KR830001068B1 - 아미노당 유도체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

아미노당 유도체의 제조방법

제1도 : 트레스타틴 A의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 중에서).

제2도 : 트레스타틴 B의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 중에서).

제3도 : 트레스타틴 C의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 중에서).

제4도 : 트레스타틴 A의¹HNMR 스펙트럼. (D₂O 중에서, 100㎒).

제5도 : 트레스타틴 B의¹HNMR 스펙트럼 (D₂O 중에서, 100㎒).

제6도 : 트레스타틴 C의¹HNMR 스펙트럼 (D₂O 중에서, 100㎒).

제7도 : 트레스타틴 A, B 및 C 각각의 고속액체 크로마토그라피 결과.

제8도 : 트레스타틴 A 및 B의 구조.

본 발명은 공통 구조 성분으로 트레할로즈를 함유하는 신규의 아미노당 유도체인 트레스타틴 및 그염의 제조방법에 관한 것으로 트레스타틴 또는 그 염을 한가지 이상 함유하고 있는 아밀라제 억제 작용을 갖는 조성물에도 관한 것이다.

특히, 본 발명은 트레스타틴 A, B 및 C와 이들의 염 및 이들의 혼합물, 그리고 이들중의 적어도 하나의 물질을 함유하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 트레스타틴 A, 트레스타틴 B 및 트레스타틴 C는 염기성의 백색분말로서 다음의 물리화학적 성질을 갖는다:

a) 원소분석 :

b) 분자량(삼투압 분석법) :

트레스타틴 A : 1470 트레스타틴 C : 1890

트레스타틴 B : 975

c) 융점 :

트레스타틴 A : 221 내지 232℃(분해)

트레스타틴 B : 209 내지 219℃(분해)

트레스타틴 C : 230 내지 237℃(분해)

d) 비선광도 :

트레스타틴 A : [α^D ₂₄=+177°(C=1.0, H₂O)

트레스타틴 B : [α^D ₂₆=+187°(C=1.0, H₂O)

트레스타틴 C : [α₂₃ ^D=+169.5°(C=1.0, H₂O)

e) 자외선 흡수 스펙트럼(물 중에서) :

트레스타틴 A, B 및 C는 각각 말단 흡수를 보여준다.

f ) 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 중에서) :

트레스타틴 A : 제1도 트레스타틴 C : 제3도

트레스타틴 B : 제2도

g )¹H NMR 스펙트럼(100㎒에서, D₂O 중에서)

트레스타틴 A : 제4도 트레스타틴 C : 제6도

트레스타틴 B : 제5도

h ) 용매에 대한 용해도 :

트레스타틴 A, B 및 C와 이들의 염산염은 물에 이용성이며 ; 디메틸설폭사이드에 가용성이며 ; 에탄올 및 아세톤에는 약간 녹으며, 에틸 아세테이트 및 클로로포름에는 불용성이다 ;

i ) 정색반응.

트레스타틴 A, B 및 C는 각각 과망간산염 및 안트론 반응에 양성이며, 사카구찌(sakaguchi)반응에는 음성이다.

본 발명에 따른 신규의 트레스타틴 즉 트레스타틴 A, B 및 C는 스트렙토 마이세스속에 속하는, 트레스타틴을 생성하는 미생물을 수성 배지중에서 호기성 조건하에서 배양시키고, 발효 육즙으로부터 트레스 타틴을 회수하고, 필요한 경우에는 트레스 타틴 A, B, 및 C를 각각 분리시키는 것을 특징으로 하여 제조한다.

본 발명에서 사용되는 트레스타틴을 생성하는 미생물은 트레스 타틴을 생성할수 있는 스트렙토마이세스속에 속하는 모든 균주, 그의 돌연변이체 및 변종을 포함한다. 이중에서 바람직한 균주로는 스트렙토 마이세스 디모르포게네스 NR-320-OM7HB와 스트렙토마이세스 디모르포게네스 NR-320-OM7HBS로서 이들 및 이들의 돌연변이체와 변종은 일본국, 사이다마껭, 찌찌무시의 토양으로부터 분리하였다.

스트렙토마이세스 디모르포게네스 NR-320-OM7HB와 스트렙토마이세스 디모르포게네스 NR-320-OM7HBS 균주는 "FERM-P No. 3664" 및 " FERM-P No. 3665"로 기탁되었으며 (Agency of Industrial Science and Technology, Fermentation Research Institute, Japan).

그 미생물학적 특성은 다음과 같다 :

I . 형 태 학

현미경에 의할때, FERM-P No. 3664는 여러종류의 ISP 매질 상에서 가지가 잘 번식된 기질 균사체로부터 사슬 하나당 10내지 50개의 포자를 지니는 주로 직선형태이며 드물게는 나선상인 기중 균사체를 생성한다. 포자는 표면이 매끄럽고, 크기는 0.6내지 1.0×0.8 내지 1.4μ이다. 윤생체의 분지현상과 포자상 생성은 관찰되지 않는다. 또한 기중 균사체 형태를 관찰하면 약간의(1%이하) 나선상의 기중 균사체가 직선상의 포자사슬 사이에 클러스터로써 존재하는 것을 볼수 있다. 나선상의 콜로니를 단독으로 분리시켜 보면 이 클론은 여러 세대에 걸쳐 그의 나선상 기중 균사체 형태를 유지하며 계속적으로 소량의(0.7 내지 2%) 직선상의 기중 균사체클러스터 또는 콜로니를 생성함을 확인할수 있다. FERM P-3664 균주로부터의 나선상의 콜로니를 단독으로 분리시켜 얻어진 아균주를 FERM P-3665라 정의한다.

FERM P-3664 및 FERM P-3665 사이에는 각 기중 균사체의 형태학상 특성을 제외하고는 어떤 현저한 차이도 발견할 수 없다.

Ⅱ. 배양상의 특성

상기 두균주 FERM P-3664 및 FERM P-3665는 모두 표 1에 언급된 바와 같이 동일한 배양상 특성을 갖는다. 모든 실험은 27℃에서 배양한 배양물에 대해 행해졌으며 단, 탈지유 시험만은 37℃에서 행해졌다. 색은 다음 문헌에 따라 14내지 21일간 배양시켜 판정하였다. [참조 : Color Harmony Manual 4th ed. (Container Cooperation of America. Chicago)]

[표 I. 배양상의 특성]

[표 Ⅱ. NR-320-OM7HB, NR-320-OM 7HBS 및 관련균주의 형태학상, 배양상 및 생리학적 특성비교]

a ; 직선상 B)++ ; 많이 이용함.

b ; 나선상 + ; 이용함.

c ; 그물상 ± ; 이용할 가능성이 있음.

d ; 기중 균사체 - ; 이용하지 않음.

e ; 기질 균사체 C)+ ; 양성.

f ; 역전-기질 균사체 - ; 음성.

g ; 가용성 색소

A)- ; 형성되지 않았음.

(-) ; 형성되지 않았을 것임

Ⅲ. 생리학적 특성

다음 특징을 비교할 때 FERM-P No. 3664 및 3665균주 사이에 현저한 차이를 발견할 수 없다.

1) 성장 온도 범위

ISP-2 배지상에서 실험 결과, 20℃, 25℃, 27℃, 30℃, 37℃ 및 45℃에서는 보통 내지는 풍부한 성장을 보였으나 6℃및 55℃에서는 그렇지 못하였다. 최적 배양 온도는 37℃정도이다.

2) 글루코즈-펩튼-젤라틴 한천 배지상에서 배양시 (27℃)젤라틴 액화, 대략 12일후에 액화현상이 나타났으며, 그 정도는 약하였다.

3) 무기염-전분 한천 배지상에서 배양시(27℃)전분의 가수분해, 가수분해는 양성을 나타내며 중간정도의 강도로 나타났다.

4) 10%탈지유 배지중에서의 응집 및 페튼화(37℃) 5일을 전후 하여 펩튼화가 일어났으며 그 정도는 강했다. 응집현상은 일어나지 않았다.

5) 10%탈지유-영양한천 배지 상에서의 카제인 가수분해(27℃), 중간 내지 강한 정도의 가수분해가 일어났다.

6) ISP-8배지(27℃)상에서의 질산염의 환원:음성

7) 27℃에서 배양시, 멜라닌의 형성, 펩톤-이스트-철한천(ISP-6)배지상에서는 색소가 형성되지 않았고, 트립톤-효모 육즙 배지(ISP-1) 및 티토신 한천 배지(ISP-7)상에서도 모두 음성으로 판정된다.

8) 프리드 함-고트리브 한천배지(ISP-9)상에서 배양(27℃)시의 탄수화물의 이용도 L-아라비노즈, D-크실로즈 D-글루코즈, D-프락토즈, 슈크로즈, 이노시틀, 라피노즈, D-만니틀, 및 L-람노즈의 경우에 풍부한 상장이 관찰된다.

FERMP No. 3664 및 3665 균주의 상기 언급된 미생물학적 성질을 요약하면 다음과 같다:

상기의 균주는 악티노마이세탈레스토, 스트렙토마이세스 속에 속하며, 이들의 기중 균사체는 직선 및 나선상의 형태를 지닌다. (NR-320-OM7HB의 경우는 주로 직선형이고, NR-320-OM7HBS의 경우는 주로 나선형이다);윤생체의 생성은 확인되지 않았다. 두균주의 포자는 모두 표면이 매끄럽고 크기는 0.6내지 1.0×0.8내지 1.4μ이다.

균주를 여러가지 ISP 배지상에서 배양할때 담황갈색 내지 황갈색 기질 균사체로부터 연회색 내지 갈색을 띤 연회색의 기중 균사체가 생성되며 갈색의 용성 색소를 생성한다. 멜라노이드 색소는 펩튼-이스트-철 한천 배지에서는 생성되지 않았으며, 트립튼-효모 육즙배지 및 티로신 한천 배지상에서는 생성되지 않는 것 같다. 탈지유 펩튼화 시험에서는 강한 양성반응을 보이며, 젤라틴의 액화도는 약하나, 전분 가수분해도는 중간정도이다. 상기 모든 시험에서 NR-320-OM 7HBS와 NR-320-OM 7HB는 어떠한 차이점도 나타내지 않는다.

상기의 특성으로 보아 이들 균주는 에스. 니그리 파시엔스[Waksman, S.A. (1961) Classification, indentification and description of genera and species, The Actinomycetes vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Shirling E.B, &D. Gottlieb (1968) Cooperative description of type culture of Streptomyces, Ⅱ. Species descriptions from the first study, Inst. J. Syst. Bacteriol., 18 : 69 -189. Buchanan, R.E. & N.E. Gibbons (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed., The Williams and Wilkins Co., Baltiomre, Waksman, S.A. (1919) Cultural stydies of species of Actinomyces, Soil Sci., 8:167-171.], 에스. 올리바세우스 [Waksman, S.A. (1961) Classification, identification and description of genera and species, "The Actinomycetes vol, 2, The Williams and Wilkins Co., Balti-more. Shirling, E.B. & D. Gottlieb (1968) Cooperative descriptoin of type culture of Streptomyces, II. Species descriptions from the first study, Inst. J. Syst. Bacteriol., 18:69-189. Buchanan, R.E. & N.E. Gibbons (9174) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed., The williams and Wil-kins Co., Baltiomre. Waksman, S.A. (1919) Cultural studies of species of Actinomyces, Soil Sci., 8:167-171. Breed, R.S., E.G.D. Murray & N.R. Smith (1957) Bergey's Manual of Determinative Bact-eriology, 7th ed., The Williams and Wilkns Co., Baltimore.] 및 에스. 플리카투스 [Buchanan, R.E.& N.E. Gibbons (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed., The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Shirling, E.B. Gottlieb (1969) Cooperative descrption of type culture of Streptomyces, IV. Species descriptions from the third and fourth studies, Inst. J. Syst. Bacteriol., 19:391-512. Parke, Davis and Co. (1954) Antibiotics and methods for obtaining same, British Pat. Specification 707,332 April 14, Patent Office, London,]

와 유사하다고 추측할 수 있다. ISP균주와 본 발명에 따른 균주의 비교결과가 표 Ⅱ에 나타나 있으며 NR-320-OM 7HB 및 a.m. 형태학적 특성이 다른 아균주인 NR-320-OM 6HBS는 상기 3가지의 밀접하게 관련된 종 어느 것과도 구별된다.

NR-320-OM 7HB는 탈지우유의 응집, 당, 이노시틀 및 라피노즈의 이용시험에서 에스. 니그리 파시엔스와 구별되며, 특히 형태학적으로, 에스. 니그리파시엔스는 나선상의 균사를 전혀 생성하지 않는다. 이러한 사실과, ISP-3배지상에서 오리브 및 회색의 기중균사체 및 녹황색 기질 균사체를 생성하고 억제제를 생성하는 능력이 없음은 이들 두 균주가 동일한 중에 속하지 않는다는 것을 시사해준다.

다른 한편으로는 에스. 폴리카투스 ISP 5319의 포자사슬은 ISP-2,3,4 및 5배지에서 주로 나선상의 형태를 보여준다. ISP 5319의 경우에 고리모양의 기중 균사체가 간혹 관찰되지만, 직선형은 발견되지 않는 사실은 에스. 플리카투스와 NR-320-OM 7HB의 차이점이다. 더군다나, 뚜렷한 차이점은 기생 균사체의 번식 형태, 색소 형성, 응집, 젤라틴 액화현상 및 슈크로즈 및 라피노즈의 이용이다.

에스. 올리바세우스는 상기 3가지의 시험균주들 가운데서 NR-320-OM7HB와 가장 유사한 균주이다. 즉 에스. 올리바세우스 ISP 5072는 ISP -2,3,4 및 5배지상에서 기중 균사체가 주로 나선상의 구조를 보여주며, 부분적으로는 고리모양의 직선상 포자연쇄도 함유한다. 그러나 에스. 올리바세우스의 경우에 기중 균사체 한 클러스터안에 나선상 고리모양의 직선상 포자 연쇄가 공존하는데 반하여, NR-320-OM 7HB 및 NR-320-OM 7HBS의 경우에는 그렇지 않다. 또한 ISP 5072균주와 NR-320-OM 7HB 균주는 가용성 색소의 생성(ISP 5072균주는 ISP-2,3,4 및 5배지상에서 색소를 형성하지 않는다), 기중 균사체의 생장(ISP 5072는 기중 균사체가 거의 생장되지 않는다) 탄소원의 이용(슈크로즈/라피노즈) 및 α-아밀라제 억제제의 생성(ISP 5072대사물은 억제효과가 없다)에 있어서도 차이를 보인다. 이러한 모든점으로 미루어 보아 NR-320-OM 7HB와 NR-320-OM 7HBS는 에스. 올리바세우스 ISP 5072와 가장 유사하기는 하나 동일하지는 않다는 것을 알수 있다.

따라서, 이들은 스트렙토마이세스 속의 새로운 종으로 분류 하는 것이 정당하며, 그 이름을 스트렙토마이세스 디모르포 게네스(Streptomyces dimorphogenes nov. sp. WATANABE and MARUYAMY, 1978)로 명명하기로 하였다. 에스, 디모르포게네스의 대표균주는 NR-320-OM 7HB (FERM-P No. 3664)이다.

어원 : 디(이중의), (그리이스), 모르포(형태)+게네시스의 합성어로써, 포자연쇄 형태학적 특성에서 두가지 형태가 나타난다는 사실, 즉 소량의 나선상의 연쇄 클러스터가 여기저기 분포되어 있음에 근거한다. 생체형인 NR-320-OM 7HBS(FERM-P No. 3665)는 나선상의 포자 연쇄가 주조를 이루고, 여기저기 소량의 직선상의 포자연쇄가 분포되어 있는데, 기생균사체 형태학의 관점에서 이를 에스, 디모르포게네스 아종스피로포르마투스로 명명하는것이 적합할 것이다. 따라서, 대표균주인 FERM-P No. 3664는 에스. 디모르포게네스 아종 디모르포게네스라 명명하여져야 한다.

본 발명에 따르면, 트레스라틴은 상기 언급된, 스트렙토 마이세속에 속하는 스트렙토 마이세스 디모르포게네스 신종 : 와따나베 & 마루야마(NR-320-OM 7HB, FERM-P No. 3664) 또는 스트렙토마이세스 디모르포게네스 아종 스피로포-르마투스(NR-320-OM7HBS, FERM-P No. 3665)등의 트레스타틴을 생산하는 미생물을 호기성 조건하, 수성배지 중에서 배양시켜 얻을 수 있다.

상기 배양은 본 발명에 따른 미생물이 이용할수 있는 통상의 영양원을 배지중에 첨가시켜 이루어지며, 탄소원으로는 전분, 덱스트린, 글루코즈, 글리세를, 슈크로즈, 트레할로즈, 당밀 또는 이들의 혼합물이 있으며, 질소원으로는 대두분, 육즙, 펩튼, 효모 추출물, 옥수수지액, 황산 암모늄, 질산 암모늄, 염화 암모늄, 또는 이들의 혼합물이 있다. 또한 필요한 경우에는 탄산칼슘, 염화나트륨;및/또는 아연, 구리, 망간 철 등의 염같은 무기질을 포함시켜도 된다. 그리고, 실리콘, 식물유 등의 소포제를 포함시켜 배양시의 거품 형성을 방지할수도 있다.

본 배양법은 호기성 조건하, 수성 배지중에서 수행하며, 특히 액침 발효법에 의하여 수행하면 효과가 좋다. 배양 시작시 배지의 pH는 약 7이며, 배양온도는 20내지 40℃특히 25내지 30℃의 범위가 바람직하다.

상기 조건하에서 약 1내지 5일간 배양시키면, 발효육즙으로부터 트레스타틴이 얻어진다. 트레스타틴의 역가가 최대에 도달했을때 배양을 중지하는 것이 바람직하며, 얻어진 트레스타틴의 양은 다음의 방법으로 측정한다.

[트레스타틴의 측정]

트레스타틴은 강력한 α-아밀라제 억제효과를 지닌다. 따라서 이들은 아래의 P. Bernfeld에 의한 α-라밀라제 분석법을 이용하여 측정할수 있다. (Methods in Enzymology, I, 149,1955)

돼지 췌장의 α-아밀라제 2단위를 함유하는 0.1ml의 6.4mM황산 암모늄 용액을 10mM의 염화나트륨 및 다른 량의 트레스타틴을 함유하는 0.6ml의 20ml 인산염 완충용액(pH 6.9)중에 가하고 이 혼합물을 37℃에서 5분간 평형화한 다음, 0.5ml의 4%용성 전분 용액을 가하여 37℃에서 5분간 배양한다. P. Bernfeld 법으로 제조한 2ml의 디니트로 살리실산 시약을 상기 용액중에서 가해반응을 종결시킨다. 이 혼합물을 비등 수용액중에서 5분간 가열하고, 10ml의 물로 희석한다. 얻어진 착색 용액읍 흡광도 (A₁)를 540nm에서 측정하고, α-아밀 라제의 억제효과를 다음식에 따라 계산한다 :

A₀; 효소 부재하의 흡광도

A₂; 트레스타틴 부재하의 흡광도

* α-아밀라제 1단위는 트레스타틴 부재하에 상기 조건하에서 1μ mol의 말토오즈에 해당하는 환원당을 형성하는데 요하는 효소량이다.

억제단위(IU)는 상기 분석 조건하에서 효소를 50%억제 하는데 요하는 트레스타틴의 양으로 정의된다.

배양이 끝나면, 발효육즙 중에서 생성된 트레스타틴을 다음 공지의 방법에 따라 분리시킨다;상기 언급된 바와 같이 수득된 발효 배양액으로부터 원심분리법 또는 여과법등의 방법으로 균사를 제거한다. 트레스타틴은 수용성의 약 염기성 화합물이므로, 수용성, 염기성물질의 분리 및 정제에 통상적으로 사용하는 방법을 사용하여 분리, 정제시킬수 있다. 예를들면, 활성탄, 양이온 이온 교환수지 등의 흡착제를 사용한 흡착법에 의하거나;알콜, 아세튼 등의 용매를 이용한 침전법, 또는 셀루로즈, 세파덱스, (파마시아사의 상표)등을 이용한 크로마토그라피 및 이들의 방법을 혼합한 방법으로 여액으로부터 트레스타틴을 분리 및 정제시킬수 있다.

약산성 양이온 교환수지중 H-형 및 암모늄 형을 함께 사용하여 컬럼 크로마토그라피시키면 트레스타틴 A, 트레스타틴 B 및 트레스타틴 C를 발효여액으로부터 각각 단일 화합물의 형태로 편리하게 분리시킬수 있으며 그중 바림직한 태양은 다음과 같다:

즉, 발효여액의 pH를 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨 등의 알칼리를 사용하여 pH7로 조정하고, 이 여액중에 활성탄을 가해 트레스타틴을 흡착시키고 혼합물을 여과한다. 이 탄소 케이크로부터 30내지 70% 바람직하게는 50%의 수성 아세톤으로 트레스타틴을 용출시킨다. 이때 용출제는 산을 가하여 pH 1내지 3으로 조정하고, 50℃내지 70℃에서 용출시키는 것이 바람직하다. 용출물을 농축시키고, 이 농축물을 도웩스 502(H-형, 다우 케미칼사의 상표)등의 양이온 교환수지 컬럼을 통과시켜 트레스타틴을 흡착시킨다. 컬럼을 물로 세척하고, 1N 수성 암모니아로 용출시킨다. 아밀라제 억제 효과를 지니는 획분을 모아, 진공하에서 농축시키고, 동결건조시키면 트레스타틴을 함유하는 조 생성물이 분말 상태로 얻어진다. 이들 메탄올로 처리하여 메탄올에 가용성인 불순물을 제거한다. 트레스타틴은 메탄올에는 거의 녹지 않는다. 트레스타틴을 함유하는 메탄올에 불용성인 분말을 물에 용해시키고, 이 용액을 도웩스 1 (아세테이트형, 다우케미칼사 상표)등의 음이온 교환수지를 충진한 칼럼에 통과시킨다. 칼럼을 물로 용출시키고, 활성 분획을 모아 감압하에 농축시키고 도웩스 50(암모늄형, 다우케미칼사 상표)같은 양이온 교환수지로 충진한 칼럼을 통과시킨다. 이 칼럼을 물로 용출시키고, 아밀라제 억제 활성을 나타내는 획분을 모아 농축시키고 동결 건조시키면 분말이 얻어지는데, 이는 고속액체 크로마토그라피결과 주로 트레스타틴 A,B 및 C로 이루어져 있다. 상기의 트레스타틴을 함유하는 수용액을 암버티트 CG 50 CH형 및 암모늄의 혼합형태, 롬 앤드하스사의 상표)등의 양이온 교환수지 칼럼을 통과시킨다. H형과 암모늄형의 비율은 1:9 (V/V) 내지 (9:1(V/V)가 바람직하다. 이 컬럼을 물로 용출시키면 트레스타틴 B, 트레스타틴 A 및 트레스타틴 C의 순서로 얻어진다.

수득된 각 트레스타틴을 재크로마토 그라피시키면, 순수한 트레스타틴 A, 트레스타틴 B 및 트레스타틴 C가 각각 얻어진다. 이들 트레스타틴은 경우에 따라서는 염산염, 황산염, 인산염, 아세트산염, 옥살산염등의 염으로 전환시킬 수도 있다.

염산염의 융점:

트레스타틴 A의 염산염 : 163 내지 190℃ (거품을 일으키면서 분해)

트레스타틴 B의 염산염 : 158 내지 186℃ (거품을 일으키면서 분해)

트레스타틴 C의 염산염 : 190 내지 200℃ (거품을 일으키면서 분해)

염산염의 선광도 :

트레스타틴 A 의 염산염 : [α]^D ₂₅=+162.5°(C=1=1.0.0.01N HCl)

트레스타틴 B 의 염산염 : [α]^D ₂₆=+169°(C=1.0 0.01N HCl)

트레스타틴 C의 염산염 : [α]^D ₂₅=+160.5°(C=1.0,0.01N HCl)

적정(물중에서): Pka 동량 트레스타틴 B 5.0 960

트레스타틴 A 5.0 720 트레스타틴 C 5.0 650

이들 데이타는 전술한 분자량 데이타와 함겠 트레스타틴 A, B 및 C가 각각 2산염기, 1산염기, 3산염기임을 보여준다.

실험식 :

트레스타틴 A : C₅₆H₉₄N₂O₄₀트레스타틴 C : C₇₅H₁₂₅N₃O₅₂

트레스타틴 B : C₃₇H₆₃NO₂₈

트레스타틴 A, B 및 C의 유리염기로서의 양자자기 공명 스펙트럼(100㎒, D₂O중에서)은 JEOL FX-100분광계를 이용하여 탈커플링법(homo gated decoupling method)으로 DSS를 내부표준으로 하여 구한 것으로 각각 도면 4,5 및 6도에 나타나 있다.

박층 크로마토그라피 :

판 : 실리카겔 F₂₅₄(머크)

용출용매계 : 클로로포름-메탄올-25% 수성 암모니아-물(1:4:2:1)

확인 : 열황산

상기 조건하에서의 트레스타틴 A, B 및 C의 Rf치는 각각 0.19, 028 및 0.14이다.

고속 액체 크로마토그라피 :

컬럼 : μ-븐다팍/CH (1피트×0.25인치)

용출용매 : 아세토니트릴-물(63:37)

용출속도 : 4.0ml/min

확 인 : 210nm에서 UV 흡수

상기 조건하에서의, 트레스타틴 A, B 및 C의 정체시간은 각각 5.5, 3.4 및 8.8분이다. 그 크로마토 그라피는 제7도에 나타나 있다.

페이퍼 전기 영등법 :

페이퍼 : 도요로시 No.51

완충용액 : 포름산-아세트 산-물(25:75:900, pH1.8)

전 압 : 3,000V

시 간 : 40분

상기 조건하에서 모든 종류의 트레스타틴은 음극으로 이용 하였는데 트레스타틴 A는 12㎝, 트레스타틴 B는 9㎝ 트레스타틴 C는 13㎝ 이동하였다.

구조 성분 :

80℃에서 3시간 동안 4N 염산을 사용하여 가수분해 시키면 트레스타틴 A, B 및 C는 모두 글루코즈와 아민을 생성한다. 아민의 pka'는 3.9이며, 고성능 질량 스펙트럼으로부터 구한 분자식은 C₁₃H₂₁No₇이다. 트레스타틴 A, B 및 C는 각각 5.4 및 6물의 글루코즈를 함유하며. 트레스타틴 A, B 또는 C를 도웩스 50(H형)을 촉매로하여 약산으로 가수분해 (80℃, 4시간)시키면 트레할로즈(α-D-글루코피라노실-α-D-글루코피라노시드)가 얻어진다. 트레스타틴 A, B 및 C중 어느 하나도 아미노산을 함유하지 않는다.

상기 서술한 성질로 비추어 보아, 본 발명에 따라 얻어진 트레스타틴 A, B 및 C는 트레할로즈를 공통 구조성분으로 갖는 약염기성 아미노글루코시드이다. 트레스타틴 A와 B의 구조는 제8도와 같다.

또한, 트레스타틴 A, B 및 C는 아래에서와 같이 강력한 아밀라제 억제효과를 지니며, 따라서 아밀라제 억제제로 유용하다.

발효법에 의하여 제조된 통상의 아밀라제 억제제는 지금까지 다음 문헌에 소개된 바 있다 :

1) 나이와등의 노지리마이신(Biol. chem; 34,966,1930). 노지리마이신은 모노사카리이드로써 본 발명에 따른 트레스타틴과는 확실히 다르다.

2) 에스. 우에다 등의 펩타이드당(Agr. Biol. chem., 37,2025, 1973 and Agr. Biol. chem., 40 1167.1976) 이 펩타이드당은 구조성분으로서 아미노산을 함유한다.

3) 에스. 무라오 등의 아밀로 스타틴(일본국공개 특허원 123891/1975)이 명세서에서는, 아밀로스타틴 A가 pH 1내지 14범위에서 강산성 양이온 교환 수지에 흡착되지 않는다고 보고되었으나 트레스타틴은 언급한 바와 같이 이와 같은 이온 교환 수지에 흡착된다.

4) 케이. 우에다 등의 아밀라제 억제제(일본국 공개특허원 54990/1976)이 아밀라제 억제제는 분자량이 대략 600으로써, 이는 트레스타틴 A, 트레스타틴 B, 트레스타틴 C의 어느 하나와도 동일하지 않다.

5) 더블류·프롬머 등의 아미노-당 화합물(독일연방공화국 ot 2,347,782:일본국 공개특허원 53593/1975)

이들 화합물은 모두 일산 염기인 반면, 트레스타틴 A는 2산 염기이고, 트레스타틴 C는 3산 염기이다. 트레스타틴 B는 구조성분으로 트레할로즈를 갖는 1산 염기로서 상기 아미노당과는 다르다.

트레할로즈를 지니는 아밀라제 억제제는 아직까지 발표된 바 없었다.

트레스타틴 및 이들 염의 생물학적 성질은 다음과 같다 :

1) 급성 독성 ;

500㎎/㎏의 트레스타틴 A, 트레스타틴 B 및 트레스타틴 C를 각각 쥐에게 경구로 투여했을때 (이는 유효량의 65내지 700배의 량이다) 조차도 급성 독성은 관찰되지 않았다.

트레스타틴 혼합물(실시예 1의 Ⅱ단계분리과정 3)에 따라 수득된 제Ⅱ단계분말)을 1일 용량 8000㎎/㎏까지로 하여 생지 및 쥐에게 10일간 투여하여도 독성이 나타나지 않았다.

2) 항 미생물 스펙트럼

트레스타틴 A, 트레스타틴 B 및 트레스타틴 C의 항미생물 효과의 결여성을 한천-희석법에 의하여 측정한 결과가 다음 표에 나타나 있다 :

트레스타틴 A, B 및 C의 항미생물 스펙트럼

3) 아밀라제 억제 활성 :

트레스타틴 A, B, C 및 이들의 염과 이들의 혼합물의 , 돼지 췌장 α-아밀라제 억제 활성은 다음과 같다. 이는 상기 언급된 방법에 따라 측정하였다.

소화된 쌀전분으로 인한 과혈당증 억제활성

** 트레스타틴 복합체는 실시예 1-Ⅱ 분리과정 5)에 따라 얻은 것으로, 트레스타틴 A, B 및 C를 포함한다.

** ED₂₀은 체중 ㎏당 2g의 쌀 전분을 경구로 투여한 결과 발생한 과혈당증을 투여후 20분 후에 20%감소시킬수 있는 양으로 정의된다.

더군다나, 이들 프레스타틴은 바실루스 서브티리스 및 아스페르길루스 오지라에의 α-아밀라제뿐만 아니라 아스페르길루스 니거의 아밀로-α-1.4-α-1,6-글루코시데이즈도 억제시킬수 있으나, 고구마의 β-아밀라제에 대해서는 억제활성을 보이지 못한다.

인간이 섭치하는 음식물의 주된 탄수화물인 전분의 소화는 α-아밀 라제의 작용으로 시작된다. 이 흐소는 타액 및 췌장 분비물중에서 발견된다. 위장관내의 전분 소화는 주로 췌장 아밀라제에 의하여 이루어지며, 이 아밀라제는 탄수화물 중합체를 분해하여 최종적으로 말토즈를 생성하는데, 이 말로즈는 장내 디싸카리다아제에 의해 가수분해되어 글루코즈로 된다. 따라서 탄수화물이 포함된 식사를 한 바로 직후에는 과인슐린혈증을 일으키는 뚜렷한 과혈당증이 관찰된다.

당뇨병 환자에게서 과혈당증이 특히 현저한데, 이는 매우 바람직하지 못하다. 비만증인 사림의 경우, 과혈당증은 흔히 인슐린의 분비를 증가시키고, 이것이 췌장 β-세포를 고갈시킨다. 더구나 과인슐린증은 지방형성을 촉진시켜 과지방혈증을 가져온다.

트레스타틴 A, B 및 C뿐만 아니라 이들중의 하나 또는 그 이상을 함유하는 제제도 쥐 및 생쥐에 있어 전분 섭취실험(25페이지 및 표1) 또는 사료 투여후에 나타나는 식후 과혈당증 및 과인슐린증을 억제시킬 수 있다.

경구로 슈크로즈를 투여하여 일어난 과혈당증의 감소는 (표 1) α-아밀라제의 억제 작용 외에도 슈크라제의 작용을 약간 억제하는 것에 기인한다고 볼수 있다. (그러나, 글루코즈로 유도된 과혈당증에는 효과가 없다)

따라서, 본 발명의 트레스타틴은 당뇨병, 비만증, 과지방혈증 아테롬성 동맥경화증에 유효하다.

타액의 α-아밀라제는 전분을 입안에서 소화시키기 때문에 충치를 일으키므로, 트레스타틴은 충치의 예방 및 충치 형성 억제제로도 사용될 수 있다. 또한 트레스타틴은 생화학적 시료로도 사용된다.

표 1 : 전분 또는 설탕을 경구투여한후 일어나는 과혈당증(과인슐린증)에 미치는 트레스타틴의 효과 탄수화물±트레스타틴(1.6g 밑전분/㎏ 또는 3.2g의 설탕/㎏) 투여 20분후의 혈장 글루코즈 및 인슐린%(^*p<0.05),^**(p<0.01),^***(p<0.001),

(Kolmgorov-Smirnov-Test)

*) 실시예 1-Ⅱ 분리 4)에 따라 얻어진 제Ⅳ단계의 분말로 트레스타틴 A, B 및 C를 함유한다.

[표 2 : 식후에 나타나는 과혈당증 및 과인슐린증에 미치는 트레스타틴의 효과]

6마리의 암쥐(85-95g)를 24시간 동안 단식시키고 위관을 통하여 사료^*)±트레스타틴 혼합물(^**)을 투여함

^*)0.07%카라게닌중에 현탁시킨 보통실험실 사료분(Nafag 859/850, mesh 80; NAFAG, Gossau SG, Switzerland)^**) 실시예 1Ⅱ 분리 4)에 따라 수득된 제Ⅳ단계의 분말로, 트레스타틴 A, B 및 C를 함유한다. [Kolmogorov-Smirnov에 따른 통계치^*(p<0.05),^**(p<0.01),^***(p<0.001)]

본 발명에 따른 신규의 트레스타틴 및 이들의 염은 약제로서 사용될 수 있다. 예를들어, 이들 또는 이들의 염을 물, 젤라틴, 아라비아고무, 유당, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 식물유, 폴리알킬렌글리클등의 유기 또는 무기 불황성 담체와 혼합한 약체학적 제제형태로 사용될 수 있다. 이 약제학적 제제는 정제, 당의정, 캅셀제등의 고형제나, 액체, 현탁제 등의 액체형으로 존재할 수 있다.

단위 용량은 유효성분 20내지 50㎎을 함유하며, 성인에 대한 1일 용량은 10내지 200㎎으로서 각 개인의 필요에 따라 변화될 수 있다.

트레스타틴 및 이들의 염은 설탕, 과일쥬스, 쵸코레ㅌ, 잼, 감자생성물, 당 또는 과자류의 생성물 등의 식료품 및 규정식에 첨가물로 사용될 수 있다.

이들 식료품 또는 규정식은 본 발명의 트레스타틴 0.1 내지 1%(W/W)을 함유하는 것이 좋다.

다음 실시예는 본 발명을 상세히 설명한다.

[실시예 1]

I. 발 효

다음의 물질로부터 영양 배지를 제조한다.

감자전분 20g 염화나트륨 2.5g

글루코즈 20g 광물질 저장용액 1 1ml

효모 추출물 5g 탈이온수 1l

^*1 이용액은 탈이온수 1l당 ZnSO₄, 7H₂O(50g), CuSO₄, 5H₂O(5g), MnCl₂4H₂O(5g)을 함유한다.

6N 수산화나트륨을 가하여 상기 혼합물의 pH를 6으로 조정한 후 3.2g의 탄산칼슘 및 20g의 대두분을 가하여 120℃에서 20분간 중기 멸균시킨다.

상기의 멸균 배치를 각각 110ml씩 함유하는 10개의 500ml 삼각 플라스크중에 한천 사면으로부터 긁어낸 스트렙토마이세스 디모르포게네스종 NR 320-OM7HB-P No.3664)의 포자를 접종시킨다. 이 플라스크를 185r.p.m.에서 작동시킨 회전 진탕기중에 장치하고 27℃에서 72시간동안 진탕한다. 이 시간이 거의 끝나갈 무렵, 동일한 배지 25l를 함유하는 50l의 발효기 내에 상기 플라스크의 접종물을 심는다. 발효시간은 43시간 이고, 이때 27℃의 온도를 유지하고, 여과시킨 공기를 매분 25l의 속도로 공급하면서 300r.p.m.의 속도로 진탕한다. 특정한 트레스타틴 발효액(pH 6.9)은 3.1×10⁴IU/ml의 역가를 갖는다.

Ⅱ. 분 리

1) 탄소를 이용한 흡착 :

상기 서술된 트레스타틴 발효액으로부터 얻어진 전 발효물에 5N 수산화나트륨을 가하여 pH7.0으로 조정한다. 여액(19l, 3.1×10⁴IU/ml 5.9×10⁸IU/total)중에 380g을 활성탄을 가하고, 이 혼합물을 실온에서 20분간 교반한 후 여과한다. 이 탄소케이크를 4l의 수도물로 세척하고, 10l의 뜨거운 50% 수성 아세톤중에 현탁시킨다. 이 현탁액의 pH를 6NHCl을 사용하여 2로 조정한후 60℃에서 20분간 교반하면서 방치한다. 이때 가끔 6NHCl을 가하여 혼합물의 pH를 2로 유지시켜야 한다. 혼합물을 여과하고, 탄소케이크 10l의 50% 수성아세톤으로 다시 한번 처리한다. 여액을 모아, 6N NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정한후, 여과하여 생성된 소량의 침전을 제거한다. 여액(5.6×10⁸IU/total)을 감압하에서 농축시켜 3l로 하고, 농축액의 일부를 동경 건조시키면 조(粗) 트레스타틴 복합체가 암갈색의 가루(3.2×10⁶IU/g)로 얻어진다. 이를 제 I 단계 분말이라 한다.

2) 도웩스 50을 이용한 흡착 :

상기 서술된 농축액(약 3l, 5.6×10⁸IU/total)를 약 10ml/min의 속도로 도웩스 50(H-형태, 3.5l, 20 내지 50매쉬) 컬럼(80×7.5㎝)을 통과시키고, 이 컬럼을 10.5l의 탈이온수로 세척한후 1N NH₄OH로 용출시켜 분별시킨다. 3×10³IU/ml 이상의 트레스타틴을 함유하는 획분을 모아 감압하에서 농축시키고 동결건조시키면 75.4g의 갈색가루(7.0×10⁶IU/g, 15.3×10⁸IU/total)가 얻어진다. 이것을 제Ⅱ단계분말이라 한다.

3) 메탄올 차리 :

상기 언급된 제Ⅱ단계분말 (75.4g, 7.0×10⁶IU/g 5.3×10⁸IU/total)를 3770ml의 메탄올 중에 현탁시키고, 이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한다. 여과하여 불용성 물질을 모은 후, 소량의 메탄올로 세척하고 건조시키면 41.5g의 갈색분말 (1.1×10⁷IU/g 4.6×10⁸IU/total)이 얻어진다. 이것을 제Ⅲ단계분말이라 한다.

4) 도웩스 1을 이용한 크로마토그라피 :

상기 언급한 제Ⅲ단계분말(41.5g,1.1×10⁷IU/g 4.6×10⁸IU/total)을 100ml의 탈이온수중에 용해시킨 다음 이 용액을 도웩스 1(아세테이트 형태, 2.050ml, 200 내지 400메쉬) 컬럼(87×5.5㎝)에 적용한다. 이 컬럼에 2.5ml/min의 속도로 탈이온수를 가하여 용출시키고, 용출물을 분별시킨다(각 분획 : 17ml).

활성 획분 35 내지 70을 모아, 감압하에서 농축시키고 동결 건조시키면 22.6g의 황색가루(1.8×10⁷IU/g, 4.1×10⁸IU/total)가 얻어진다. 이것을 제Ⅳ단계분말이라 한다.

5) 도웩스 50을 이용한 크로마토그라피 :

상기 언급된 제Ⅳ단계분말(22.6g, 1.8×10⁸IU/g, 4.1×10⁸IU/total)를 50ml의 탈이온수중에 용해시키고, 이 용액을 도웩스 50(암모늄형태 2900ml, 200 내지 400메쉬)의 컬럼(85×6.6㎝)에 적용한다. 이 컬럼에 2.5ml/min의 속도를 탈이온수를 가하여 용출시키고, 용출물을 분별시킨다. (각각 17ml씩) 활성 획분 65 내지 89을 모아 감압하에서 농축시킨다음 동결건조시키면 10.6g의 트레스타틴 복합체가 담황색가루(3.6×10⁷IU/g, 3.8×10⁸IU/total)로 얻어진다. 이것을 제Ⅴ단계분말이라 한다.

Ⅲ. 트리스타틴 복합체의 트리스타틴 A, B 및 C로의 분리

상기 언급된 제Ⅴ단계분말(10.6g, 3.6×10⁷IU/g, 3.8×10⁸IU/total)를 20ml의 증류수중에 용해시키고, 이 용액을 암버리트 CG 50(암모늄형 3.5부와 H-형 6.5부로 이루어진 혼합상 1420ml, 형태 I)의 컬럼(78×4.8㎝)에 붓는다. 이 컬럼을 2.0ml/min의 속도로 증류수를 사용하여, 용출시키고 용출물을 분별시킨다(각 획분 : 14ml). 활성 분획에 대해 다음 조건하에서 고속액체 크로마토 그라피(HSLC)를 실시한다.

컬럼 : μ본다팍/탄수화물(1/4"×1', Waters Associate)

용출제 : CH₃CN : H₂O(63:37)

용출속도 : 4.0ml/min

주입용량 : 2내지 10㎕

확인 : 210nm 자외선 흡수도

적합한 분획을 모아, 감압하에서 농축시키고 동결 건조시킨다. 그 결과는 다음과 같다.

Ⅳ. 트레스타틴 A의 제조

트레스타틴 A의 순수한 샘플을 암버리트 CG 5-위에서 재크로 마토그라피시켜 얻는다. 즉, Ⅲ항에서와 같이 하여 수득된 1.17g의 트레스타틴 A의 샘플을 4ml의 증류수중에 용해시키고, 암버리트 CG 50(H형 수지 8부와 암모늄형 수지 2부의 혼합상 300ml, Ⅱ타입)의 컬럼(1.33×1.7㎝)에 붓는다. 이 컬럼에 증류수를 가하여 용출시키고 용출물을 분별시킨 다음(각 획분 : 7ml), 상기 언급된 조건하에서 고속 액체 크로마토그라피에 의해 추적한다. 트레스타틴 A를 함유한 획분 245 내지 495를 모아 감압하에서 농축시키고 동결 건조시키면 649㎎의 트레스타틴 A가 백색분말로 얻어진다. 이는 상기 언급된 바와 같은 성질을 지닌다.

Ⅴ. 트레스타틴 B의 제조

트레스타틴 B의 순수한 샘플을 암버리트 CG 50위에서 재크로마토그라피시켜 얻는다. 즉, 상기 Ⅲ항에서와 같이 얻어진 트레스타틴 B의 샘플 450㎎을 2ml의 증류수중에서 용해시키고, 암버리트 CG 50(H형수지 8부와 암모늄형수지 2부의 혼합상, 280ml, Ⅱ타입)의 컬럼(122×1.7㎝)에 붓는다. 증류수를 사용하여 용출시킨후 용출물을 분별시킨다음(각획분 : 3ml), 상기 조건하에서 고속액체 크로마토그라피에 의해 추적한다. 트레스타틴 B를 함유하는 획분 121 내지 129를 모아 감압하에서 농축시키고 동결건조시키면 170㎎의 트레스타틴 B가 백색분말로 얻어진다. 이 물질의 성질은 상기 언급된 바와같다.

Ⅵ. 트레스타틴 C의 제조

트레스타틴 C의 순수한 샘플은 알버리트 CG 50위에서 재크로마토그라피시켜 얻는다. 즉, 상기 Ⅲ에서와 같이 얻어진 트레스타틴 C의 샘플 720㎎을 3ml의 증류수에 용해시키고 암버리트 CG 50(H형수지 6.2부와 암모늄형수지 3.8부의 혼합상, 300ml, Ⅱ타입)의 컬럼(133×1.7㎝)에 붓는다. 증류수를 사용하여 용출시키고, 용출물을 분별시킨다음(각획분:6ml)상기 조건하에서 고속액체 크로마토그라피시켜 추적한다. 트레스타틴 C를 함유하는 획분 42내지 59를 모아 감압하에서 농축시키고 동결건조시키면 515㎎의 트레스타틴 C가 백색분말로 얻어지는데, 그 성질은 상기 언급한 바와 같다.

[실시예 2]

트레스타틴 A연산염의 제조

실시예 1에서 얻어진 트레스타틴 A(95㎎)를 1ml의 증류수에 용해시키고, 0.1N염산을 사용하여 pH를 2.0에 맞춘다. 이 용액을 감압하에서 농축시켜 0.5ml로 한후, 에탄올(6ml)을 가하여 백색 침전을 형성시키고, 이를 원심 분리시켜 모은다음, 2ml의 에탄올로 세척하고 진공 건조시키면 97㎎의 트레스타틴 A, 2 염산염이 백색분말로 얻어진다.

[실시예 3]

트레스타틴 B염산염의 제조

실시예 1에서 얻어진 트레스타틴 B(92ml)를 1ml의 증류수에 용해시키고, 0.1N염산을 사용하여 pH를 2.0에 맞춘다. 이 용액을 감압하에서 농축시켜 0.5ml로 하고, 에탄올(7ml)을 가하여 백색 침전이 형성되면 이를 원심 분리시켜 모은후, 2ml의 에탄올로 세척한다음 진공 건조시키면 91㎎의 트레스타틴 B, 1 염산염이 백색분말로 얻어진다.

[실시예 4]

트레스타틴 C염산염의 제조

실시예 1에서 얻어진 트레스타틴 C(90㎎)를 1ml의 증류수에 용해시키고, 0.1N염산을 사용하여 pH를 2.0에 맞춘다. 이 용액을 감압하에서 농축시켜 0.5ml로 하고 에탄올(5ml)을 가하여 백색 침전이 형성되면, 이를 원심 분리시켜 모은후, 2ml의 에탄올로 세척한다음 진공 건조시키면 91㎎의 트레스타틴 C, 3 염산염이 백색분말로 얻어진다.

[실시예 5]

실시예 1의 공정과 유사한 공정에 따라, 스트렙토 마이세스 디모르포게네스 종 NR-320-OM7HBS(FERM-PNo.3665)를 사용하여 트레스타틴 A, B 및 C를 각각 수득한다.

Claims (1)

1. 스트렙토마이세스속에 속하는 트레스타틴-생성미생물을 호기성 조건하에 수성 배지중에서 배양시키고, 발효육즙으로부터 트레스타틴을 회수하고, 필요하면, 트레스타틴 A, 트레스타틴 B 및 트레스타틴 C를 각각 분리시켜 트레할로즈를 공통 구조성분으로 하는 신규의 아미노당 유도체인 구조식(I)의 트레스타틴 A, 구조식(Ⅱ)의 트레스타틴 B, 및 트레스타틴 C 및 이들의 염을 제조하는 방법.

   

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