keveréket 2 órán át keverés közben extraháljuk, majd az aktív szenet centrifugálással eltávolítjuk, és az extraktumot 3,54 literre töményítjük. Az igy nyert anyag arainopeptidáz B-gátló hatása,
ICso: 0,0063 ul/mg.
7. példa
A 6. példa szerint előállított 3,54 liter mennyiségű koncentrátumot 2 n nátrium-hidroxiddal semlegesítve 5,35 literre egészítjük ki. Ezt a folyadékot ezután 1,7 literes Amberlite XAD-4 töltetű oszlopon engedjük át, az oszlopot vízzel mossuk és 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. A 7 literes aktív frakciót csökkentett nyomáson 280 ml-re töményitjük be (aminopeptidáz B-gátló hatása, ICm: 0,01 ul/mg), majd a koncentrátumot 1,7 literes CM-Sephadex töltetű oszlopon kromatografáljuk, 6 liter 0,05 mólos vizes nátrium-klorid oldattal, majd 2 liter 0,05 mólos citrát pufferrel (pH=4,5) mossuk. Ezután az oszlop eluálását 6 liter fenti puffer oldattal és 6 liter 0,6 mól nátrium-kloridot is tartalmazó fenti puffer oldattal végezzük. Az eluátumot 200 ml-es frakciókban gyűjtjük. Az Arphamenine A-t a 30-39. frakciók, az Arphamenine B-t a 42-52. frakciók tartalmazzák. Az egyes frakciókat összegyűjtve ée Amberlite XAD-4-gyel sótalanitva, 85 ml Arphamenine A-t (ICso: 0,00058 ul/ml) és .43 ml Arphamenine B-t nyerünk (ICso: 0,00031 ug/ml).
8, példa ml 7. példa ezerint előállított Arphamenine A frakciót 240 ml-es Biogel P-2 töltetű (gyártó Bio-Rád) oszlopon kromatografalunk. Az oszlopot ezután 2 liter vízzel mossuk, majd 1 liter 20%-os vizes metanollal, majd ezt követően 0,005 mólos vizes nátrium10
-klorid oldattal eluáljuk. Az eluátumot 18 ml-ee frakciókban gyűjtjük, az Arphamenine B-t a 6-25. frakciók tartalmazzák. Ezeket a frakciókat összegyűjtjük, betöményítjük, Amberlite XAD-4-gyel eótalanitjuk ás fagyasztva ® szárítjuk. Ily módon 1,89 g Arphamenine B-t nyerünk könnyű sárgás színű por formájában (ICso: 0,019 jug/ml).
9. példa ml 7. példa szerint előállított Arphamenine B frakciót 240 ml-es Biogel P-2 (Bio-Rad gyárt.) töltetű oszlopon kromatogra- 15 faljuk. Az oszlopot ezután 1 liter 20%-os vizes metanol oldattal átmossuk, majd 0,005 mólos vizes nátrium-klorid oldattal eluáljuk.
Az eluátumot 18 ml-es frakciókban gyűjtjük, az Arphamenine B-t a 6-25. frakciók tártál- 20 mázzák. Ezeket összegyűjtjük, betöményítjük, Amberlite XAD-4-gyel eótalanitjuk, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon 1,89 g Arphamenine B-t nyerünk sárga könnyű por formájában, ICso: 0,019 jug/ml. 25
10. példa
5,6 g Arphamenin A-hidroklorid sóját 30 ezulfát-tipuBÚ Bowex 1x2 töltetű oszlopon kromatografáljuk az eluálást vízzel végezve.
Az aktív frakciókat egyesítjük és liofilizálás után 5,3 g Arphamenine A-szulfátot nyerünk. ICso: 0,025 jul/mg. 35
11. példa
Tablettakészitmény előállítása 40
Összetétel:
Arphamenine A vagy B 100 mg Laktóz 68.8 mg
Kukoricakeményitó 20 mg
Poli(vinil-pirrolidon) 8.0 mg
Magnézium-sztearát 1.15 mg
Talkum 2.0 mg
Pigment 0.05 mg
A fenti komponenseket összekeverjük és is20 mert módon tablettákká alakítjuk.
12. példa
Injekciókészítmény előállítása összetétel:
Arphamenine A vagy B (sterilizált) 30 mg Nétrium-hidrogén-foszfát (vízmentes)
Nátrium-dihidrogén-foszfét (vízmentes)
Nátrium-klorid Sterilizált viz
7.05 mg
6.0 mg
5.1 mg -1.5 ml-ig
Claims (5)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás az (I) általánoe képletű vegyületek - a képletben R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport - és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy Chromobacterium violaceum fajhoz tartozó mikroorganizmus törzset ismert tápanyagok jelenlétében tenyésztünk, és a képződött (I) általános képletű vegyületet a tápközegból kinyerjük és kívánt esetben sóvá alakítjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az új Chromobacterium violaceum mikroorganizmus törzset (deponálási szám: FERM BP-286) használjuk.
- 3. Az 1-2. igénypontok szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy folyékony tápközeget használunk, és az (I, általános képletű vegyületet - a képletben R jelentése az 1. igénypont szerinti - a tenyészetszűrletből ismert anyagokon való adszorbeálás és ezt követő elválasztás útján nyerjük ki.
- 4. Eljárás gyógyászati, elsősorban sejtközvetitett immunitást fokozó és rákellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1-2. igénypontok szerinti eljárással előállított vegyületet - a képletben R jelentése az 1. igénypont szerinti - gyógyszerészeti célra alkalmas hordozóanyaggal és/vagy segédanyaggal keverünk össze és a. keveréket előnyösen gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
- 5 rajzA kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója88.547.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató li-10191849Nemzetközi osztályozás:C 12 P 13/04HoM XNHYNHI ch2 ch2
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57096276A JPS58212791A (ja) | 1982-06-07 | 1982-06-07 | 新生理活性物質アルフアメニン及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU191849B true HU191849B (en) | 1987-04-28 |
Family
ID=14160605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU832020A HU191849B (en) | 1982-06-07 | 1983-06-06 | Process for preparing compounds with pharmaceutical activity and compositions containing such compounds by means of a new chromobacterium violaceum strain |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4595698A (hu) |
| EP (1) | EP0096356B1 (hu) |
| JP (1) | JPS58212791A (hu) |
| KR (1) | KR900008247B1 (hu) |
| AT (1) | ATE37393T1 (hu) |
| CA (1) | CA1201992A (hu) |
| DE (1) | DE3378058D1 (hu) |
| DK (1) | DK257083A (hu) |
| ES (1) | ES8503029A1 (hu) |
| FI (1) | FI71765C (hu) |
| HU (1) | HU191849B (hu) |
| NO (1) | NO165200C (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS606647A (ja) * | 1983-06-17 | 1985-01-14 | Microbial Chem Res Found | アルフアメニン及びその関連化合物と合成法 |
| JPS6034190A (ja) * | 1983-08-05 | 1985-02-21 | Microbial Chem Res Found | アルフアメニンの高収率製造法 |
| JPS61204170A (ja) * | 1984-09-03 | 1986-09-10 | Microbial Chem Res Found | アルフアメニン関連化合物と免疫賦活剤 |
| JPH05279374A (ja) * | 1992-03-31 | 1993-10-26 | Sawao Murao | スイダトレスチン及びその製造方法 |
| JPH06247964A (ja) * | 1993-02-22 | 1994-09-06 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 新規生理活性物質ｈｓ−１及びその製造方法 |
| US8883461B2 (en) | 2010-03-12 | 2014-11-11 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for the production of violacein and its derivative deoxyviolacein containing bioactive pigment from Chromobacterium sp. (MTCC5522) |
| CN112430633B (zh) * | 2020-11-02 | 2023-05-09 | 新疆阜丰生物科技有限公司 | 一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3824267A (en) * | 1971-08-19 | 1974-07-16 | Ono Pharmaceutical Co | Thiolesters of guanidino organic acids |
| DE2359544A1 (de) * | 1973-11-29 | 1975-10-30 | Hoechst Ag | Cephemderivate und verfahren zu ihrer herstellung |
| US3994965A (en) * | 1974-08-09 | 1976-11-30 | Pfizer Inc. | D-N-(guanylureidoacetyl)-α-aminophenyl acetic acid and D-N-(guanylureidoacetyl)-α-aminophenyl acetyl chloride |
| US4105789A (en) * | 1976-05-10 | 1978-08-08 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Carboxyalkylacylamino acids |
| JPS6026099B2 (ja) * | 1977-09-21 | 1985-06-21 | 財団法人微生物化学研究会 | ペプチド、その酸附加塩およびその製造法 |
| JPS5832592B2 (ja) * | 1979-01-31 | 1983-07-14 | 財団法人微生物化学研究会 | 新抗生物質バクトロポンおよびその製造法 |
-
1982
- 1982-06-07 JP JP57096276A patent/JPS58212791A/ja active Granted
-
1983
- 1983-06-01 AT AT83105416T patent/ATE37393T1/de active
- 1983-06-01 EP EP83105416A patent/EP0096356B1/en not_active Expired
- 1983-06-01 DE DE8383105416T patent/DE3378058D1/de not_active Expired
- 1983-06-02 US US06/500,396 patent/US4595698A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-06-02 KR KR1019830002470A patent/KR900008247B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-06-02 CA CA000429549A patent/CA1201992A/en not_active Expired
- 1983-06-03 FI FI832007A patent/FI71765C/fi not_active IP Right Cessation
- 1983-06-06 HU HU832020A patent/HU191849B/hu unknown
- 1983-06-06 ES ES523022A patent/ES8503029A1/es not_active Expired
- 1983-06-06 NO NO832046A patent/NO165200C/no unknown
- 1983-06-06 DK DK257083A patent/DK257083A/da not_active Application Discontinuation
-
1985
- 1985-12-16 US US06/809,215 patent/US4859593A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR840005169A (ko) | 1984-11-05 |
| NO165200C (no) | 1991-01-16 |
| JPH022593B2 (hu) | 1990-01-18 |
| KR900008247B1 (ko) | 1990-11-06 |
| DK257083D0 (da) | 1983-06-06 |
| FI832007L (fi) | 1983-12-08 |
| US4595698A (en) | 1986-06-17 |
| ES523022A0 (es) | 1985-02-01 |
| DK257083A (da) | 1983-12-08 |
| NO165200B (no) | 1990-10-01 |
| FI832007A0 (fi) | 1983-06-03 |
| ATE37393T1 (de) | 1988-10-15 |
| FI71765B (fi) | 1986-10-31 |
| DE3378058D1 (en) | 1988-10-27 |
| EP0096356B1 (en) | 1988-09-21 |
| EP0096356A3 (en) | 1985-06-12 |
| JPS58212791A (ja) | 1983-12-10 |
| EP0096356A2 (en) | 1983-12-21 |
| FI71765C (fi) | 1987-02-09 |
| CA1201992A (en) | 1986-03-18 |
| NO832046L (no) | 1983-12-08 |
| US4859593A (en) | 1989-08-22 |
| ES8503029A1 (es) | 1985-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2310400C (en) | Novel physiologically active substance sulphostin, process for producing the same, and use thereof | |
| EP0182315B1 (en) | Novel antibiotic nk84-0218 pharmaceutical compositions containing it and process for the production of the same | |
| DK170029B1 (da) | Benanomicinforbindelser og salte og estere deraf, fremgangsmåder til fremstilling deraf, antifungale midler med indhold deraf samt deres anvendelse til fremstilling af farmaceutiske præparater | |
| CA1153966A (en) | Physiologically active substance, ebelactone and production thereof | |
| CA2022609A1 (en) | Bu-4061t | |
| KR870001373B1 (ko) | 항생물질 BMG 162-aF2의 제조방법 | |
| HU191849B (en) | Process for preparing compounds with pharmaceutical activity and compositions containing such compounds by means of a new chromobacterium violaceum strain | |
| KR950005134B1 (ko) | 펩타이드 항생제 | |
| KR840001258B1 (ko) | 신항생물질 mf 266 물질의 제조방법 | |
| KR920001448B1 (ko) | Bbm-2478 항생제 착화합물 | |
| RU2134694C1 (ru) | Аминоолигосахарид ск-4416, способ его получения, ингибитор сахаридгидролазы и антибактериальный агент | |
| JPH03141290A (ja) | 抗腫瘍抗生物質ｂｍｙ―４１３３９ | |
| KR830002817B1 (ko) | 생물학적으로 활성인 fr-900156물질의 제조방법 | |
| JPS6212227B2 (hu) | ||
| US4916063A (en) | BU-2867T peptide antibiotics | |
| JPH0358342B2 (hu) | ||
| JPH01240196A (ja) | 新規グリコペプチド系抗生物質ｐａ−４５０５２ | |
| JPS63101336A (ja) | 新規物質ｄｃ―１０２ | |
| JPS6054690A (ja) | 抗生物質ＬＬ−Ｄ０５１３９β | |
| EP0385594B1 (en) | Acidic polycyclic ether antibiotic | |
| KR830001068B1 (ko) | 아미노당 유도체의 제조방법 | |
| JPS62201900A (ja) | ストレプトグラミン型の新規抗生物質およびその微生物学的製法 | |
| JPS5925366A (ja) | 新生理活性物質ジプロチン及びその製造法 | |
| JPH02142799A (ja) | 新規なグリコペプチド抗生物質のデカプラニン | |
| JPH07242688A (ja) | 新規生理活性物質ｎｋ１４８１９８ａ及びｎｋ１４８１９８ｂ、その製造法及びその用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 |