JP3106012B2

JP3106012B2 - オキサゾリン誘導体の製造法

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Publication number: JP3106012B2
Application number: JP22566292A
Authority: JP
Inventors: 睦男中島; 治安東; 潔浜野; 秀次高橋; 章佐藤; 安行高松; 竜三榎田
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1991-08-26
Filing date: 1992-08-25
Publication date: 2000-11-06
Anticipated expiration: 2015-11-06
Also published as: JPH05252969A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の目的】

【０００２】

【産業上の利用分野】本発明は、スクラーゼ阻害活性を
有する新規なオキサゾリン誘導体の製造法に関する。

【０００３】

【従来の技術】従来、スクラーゼに対して強い阻害活性
を示す物質としては、ＡＯ−１２８、アカルボース等が
知られており、抗肥満、抗糖尿等に有用な物質として報
告されている（文献：Satoshi Horii et al.、ジャーナ
ルオブメディシナルケミストリー（Journal of M
edicinal Chemistry）、29巻、 1038-1046頁、 1986
年；合田敏尚等、「栄養と食糧」、34巻、2 号、 139-1
43頁、1981年）。従って、スクラーゼ阻害活性を有する
化合物は、抗肥満薬、抗糖尿病薬として有用であること
が予想される。

【０００４】なお、本発明の下記の式（Ｉ）で示される
化合物およびその別製法は、既に特願平 4−140186号に
記載されている。

【０００５】

【発明の構成】

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、式（Ｉ）

【０００７】

【化４】

【０００８】で示される化合物（以下、化合物（Ｉ）と
いう。）の製造法に関する。

【０００９】更に詳しくは、本発明はミクロモノスポラ
属またはアミコラトプシス属に属する化合物（Ｉ）の生
産菌を培養し、その培養物より化合物（Ｉ）を採取する
ことからなる化合物（Ｉ）の製造法に関する。

【００１０】本発明の製造法によって得られる化合物
（Ｉ）は次のような特性を有する。１）色と形状：塩基性白色粉末２）溶解性：水に可溶。アセトン、クロロホルムに不
溶。３）分子式：Ｃ₇ Ｈ₁₂Ｎ₂ Ｏ₅ ４）分子量： 204（FAB-MSスペクトルにより測定）５）比旋光度： [α]_D ²⁵ ＋10.0°(c 0.51,水）６）紫外線吸収スペクトル：λ_max nm（E 1cm・1%) 水溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、210 nmよ
り長波長側には特徴的な吸収を示さない。７）赤外線吸収スペクトル：ν_max(KBr) cm^-1 3358、1668、1528、1398、1066 ８） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：δppm 重水中、内部基準にＴＳＰ（トリメチルシリルプロピオ
ン酸ナトリウム）を使用して測定した核磁気共鳴スペク
トル（500 MHz ）は、次の通りである。 3.73(1H,d,J=11.72Hz)、3.82(1H,d,J=12.21Hz)、3.97(1
H,d,J=4.4Hz)、4.23(1H,dd,J=4.4 および 2.44Hz)、4.
37ppm(1H,d,J=8.79Hz)、5.03(1H,dd,J=8.79 および 2.4
4Hz) ９）高速液体クロマトグラフィー分離カラム；アサヒパック ES−502 C （旭化成工業
（株）製）移動相； 20 mM 酢酸アンモニウム(pH 8.5) + 50 mM
食塩水流速； 1 ml ／分検出波長； 210 nm 温度； 25 ℃ 保持時間； 8.39 分。

【００１１】本発明の化合物（Ｉ）は、常法にしたがっ
て塩にすることができる。そのような塩としては、例え
ば弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩
のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫
酸塩、燐酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリ
フルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のよ
うな低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸
塩、p-トルエンスルホン酸塩のようなアリ−ルスルホン
酸塩、フマ−ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸
塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩及びグルタミン
酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げるこ
とができる。好適には薬理上許容しうる塩である。

【００１２】なお、本発明の化合物（Ｉ）は、種々の異
性体を有する。化合物（Ｉ）においては、これらの異性
体およびこれらの異性体の混合物がすべて単一の式で示
されている。従って、本発明においてはこれらの異性体
およびこれらの異性体の混合物をもすべて含むものであ
る。

【００１３】本発明の化合物（Ｉ）の製造法において用
いられるミクロモノスポラ（Micromonospora）属に属す
る菌株としては、例えばミクロモノスポラエスピー
SANK62390 株を挙げることができる。

【００１４】SANK 62390 株の菌学的性状は、次の通り
である。

【００１５】１．形態学的性状 SANK 62390 株は、菌株同定用寒天培地上 28 ℃、7 な
いし 14 日間の培養において普通もしくはやや貧弱に生
育する。基生菌糸は良好に伸長、分岐し、明るい橙、橙
ないし暗い茶味灰色を示すが、ノカルディア（Nocardi
a）属菌株様の断裂やジグザグ伸長は観察されない。気
菌糸は原痕跡的に僅かに形成し、白ないし茶味白色を示
す。胞子は基生菌糸上にのみ観察されるが、比較的短い
胞子柄の先端に 1 個ずつ形成し、球状である。胞子の
表面は平滑である。胞子のう、菌核、車軸分岐等の特殊
器官は認められない。

【００１６】２．各種培養基上の諸性質各種培養基上で 28 ℃、 14 日間培養後の性状は表１に
示した通りである。色調の表示は日本色彩研究所版「標
準色表」のカラーチップ・ナンバーをあらわす。

【００１７】

【表１】 ──────────────────────────────────── 培地の種類項目 SANK 62390 株の性状 ──────────────────────────────────── シュクロース・Ｇ：余り良くない、平坦、薄橙（3-9-6 ）硝酸塩寒天ＡＭ：形成せずＲ：薄橙（3-9-6 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── グルコース・Ｇ：余り良くない、平坦、黄味橙（12-7-7）アスパラギン寒天ＡＭ：形成せずＲ：薄橙（6-8-7 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── グリセリン・Ｇ：余り良くない、平坦、明るい橙（8-7-6 ）アスパラギン寒天ＡＭ：形成せず (ISP 5) Ｒ：明るい茶味灰（2-6-6 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── 澱粉・無機塩寒天Ｇ：良好、平坦、明るい橙（8-7-6) (ISP 4) ＡＭ：形成せずＲ：灰（N-5 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── チロシン寒天Ｇ：余り良くない、平坦、鈍橙（6-8-6 ） (ISP 7) ＡＭ：僅かに形成、原痕跡的、白Ｒ：茶味白（2-9-7 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── 栄養寒天Ｇ：余り良くない、平坦、黄橙（10-8-7） (DIFCO) ＡＭ：形成せずＲ：鈍黄味橙（8-8-7 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── イーストエキス・Ｇ：良好、平坦、暗い茶味灰（1-4-6 ）麦芽エキス寒天ＡＭ：僅かに形成、原痕跡的、茶味白（1-8-6 ） (ISP 2) Ｒ：茶味黒（1-2-6 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── オートミール寒天Ｇ：良好、平坦、橙（10-7-6) (ISP 3) ＡＭ：僅かに形成、原痕跡的、白Ｒ：橙（12-7-6）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── 水寒天Ｇ：余り良くない、平坦、薄黄味橙（2-9-9 ）ＡＭ：形成せずＲ：灰（N-5 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── ポテトエキス・Ｇ：良好、平坦、黄味灰（1-9-10）人参エキス寒天ＡＭ：僅かに形成、原痕跡的、白Ｒ：茶味白（2-9-7 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── Ｇ：生育，ＡＭ：気菌糸，Ｒ：裏面，ＳＰ：可溶性色素。

【００１８】３．生理学的性質 28 ℃で培養後、2 ないし 21 日間に観察した SANK 62
390 株の生理学的性質は表２に示した通りである。

【００１９】

【表２】 ──────────────────────────────────── 澱粉の水解陽性ゼラチンの液化陽性硝酸塩の還元陰性ミルクの凝固陽性ミルクのペプトン化陽性メラニン様色素生産性 (培地1)^* 陰性 (培地2)^* 陰性 (培地3)^* 陰性基質分解性カゼイン陽性チロシン陰性キサンチン陰性生育温度範囲 (培地4)^* 17-42 ℃ 生育適正温度 (培地4)^* 27-32 ℃ 食塩耐性 2 ％ ──────────────────────────────────── ＊：培地１；トリプトン・イーストエキス・ブロス(ISP
1) 培地２；ペプトン・イーストエキス・鉄寒天(ISP 6) 培地３；チロシン寒天(ISP 7) 培地４；イーストエキス・麦芽エキス寒天(ISP 2) 。

【００２０】また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地(I
SP 9) を使用して、 28 ℃、 14 日間培養後に観察した
SANK 62390 株の炭素源の資化性は表３に示す通りであ
る。

【００２１】

【表３】 ──────────────────────────────────── D-グルコース利用する D-フルクトース利用する L-アラビノース利用する L-ラムノース利用しない D-キシロース利用するシュクロース利用しないイノシトール利用するラフィノース利用する D-マンニトール利用しない対照利用しない ──────────────────────────────────。

【００２２】４．菌体成分について SANK 62390 株の細胞壁は、ビー・ベッカーらの方法
（B. Becker et al.、アプライドマイクロバイオロジ
ー（Applied Microbiology）、12巻、 421-423頁、1984
年）に従い検討した結果、メソ−ジアミノピメリン酸お
よびグリシンが検出された。また、SANK 62390 株の全
細胞壁中の糖成分をエム・ピー・レシェバリエの方法
（M. P. Lechevalier 、ジャーナルオブラボラトリ
ーアンドクリニカルメディスン（ Journal of Labo
ratory & Clinical Medicine）、71巻、 834頁、1968
年）に従い検討した結果、アラビノースとキシロースが
検出された。ミコール酸の存在は確認されなかった。細
胞壁ペプチドグリカン中のアシル型はグリコリル型であ
った。また、主要メナキノン成分として MK-10(H₆)、M
K-10(H₄) 、MK-10(H₈) が検出された。

【００２３】以上から、本菌株は放線菌の中でもミクロ
モノスポラ属に属することが判明したので、ミクロモノ
スポラエスピー( Micromonospora sp.) SANK 62390
株（寄託機関、工業技術院微生物工業技術研究所：寄託
番号、微工研条寄第 3521 号(FERM BP-3521): 原寄託
日、1990 年 7 月 26 日）と命名された。

【００２４】本発明の化合物（Ｉ）の製造法において用
いられるアミコラトプシス（ Amycolatopsis ）属に属
する菌株としては、例えばアミコラトプシスエスピー
（ Amycolatopsis sp. ）SANK 60791 株を挙げるこ
とができる。

【００２５】SANK 60791 株の菌学的性状は、次の通り
である。

【００２６】１．形態学的特徴 SANK 60791 株は菌株同定用寒天培地上、28 ℃、7 な
いし 14 日間の培養において普通もしくは、やや貧弱に
生育する。基生菌糸は良好に伸長、分岐し平坦もしくは
しわ状となり、茶白、薄黄味茶ないし鈍黄色を示す。気
菌糸はやや貧弱もしくは原痕跡的に僅かに形成し、白、
薄黄ないし薄橙色を示す。培養後期には基生菌糸や気菌
糸の分断が認められることもあり気菌糸では桿菌状構造
が観察されることもある。菌糸のノカルディア（ Nocar
dia ）様のジグザグ（ Zig-Zag）伸長は認められない。
胞子のう、菌核、車軸分岐等の特殊器官は認められな
い。

【００２７】２．各種培養基上の諸性質各種培養基上で 28 ℃、 14 日間培養後の性状は表４に
示した通りである。色調の表示は日本色彩研究所版「標
準色表」のカラーチップ・ナンバーをあらわす。

【００２８】

【表４】 ──────────────────────────────────── 培地の種類項目 SANK 60791 株の性状 ──────────────────────────────────── シュクロース・Ｇ：良好、平坦、黄味灰（1-9-10）硝酸塩寒天ＡＭ：余り良くない、白Ｒ：黄味灰（2-9-10）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── グルコース・Ｇ：余り良くない、平坦、薄橙（3-9-6 ）アスパラギン寒天ＡＭ：僅かに形成、黄味灰（2-9-10）Ｒ：薄茶（3-8-6 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── グリセリン・Ｇ：良好、平坦、茶味白（2-9-7 ）アスパラギン寒天ＡＭ：原痕跡的に形成、白 (ISP 5) Ｒ：薄黄味茶（6-8-8 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── 澱粉・無機塩寒天Ｇ：余り良くない、平坦、薄黄味茶（4-8-9) (ISP 4) ＡＭ：原痕跡的に形成、薄黄（3-9-10）Ｒ：薄黄味茶（6-8-9 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── チロシン寒天Ｇ：非常に良好、しわ状、茶味白（2-9-6 ） (ISP 7) ＡＭ：僅かに形成、薄橙（3-9-6 ）Ｒ：薄橙（6-8-7 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── 栄養寒天Ｇ：良好、平坦、薄黄味茶（4-8-8 ） (DIFCO) ＡＭ：原痕跡的に形成、白Ｒ：薄黄（3-9-8 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── イーストエキス・Ｇ：良好、しわ状、鈍黄（10- 7-9 ）麦芽エキス寒天ＡＭ：原痕跡的に形成、白 (ISP 2) Ｒ：鈍黄味橙（10- 7-8 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── オートミール寒天Ｇ：余り良くない、平坦、薄黄味茶（4-8-9) (ISP 3) ＡＭ：原痕跡的に形成、白Ｒ：薄黄（4-9-9 ）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── 水寒天Ｇ：余り良くない、平坦、黄味灰（1-9-10）ＡＭ：余り良くない、白Ｒ：黄味灰（1-9-10）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── ポテトエキス・Ｇ：余り良くない、平坦、黄味灰（1-9-10）人参エキス寒天ＡＭ：原痕跡的に形成、白Ｒ：黄味灰（2-9-11）ＳＰ：産生せず ──────────────────────────────────── Ｇ：生育，ＡＭ：気菌糸，Ｒ：裏面，ＳＰ：可溶性色素。

【００２９】３．生理学的性質 28 ℃で培養後、2 ないし 21 日間に観察した SANK 60
791 株の生理学的性質は表５に示した通りである。

【００３０】

【表５】 ──────────────────────────────────── 澱粉の水解陰性ゼラチンの液化陽性硝酸塩の還元陽性ミルクの凝固陽性ミルクのペプトン化陰性メラニン様色素生産性 (培地1)^* 陰性 (培地2)^* 陰性 (培地3)^* 陰性基質分解性カゼイン陰性チロシン陽性キサンチン陰性食塩耐性 (培地4)^* 3 ％ ──────────────────────────────────── ＊：培地１；トリプトン・イーストエキス・ブロス(ISP
1) 培地２；ペプトン・イーストエキス・鉄寒天(ISP 6) 培地３；チロシン寒天(ISP 7) 培地４；イーストエキス・麦芽エキス寒天(ISP 2) 。

【００３１】また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地
（ISP 9 ）を使用して、28 ℃、14日間培養後に観察し
た SANK 60791 株の炭素源の資化性は表６に示す通りで
ある。

【００３２】

【表６】 ──────────────────────────────────── D-グルコース利用する D-フルクトース利用する L-アラビノース弱く利用する L-ラムノース利用する D-キシロース利用するシュクロース利用するイノシトール利用しないラフィノース利用する D-マンニトール利用する対照利用しない ──────────────────────────────────。

【００３３】４．菌体成分について SANK 60791 株の細胞壁はビー・ベッカーらの方法〔B.
Becker et al.、アプライドマイクロバイオロジー
（ Applied Microbiology）、 12 巻、 421〜423 頁、
1984年〕に従い検討した結果、メソ−ジアミノピメリン
酸が検出された。また、SANK 60791 株の全細胞壁中の
糖成分をエム・ピー・レシェバリエの方法〔M. P. Lech
evalier 、ジャーナルオブラボラトリーアンド
クリニカルメディスン（ Journal of Laboratory & Cli
nical Medicine）、 71 巻、834 頁、1968 年〕に従い
検討した結果、アラビノースが検出された。ミコール酸
の存在は確認されなかった。細胞壁ペプチドグリカン中
のアシル型はアセチル型であった。また、主要メナキノ
ン成分として MK −9 （H₄）が検出された。

【００３４】以上から、本菌株は放線菌の中でもアミコ
ラトプシス属に属する放線菌であると判断するのが妥当
であると考えられ、アミコラトプシスエスピー（ Amy
colatopsis sp.）SANK 60791 株（寄託機関、工業技術
院微生物工業技術研究所：寄託番号、微工研条寄第 351
3 号(FERM BP-3513): 原寄託日、1991 年 8 月 14
日）と命名された。

【００３５】なお、SANK 62390 株および SANK 60791
株の同定はＩＳＰ〔ジ・インターナショナル・ストレプ
トマイセス・プロジェクト（The International Strept
omyces Project）〕基準、バージーズ・マニュアル・オ
ブ・システマテック・バクテリオロジー（Bergey's Man
ual of Systematic Bacteriology）第 4 巻、ジ・アク
チノミセテス（The Actinomycetes ）第 2 巻および放
線菌に関する最近の文献によって行った。

【００３６】周知のとおり、放線菌は自然界において、
または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照
射、化学薬品処理等）により、変異を起こし易く、本発
明のSANK 62390 株および SANK 60791 株もこの点は同
じである。本発明にいう SANK 62390 株および SANK
60791 株はそのすべての変異株を包含する。また、これ
らの変異株の中には、遺伝学的方法、例えば、組み替
え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含さ
れる。即ち、化合物（Ｉ）を生産する、SANK 62390 株
および SANK 60791 株、その変異株およびそれらと明確
に区別されない菌株は、すべて SANK 62390 株および
SANK 60791 株に包含されるものである。

【００３７】化合物（Ｉ）を得るため、これらの微生物
の培養は、他の醗酵生成物を生産するために用いられる
ような培地中で行う。このような培地中には、微生物が
同化できる炭素源、窒素源及び無機塩を含有する。

【００３８】一般に、炭素源としてグルコース、フラク
トース、マルトース、シュークロース、マンニトール、
グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウ
モロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆
粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、ある
いは併用して用いる事ができる。一般には、培地量の1
−10 重量％で変量する。

【００３９】窒素源としては、一般に蛋白質を含有する
物質を醗酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆
粉、フスマ、落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水
分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、
ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マル
トエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム等である。窒素源は、単一または併用して培
地量の 0.2−6 重量％の範囲で用いる。

【００４０】培地中にとり入れる栄養無機塩は、ナトリ
ウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サ
ルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得
ることのできる通常の塩類である。また、カリウム、カ
ルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の
微量の金属も含む。

【００４１】液体培養に際しては、シリコン油、植物
油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。

【００４２】SANK 62390 株または SANK 60791 株を培
養し、化合物（Ｉ）を生産する培地の pH は、 5.0−8.
0 に変化できる。

【００４３】菌の生育は 22 ℃から 38 ℃の範囲が良好
であり、更に化合物（Ｉ）の生産には 22 ℃から 28 ℃
が好適である。化合物（Ｉ）は、好気的に培養して得ら
れるが、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養
法、振盪培養法、通気撹拌培養法等が用いられる。

【００４４】小規模な培養においては、 28 ℃で数日間
振盪培養を行うのが良好である。

【００４５】培養は、バッフル( 水流調節壁) のついた
三角フラスコ中で、 1−2 段階の種の発育工程により開
始する。種発育段階の培地は、炭素源および窒素源を併
用できる。種フラスコは定温インキュベーター中で 28
℃、 7 日間振盪するか、または充分に成長するまで振
盪する。成長した種は第二の種培地または生産培地に接
種するのに用いる。中間の発育工程を用いる場合には、
本質的に同様の方法で成長させ生産培地に接種するため
に、それを部分的に用いる。接種したフラスコを一定温
度で数日間振盪し、インキュベーションが終わったらフ
ラスコの含有物を遠心分離またはろ過する。

【００４６】大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を
付けた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法
によれば、栄養培地をタンクの中で作成できる。栄養培
地を125 ℃ まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地に
あらかじめ成長させてあった種を接種する。培養は 28
℃で通気撹拌して行う。この方法は、多量の化合物を得
るのに適している。

【００４７】培養の経過に伴って生産される化合物
（Ｉ）の量の経時変化を知るには、例えば培養ろ液中の
化合物（Ｉ）をアンバーライト IRC−50(NH₄ ⁺)に吸着さ
せ、水洗後、0.5 N アンモニア水溶液で溶出し、濃縮
し、凍結乾燥した粉末中の化合物（Ｉ）の量を高速液体
クロマトグラフィーに付して測定するか、または化合物
（Ｉ）をアセチル化後、ガスクロマト−マススペクトロ
メトリー（ＧＣ／ＭＳ）により測定する。通常は 96 時
間から 168 時間の培養で化合物（Ｉ）の生産量は最高
値に達する。

【００４８】培養終了後、培養液中の液体部分 (および
菌体内) に存在する化合物（Ｉ）は、菌体、その他の固
形部分を珪藻土をろ過助剤とするろ過操作または遠心分
離によって分別し、そのろ液または上清中に存在する化
合物（Ｉ）を、その物理化学的性状を利用し抽出精製す
ることにより得られる。

【００４９】例えば、ろ液または上清中に存在する化合
物（Ｉ）をイオン交換樹脂、例えばアンバーライト IRC
−50、CG−50、ダウエックス 50W×4 、ダウエックス S
BR−P の層を通過させて不純物を吸着させて取り除く
か、または化合物（Ｉ）を吸着させた後、アンモニア水
を用いて溶出させることにより得られる。あるいは吸着
剤として、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバ
ーライト XAD−2 、XAD−4(ローム・アンド・ハース社
製 )等や、ダイヤイオン HP −10、HP−20、HP−50、 C
HP 20 (三菱化成（株）社製) 等が使用される。化合物
（Ｉ）を含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて
不純物を吸着させて取り除くか、または化合物（Ｉ）を
吸着させた後、メタノール水、アセトン水等の水と有機
溶剤との混合溶剤を用いて溶出させることにより得られ
る。

【００５０】このようにして得られた化合物（Ｉ）は、
更にシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着
カラムクロマトグラフィー、アビセル (旭化成工業
（株）社製) 、セファデックスLH−20( ファルマシア社
製) 等を用いた分配カラムクロマトグラフィーおよび順
相、逆相カラム、イオン交換カラムを用いた高速液体ク
ロマトグラフィー等で精製することができる。

【００５１】なお、化合物（Ｉ）の生産菌であるミクロ
モノスポラエスピーＳＡＮＫ６２３９０株の培養
において、化合物（Ｉ）と共にトレハゾリン（Ｔｒｅｈ
ａｚｏｌｉｎ）（特開平 4−99792 号）も生産される。

【００５２】

【作用】本発明の製造法によって得られる化合物（Ｉ）
は、文献未載の新規化合物であり、スクラーゼ阻害活性
を有する。従って、本化合物は抗肥満薬、抗糖尿病薬と
しての用途に有用であることが予想される。本発明の製
造法によって得られる化合物（Ｉ）を医薬として用いる
場合、常法に従ってそれ自体または適宜の薬学的に許容
される担体、賦形剤、希釈剤と混合し、粉末、顆粒、錠
剤、カプセル剤、注射剤などの形態で経口的または非経
口的に安全に投与することが出来る。投与量は対象疾
患、投与経路および投与回数などにより異なるが、例え
ば成人に対しては 1 日 1 mg から 1000 mg を、症状
に応じて 1 回または数回に分けて投与するのが好まし
い。

【００５３】

【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００５４】実施例１．（Ａ）培養アミコラトプシスエスピー SANK 60791 株を培地組
成−1 で示される培地80 ml を含む 500 ml 容三角フラ
スコ( バッフル付) 2 本にスラントより一白金耳接種
し、 210 rpm の回転振盪培養機で 28 ℃で 96 時間培養
した。

【００５５】培地組成−1 グルコース 1 ％シュクロース 1 ％グリセリン 1 ％オートミール 0.5 ％生イースト 1 ％大豆粉 2 ％カザミノ酸 0.5 ％ＣａＣＯ₃ 0.1 ％ＣＢ−４４２ 0.01 ％ ─────────────────────────── 滅菌前 pH 7.0 。

【００５６】培地組成−2 で示される培地を 30 リット
ル容ジャーファーメンター 2基に各 15 リットルづつ仕
込み、 120 ℃で 30 分間加熱滅菌した。次いで、これ
を28 ℃に冷却した後に、種培養液 75 ml を接種し
た。次いで、これを溶存酸素濃度を 2 ppm に保持する
ように回転数を 100−400 rpm の範囲で調整し、通気量
7.5 リットル／分、 28 ℃ で 144 時間攪拌培養し
た。

【００５７】培地組成−2 グルコース 2 ％可溶性デンプン 1 ％生イースト 0.9 ％極東肉エキス 0.5 ％ポリペプトン 0.5 ％ＮａＣｌ 0.5 ％ＣａＣＯ₃ 0.3 ％ＣＢ−４４２ 0.01 ％ ─────────────────────────── 滅菌前 pH 7.2。

【００５８】（Ｂ）単離得られた培養液 25 リットルにろ過助剤としてセライト
545（ジョンズマンビルプロダクトコーポレーシ
ョン製) を 1.5 kg 加えてろ過しろ液 23 リットルを得
た。塩酸を用いて pH 6.0 に調整したろ液をアンバーラ
イト IRC-50(NH₄ ⁺) 3リットルを充填したカラムに通じ
て化合物（Ｉ）を吸着させ、脱イオン水 15 リットルで
洗浄後 0.5 N アンモニア水溶液で溶出を行った。溶出
液のpHがアルカリ性になってから 4.5 リットルを集
め、減圧下濃縮し、 200 ml とした。次いで濃縮液をダ
ウエックス 1X2 (OH^-)を 450 ml 充填したカラムに通し
脱イオン水で展開溶出した。最初の流出液 800 ml を除
いた後、続く流出液を 20mlづつ分画した。後述の定量
法により分析を行い化合物（Ｉ）の認められたフラクシ
ョン番号 60ー90 を集めた。得られた画分を減圧下で濃
縮、凍結乾燥すると化合物（Ｉ）の白色粉末 16.6 mg
が得られた。

【００５９】化合物（Ｉ）の定量は次の方法で行なっ
た。高速液体クロマトグラフィーによる定量法分離カラム；アサヒパック ES−502 C （旭化成工業
（株）製）移動相； 20 mM 酢酸アンモニウム(pH 8.5) + 50 mM
食塩水流速； 1 ml ／分検出波長； 210 nm 温度； 25 ℃ 保持時間； 8.39 分。

【００６０】ＧＣ／ＭＳによる定量法サンプルを一定の液量にした後、その 10 μl をアセチ
ル化するために反応用のバイアルにとり、乾固した。残
渣に無水酢酸 30 μl とピリジン 50 μlを加え 60 ℃
で 40 分間加熱した。窒素ガスで過剰の試薬を留去し、
内部標準物質（ペンタアセチル−1 −アミノ−1 −デ
オキシ−β−D −グルコース）を一定量加え、酢酸エチ
ル 100 μl に溶かしてＧＣ／ＭＳに注入するサンプル
とした。分析条件は、ガスクロマトグラフィ−カラムに
ヒューズドシリカキャピラリカラム DB-5 （長さ 15 m
x 内径 0.25 mm 、0.25 μm 薄膜、J & W SCIENTIFIC
社製）を用い、キャリアーガスとしてヘリウムを用い 5
psi で流した。インジェクターとインターフースの温
度を 250 ℃に設定した。サンプル 2 μl をスプリッ
トレスで注入し、カラム温度を 60 ℃ から 25 ℃/ 分
で 280 ℃まで昇温した。

【００６１】四重極型質量分析計 Trio-1 (VG 社製) を
用い、メタンガスを用いる化学イオン化法で負イオンを
検出した。即ち、イオン源温度 180 ℃、イオン化エネ
ルギー70 eV、イオン源圧力 1x10^-4 トールで検出され
る保持時間約 8.8 分のm/z 388 の内部標準物質、約
9.6 分の m/z 413 の化合物（Ｉ）( 共にペンタアセ
テート) の負イオンピークを定量に用いた。内部標準法
により化合物（Ｉ）の含有量を算出した。

【００６２】実施例２．（Ａ）培養ミクロモノスポラエスピー SANK 62390 株のスラント
1 本を生理食塩水10 ml でホモゲナイズし、菌の懸濁
液を調製して、その 1ml 宛を培地組成−3で示される
培地 500 ml を含む 2リットル容三角フラスコ 2 本に
接種して、210 rpm の回転振盪培養機により 28 ℃ で
96 時間培養して初代種培養液とした。

【００６３】培地組成−3 グルコース 2 ％イーストエキス(difco) 0.5 ％ポリペプトン 0.5 ％ＣａＣＯ₃ 0.1 ％ＣＢ−４４２ 0.01 ％ ─────────────────────────── 滅菌前 pH 7.2。

【００６４】培地組成−3 で示される培地 30 リットル
を 60 リットル容ジャーファーメンターに仕込み、 120
℃ で 30 分間加熱滅菌した。次いで、これを 28 ℃
に冷却した後に、初代種培養液 600 ml を接種した。
次いで、これを回転数 165rpm、通気量 15 リットル／
分で 28 ℃、 48 時間攪拌培養して、第 2 代種培養液
を調製した。

【００６５】培地組成−4 で示される培地 300 リット
ルを 600 リットル容タンクに仕込み、 120 ℃で 35 分
間加熱滅菌した。次いで、これを 28 ℃に冷却した後
に、第2 代種培養液 15 リットルを接種した。次い
で、これを溶存酸素濃度を 2 ppmに保つように回転数を
82ー142 rpm の範囲で調整し、通気量 150 リットル／
分、内圧 0.5 kg ／cm² 、 28℃ で 144 時間攪拌培養
した。

【００６６】培地組成−4 グルコース 8 ％（別滅菌 120 ℃、15 分）ラスターゲンＦＫ 2 ％生イースト 1.8 ％極東肉エキス 1 ％ポリペプトン 1 ％ＮａＣｌ 0.5 ％ＣａＣＯ₃ 0.3 ％Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 0.25 ％ＣＢ−４４２ 0.02 ％ ─────────────────────────── 滅菌前 pH 7.2。

【００６７】（Ｂ）単離得られた培養液 300リットルにろ過助剤としてセライト
545(ジョンズマンビルプロダクトコーポレーショ
ン製) を 15 kg 加えてろ過することによりろ液 290
リットルを得た。そのうち 20 リットルを塩酸で pH 6.
0 に調整し、アンバーライト IRC-50 (NH₄ ⁺) 3リットル
を充填したカラムに通じて化合物（Ｉ）を吸着させ、脱
イオン水 15 リットルで洗浄後 0.5 N アンモニア水溶
液で溶出を行った。溶出液の pH がアルカリ性になって
から 4.5リットルを集め減圧下濃縮し 150 ml とした。
次いで、濃縮液をダウエックス 1X2 (OH^-) 500 ml を充
填したカラムに通し脱イオン水で展開溶出した。最初の
流出液 1 リットルを除いた後、続く流出液を 20 ml
づつ分画した。実施例１．に記載の定量法により分析を
行い、化合物（Ｉ）の認められるフラクション番号 58-
80 を集めた。活性画分を減圧下で濃縮、凍結乾燥する
と化合物（Ｉ）の粗粉末 9.6 mg が得られた。この粉末
を再度、ダウエックス 1X2 (OH^-) 100 ml のカラムで精
製すると化合物（Ｉ）の白色粉末 4.8 mg が得られた。

【００６８】

【発明の効果】本発明の化合物（Ｉ）は顕著なスクラー
ゼ阻害活性を有しており、例えば抗糖尿剤、抗肥満剤等
として有用である。

【００６９】試験例１．化合物（Ｉ）のラットスクラ
ーゼに対する阻害活性ラット小腸刷子縁膜酵素液は、エム．ケスラーらの方法
（M. Kessler et al.、ビオキミカエトビオフィジ
カアクタ（Biochimica et Biophysica Acta）、 506
巻、136-154 頁、1978年）に従った。即ち、ウィスター
（Wistar）系ラット（雄） 3 頭の小腸より調製し、生
理食塩水 3 ml に懸濁した状態の酵素液を得た。4 −
アミノアンチピリン（A 4382）はシグマ社より、ペルオ
キシダーゼ（Grade I ）、グルコースオキシダーゼ（Gr
ade I ）はベーリンガーマンハイム社より購入した。以
下、希釈等の操作には、20 mM クエン酸−40 mM リン
酸二ナトリウム緩衝液（pH 6.2）を使用した。

【００７０】96 穴マイクロタイタープレート（ファル
コン社）の各ウェルに、ウシ血清アルブミン（シグマ
社、A 7906）0.2 mg、グルコースオキシダーゼ 3 unit
s 、ペルオキシダーゼ 0.132 unit 、4 −アミノアンチ
ピリン 20 μg 、フェノール40 μg 、ショ糖 3 μmo
leと、測定試料を加え、総計 130 μl とした。次い
で、これにラット小腸刷子縁膜酵素液の 100 倍希釈液
を 20 μl 加えた。これを 37 ℃で 20 分間反応さ
せ、遊離したグルコースの濃度を 492 nm 吸光度の変化
を測定することで定量した。

【００７１】酵素反応時に測定試料を添加していない場
合と、酵素溶液を添加していない場合のグルコース濃度
をそれぞれ 0 ％および 100 ％阻害として阻害率を
計算した。化合物（Ｉ）の 50 ％阻害濃度を表７に示
す。

【００７２】

【表７】 ──────────────────────── 試料スクラーゼ 50 ％阻害濃度 ──────────────────────── 化合物（Ｉ） 14 μg ／ml ──────────────────────── 表７から、化合物（Ｉ）は顕著なスクラーゼ阻害活性を
示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:29） (72)発明者高橋秀次東京都品川区広町１丁目２番58号三共株式会社内 (72)発明者佐藤章福島県いわき市泉町下川字大剱389−４三共株式会社内 (72)発明者高松安行福島県いわき市泉町下川字大剱389−４三共株式会社内 (72)発明者榎田竜三茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 17/00 - 17/18 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ミクロモノスポラ属またはアミコラトプシ
ス属に属する式（Ｉ）【化１】で示される化合物の生産菌を培養し、その培養物より式
（Ｉ）で示される化合物を採取することからなる式
（Ｉ）で示される化合物の製造法。
【請求項２】［請求項１］において、ミクロモノスポラ
属に属する式（Ｉ）【化２】で示される化合物の生産菌がミクロモノスポラエスピ
ー SANK 62390 株（微工研条寄第 3521 号）である製造
法。
【請求項３】［請求項１］において、アミコラトプシス
属に属する式（Ｉ）【化３】で示される化合物の生産菌がアミコラトプシスエスピ
ー SANK 60791 株（微工研条寄第 3513 号）である製
造法。